專利名稱：用于治療前列腺癌的偶聯(lián)物的制作方法
背景技術(shù)：
1994年，預計在美國有200,000位男性被診斷患有前列腺癌，并且有38,000美國男性會死于此疾病(Garnick，M.B.(1994).前列腺癌的難題-《美國科學》(The Dilemmas of Prostate Cancer.ScientificAmerican)，4月72-81)。因此，前列腺癌是美國男性中發(fā)病率最高的惡性腫瘤(除皮膚癌外)并且是與癌癥有關(guān)的死亡率排在第二位的原因(第一位為肺癌)。
前列腺特異性抗原(PSA)是單鏈33 kDa糖蛋白，它幾乎完全由人前列腺上皮產(chǎn)生，在人精液中其濃度為0.5至2.0mg/ml(Nadji，M.，Taber，S.Z.，Castro，A.等，(1981)《癌癥》(Cancer)481229；Papsidero，L.，Kuriyama，M.，Wang，M.等，(1981).JNCI 6637；Qui，S.D.，Young，C.Y.F.，Bihartz，D.L.等，(1990)，《泌尿科學雜志》(J.Urol.)1441550；Wang，M.C.，Valenzuela，L.A.，Murphy，G.P.等，(1979).《泌尿科學研究》(Invest.Urol.)17159)。此單個碳水化合物單元連接在第45號天冬酰胺殘基上并占總分子量的2至3kDa。PSA是具有胰凝乳蛋白酶樣特異性的蛋白酶(Christensson，A.，Laurell，C.B.，Lilja，H.(1990).《歐洲生物化學雜志》(Eur.J.Biochem.)194755-763)?，F(xiàn)已表明，通過對精液誘捕凝膠精液凝膠I(Semenogelin I)、精液凝膠II(Semenogelin II)和纖連蛋白中主要代表的蛋白水解作用，PSA主要負責射精時形成的凝膠結(jié)構(gòu)的分解(Lilja，H.(1985).《臨床研究雜志》(J.Clin.Invest.)761899；Lilja，H.，Oldbring，J.，Rannevik，G.等，(1987).《臨床研究雜志》(J.Clin.Invest.)80281；McGee，R.S.，Herr，J.C.(1988).《生物生殖》(Biol.Reprod.)39499)。對凝膠形成蛋白的PSA介導的蛋白水解產(chǎn)生幾種可溶解的精液凝膠I和精液凝膠II片段和可溶解的纖連蛋白片段，同時將精液液化并釋放有活力的精子(Lilja，H.，Laurell，C.B.(1984).《斯堪的納維亞臨床實驗室研究雜志》(Scand.J.Clin.Lab.Invest.)44447；McGee，R.S.，Herr，J.C.(1987).《生物生殖》(Biol.Reprod.)37431)。此外，PSA可以蛋白水解的方式降解IGFBP-3(胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3)使IGF特異性刺激PSA分泌細胞的生長(Cohen等，(1992)《臨床內(nèi)分泌學和超生物學雜志》(J.Clin.Endo.& Meta.)751046-1053)。
與α1-抗凝乳蛋白酶復合的PSA是血清PSA的主要分子形式并可能占被檢測血清PSA的95％或95％以下(Christensson，A.，Bjork，T.，Nilsson，O.等，(1993).《泌尿科學雜志》(J.Urol.)150100-105；Lilja，H.，Christensson，A.，Dahlen，U.(1991).《臨床化學》(Clin.Chem.) 371618-1625；Stenman，U.H.，Leinoven，J.，Alfthan，H.等，(1991).《癌癥研究》(Cancer Res.)51222-226)。推斷前列腺組織(正常、良性增生或惡性組織)主要釋放成熟的、具有酶活性的PSA，因為此形式是與α1-抗凝乳蛋白酶復合物需要的(Mast，A.E.，Enghild，J.J.，Pizzo，S.V.等，(1991).《生物化學》(Biochemistry)301723-1730；Perlmutter，D.H.，Glover，G.I.，Rivetna，M.等，(1990).《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)873753-3757)。因此，確信在前列腺PSA分泌細胞的微環(huán)境中，在其成熟的具有酶活性的形式而不是與任何抑制分子復合的形式處理并分泌PSA。PSA還與α2-巨球蛋白形成穩(wěn)定的復合物，但是作為在PSA包封和PSA表位完全缺失的結(jié)果，此復合物形成在體內(nèi)的顯著性尚不清楚。游離的、非復合形式的PSA構(gòu)成了血清PSA的一小部分(Christensson，A.，Bjork，T.，Nilsson，O.等，(1993).《泌尿科學雜志》(J.Urol.)150100-105；Lilja，H.，Christensson，A.，Dahlen，U.(1991).《臨床化學》(Clin.Chem.)371618-1625)。在血清PSA中的此形式與其在精液PSA中的形式相似(Lilja，H.，Christensson，A.，Dahlen，U.(1991).《臨床化學》(Clin.Chem.)371618-1625)，但是還不知道血清PSA的游離形式可能是酶原、成熟PSA的內(nèi)在裂解的滅活形式、還是具有酶活性的PSA。然而，與檢測的PSA游離33kDa形式的血清濃度比較，它似乎與表現(xiàn)有酶活性的血清PSA的游離形式不同，因為其中有摩爾量過量很大(100至1000倍)的未反應α1-抗凝乳蛋白酶和α2-巨球蛋白(Christensson，A.，Bjork，T.，Nilsson，O.等，(1993).《泌尿科學雜志》(J.Urol.)150100-105；Lilja，H.，Christensson，A.，Dahlen，U.(1991).《臨床化學》(Clin.Chem.)371618-1625)。
PSA的血清檢測有利于監(jiān)控前列腺腺癌的治療(Duffy，M.S.(1989).《臨床生物化學年鑒》(Ann.Clin.Biochem.)26379-387；Brawer，M.K.和Lange，P.H.(1989).《泌尿科學增刊》(Urol.Suppl.)511-16；Hara，M.和Kimura，H.(1989).《臨床實驗室藥物雜志》(J.Lab.Clin.Med.)113541-548)，雖然上述正常血清濃度的PSA也見于良性前列腺增生和前列腺手術(shù)創(chuàng)傷后(Lilja，H.，Christensson，A.，Dahlen，U.(1991).(Clin.Chem)371618-1625)。由于在表現(xiàn)有廣泛轉(zhuǎn)移前列腺癌的前列腺切除患者體內(nèi)檢測到高濃度的血清PSA，故還已知前列腺轉(zhuǎn)移瘤分泌具有免疫活性的PSA(Ford，T.F.，Butcher，D.N.，Masters，R.W.等，(1985).《英國泌尿科學雜志》(Brit.J.Urology)5750-55)。因此，可被PSA蛋白水解活性滅活的細胞毒化合物可能是前列腺細胞特異性和分泌PSA的前列腺轉(zhuǎn)移瘤特異性的。
本發(fā)明的目的是提供新的、用于治療前列腺癌的抗癌組合物，其中含有寡肽，該寡肽被游離的前列腺特異性抗原(PSA)以選擇性蛋白水解的方式裂解，并且其中包括一種環(huán)氨基酸，該氨基酸具有親水取代基，并與細胞毒試劑軛合。
本發(fā)明的另一目的是提供治療前列腺癌的方法，包括使用此新的抗癌組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明公開了含有寡肽和已知細胞毒試劑的化學偶聯(lián)物，其中寡肽被游離的前列腺特異性抗原(PSA)以選擇性蛋白水解的方式裂解，并且其中包括一種環(huán)氨基酸，該氨基酸具有親水取代基。這種偶聯(lián)物可用于治療前列腺癌和良性前列腺增生(BPH)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于治療前列腺癌的、新的抗癌組合物。這種組合物含有與細胞毒試劑直接共價鍵合或通過化學連接劑鍵合的寡肽。該寡肽選自被游離前列腺特異性抗原(PSA)選擇性識別的并通過此游離前列腺特異性抗原的酶活性以蛋白水解的方式裂解的寡聚體。寡肽和細胞毒試劑的如此結(jié)合可命名為偶聯(lián)物。
本發(fā)明的偶聯(lián)物的特征還在于將帶有親水取代基的環(huán)氨基酸作為一部分加入該寡肽中，所述環(huán)氨基酸對此偶聯(lián)物的水溶性有貢獻。這種親水環(huán)氨基酸的例子包括但不限于羥基化的、多羥基化的及烷氧基化的脯氨酸和2-哌啶酸部分。
理想的是，當此含有PSA蛋白水解裂解位點的寡肽與細胞毒試劑直接鍵合或通過化學連接劑鍵合而完整時，此細胞毒試劑的細胞毒活性大大降低或消失。同樣理想的是，當鍵合的寡肽在裂解位點被蛋白水解裂解時，該細胞毒試劑的細胞毒活性顯著增加或回到未修飾的細胞毒試劑原來的細胞毒活性。
此外，優(yōu)選此寡肽選自與游離的具有酶活性的PSA存在下寡肽裂解相比，在非PSA蛋白水解酶存在下不裂解或以非常低的速率裂解的寡肽。
基于上述原因，要求此寡肽含有短的肽序列，優(yōu)選少于10個氨基酸。最優(yōu)選此寡肽含有7個或6個氨基酸。因為此接合物優(yōu)選含有短的氨基酸序列，故通常細胞毒試劑組份的疏水性可能對此偶聯(lián)物的溶解度影響極大。因此，選擇本偶聯(lián)物的環(huán)氨基酸上的親水取代基來抵消或減小細胞毒試劑帶來的這種疏水性。
雖然對實施本發(fā)明的此方面內(nèi)容不是必需的，但是本發(fā)明優(yōu)選的實施方案是偶聯(lián)物，其中寡肽和化學連接劑(如果存在)通過游離PSA的蛋白水解活性及附近組織存在的任何天然蛋白水解酶的蛋白水解活性與細胞毒試劑分離，因此使細胞毒試劑、或仍是寡肽/連接劑單元的一部分但是保留細胞毒作用的細胞毒試劑進入蛋白水解裂解的生理環(huán)境。還包括此偶聯(lián)物的藥用鹽。
應理解與細胞毒試劑軛合的此寡肽，不論通過直接共價鍵合或通過化學連接劑，不需要是被游離PSA最大限度識別并最易被游離PSA蛋白水解裂解的寡肽。因此，選擇加入這種抗癌組合物中的此寡肽時，要考慮其被游離PSA選擇性蛋白水解裂解和由這類裂解產(chǎn)生的細胞毒試劑-蛋白水解殘基偶聯(lián)物的細胞毒活性(或?qū)ξ葱揎椉毎驹噭﹣碚f理想的情況)。與蛋白水解PSA裂解有關(guān)的術(shù)語“選擇性”指相對于含隨機序列氨基酸的寡肽來說，游離PSA對本發(fā)明的寡肽組份的裂解速率大得多。因此，本發(fā)明的寡肽組份是游離PSA的優(yōu)選底物。術(shù)語“選擇性”還指此寡肽被游離PSA在此寡肽的兩個特定氨基酸之間以蛋白水解的方式裂解。
本發(fā)明的此寡肽組份被游離前列腺特異性抗原(PSA)選擇性識別并被此游離前列腺特異性抗原的酶活性蛋白水解裂解。這些寡肽包括選自如下的寡聚體
