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      一種新型多房棘球蚴亞單位疫苗的設(shè)計、制備方法和應(yīng)用

      文檔序號:10705371閱讀:992來源:國知局
      一種新型多房棘球蚴亞單位疫苗的設(shè)計、制備方法和應(yīng)用
      【專利摘要】本發(fā)明提供一種新型多房棘球蚴亞單位疫苗,其活性成分是一條多肽,主要由多房棘球蚴的表面抗原Emy162以及黏膜免疫佐劑霍亂毒素B亞基(CTB)構(gòu)成。本發(fā)明主要通過基因合成技術(shù)合成多房棘球蚴表面抗原Emy162基因序列,然后將該基因與霍亂毒素B亞基的基因序列相偶聯(lián),形成一個融合基因。利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達該融合基因,經(jīng)蛋白純化后,獲得多房棘球蚴亞單位疫苗。該多房棘球蚴亞單位疫苗能夠誘發(fā)機體產(chǎn)生針對多房棘球蚴T細胞及B細胞免疫應(yīng)答和高滴度特異性抗體體液免疫應(yīng)答,可用于預(yù)防和治療多房棘球蚴感染相關(guān)性疾病。
      【專利說明】
      一種新型多房棘球蚴亞單位疫苗的設(shè)計、制備方法和應(yīng)用
      技術(shù)領(lǐng)域
      [0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域,具體涉及到一種新型多房棘球蝴亞單位疫苗的設(shè)計制 備方法和應(yīng)用。
      【背景技術(shù)】
      [0002] 多房棘球蝴(Alveolar Echinococcosis)導(dǎo)致泡型棘球蝴病,多房棘球蝴在中間 宿主肝內(nèi)以出芽的方式生長或浸潤式增殖,產(chǎn)生新囊泡,長入肝組織,囊壁外角皮層很薄且 常不完整,囊體與周圍組織間無明顯界限,囊液持續(xù)滲漏可與肝組織接觸,引起局部肝組織 病變、增生、肝纖維化、萎縮、變性和壞死,,晚期似肝癌樣轉(zhuǎn)移能轉(zhuǎn)移至肺、腦、乳腺等臟器, 素有"蟲癌"之稱,預(yù)后極差。世界范圍內(nèi)北半球高海拔地區(qū)為泡型棘球蝴病的高發(fā)區(qū)域。我 國三江源地區(qū)是多房棘球蝴病的世界罕見高發(fā)地區(qū)。多房棘球蝴病具有發(fā)病范圍廣、惡性 程度高、早期診斷難、預(yù)后效果差、術(shù)后易復(fù)發(fā)等特點。目前針對多房棘球蝴病尚無令人滿 意的治療策略。大多數(shù)牧區(qū)患者出現(xiàn)癥狀時才就醫(yī),而病情往往已至晚期,喪失手術(shù)機會, 即使進行肝部分或半葉切除,術(shù)后復(fù)發(fā)率也很高。甲苯達唑、阿苯達唑等抗生素療法有一 定的治療效果,但是由于需長期連續(xù)治療導(dǎo)致耐藥性的出現(xiàn)及治療后復(fù)發(fā)率高等缺限。 [0003]表面抗原是刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的基本功能單位,很多表面抗原可以用作疫苗 的研發(fā)。而亞單位疫苗基于表面抗原而制備,具有獨特的疫苗設(shè)計思路,是研制預(yù)防和治療 感染性疾病、惡性腫瘤和自身免疫性疾病等疫苗的新方向。亞單位疫苗具有以下優(yōu)點:(1) 亞單位疫苗減少或消除了常規(guī)活疫苗或滅活疫苗難以去除的熱原、變應(yīng)原及其它有害的反 應(yīng)原;且由于亞單位疫苗不能在體內(nèi)復(fù)制,對宿主沒有致病風(fēng)險,是最具安全性和穩(wěn)定性 的一種基因工程疫苗。(2)亞單位疫苗只含有病原體的一種或幾種只產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答 所必需的免疫原成分,而不含有病原體其他遺傳信息,故不含有感染性組分,因而無須滅 活,也無致病性,具有很好的穩(wěn)定性。(3)亞單位疫苗可采用大腸桿菌、酵母菌等原核表達系 統(tǒng)進行表達。故亞單位疫苗產(chǎn)量很高,易純化,便于工業(yè)化生產(chǎn)。在多房棘球蝴疫苗研究領(lǐng) 域,亞單位疫苗與其他疫苗相比,同樣具有很大優(yōu)勢,既可激發(fā)更高特異性的抗多房棘球蝴 抗體,又可防止疫苗免疫引起的一些自身免疫性疾病,具有更高的免疫針對性和安全性。