a)HaaXaaSerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.1)；b)HaaTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.2)；c)HaaXaaLysTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.3)；d)HaaXaaLysTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.4)；e)HaaXaahArgTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.5)；f)HaaXaahArgChaGln|SerSer (SEQ.ID.NO.6)；g)HaaXaaSerTyrGln|SerXaa (SEQ.ID.NO.7)；h)HaaTyrGln|SerXaa (SEQ.ID.NO.8)；i)HaaXaaSerChgGln|SerXaa (SEQ.ID.NO.9)；j)HaaChgGln|SerXaa (SEQ.ID.NO.10)；其中Haa是被親水部分取代的環(huán)氨基酸，Xaa是任何氨基酸，hArg是高精氨酸，Cha是環(huán)己基丙氨酸而Chg是環(huán)己基甘氨酸。
在本發(fā)明的一個實施方案中，此寡肽包括選自如下的寡聚體a)HaaTyrGln|SerSerSerLeu (SEQ.ID.NO.11)，
b)HaaXaaSerTyrGln|SerAla (SEQ.ID.NO.12)，c)AlaHaaXaaSerTyrTyr|Ser (SEQ.ID.NO.13)，d)AlaAsnHaaXaaSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.14)，e)HaaXaaSerTyrGln|SerSerThr (SEQ.ID.NO.15)，f)HaaTyrGln|SerSerThr (SEQ.ID.NO.16)，g)HaaXaaSerTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.17)，h)HaaTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.18)，i)HaaXaaLysTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.19)，j)HaaXaahArgTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.20)，k)HaaXaaSerTyrGln|SerSerLeu (SEQ.ID.NO.21)；l)HaaTyrGln|SerSerLeu (SEQ.ID.NO.22)；m)HaaXaaSerTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.23)；n)HaaTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.24)；p)HaaXaaSerTyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.25)；q)HaaTyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.26)；r)HaaXaaSerTyrGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.27)；s)HaaTyrGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.28)；
t)HaaXaaSerChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.29)；u)HaaChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.30)；v)HaaXaaSerChgGln|SerNle (SEQ.ID.NO.31)；w)HaaChgGln|SerNle (SEQ.ID.NO.32)；x)HaaXaaSerChgGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.33)；y)HaaChgGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.34)；z)hArgChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.35)；andaa)hArgTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.36).在本發(fā)明的更優(yōu)選的實施方案中，此寡肽包括選自如下的寡聚體
a)4-HypXaaSerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.37)，b)4-HypXaaSerTrGln|SerAla (SEQ.ID.NO.38)，c)Ala-4-HypXaaSerTyrTyr|Ser (SEQ.ID.NO.39)，d)AlaAsn4-HypXaaSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.40)，e)4-HypXaaSerTyrGln|SerSerThr (SEQ.ID.NO.41)，f)4-HypTyrGln|SerSerThr (SEQ.ID.NO.42)，g)4-HypXaaSerTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.43)，h)4-HypTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.44)，
i)4-HypXaaLysTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.45)，j)4-HypXaahArgTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.46)，k)4-HypXaaSerTyrGln|SerSerLeu (SEQ.ID.NO.47)；l)4-HypTyrGln|SerSerLeu (SEQ.ID.NO.48)；m)4-HypXaaSerTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.49)；n)4-HypTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.50)；p)4-HypXaaSerTyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.51)；q)4-HypTyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.52)；r)4-HypXaaSerTyrGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.53)；s)4-HypTyrGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.54)；t)4-HypXaaSerChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.55)；u)4-HypChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.56)；v)4-HypXaaSerChgGln|SerNle (SEQ.ID.NO.57)；w)4-HypChgGln|SerNle (SEQ.ID.NO.58)；x)4-HypXaaSerChgGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.59)；y)4-HypChgGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.60)；
其中4-Hyp是4-羥基脯氨酸，Xaa是任何氨基酸，hArg是高精氨酸，Cha是環(huán)己基丙氨酸而Chg是環(huán)己基甘氨酸。
在更優(yōu)選的實施方案中，優(yōu)選Xaa選自Ala、Ser和Ile。
上文及本發(fā)明詳述中使用的術(shù)語“含氨基酸序列的寡聚體”描述了含約3至約100個氨基酸殘基的寡聚體，在其氨基酸序列中包括所述特異性氨基酸序列并因此被游離的PSA在所述氨基酸序列內(nèi)以蛋白水解的方式被裂解。優(yōu)選此寡聚體含有5至10個氨基酸殘基。因此，例如，下面的寡聚體hArgSer4-HypChgGln|SerLeu(SEQ.ID.NO61)；含有氨基酸序列4-HypChgGln|SerLeu(SEQ.ID.NO56)；并因此包括在本發(fā)明中。
肽化學領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會容易地鑒別生物活性寡肽中的某種氨基酸可被其它同系的、同配的和/或等電子的氨基酸取代，其中原寡肽的生物活性在修飾的寡肽中得到保留。某些非天然的和經(jīng)修飾的天然氨基酸也可用來代替本發(fā)明寡肽中的相應天然氨基酸。因此，例如，酪氨酸可被3-碘代酪氨酸、2-甲基酪氨酸、3-氟酪氨酸、3-甲基酪氨酸等代替。在如賴氨酸可以被N′-(2-咪唑基)賴氨酸等代替。下表中氨基酸替換只是舉例而非限制原氨基酸替換氨基酸AlaGlyArgLys，鳥氨酸AsnGlnAspGlu
Glu AspGln AsnGly AlaIle Val，Leu，Met，NleLeu Ile，Val，Met，NleLys Arg，鳥氨酸Met Leu，Ile，Nle，Val鳥氨酸 Lys，ArgPhe Tyr，TrpSer ThrThr SerTrp Phe，TyrTyr Phe，TrpVal Leu，Ile，Met，Nle因此，例如，下列寡肽可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)合成并當加入本發(fā)明偶聯(lián)物時預計被游離PSA以蛋白水解的方式裂解Asn4-HypIleSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.62)Asn4-HypValSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.63)4-HypAlaSerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.64)(3，4-二羥脯氨酸)AlaSerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.65)3-羥脯氨酸 SerChgGln|Ser (SEQ.ID.NO.66)4-HypAlaSerChgGln|SerSer (SEQ.ID.NO.67).
氨基酸序列中包括的符號“|”表示此寡肽被游離PSA以蛋白水解的方式裂解在該序列中的位置。
本發(fā)明的化合物可具有不對稱中心并存在外消旋體、外消旋混合物和單個非對映異構(gòu)體，所有可能的異構(gòu)體、包括旋光異構(gòu)體均包括在本發(fā)明中。除非特別說明，將所謂氨基酸理解為天然“L”立體構(gòu)型。
本說明書中使用的縮寫如下，此表指出了氨基酸和其部分hR或hArg 高精氨酸hY或hTyr 高酪氨酸
Cha 環(huán)己基丙氨酸Amf 4-氨基甲基苯丙氨酸DPL 2-(4，6-二甲基嘧啶基)賴氨酸(咪唑基)K N′-(2-咪唑基)賴氨酸Me2PO3-Y O-二甲基磷酸酪氨酸O-Me-Y O-甲基酪氨酸TIC 1，2，3，4-四氫-3-異喹啉甲酸DAP 1，3-二氨基丙烷TFA 三氟乙酸AA 乙酸3PAL3-吡啶基丙氨酸4-Hyp 4-羥基脯氨酸Abu α-氨基丁酸Thi 噻吩基丙氨酸本領(lǐng)域熟知，并在本發(fā)明中可理解，如本發(fā)明寡肽-細胞毒試劑偶聯(lián)物的肽基治療劑優(yōu)選任何寡肽取代基的末端氨基部分被適宜的保護基保護，例如，乙酰基、苯甲?；?、新戊?；?。對末端氨基的這種保護降低或消除了此肽基治療劑由于溫血動物血漿中存在的氨基肽酶作用而發(fā)生的酶降解。
這種保護基還包括親水保護基團，根據(jù)親水官能度的存在對其進行選擇。增加此偶聯(lián)物親水性并因此增加此偶聯(lián)物的水溶性的保護基包括但不限于羥基化的鏈烷?；?、多羥基化的鏈烷?；?、羥基化的芳?；?、多羥基化的芳酰基、聚乙二醇、糖基化物(glycosylate)、糖和冠醚。N-末端非天然氨基酸部分也可通過氨基肽酶改善這種酶降解。
優(yōu)選N-末端保護基選自a)乙?；?；
其中R1和R2獨立地選自a)氫原子，b)未被取代或取代的芳基、未被取代或取代的雜環(huán)、C3-C10環(huán)烷基、C2-C6鏈烯基、C2-C6鏈炔基、鹵素、C1-C6全氟烷基、R3O-、R3-C(O)NR3-、(R3)2NC(O)-、R32N-C(NR3)-、R4S(O)mNH、CN、NO2、R3C(O)-、N3、-N(R3)2或R4OC(O)NR3-，c)未被取代的C1-C6烷基，d)取代的C1-C6烷基，其中在取代的C1-C6烷基上的取代基選自未被取代或取代的芳基、未被取代或取代的雜環(huán)、C3-C10環(huán)烷基、C2-C6鏈烯基、C2-C6鏈炔基、R3O-、R4S(O)mNH、R3-C(O)NR3、(R3)2NC(O)-、R32N-C(NR3)-、CN、R3C(O)-、N3、-N(R3)2或R4OC(O)NR3-；或R1和R2結(jié)合形成-(CH2)s-，其中一個碳原子被下列部分選擇性地代替O、S(O)m、-NC(O)-、HN和-N(COR4)-；R3選自氫原子、芳基、取代的芳基、雜環(huán)、取代的雜環(huán)、C1-C6烷基和C3-C10環(huán)烷基；R4選自芳基、取代的芳基、雜環(huán)、取代的雜環(huán)、C1-C6烷基和C3-C10環(huán)烷基；m是0、1或2；n是1、2、3或4；p是0或1至100之間的整數(shù)；q是0或1，條件是如果p是0，則q是1；r是1至10之間的整數(shù)；而s是3、4或5。
優(yōu)選r是1、2或3。
本偶聯(lián)物中的寡肽包括被親水部分取代的環(huán)氨基酸，前面用術(shù)語“Haa”表示，還可用下列通式表示
其中R5選自HO-和C1-C6烷氧基；R6選自氫原子、鹵素、C1-C6烷基、HO-和C1-C6烷氧基；且t是3或4。
結(jié)構(gòu)
表示5或6元環(huán)胺部分，此環(huán)胺可選擇性地與苯基或環(huán)己基環(huán)稠合。此環(huán)胺部分的例子包括但不限于下列特定結(jié)構(gòu)
本發(fā)明的偶聯(lián)物可具有不對稱中心，并產(chǎn)生外消旋體、外消旋混合物及單個非對映異構(gòu)體，所有可能的異構(gòu)體，包括旋光異構(gòu)體，包括在本發(fā)明中。當任何取代基發(fā)生不只1次任何變化(例如，芳基、雜環(huán)、R3等)時，每次發(fā)生變化的定義獨立于其它變化。例如，HO(CR1R2)2-表示HOCH2CH2-、HOCH2CH(OH)-、HOCH(CH3)CH(OH)-等。另外，只要該結(jié)合產(chǎn)生穩(wěn)定的化合物，取代基和/或變化形式的結(jié)合是容許的。
在本文中，“烷基”和芳烷基的烷基部分以及類似的術(shù)語旨在包括含特定碳原子數(shù)的直鏈或支鏈飽和脂肪烴基團；“烷氧基”表示通過氧橋連接的指定碳原子數(shù)的烷基。
在本文中，“環(huán)烷基”旨在包括具有特定碳原子數(shù)的非芳香環(huán)烴基。環(huán)烷基的例子包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基等。
“鏈烯基”包括具有特定碳原子數(shù)并具有一個或幾個雙鍵的基團。鏈烯基的例子包括乙烯基、烯丙基、異丙烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、環(huán)丙烯基、環(huán)丁烯基、環(huán)戊烯基、環(huán)己烯基、1-丙烯基、2-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、異戊烯基、法呢基、香葉基、香葉基香葉基等。
“鏈炔基”包括具有特定碳原子數(shù)并具有一個三鍵的基團。鏈炔基的例子包括乙炔基、2-丁炔基、2-戊炔基、3-戊炔基等。
“鹵素”或“鹵原子”在本文中指氟、氯、溴和碘。
在本文中，“芳基”和芳烷基和芳?；姆蓟糠种该總€環(huán)最多含7個原子的任何穩(wěn)定單或雙碳環(huán)，其中至少一個環(huán)是芳族環(huán)。此芳基的例子包括苯基、萘基、四氫萘基、2，3-二氫化茚基、聯(lián)苯基、菲基、蒽基或苊基(acenaphthyl)。
本文中，術(shù)語雜環(huán)或雜環(huán)的表示穩(wěn)定的5至7元單環(huán)或穩(wěn)定的8至11元雙環(huán)雜環(huán)，它們可以是飽和或不飽和的，并由碳原子和選自N、O和S的1至4個雜原子組成，并且包括上述任何雜環(huán)與苯環(huán)稠合組成的任何雙環(huán)。此雜環(huán)可連接在產(chǎn)生穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的任何雜原子或碳原子上。此雜環(huán)的例子包括但不限于吖庚因基、苯并咪唑基、苯并異噁唑基、苯并呋咱基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并二氫吡喃基、1，2-二氮雜萘基、二氫苯并呋喃基、二氫苯并噻吩基、二氫苯并噻喃基、二氫苯并噻喃基砜、呋喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、二氫吲哚基、吲哚基、異苯并二氫吡喃基、異二氫吲哚基、異喹啉基、異噻唑烷基、異噻唑基、異噻唑烷基、嗎啉基、1，5-二氮雜萘基、噁二唑基、2-氧代吖庚因基、噁唑基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吡啶基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑基、噠嗪基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四氫呋喃基、四氫異喹啉基、四氫喹啉基、硫嗎啉基、硫嗎啉基亞砜、噻唑基、噻唑啉基、噻吩并呋喃基、噻吩并噻吩基和噻吩基。
在本文中，術(shù)語“取代的C1-C8烷基”、“取代的芳基”和“取代的雜環(huán)”包括除與該化合物其余部分連接的位點外還含1至3個取代基的部分。這些取代基選自氟、氯、溴、CF3、NH2、N(C1-C6烷基)2、硝基、氰基、(C1-C6烷基)O-、羥基、(C1-C6烷基)S(O)m-、(C1-C6烷基)C(O)NH-、H2N-C(NH)-、(C1-C6烷基)C(O)-、(C1-C6烷基)OC(O)-、N3、(C1-C6烷基)OC(O)NH-和C1-C20烷基。
術(shù)語“1至10之間的整數(shù)”表示數(shù)字1和10以及在它們之間的整數(shù)。術(shù)語“1至100之間的整數(shù)”表示數(shù)字1和100以及在它們之間的整數(shù)。
當R1和R2結(jié)合形成-(CH2)s-時，所定義的環(huán)部分或含雜原子的環(huán)部分包括但不限于
在本文中，術(shù)語“PEG”表示具有指定數(shù)目的乙烯氧基亞單元的含取代基的某種聚乙二醇。因此，術(shù)語PEG(2)表示
而術(shù)語PEG(6)表示