      [0004] 對于多房棘球蝴抗原的尋找一直是當(dāng)前研究的熱點之一,現(xiàn)階段包蟲病研究主要 集中在包蟲病診斷抗原,對預(yù)防、抑制多房棘球蝴感染的抗原研究還較少;加之多房棘球蝴 感染宿主的免疫逃逸機制復(fù)雜,目前還未形成對多房棘球蝴的免疫治療方式。研究發(fā)現(xiàn) Emyl62具有很強的免疫作用,并穩(wěn)定表達于棘球蝴生命周期的各階段(原頭節(jié)、培養(yǎng)的棘球 蝴、未成熟成蟲與成熟成蟲),在棘球蝴的粘附及運動生理學(xué)中發(fā)揮重要的作用。
      [0005] 本課題擬將多房棘球蝴的表面抗原Emyl62與黏膜免疫佐劑霍亂毒素 B亞基進行基 因融合,經(jīng)原核系統(tǒng)表達純化得到亞單位疫苗CTB-Emy 162,免疫BALB/C小鼠,使用脾淋巴細 胞增殖、特異性ELISA等方法確證亞單位疫苗的免疫原性及免疫特異性。
      [0006] 本發(fā)明的思路如下:根據(jù)機體對多房棘球蝴的免疫保護性機制,篩選出具有良好 免疫原性的多房棘球蝴表面抗原Emy-162,利用分子生物學(xué)技術(shù)與黏膜免疫佐劑霍亂毒素 B 亞基(CTB)相偶聯(lián),設(shè)計出一個科學(xué)合理、結(jié)構(gòu)新穎的多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62。 利用小鼠脾淋巴細胞增殖、ELISA等多種免疫學(xué)方法檢測多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62的免疫原性和免疫特異性。研究表明多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62能夠激發(fā) BALB/c小鼠產(chǎn)生的T細胞、B細胞免疫應(yīng)答和有效抑制多房棘球蝴活性的高滴度特異性抗 體,具有很好的免疫原性和免疫特異性。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0007] 本發(fā)明的第一個方面是提供了一種新型多房棘球蝴亞單位疫苗。
      [0008] 本發(fā)明的第二個方面是提供了多房棘球蝴亞單位疫苗的制備方法。
      [0009] 本發(fā)明的第三個方面是公布了多房棘球蝴亞單位疫苗的用途。
      [0010] 本發(fā)明的第一個方面是提供了一種針對多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62。該多 房棘球蝴亞單位疫苗主要由Emyl62和霍亂毒素 B亞基構(gòu)成,多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62的整體氨基酸序列如(序列1)所示,表面抗原Emyl62的氨基酸序列如(序列3)所示。 [0011]本發(fā)明的新型多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62具有以下優(yōu)點:(l)Emyl62是多 房棘球蝴表面抗原,被公認為是多房棘球蝴疫苗的理想候選抗原能夠取得良好的保護作 用。多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62能夠引起T細胞及B細胞免疫應(yīng)答和特異性抗體體 液免疫應(yīng)答。(3)Emy 162抗原表位肽的分子量很小,免疫原性很低,本發(fā)明的多房棘球蝴亞 單位疫苗CTB-Emyl62采取"偶聯(lián)分子內(nèi)免疫佐劑"的設(shè)計思路來增強表面抗原Emyl62的免 疫原性,從而誘發(fā)高滴度的特異性抗體產(chǎn)生。
      [0012] 本發(fā)明的第二個方面是提供多房棘球蝴亞單位疫苗的制備方法,其技術(shù)路線詳述 如下: (1)新型多房棘球蝴亞單位疫苗抗原分子的結(jié)構(gòu)設(shè)計 根據(jù)機體對多房棘球蝴的免疫保護性機制,合理選擇具有良好免疫原性的多房棘球蝴 表面抗原Emy-162,并與黏膜免疫佐劑霍亂毒素 B亞基(CTB)相偶聯(lián),設(shè)計出一個科學(xué)合理、 結(jié)構(gòu)新穎的多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emy 162。