在本文中，術(shù)語“(2R)(2，3-二羥基丙?；?”表示下列結(jié)構(gòu)
在本文中，術(shù)語“(2R，3S)2，3，4-三羥基丁?；北硎鞠旅娴慕Y(jié)構(gòu)
因為本發(fā)明的偶聯(lián)物可用來修飾已知的生物反應，因此細胞毒試劑并不解釋限定為經(jīng)典化學治療劑。例如，此細胞毒試劑可以是具有所需生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。這些蛋白質(zhì)可包括，例如，毒素如紅豆因、蓖麻毒A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板衍生因子、組織纖溶酶原激活物；或生物反應修飾劑如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生長因子。
一般來說，優(yōu)選的細胞毒試劑包括烷化劑、抗繁殖劑、微管蛋白結(jié)合劑等。細胞毒試劑優(yōu)選的種類包括，例如，蒽環(huán)類藥物、長春花屬藥物、絲裂霉素類、博萊霉素類、細胞毒核苷、紫杉烷類、蝶啶類藥物、二炔類(diynenes)和鬼臼毒素類。特別優(yōu)選的類型包括，例如，阿霉素、洋紅霉素、柔紅酶素、氨基蝶呤、甲氨蝶呤、甲基葉酸、二氯甲氨蝶呤、絲裂霉素C、紫菜霉素、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、阿糖胞苷、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物如依托泊苷或依托泊苷磷酸鹽、馬法蘭、長春堿、長春新堿、異長春堿、長春地辛、環(huán)氧長春堿、紫杉醇等。其它可利用的細胞毒試劑包括雌莫司汀、順鉑和環(huán)磷酰胺。本領(lǐng)域技術(shù)人員可對所需細胞毒試劑進行化學修飾以便該化合物的反應更便于制備本發(fā)明偶聯(lián)物的目的。
高度優(yōu)選的本發(fā)明的細胞毒試劑包括下列通式的藥物通式(1)的甲氨蝶呤組
其中R12是氨基或羥基；R7是氫原子或甲基；R8是氫原子、氟、氯、溴或碘；R9是羥基或形成羧酸鹽的部分；通式(2)的絲裂霉素組
其中R10是氫原子或甲基；通式(3)的博萊霉素組
其中R11是羥基、氨基、C1-C3烷氨基、二(C1-C3烷基)氨基、C4-C6聚亞甲基氨基、
或
通式(4)的馬法蘭
通式(5)的6-巰基嘌呤
通式(6)的阿糖胞苷
通式(7)的鬼臼毒素或其磷酸鹽
其中R13是氫原子或甲基；R14是甲基或噻吩基；通式(8)的長春花屬生物堿組
其中R15是H、CH3或CHO；當R17和R18各自獨立時，R18是H，且R16和R17之一是乙基而另一個是H或OH；當R17和R18與它們連接的碳原子連接在一起時，它們形成環(huán)氧乙烷環(huán)，此時R16是乙基；R19是氫原子、(C1-C3烷基)-CO或氯代(C1-C3烷基)-CO；通式(9)的二氟核苷
其中R21是下列通式的基團之一
其中R22是氫原子、甲基、溴、氟、氯或碘；R23是-OH或-NH2；
R24是氫原子、溴、氯或碘；或者通式(10)的蒽環(huán)類抗生素
其中Ra是-CH3、-CH2OH、-CH2OCO(CH2)3CH3或-CH2OCOCH(OC2H5)2；Rb是-OCH3、-OH或-H；Rc是-NH2、-NHCOCF3、4-嗎啉基、3-氰基-4-嗎啉基、1-哌啶基、4-甲氧基-1-哌啶基、芐胺、二芐基胺、氰基甲基胺或1-氰基-2-甲氧基乙胺；Rd是-OH、-OTHP或-H；而Re是-OH或-H，條件是當R5是-OH或-OTHP時R6不是-OH。
雌莫司汀(11)
環(huán)磷酰胺(12)
最優(yōu)選的藥物為上述通式(10)的蒽環(huán)抗生素。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得此結(jié)構(gòu)式包括作為藥物的化合物，或藥物的衍生物，在本領(lǐng)域它們已獲得了不同的通用名和俗名。下表1表示了一些蒽環(huán)藥物及其通用名或俗名，它們特別優(yōu)選用于本發(fā)明。
表1
化合物 RaRbRcRdRe柔紅霉素a CH3OCH3NH2OHH阿霉素b CH2OHOCH3NH2OHH地托比星CH2OCOCH(OC2H5)2OCH3NH2OHH詳紅霉素CH3OH NH2OHH伊達比星CH3HNH2OHH表柔比星CH2OHOCH3NH2OHOH依索比星CH2OHOCH3NH2H HTHP CH2OHOCH3NH2OTHP HAD-32 CH2OCO(CH2)3CH3OCH3NHCOCF3OHHa″“道諾霉素”是柔紅霉素的另一名稱。b″“亞德里亞霉素”是阿霉素的另一名稱。
表1所示的化合物中，最優(yōu)選的細胞毒試劑是阿霉素、長春堿和去乙酰基長春堿。阿霉素(本文中也稱為“DOX”)屬于通式(10)的蒽環(huán)類，其中Ra是-CH2OH、Rb是-OCH3、Rc是-NH2、Rd是-OH而Re是-H。
其中細胞毒試劑優(yōu)選阿霉素的、用如下通式(I)描述的、本發(fā)明的寡肽-細胞毒試劑偶聯(lián)物或其藥用鹽
其中寡肽是被游離前列腺特異性抗原(PSA)選擇性識別并能被游離前列腺特異性抗原的酶活性以蛋白水解的方式裂解的寡肽，其中該寡肽包括下列通式的環(huán)氨基酸
并且其中C末端羰基與阿霉素的氨基以共價鍵的方式連接；R選自如下a)氫原子b)-(C＝O)R1a，
R1和R2獨立地選自氫原子、OH、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6芳烷基和芳基；R1a是C1-C6烷基、羥基化芳基、多羥基化芳基或芳基；R5選自HO-和C1-C6烷氧基；R6選自氫原子、鹵素、C1-C6烷基、HO-和C1-C6烷氧基；并且n是1、2、3或4；p是0或1至100之間的整數(shù)；q是0或1，條件是如果p是0，則q是1；r是1至10之間的整數(shù)；而t是3或4。
在寡肽-細胞毒試劑偶聯(lián)物或其旋光異構(gòu)體或其藥用鹽的優(yōu)選實施方案中環(huán)氨基酸是
R選自如下a)氫原子，b)-(C＝O)R1a，
R1和R2獨立地選自氫原子、C1-C6烷基和芳基；R1a是C1-C6烷基或芳基，n是1、2、3或4；n′是0、1、2或3；p是0或1至14之間的整數(shù)；q是0或1，條件是如果p是0，則q是1；r是1至10之間的整數(shù)；而t是3。下列化合物是本發(fā)明的寡肽-細胞毒試劑偶聯(lián)物的特別實例
其中X是
細胞毒試劑優(yōu)選長春堿和去乙酰基長春堿的、用如下通式II描述的、本發(fā)明的寡肽-細胞毒試劑偶聯(lián)物或其藥用鹽
其中寡肽是被游離前列腺特異性抗原(PSA)選擇性識別并能被游離前列腺特異性抗原的酶活性以蛋白水解的方式裂解的寡肽，且該寡肽包括下列通式的環(huán)氨基酸
XL是-NH-(CH2)u-NH-，R選自如下a)氫原子b)-(C＝O)R1a，
R1和R2獨立地選自氫原子、OH、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6芳烷基和芳基；R1a是C1-C6烷基、羥基化芳基、多羥基化芳基或芳基；
R19是氫原子、(C1-C3烷基)-CO或氯取代的(C1-C3烷基)-CO；n是1、2、3或4；p是0或1至100之間的整數(shù)；q是0或1，條件是如果p是0，則q是1；r是1、2或3；t是3或4；u是1、2、3、4或5。
細胞毒試劑優(yōu)選長春堿和去乙?；L春堿的、用如下通式III描述的、本發(fā)明的寡肽-細胞毒試劑偶聯(lián)物或其藥用鹽的另一種實施方案
其中寡肽是被游離前列腺特異性抗原(PSA)選擇性識別并能被游離前列腺特異性抗原的酶活性以蛋白水解的方式裂解的寡肽，且該寡肽包括下列通式的環(huán)氨基酸
Rg和Rh獨立地選自氫原子、C1-C6烷基、C1-C6烷基-OH、-C1-C6烷基-二-OH、-C1-C6烷基-三-OH和
條件是Rd和Re中至少一個不是氫原子或C1-C6烷基，或者Rg和Rh聯(lián)合形成-CH2CH2OCH2CH2-雙游離基；R19是氫原子、(C1-C3烷基)-CO或氯取代的(C1-C3烷基)-CO；p是0或1至100之間的整數(shù)；q是0或1，條件是如果p是0，則q是1。
下列化合物或其旋光異構(gòu)體或其藥用鹽是本發(fā)明的寡肽-去乙?；L春堿偶聯(lián)物的特別實例
本發(fā)明的寡肽、肽亞單位和肽衍生物(也稱為“肽”)可通過常規(guī)肽合成技術(shù)由它們的組成氨基酸合成，優(yōu)選通過固相技術(shù)。然后通過反相高效液相色譜(HPLC)將這些肽純化。