      [0013] (2)重組表達質(zhì)粒pET28a-CTB-Emyl62(含有融合基因 CTB-Emy 162)的構(gòu)建 首先構(gòu)建一個含有霍亂毒素 B亞基(CTB)基因的重組表達載體pET-CTB;然后通過基因 合成技術(shù)合成一個多房棘球蝴表面抗原Emyl62的核苷酸序列,并將其插入重組表達載體 pET-CTB中,構(gòu)建重組表達載體pET28a-CTB-Emy 162。
      [0014] (3)融合蛋白CTB-Emyl62的原核表達及純化 將重組表達載體pET28a-CTB-Emyl62轉(zhuǎn)化進大腸桿菌BL21(DE3)中,構(gòu)建重組基因工程 菌株BL21(DE3)/ pET28a-CTB-Emyl62。利用IPTG誘導(dǎo)表達,并通過Ni-NTA鎳離子親和層析 能夠獲得高純度融合蛋白CTB-Emy 162,即為多房棘球蝴亞單位疫苗。
      [0015] 本發(fā)明的第三個方面是提供了多房棘球蝴亞單位疫苗的用途。多房棘球蝴亞單位 疫苗CTB-Emy 162可用于預(yù)防和治療多房棘球蝴感染相關(guān)性疾病。
      【附圖說明】
      [0016] 圖1:新型多房棘球蝴亞單位疫苗的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計特點。
      [0017] 圖2:Emyl62基因 PCR結(jié)果圖。
      [0018] 泳道I:DNA Marker;泳道2為Emy 162 DNA片段經(jīng)PCR后的結(jié)果 圖3:重組表達載體pET28a-CTB-Emyl62的雙酶切鑒定。
      [0019] 泳道 1:DNA Marker;泳道2:pET28a-CTB-Emyl62質(zhì)粒經(jīng)Nco I和 Xho I雙酶切后 圖4:重組表達載體pET28a-CTB-Emy 162質(zhì)粒圖譜。
      [0020] Nco I和Xho I之間為插入的融合基因 CTB-Emyl62 圖5:多房棘球蝴融合蛋白CTB-Emy 162的原核表達。
      [0021] 泳道I: BL21 (DE3) / pET-28a全菌蛋白;泳道2:蛋白質(zhì)Marker;泳道3: BL21 (DE3) / pET-28a-CTB-Emyl62全菌蛋白;泳道4:BL21(DE3)/ pET-28a- CTB-Emyl62可溶蛋白;泳道 5: BL21 (DE3) /CTB-Emy 162包涵體蛋白。
      [0022]圖6:多房棘球蝴融合蛋白CTB-Emyl62的Ni-NTA親和層析純化。
      [0023] 泳道1:純化前的CTB- Emyl62蛋白樣品;泳道2:經(jīng)Ni-NTA純化后的CTB- Emyl62蛋 白樣品。
      [0024] 圖7 :多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62誘發(fā)抗CTB-Emyl62及Emyl62抗原表位 E7-13、El29-129抗體的檢測。
      [0025] 多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emy 162能夠誘發(fā)較高滴度的針對CTB-Emy 162及 Emyl62抗原表位E7-l3、El29-l29的抗體。
      [0026] 圖8:多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62抗體效價檢測。
      [0027]圖9:多房棘球蝴亞單位疫苗CTB_Emyl62致敏小鼠脾臟淋巴細胞對抗原刺激的增 殖反應(yīng)。
      [0028]圖10:多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62誘發(fā)抗多房棘球蝴抗體分型的檢測。
      【具體實施方式】 [0029] 材料 I. IPTG溶液:稱取1.2g IPTG置于50ml離心管中,加入40ml無菌水,充分混勻溶解后, 定容至50ml。用0.22μπι濾器過濾除菌,小份分裝,-20°C保存。
      [0030] 2.卡那青霉素(Kana)JC液(lg/mL):稱取Ig卡那青霉素(Kana)溶于ImL無菌水, 制得濃度為lg/mL的貯存液,通過0.22μπι細菌濾器過濾除菌,溶液分裝保存于-20°C冰箱 中。
      [0031] 3.培養(yǎng)基:(I)LB液體培養(yǎng)基:稱取IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g NaCl,加蒸 餾水至1000 ml,調(diào)整pH至7.4,高壓蒸氣滅菌。(2)LB固體培養(yǎng)基:1.5g瓊脂粉/100ml LB培養(yǎng) 液,高壓滅菌后,傾倒平板。
      [0032] 4. DNA電泳緩沖液(50 X TAE):稱取242g Tris、37.2g Na2EDTA · 2H20和57.1ml 冰乙酸,加水至1000ml,使用時稀釋50倍。
      [0033] 5·SDS-PAGE電泳緩沖液(5X):稱取Tris粉末15.1g、甘氨酸94g、SDS5.0g;加入 約800ml的去離子水,攪拌溶解;加去離子水定容至1L,室溫保存;注意:加水時應(yīng)讓水延著 壁緩緩流下,以避免由于SDS的原因產(chǎn)生很多泡沫。
      [0034] 6.考馬斯亮藍R-250染液:0.25g考馬斯亮藍R-250溶解在100mL脫色液中。(3)固定 液:500ml乙醇、100mL冰醋酸用蒸餾水稀釋至1000 ml。(4)脫色液:250ml乙醇、80ml冰醋酸用 蒸餾水稀釋至1000 ml。(5)保存液:25ml 87%甘油溶于225ml脫色液中。
      [0035] 9 .實驗動物:(2)BALB/c小鼠:為SPF級,雄性,6~7周齡,購自北京,許可證號: SCXK(京)2012-0001。
      [0036] 12.淋巴細胞增殖實驗主要試劑(1)小鼠脾臟淋巴細胞分離液(天津灝洋生物技 術(shù)有限公司)(2)RPMI-1640完全培養(yǎng)液:在RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液加入10%胎牛血清、100U/ ml青霉素、100μg/ml鏈霉素。
      [0037] 實例1:多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emy 162的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計 在獲取Emy 162氨基酸序列的基礎(chǔ)上,在此基礎(chǔ)上添加分子內(nèi)粘膜免疫佐劑CTB,設(shè)計出 具有科學(xué)合理結(jié)構(gòu)的多房棘球蝴融合蛋白,以達到有效提高體內(nèi)粘膜免疫反應(yīng)。
      [0038]結(jié)果:多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計特點和思路如(圖1)所 不。
      [0039]實例2:重組表達載體(含有融合基因 CTB-Emy 162 )的構(gòu)建 (1)多房棘球蝴表面抗原Emyl62核苷酸序列的基因合成 將前期獲取的Emyl62的氨基酸序列,按照大腸桿菌密碼子偏愛性原則轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的核 苷酸序列,委托南京金斯瑞生物科技公司進行基因合成。合成后的Emyl62進行PCR,反應(yīng)體
      PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min,95°C變性30 sec,72°C退火30 sec,72°C延伸40sec, 共30個循環(huán);最后72°C延伸10 min。然后用1%瓊脂糖凝膠電泳,觀察電泳結(jié)果(圖2)。利用 DNA片段凝膠回收純化試劑盒(北京天根生物技術(shù)有限公司)回收純化PCR擴增的Emyl62基 因,以備后續(xù)實驗使用。
      [0040] (2)重組表達載體pET28a-CTB(含有霍亂素素 B亞基基因)的構(gòu)建 通過質(zhì)粒小量提取試劑盒(天根)提取重組質(zhì)粒PET-CTB-UE(由郭樂教授惠贈),用