例如，肽合成的標準方法描述于下列著述中Schroeder等，“《肽》(The Peptides)”，Vol.I，Academic Press 1965；Bodansky等，“《肽合成》(Peptides Synthesis)”，Interscience Publishers，1966；McOmie(編輯.)“《有機化學中的保護基》(Protective GroupsinOrganic Chemistry)”，Plenum Press，1973；Barany等，《肽分析、合成、生物學》(The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology)2，第一章，Academic Press，1980和Stewart等，《固相肽合成》(Solid Phase Peptide Synthesis)，第二版，Pierce ChemicalCompany，1984。將這些著述中的描述在此引為參考。
適宜取代的環(huán)氨基酸帶有親水取代基，可將它們通過標準肽合成技術(shù)加入到本偶聯(lián)物中，其本身也可商購或通過本領(lǐng)域熟知技術(shù)或本文中描述的技術(shù)容易地合成。因此，適宜取代的脯氨酸的合成描述于下列文章并將其引為參考J.Ezquerra等，《有機化學雜志》(J.Org.Chem.)，602925-2930(1995)；P.Gill和W.D.Lubell，《有機化學雜志》J.Org.Chem.，602658-2659(1995)和M.W.Holladay等，《藥物化學雜志》(J.Med.Chem.)，34457-461(1991)。將這些著述中的描述在此引為參考。
本發(fā)明化合物的藥用鹽包括常規(guī)無毒鹽，該鹽由本發(fā)明化合物與如無毒無機或有機酸形成。例如，這些常規(guī)無毒鹽包括得自無機酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的鹽；以及由有機酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、雙羥萘酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水楊酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富馬酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸、草酸、羥乙磺酸、三氟乙酸等制備的鹽。
含有具有PSA裂解位點的寡肽和細胞毒試劑的本發(fā)明的偶聯(lián)物可通過藥物化學領(lǐng)域熟知的技術(shù)類似地合成。例如，可將細胞毒試劑的游離胺部分與寡肽的羧基末端共價連接形成酰胺鍵。同樣，通過將寡肽的胺部分與細胞毒試劑的羧基部分共價偶合可形成酰胺鍵。為了這些目的，可單獨或聯(lián)合使用試劑如六氟磷酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，3，3-四甲基脲鹽(稱為HBTU)、1-羥基苯并三唑水合物(稱為HOBT)、二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)、N-乙基-N-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺(EDC)、二苯基膦?；B氮化物(DPPA)、苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)六氟磷酸鏻(BOP)等。
此外，本發(fā)明的偶聯(lián)物可通過PSA裂解位點和細胞毒試劑之間的非肽鍵形成。例如，此細胞毒試劑可通過細胞毒試劑上的羥基部分與寡肽的羧基末端共價連接，由此形成酯連接。為此，可使用試劑如HBTU和HOBT的混合物、BOP和咪唑的混合物、DCC和DMAP的混合物等。此羧酸也可通過形成硝基苯酯等而活化并在DBU(1，8-二氮雜二環(huán)[5，4，0]十一碳-7-烯)存在下反應。
本發(fā)明的偶聯(lián)物也可通過連接劑單元將此寡肽連接到細胞毒試劑上。此連接劑單元包括，例如，二羰基烷基雙游離基，其中此細胞毒試劑的胺部分與連接劑單元連接形成酰胺鍵而此寡肽的氨基末端與此連接劑單元的另一端連接形成酰胺鍵。相反，也可使用二氨基烷基雙游離基連接劑單元，其中此細胞毒試劑的羰基部分與此連接劑單元的一個胺共價連接而此連接劑單元的另一個胺與此寡肽的C末端共價連接。也可預想出當不存在游離PSA時對生理環(huán)境穩(wěn)定，但是在PSA蛋白水解裂解位點可裂解其它這樣的連接劑單元。此外，可使用PSA蛋白水解裂解位點裂解時仍保留在此細胞毒試劑上，但與未修飾的細胞毒試劑相比不顯著降低此裂解后細胞毒試劑衍生物的細胞毒活性的連接劑單元。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解本發(fā)明化合物的合成中，可能需要保護起始化合物和中間體的多種反應官能團，同時該分子的其它部分進行所需的反應。在所需反應完成后，或在任何需要的時間，一般通過，例如，水解或氫解方法將這樣的保護基除去。此保護和脫保護步驟是有機化學中常規(guī)方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可參照《有機化學中的保護基》，McOmie，編輯，Plenum Press，NY，NY(1973)和《有機合成中的保護基》，Greene，編輯，John Wiley & Sons，NY，NY(1981)中有關(guān)保護基的描述。這些描述可用于本發(fā)明化合物的制備。
例如，可利用的氨基保護基可包括，例如，C1-C10烷酰基如甲?；?、乙?；?、二氯乙?；⒈；?、己?；?、3，3-二乙基己?；ⅵ?氯代丁?；?；C1-C10烷氧基羰基和C5-C15芳氧基羰基如叔丁氧基羰基、芐氧基羰基、烯丙氧基羰基、4-硝基芐氧基羰基、芴基甲氧基羰基和肉桂酰氧基羰基；鹵代-(C1-C10)-烷氧基羰基如2，2，2-三氯乙氧基羰基；以及C1-C15芳烷基和鏈烯基如芐基、苯乙基、烯丙基、三苯甲游基等。其它通常使用的氨基保護基為由β-酮基酯如乙?；宜峒柞セ蛞阴ブ苽涞南┌返男问健?br> 可利用的羧基保護基可包括，例如，C1-C10烷基如甲基、叔丁基、癸基；鹵代-C1-C10烷基如2，2，2-三氯乙基和2-碘代乙基；C5-C15芳烷基如芐基、4-甲氧基芐基、4-硝基芐基、三苯基甲基、二苯基甲基；C1-C10烷酰氧基甲基如乙酰氧基甲基、丙酰氧基甲基等；以及基團如苯甲酰甲基、4-鹵代苯甲酰甲基、烯丙基、二甲基烯丙基、三(C1-C3烷基)甲硅烷基如三甲基甲硅烷基、β-對甲苯磺酰基乙基、β-對硝基苯硫基乙基、2，4，6-三甲基芐基、β-甲硫基乙基、苯二甲酰亞氨基甲基、2，4-二硝基-苯基亞磺?；?、2-硝基二苯甲基和相關(guān)基團。
同樣，可利用的羥基保護基可包括，例如，甲?；?、氯乙?；⑵S基、二苯甲基、三苯甲游基、4-硝基芐基、三甲硅烷基、苯甲酰甲基、叔丁基、甲氧基甲基、四氫吡喃基等。
針對寡肽與蒽環(huán)抗生素阿霉素結(jié)合的優(yōu)選實施方案，下面的反應方案說明了本發(fā)明偶聯(lián)物的合成。
反應方案I
反應方案II
反應方案III
反應方案IV
反應方案V
反應方案VI說明了用于本發(fā)明治療方法中的偶聯(lián)物的制備，其中此寡肽與長春花屬生物堿細胞毒試劑長春堿結(jié)合。說明了此寡肽的N末端與長春堿的連接(S.P.Kandukuri等，《藥物化學雜志》(J.Med.Chem.)，281079-1088(1985))。
反應方案VII說明了本發(fā)明的寡肽和長春花屬生物堿細胞毒試劑長春堿的偶聯(lián)物的制備，其中將此長春堿連接在此寡肽的C末端。使用1，3-二氨基丙烷連接劑僅用于說明；也可預想出在長春堿的羰基和寡肽的C末端之間的其它空間連接劑單元。此外，方案VII說明了偶聯(lián)物的合成，其中C-4-位羥基部分在加入連接劑單元后又被乙?；?。申請人已發(fā)現(xiàn)去乙?；L春堿偶聯(lián)物也是有效的并可通過除去反應方案VII中保護伯胺連接劑并將此中間體與乙酸酐反應的步驟，然后將此胺脫保護而制備。寡肽的其它位置和長春堿官能團的軛合可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地完成并也預期地提供了用于治療前列腺癌的化合物。
還應理解可制備這樣的偶聯(lián)物，其中用于本發(fā)明治療方法的、含帶有親水取代基的環(huán)氨基酸的寡肽的N末端與一種細胞毒試劑如長春堿結(jié)合，而C末端同時連接另一種相同或不同的細胞毒試劑如阿霉素。反應方案VIII描述了這種多細胞毒試劑偶聯(lián)物的合成。這種多細胞毒試劑偶聯(lián)物可較僅含一種細胞毒試劑的偶聯(lián)物具有某些優(yōu)點。
反應方案VI
反應方案VI(續(xù))
其中R是-NH2、-O-烷基等反應方案VII
反應方案VII(續(xù))
反應方案VIII
反應方案VIII(續(xù))