      37Γ _切反應(yīng)2 h,然后用1%瓊脂糖凝股電泳。分別利用瓊脂糖凝股DNA回收純化試 劑盒回收多表位肽UE基因和pET28a-CTB表達載體雙酶切產(chǎn)物,pET28a-CTB以備后續(xù)實驗使 用。
      [0041 ] (3)多房棘球蝴表面抗原Emyl62基因與pET28a-CTB表達載體的連接 將回收的pET28a-CTB線性化質(zhì)粒載體和PCR后回收的Emyl62基因通過互補的粘性末 端,在T4 DNA連接酶的作用下(4°C過夜)連接成閉合環(huán)狀的DNA分子,即形成重組表達質(zhì)粒 nRT28a-CTR-Rmvlfi2"T4 DNA 連梓BS連梓體系加下,
      結(jié)果:利用Afco IAfto I雙酶切待檢重組質(zhì)粒pET28a-CTB-Emyl62,37°C反應(yīng)2h,用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測,發(fā)現(xiàn)雙酶切的DNA片段約790bp,與融合基因 CTB-Emy 162的理論大 小一致(圖3所示)。
      [0042] 將pET28a-CTB-Emyl62送交南京金斯瑞生物科技公司,采用T7啟動子和終止子通 用引物進行基因測序,證明pET28a-CTB-Emyl62中融合基因 CTB-Emyl62的核苷酸序列完全 正確,且無移碼突變。重組表達載體pET28a-CTB-Emyl62的質(zhì)粒圖譜如(圖4)所示。
      [0043]實例3多房棘球蝴融合蛋白CTB-Emy 16 2的原核表達 將測序100%成功的重組表達質(zhì)粒pET28a-CTB-Emyl62轉(zhuǎn)化進E.coli BL21(DE3)菌株 中。在預(yù)先制備好的含50ug/mL Kana的LB平板上,接種環(huán)劃線基因工程菌株pET28a-CTB-Emy 162/BL21 (DE3),倒置于37°C培養(yǎng)箱,過夜培養(yǎng)12~16h后,挑取單個菌落,接種于含50μ g/mL Kana的LB液體培養(yǎng)基中,37°C,190rpm,培養(yǎng)6-8h。以1%接種量分別接種重組菌于含50 Ug/mL Kana LB液體培養(yǎng)基中,37 °C,180rpm振蕩過夜,次日晨再將該菌液以1%接種量接種 于含SOyg/mL Kana的LB液體培養(yǎng)基中,37°C,190rpm搖瓶9h后,加入IPTG使終濃度達到 ImmoI/L,28 °C,190rpm誘導(dǎo)表達,以空載體菌pET28a/BL21 (DE3)作為陰性對照。
      [0044] 結(jié)果:將基因工程重組菌株pET28a-CTB-Emyl62/BL21(DE3)在PH值為7、IPTG濃度 為lmmol/L、誘導(dǎo)溫度28°C、誘導(dǎo)時間為9h的情況下進行誘導(dǎo)表達。與對照菌株對比,基因工 程重組菌株pET28a-CTB-Emy162/BL21(DE3)在約33KD處出現(xiàn)目的蛋白條帶,與多房棘球蝴 重組融合蛋白CTB-Emyl62的理論大小相符合(圖5)。多房棘球蝴重組融合蛋白CTB-Emyl62 在包涵體蛋白中存在。
      [0045] 實例4:多房棘球蝴多表位肽融合蛋白CTB-EMY162的純化 (DNi-NTA鎳離子親和層析柱的純化 將Ni-NTA填料充分混勻后加入層析柱中,溶液可通過重力作用緩慢流出,待完全加入 后,將上層篩板平放入柱中;向裝填好的柱中加入適量的去離子水將乙醇沖洗干凈后,加入 8倍柱體積的Binding buffer平衡,平衡結(jié)束后即可上樣;收集菌體后,每IOOmg菌體加入1_ 5ml Binding Buffer,冰浴超聲裂解菌體;12000rpm離心,棄上清,將沉淀重懸于Binding Buffer中,進行超聲波處理,直至包涵體清洗干凈(呈較潔凈的乳白色狀);將沉淀重懸于 含8M尿素的Binding Buffer中,冰浴lh,使包涵體溶解;將菌體裂解液負載上柱,流速為10 倍柱體積/小時;使用15倍柱體積的Wash buffer沖洗柱子,收集流穿峰;使用5倍柱體積的 Elution Buffer洗脫,收集洗脫峰;依次使用3倍柱體積的Binding Buffer和5倍柱體積 的去離子水洗滌后,用3倍柱體積的20%乙醇平衡,4°C保存。