本發(fā)明的寡肽-細胞毒試劑偶聯(lián)物給患者以藥物組合物的形式使用，該組合物含有本發(fā)明的偶聯(lián)物和藥用載體、賦形劑或稀釋劑。在本文中，“藥用”指用于治療或診斷溫血動物包括，例如，人、馬、豬、牛、鼠、犬、貓或其它哺乳動物，以及鳥類或其它溫血動物的試劑。優(yōu)選的給藥方式是非腸道給藥，特別是靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或淋巴管內(nèi)給藥。可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的載體、稀釋劑或賦形劑制備這些制劑。在這方面，參見，例如，《Remington′s藥物學》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，16版，1980，MackPublishing Company，Osol等主編。這些組合物中可含有蛋白質(zhì)如血清蛋白質(zhì)，例如，人血清白蛋白，緩沖液或緩沖物質(zhì)如磷酸鹽或其它鹽，或電解質(zhì)等。適宜的稀釋劑包括，例如，滅菌水、等滲鹽水、稀葡萄糖水溶液、多元醇或這些醇的混合物，例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等。該組合物可含有防腐劑如苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯或丙酯、乙基汞硫代水楊酸鈉等。如果需要，此組合物可含有約0.05至約0.20％(重量)的抗氧化劑如次焦亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉。
在本文中，術(shù)語“組合物”包括含特定量的特定組份的產(chǎn)品，以及直接或間接由特定量的特定組份混合后得到的任何產(chǎn)品。
對于靜脈內(nèi)給藥，優(yōu)選此組合物制備成給患者的使用量為約0.01至約1g偶聯(lián)物的形式。優(yōu)選此偶聯(lián)物的給藥量為約0.2至約1g。根據(jù)多種因素如所治療的疾病狀態(tài)、要改良的生物作用、此偶聯(lián)物的給藥方式、患者的年齡、體重和狀況以及主治醫(yī)生確定的其它因素，本發(fā)明的偶聯(lián)物在很寬的劑量范圍內(nèi)是有效的。因此，對任何患者的給藥量必需按照具體情況確定。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會領(lǐng)會到雖然下列實施例中給出了特定試劑和反應條件，但是可對其進行改進，這些改進在本發(fā)明的實質(zhì)和范圍內(nèi)。因此，下列制備例和實施例只是進一步說明本發(fā)明，而不是對其進行限制。
實施例實施例1含有PSA介導的裂解位點的寡肽的制備在Applied Biosystems 430A型全自動肽合成儀中，用雙偶合方法引入氨基酸，通過固相合成制備保護的寡肽。用液體氫氟酸處理達到由樹脂支持物上將此寡肽脫保護并除去的目的。通過制備高壓液相色譜在反相C18硅膠柱上用0.1％三氟乙酸水溶液/乙腈梯度洗脫純化此寡肽。通過氨基酸組成分析、高壓液相色譜和快速原子轟擊質(zhì)譜分析確定寡肽的同一性和均一性。通過此方法制備的寡肽見表2。
表2
4-反式-L-Hyp是反式-4-羥基-L-脯氨酸脫氫-Pro是3，4-脫氫-L-脯氨酸實施例2被游離PSA識別的寡肽的評估將實施例1制備的寡肽單個溶解于PSA消化緩沖液(12mM三(羥甲基)氨基甲烷pH8.0、25mM氯化鈉、0.5mM氯化鈣)并將此溶液以摩爾比100比1加入到PSA中?；蛘?，所用PSA消化緩沖液是50mM三(羥甲基)-氨基甲烷pH7.4、140mM氯化鈉。不同的反應時間后通過加入三氟乙酸(TFA)達到最終濃度1％(體積/體積)停止該反應?；蛘哂?0mm氯化鋅停止該反應。在反相C18柱上用0.1％TFA/乙腈梯度洗脫通過HPLC分析停止的反應。評估結(jié)果見表2。表2表明利用具有酶活性的游離PSA裂解50％所述寡肽需要的時間(分鐘)。含游離胺部分(即含hArg、Orn、Lys和/或3PAL)的寡肽以TFA鹽的形式測定。所有其它寡肽以中性化合物的形式檢測。
實施例3制備[N-Ac-(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox(SEQ.ID.NO.68)
步驟A[N-Ac-(4-反式-L-Hyp(Bzl))]-Ala-Ser(Bzl)Chg-Gln-Ser(Bzl)Leu-PAM樹脂(3-1)以0.5mmol(0.67g)Boc-Leu-PAM樹脂開始，在430A ABI肽合成儀中合成被保護的肽。此方法中使用4倍過量(2mmol)的下列各個被保護的氨基酸Boc-Ser(Bzl)、Boc-Gln、Boc-Chg、Boc-Ala、N-Boc-(4-反式-L-Hyp(Bzl))。用DCC和HOBT在甲基-2-吡咯烷酮中活化達到偶合。用乙酸引入N末端乙?；Ｓ?0％TFA在二氯甲烷中除去Boc基并用二異丙基乙胺中和TFA鹽。合成完畢時，將該肽樹脂干燥得到中間體3-1。
步驟B[N-Ac-(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-OH(3-2)將1.2g被保護的肽樹脂(3-1)用HF(20ml)在0℃在苯甲醚(2ml)的存在下處理1小時。將HF蒸發(fā)后，用乙醚洗滌此殘余物，過濾并用水(200ml)萃取。將此濾液凍干得到中間體3-2。
步驟C[N-Ac-(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox將1.157g(1.45mmol)上述中間體(3-2)溶解于DMSO(30ml)中并用DMF(30ml)稀釋。向此溶液中加入鹽酸阿霉素516mg(0.89mmol)，然后加入0.310ml二異丙基乙胺(1.78mmol)。將此攪拌的溶液冷卻(0℃)并加入0.276ml二苯基磷酰基疊氮化物(1.28mmol)。30分鐘后，再加入0.276ml(1.28mmol)DPPA并用二異丙基乙胺(DIEA)將pH調(diào)節(jié)至約7.5(pH試紙)。隨后的3小時內(nèi)，用DIEA將此冷卻的反應(0℃)的pH維持在約7.5并在0-4℃將此反應攪拌過夜。18小時后，將此反應(通過分析用HPLC，系統(tǒng)A發(fā)現(xiàn)反應完全)濃縮為油狀物。將此得到的粗品通過制備HPLC純化，緩沖液A＝0.1％乙酸銨-水；B＝乙腈。將此粗品溶解于400ml 100％A緩沖液中，過濾并在C-18反相HPLC徑向壓縮柱(Waters，Delta-Pak，15μM，100埃)上純化。用梯度100％A至60％A以75ml/分鐘(UV＝214nm)流速洗脫。收集均勻的產(chǎn)物餾份(通過HPLC，系統(tǒng)A評價)并凍干。將此產(chǎn)物溶解于水(300ml)中，過濾并凍干得到純化的標題化合物。HPLC條件，系統(tǒng)A柱Vydac 15cm # 218TP5415，C18洗脫劑 梯度95∶5(A∶B)至5∶95(A∶B)，洗脫45分鐘A＝0.1％TFA/水，B＝0.1％TFA/乙腈流速1.5ml/分鐘波長214nM，254nM保留時間阿霉素＝13.66分鐘Ac-Hyp-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-OH＝10.8分鐘Ac-Hyp-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox＝18.2分鐘物理性質(zhì)步驟C的產(chǎn)物的理化性質(zhì)如下分子式 C62H85N9O23分子量 1323.6高分辨ES質(zhì)譜1341.7(NH4+)HPLC系統(tǒng)A柱Vydac 15cm#218TP5415，C18洗脫劑梯度95∶5(A∶B)至5∶95(A∶B)，洗脫45分鐘A＝0.1％TFA/水，B＝0.1％TFA/乙腈流速 1.5ml/分鐘波長 214nM，254nM保留時間18.2分鐘氨基酸組分分析1理論值 實測值A(chǔ)la(1) 1.00Ser(2) 1.88Chg(1) 0.91Gln2(1)1.00(為Glu)Hyp(1) 0.80Leu(1) 1.01肽含量0.657μmol/mg注120小時，100℃，6N HCl2Gln轉(zhuǎn)變?yōu)镚lu表3說明了通過實施例3描述的方法但是用適當氨基酸殘基和保護基團?；苽涞钠渌?阿霉素偶聯(lián)物。
表3
<p>實施例4制備[N-戊二酰基-(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox(SEQ.ID.NO.71)