      [0046]結(jié)果:經(jīng)Ni-NTA鎳離子親和層析柱的純化后,收集的各個蛋白峰進行SDS-PAGE分 析,可以發(fā)現(xiàn)目的蛋白集中在50mM咪唑和250mM咪唑洗脫產(chǎn)生的蛋白峰。通過凝膠成像檢 測儀分析在250mM咪唑洗脫的目的蛋白純度均在85%以上(圖6)。
      [0047] 實施例5:多房棘球蝴多表位疫苗CTB-EMY162的免疫原性和免疫特異性研究 (l)BALB/c小鼠的免疫 實驗分組:將SPF級BALB/c小鼠隨機分為2組,分別為新型多房棘球蝴多表位融合蛋白 CTB-Emyl62免疫組、PBS免疫組。每組12只BALB/c小鼠,共24只,詳細分組如下圖所示: 衷I :SPF級MLR/c小鼠分鉬及免痦方鑾
      免疫萬式:用75% 稩對小鼠腹部消毐,然后腹腔注射里組蛍臼和弗氏芫全佐刑的混 合乳化劑;每隔一周加強免疫一次,第2和3周加弗氏不完全佐劑,第4周直接注射重組蛋白 溶液加強免疫。
      [0048] 抗血清的采集:在末次免疫后第五天,摘小鼠眼球采血,收集血液,放置待血清完 全分離,3000rpm離心5分鐘分裝血清,一 80°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0049] (2 )抗血清中特異性抗體的ELI SA檢測 將抗原Emyl62、Emyl62特異性抗原表位小肽(E7-13、E129-139)、I?S用包被液稀釋成5μg/ ml,100μl/孔包被ELISA板,4°C過夜。用洗滌液洗4次后,每孔加入300μl封閉液,37°C封閉 2h。用洗滌液洗4次后,將抗血清(鼠抗CTB-Emy 162抗血清、和鼠抗CTB抗血清)和小鼠陰性血 清倍比稀釋后加入ELISA板,100μΙ/孔,在37°C下孵育60min。用洗滌液洗4次后,加入HRP標(biāo) 記的羊抗鼠 IgG(l :2000),100μ1/孔,在37°C下孵育lh。用洗滌液洗4次后,加入TMB底物顯色 液,室溫避光反應(yīng)15min,加50μ1終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測定各孔0D45Q值。將OD值大于設(shè) 定的陰性對照OD值的2.1倍的孔對應(yīng)的稀釋度,定為該樣品的效價。
      [0050] 結(jié)果:Emyl62的包被濃度為5μg/ml,通過ELISA檢測,CTB-EMY162亞單位疫苗能夠 產(chǎn)生針對Emyl62抗原的IgG抗體,而PBS免疫組不能產(chǎn)生針對Emyl62抗原的IgG抗體;E7-13及 E129-139包被濃度為5μg/ml,通過ELISA檢測,CTB-EMY162亞單位疫苗能產(chǎn)生針對Emyl62特異 性抗原表位肽E7- 13&E129-139的IgG抗體,而I3BS不能產(chǎn)生針對Emyl62特異性抗原表位肽E7- 13 及已129-139的IgG抗體(圖7,8)。上述結(jié)果說明亞單位疫苗CTB-Emyl62能夠刺激機體產(chǎn)生針對 Emy 162的高滴度特異性抗體,具有很好的免疫原性。
      [0051 ] (3)小鼠脾臟淋巴細胞增殖實驗 將經(jīng)抗原免疫的小鼠脫白處死,泡75%酒精5min后,移入超凈工作臺。用剪刀小心剪開 小鼠的腹部外皮,再剪開小鼠的腹腔,用鑷子取出小鼠脾臟(暗紅色)。在20 ml的無菌小燒 杯中放入4~5 ml EZ-Sep TM Mouse IX淋巴細胞分離液;用鑷子固定尼龍網(wǎng),然后用注射器 活塞輕輕研磨小鼠脾臟,使得分散的單細胞透過尼龍網(wǎng)進入到淋巴細胞分離液中;把懸有 脾臟細胞的分離液立即轉(zhuǎn)移到離心管中,離心前再覆蓋上大約200yl的1640培養(yǎng)基;800 g 離心30 min。離心結(jié)束后淋巴細胞會漂浮上來,在1640覆蓋層下面聚集。用含10%小牛血清 的RPMI-1640培養(yǎng)基制備成一定濃度的細胞懸液(5 X 104/ml)。在96孔平底培養(yǎng)板中,每孔 加入100μΙ細胞,同時加入CTB-Emy 162、E7-13、E129-139、PBS(20μg/ml),終體積為200μ1/孔,每 組做3個平行孔。將加好的96孔平底培養(yǎng)板放置37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后,向各孔中 加入MTT溶液(5mg/ml)30μ1,繼續(xù)培養(yǎng)4h后,輕輕吸出上清,每孔加入DMSO 100μΙ振蕩混勻 后用酶標(biāo)儀讀取OD570值。
      [0052] 結(jié)果:多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62致敏過的小鼠脾臟淋巴細胞,gCTB- Emyl62、E7-i3、E129-139刺激均均能夠發(fā)生明顯的淋巴細胞增殖反應(yīng),而PBS免疫組的小鼠脾臟 淋巴細胞接受上述抗原刺激時均未發(fā)生淋巴細胞增殖反應(yīng),說明多房棘球蝴亞單位疫苗 CTB-Emyl62保持有其免疫學(xué)特性,能夠刺激機體產(chǎn)生特異性細胞免疫應(yīng)答(圖9)。
      [0053] (4)抗血清中特異性抗體分型的ELISA檢測 將抗原Emy 162、PBS用包被液稀釋成5μg/ml,100μΙ/孔包被ELISA板,4°C過夜。用洗滌液 洗4次后,每孔加入300μ1封閉液,37°C封閉2h。用洗滌液洗4次后,將抗血清和小鼠陰性血清 倍比稀釋后加入ELISA板,100μΙ/孔,在37°C下孵育60min。用洗滌液洗4次后,加入HRP標(biāo)記 的羊抗鼠 IgA、IgGI、IgG2a,抗體稀釋液稀釋,稀釋比例(1:2000),100μ1 /孔,在37 °C下孵育 Ih。用洗滌液洗4次后,加入TMB底物顯色液,室溫避光反應(yīng)15min,加50μ1終止液終止反應(yīng)。 用酶標(biāo)儀測定各孔OD 450值。
      [0054] 結(jié)果:如(圖10)所示,PBS免疫對照組相比,多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-EMY162能 夠產(chǎn)生抗Emy 162的I gG I、I gGA和I gG2a抗體。
      【主權(quán)項】
      1. 一種多房棘球蝴亞單位疫苗,其活性成分是一條多肽,主要由霍亂毒素 B亞基(CTB) 和棘球蝴表面抗原Emyl62構(gòu)成,其氨基酸序列如序列1所示。2. 如權(quán)利要求1所述,一種多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62,其核苷酸序列如序列2 所示。3. -種多房棘球蝴表面抗原Emyl62的氨基酸序列如序列3所示。4. 如權(quán)利要求3所述,多房棘球蝴表面抗原Emyl62的核苷酸序列如序列4所示。5. 包含權(quán)利要求2和4中所述的核苷酸序列的表達載體,轉(zhuǎn)基因細胞系及宿主菌。6. 如權(quán)利要求1所述,霍亂毒素 B亞基(CTB)和多房棘球蝴表面抗原Emyl62之間的間隔 序列為DPRVPSS。7. -種多房棘球蝴亞單位疫苗的制備方法,通過基因合成技術(shù)合成多房棘球蝴表面抗 原Emyl62的核苷酸序列,將其融合在霍亂毒素 B亞基(CTB)基因的下游,構(gòu)建含有融合基因 CTB-Emy 162的重組表達載體pET28a-CTB-Emy 162及其重組基因工程菌BL-21 (DE3), 重組基因工程菌株發(fā)酵后,經(jīng)Ni-NTA鎳離子交換層析純化,獲得該疫苗的融合蛋白 CTB-Emy162〇8. 按照權(quán)利要求1和6所述的多房棘球蝴亞單位疫苗,其特征在于能夠激發(fā)機體產(chǎn)生針 對多房棘球蝴T細胞免疫應(yīng)答和有效抑制多房棘球蝴的高滴度特異性抗體。9. 按照權(quán)利要求1和7所述的多房棘球蝴亞單位疫苗,其特征是可以用作預(yù)防和治療多 房棘球蝴感染的藥物組合。
      【文檔編號】C12P21/02GK106075416SQ201610417912
      【公開日】2016年11月9日
      【申請日】2016年6月15日 公開號201610417912.8, CN 106075416 A, CN 106075416A, CN 201610417912, CN-A-106075416, CN106075416 A, CN106075416A, CN201610417912, CN201610417912.8
      【發(fā)明人】樊海寧, 格日力, 陽旦才讓, 湯鋒, 周虎, 李潤樂
      【申請人】青海大學(xué)
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