步驟A[N-戊二?；?OFm)-(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-PAM樹脂以0.5mmol(0.67g)Boc-Leu-PAM樹脂開始，在430A ABI肽合成儀中合成被保護的肽。此方法中使用4倍過量(2mmol)的下列各個被保護的氨基酸Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Chg、Fmoc-Ala、Boc-(4-反式-L-Hyp)。用DCC和HOBT在甲基-2-吡咯烷酮中活化達到偶合。用中間體戊二酸單芴基甲基酯[戊二?；?OFm)]引入N末端戊二?；?。用20％哌啶除去Fmoc基。用50％TFA在二氯甲烷中除去對酸敏感的保護基Boc、Trth和tBu。用二異丙基乙胺中和TFA鹽。合成完畢時，將該肽樹脂干燥得到標題化合物。
步驟B[N-戊二?；?OFm)-(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-OH將1.2g步驟A的被保護的樹脂用HF(20ml)在0℃在苯甲醚(2ml)的存在下處理1小時。將HF蒸發(fā)后，用乙醚洗滌此殘余物，過濾并用DMF萃取。將此DMF濾液(75ml)濃縮至干并用水研制。濾出不溶的產(chǎn)物并干燥得到標題化合物。
步驟C[N-戊二?；?OFm)-(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox將來自步驟B的上述制備的中間體(1.33g，1.27mmol)溶解于DMSO(6ml)和DMF(69ml)中。向此溶液中加入鹽酸阿霉素599mg(1.03mmol)，然后加入376μl二異丙基乙胺(2.16mmol)。將此攪拌的溶液冷卻(0℃)并加入324μl二苯基磷?；B氮化物(1.5mmol)。30分鐘后，再加入324μl DPPA并用二異丙基乙胺(DIEA)將pH調(diào)節(jié)至約7.5(pH試紙)。隨后的3小時內(nèi)，用DIEA將此冷卻的反應(0℃)的pH維持在約7.5并在0-4℃將此反應攪拌過夜。18小時后，將此反應(通過分析用HPLC，系統(tǒng)A發(fā)現(xiàn)反應完全)濃縮得到標題化合物，為油狀物。
步驟D[N-戊二?；?(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox將步驟C制備的上述產(chǎn)物溶解于DMF(54ml)中，冷卻至0℃并加入14ml哌啶。將此溶液濃縮至干并通過制備HPLC純化(A＝0.1％乙酸銨-水；B＝乙腈)。將此粗品溶解于100ml 80％A緩沖液中，過濾并在C-18反相HPLC徑向壓縮柱(Waters，Delta-Pak，15μM，100埃)上純化。用梯度80％A至67％A以75ml/分鐘(UV＝214nm)流速洗脫。收集均勻的產(chǎn)物餾份(通過HPLC，系統(tǒng)A評價)并凍干。將此產(chǎn)物用上述HPLC柱進一步純化。緩沖液A＝15％乙酸-水；B＝15％乙酸-甲醇。將此產(chǎn)物溶解于100ml 20％B/80％A緩沖液中并純化。用梯度20％B至80％B以75ml/分鐘(UV＝260nm)流速洗脫。收集均勻的產(chǎn)物餾份(通過HPLC，系統(tǒng)A評價)、濃縮并從水中凍干得到純標題化合物。HPLC條件，系統(tǒng)A柱Vydac 15cm#218TP5415，C18洗脫劑梯度95∶5(A∶B)至5∶95(A∶B)，洗脫45分鐘A＝0.1％TFA/水，B＝0.1％TFA/乙腈流速 1.5ml/分鐘波長 214nM，254nM保留時間阿霉素＝13.66分鐘[N-戊二酰基(OFm)-(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-OH＝19.66分鐘[N-戊二?；?OFm)-(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox＝24.8分鐘[N-戊二?；?(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox＝18.3分鐘高分辨ES質(zhì)譜1418.78(Na+)HPLC系統(tǒng)A柱 Vydac 15cm#218TP5415，C18洗脫劑 梯度95∶5(A∶B)至5∶95(A∶B)，洗脫45分鐘A＝0.1％TFA/水，B＝0.1％TFA/乙腈流速1.5ml/分鐘波長214nM，254nM保留時間18.3分鐘氨基酸組分分析1理論值實測值A(chǔ)la(1) 0.99Ser(2) 2.02Chg(1) 1.00Gln2(1) 1.01(為Glu)Hyp(1) 0.99Leu(1) 1.00肽含量 0.682μmol/mg注120小時，100℃，6N HCl2Gln轉(zhuǎn)變?yōu)镚lu表4說明了通過實施例4描述的方法但是用適當氨基酸殘基和保護基團?；苽涞钠渌?阿霉素偶聯(lián)物。
表4
<p>實施例5制備(4-反式-L-Hyp)-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox(SEQ.ID.NO.70)
步驟AFmoc-(4-反式-L-Hyp(Bzl))-Ala-Ser(Bzl)Chg-Gln-Ser(Bzl)Leu-PAM樹脂以0.5mmol(0.67g)Boc-Leu-PAM樹脂開始，在430A ABI肽合成儀中合成被保護的肽。此方法中使用4倍過量(2mmol)的下列各個被保護的氨基酸Boc-Ser(Bzl)、Boc-Gln、Boc-Chg、Boc-Ala、N-Boc-(4-反式-L-Hyp(Bzl))。用DCC和HOBT在甲基-2-吡咯烷酮中活化達到偶合。用Fmoc-OSu(Fmoc的琥珀?；?引入N末端保護基。用50％TFA在二氯甲烷中除去Boc基。用二異丙基乙胺中和TFA鹽。合成完畢時，將該肽樹脂干燥得到標題中間體。
步驟BFmoc-(4-反式-L-Hyp)-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-OH將1.1g步驟A的被保護的肽樹脂用HF(20ml)在0℃在苯甲醚(2ml)的存在下處理1小時。將HF蒸發(fā)后，用乙醚洗滌此殘余物，過濾并用水(200ml)萃取。將此濾液凍干得到標題中間體。
步驟CFmoc-(4-反式-L-Hyp)-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox將上述步驟B的中間體0.274g溶解于DMSO(10ml)并用DMF(10ml)稀釋。向此溶液中加入鹽酸阿霉素104mg，然后加入62μl二異丙基乙胺。將此攪拌的溶液冷卻(0℃)并加入56μl二苯基磷酰基疊氮化物。30分鐘后，再加入56μl DPPA并用二異丙基乙胺(DIEA)將pH調(diào)節(jié)至約7.5(pH試紙)。用DIEA將此冷卻的反應(0℃)的pH維持在約7.5。4小時后，將此反應(通過分析用HPLC，系統(tǒng)A發(fā)現(xiàn)反應完全)濃縮為油狀物。HPLC條件，系統(tǒng)A步驟D(4-反式-L-Hyp)-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox將步驟C制備的上述產(chǎn)物溶解于DMF(10ml)中，冷卻至0℃并加入4ml哌啶。將此溶液濃縮至干并通過制備HPLC純化(A＝0.1％乙酸銨-水；B＝乙腈)。將此粗品溶解于100ml 90％A緩沖液中，過濾并在C-18反相HPLC徑向壓縮柱(Waters，Delta-Pak，15μM，100埃)上純化。用梯度90％A至65％A以75ml/分鐘(UV＝214nm)流速洗脫。收集均勻的產(chǎn)物餾份(通過HPLC，系統(tǒng)A評價)并凍干。
HPLC條件，系統(tǒng)A柱 Vydac 15cm#218TP5415，C18洗脫劑 梯度95∶5(A∶B)至5∶95(A∶B)，洗脫45分鐘A＝0.1％TFA/水，B＝0.1％TFA/乙腈流速1.5ml/分鐘波長214nM，254nM保留時間阿霉素＝13.66分鐘Fmoc-(4-反式-L-Hyp)-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-OH＝18.6分鐘Fmoc-(4-反式-L-Hyp)-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox＝23.8分鐘(4-反式-L-Hyp)-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox＝17.6分鐘分子式C62H83N9O22分子量1281.56
高分辨ES質(zhì)譜1282.59(MH+)HPLC系統(tǒng)A柱 Vydac 15cm#218TP5415，C18洗脫劑 梯度95∶5(A∶B)至5∶95(A∶B)，洗脫45分鐘A＝0.1％TFA/水，B＝0.1％TFA/乙腈流速1.5ml/分鐘波長214nM，254nM保留時間17.6分鐘氨基酸組分分析1理論值實測值A(chǔ)la(1) 1.00Ser(2) 1.94Chg(1) 0.94Gln2(1) 1.05(為Glu)Hyp(1) 0.96Leu(1) 1.03肽含量 0.690μmol/mg注120小時，100℃，6N HCl2Gln轉(zhuǎn)變?yōu)镚lu實施例6對游離PSA識別寡肽-阿霉素偶聯(lián)物的評價將實施例3-5制備的偶聯(lián)物分別溶解于PSA消化緩沖液中(12mM三(羥甲基)-氨基甲烷pH8.0，25mM氯化鈉，0.5mM氯化鈣)并將此溶液以100比1的摩爾比加入到PSA中。或者，所用PSA消化緩沖液是50mM三(羥甲基)-氨基甲烷pH7.4、140mM氯化鈉。不同的反應時間后通過加入三氟乙酸(TFA)達到最終濃度1％(體積/體積)停止該反應?；蛘哂?0mm氯化鋅停止該反應。在反相C18柱上用0.1％TFA/乙腈梯度洗脫通過HPLC分析停止的反應。評估結(jié)果見表3。表3表明利用具有酶活性的游離PSA裂解50％所述寡肽細胞毒試劑偶聯(lián)物需要的時間(分鐘)。如果未指出是偶聯(lián)物的鹽，則用游離偶聯(lián)物作試驗。對實施例4和5中所述的寡肽-細胞毒試劑偶聯(lián)物評價利用具有酶活性的游離PSA裂解50％所述寡肽需要的時間(分鐘)，且這些偶聯(lián)物50％裂解需要的時間少于2小時。
實施例7阿霉素肽基衍生物細胞毒性體外試驗用Alamar Blue試驗，評價按照實施例3和4所述制備的裂解的寡肽-阿霉素偶聯(lián)物對已知被未修飾阿霉素殺傷的細胞系的細胞毒性。具體地講，將LNCap前列腺腫瘤細胞的細胞培養(yǎng)物(它們表達有具有酶活性的PSA)或DuPRO細胞在96孔板中用含不同濃度的給定偶聯(lián)物的培養(yǎng)基(Dulbecco′s極限必需培養(yǎng)基-α[MEM-α])稀釋(最終板孔體積為200μl)。將這些細胞在37℃培養(yǎng)3天，向試驗孔中加入20μl AlamarBlue。將這些孔進一步孵育并將此試驗板在EL-310 ELISA讀數(shù)器在加入Alamar Blue后4和7小時在雙波長570和600nm讀數(shù)。然后計算被測偶聯(lián)物不同濃度與對照(無偶聯(lián)物)培養(yǎng)物的相對百分率變化。此評價的一些結(jié)果見表5。如果未指出是鹽，則檢測的是游離偶聯(lián)物。
表5
實施例8肽基-細胞毒試劑偶聯(lián)物的體內(nèi)效果將LNCaP.FGC或DuPRO-1細胞進行胰蛋白酶消化，再懸浮于生長培養(yǎng)基中并以200×g離心6分鐘。將這些細胞再懸浮于無血清的MEM-α中并計數(shù)。然后將含所需數(shù)量細胞的適當體積的此溶液轉(zhuǎn)移至圓錐形離心管中，離心并再懸浮于適當體積的冷的MEM-αMatrigel(Collaborative Biomedical Products，New Bedford，Mass)的1∶1混合物中。將此懸浮液保持在冰上直到給動物接種。
不麻醉將Harlan Sprague Dawley雄性裸鼠(10-12周齡)關(guān)養(yǎng)并在其左肋通過用22號針皮下注射用0.5ml細胞懸浮液接種。小鼠使用約5×105 DuPRO細胞或1.5×107 LNCaP.FGC細胞。
用如下兩種方案之一治療用腫瘤細胞接種后的小鼠方案A細胞接種后第一天，通過腹膜內(nèi)給動物使用0.1至0.5ml的被測偶聯(lián)物、阿霉素或載體對照(無菌水)。偶聯(lián)物和阿霉素的起始劑量為非致死量最大值，但隨后可降低用量。5天內(nèi)以24小時為一周期使用相同的劑量。10天后，從小鼠中采集血樣并檢測血清的PSA水平。在5-10天內(nèi)檢測到相似的血清PSA水平。在第5.5周結(jié)束時將小鼠處死并稱量存在的任何腫瘤的重量并再次檢測血清PSA水平。在試驗開始和結(jié)束稱量動物的體重。
方案B細胞接種后第10天，從動物中采集血樣并檢測血清PSA水平。然后根據(jù)它們的PSA血清水平給動物分組。在細胞接種后第14-15天，通過腹膜內(nèi)給動物使用0.1至0.5ml體積的被測偶聯(lián)物、阿霉素和載體對照(無菌水)。偶聯(lián)物和阿霉素的起始劑量為非致死量最大值，但隨后可降低用量。5天內(nèi)以24小時為一周期使用相同的劑量。在5-10天內(nèi)檢測到相似的血清PSA水平。在第5.5周結(jié)束時將小鼠處死并稱量存在的任何腫瘤的重量并再次檢測血清PSA水平。在試驗開始和結(jié)束稱量動物的體重。
方案C細胞接種后第一天，通過腹膜內(nèi)給動物使用0.1至0.5ml的被測偶聯(lián)物、阿霉素或載體對照(無菌水)。偶聯(lián)物和阿霉素的起始劑量為非致死量最大值，但隨后可降低用量。連續(xù)5周內(nèi)以7天為一周期使用相同的劑量。在處死小鼠之前或之時立即檢測血清PSA水平。在第5.5周結(jié)束時將小鼠處死并稱量存在的任何腫瘤的重量。在試驗開始和結(jié)束稱量動物的體重。
實施例9
內(nèi)源性非PSA蛋白酶對偶聯(lián)物蛋白水解裂解的體外測定步驟A制備蛋白水解組織提取物所有步驟在4℃進行。將適宜的動物處死并分離出相關(guān)的組織并保存在液氮中。將冷凍組織用研缽和研杵粉碎并將此粉碎的組織轉(zhuǎn)移至Potter-Elvejeh均漿器中并加入2體積的緩沖液A(50mM Tris，其中含1.15％氯化鉀，pH 7.5)。然后將此組織用研杵搗20個來回，先松散地搗，然后再緊密地搗。將此均漿以10000×g在水平式超離心頭(HB4-5)中離心，棄去沉淀并將此上清液以100000×g(Ti70)離心。保存上清液(胞質(zhì)溶膠)。
將此沉淀再懸浮于緩沖液B(10mM EDTA，其中含1.15％氯化鉀，pH7.5)，使用的體積與上述緩沖液A相同。將此懸浮液在杜恩斯均漿器中均漿化并將此溶液以100000×g離心。棄去上清液并將沉淀(膜)再懸浮于緩沖液C(10mM磷酸鉀緩沖液，其中含0.25M蔗糖，pH 7.4)，用上述體積的1/2，并用杜恩斯均漿器均漿化。
用Bradford試驗測定兩種溶液(胞質(zhì)溶膠和膜)的蛋白質(zhì)含量。然后將試驗的等份試樣移出并在液氮中冷凍。在-70℃保存此等份試樣。
步驟B蛋白水解裂解試驗對每個時間點，將20微克的肽-阿霉素偶聯(lián)物和如步驟A所述制備的并通過Bradfod在反應緩沖液中檢測的150微克的組織蛋白置于終體積200微升緩沖液(50mm TRIS，140mM氯化鈉，pH 7.2)的溶液中。在0、30、60、120和180分鐘檢測反應，然后立即在沸水中保持90秒以停止反應。通過HPLC用VYDAC C18 15cm柱在水/乙腈(5％至50％乙腈，在30分鐘內(nèi))中分析反應產(chǎn)物。
序列表(1)一般信息(i)申請人Garsky，Victor M.Feng，Dong-MeiDeFeo-Jones，Deborah(ii)發(fā)明名稱用于治療前列腺癌的偶聯(lián)物(iii)序列數(shù)97(iv)相應地址(A)地址Merck &amp; Co.，Inc.(B)街道P.0.Box 2000，126 E.Lincoln Ave.(C)城市Rahway(D) 州NJ(E)國家USA(F)郵編07065-0900(v)計算機可讀形式(A)媒體類型磁盤(B)計算機IBM兼容機(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQ Windows 2.0版(vi)當前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類號(vii)優(yōu)先權(quán)申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?0/029,224(B)申請日1996年10月30日(A)申請?zhí)?0/042,921(B)申請日1997年4月4日(viii)律師/代理人資料(A)姓名Muthard，David A(B)注冊號35,297(C)參考/登記號19821Y(ix)通信資料(A)電話908-594-3903(B)遠程電傳908-594-4720(C)電傳(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息被親水部分取代的環(huán)氨基酸(xi)序列描述SEQ ID NO1Xaa Xaa Ser Tyr Gln Ser Ser1 5(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息被親水部分取代的環(huán)氨基酸(xi)序列描述SEQ ID NO2Xaa Tyr Gln Ser Ser1 5(2)SEQ ID 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NO46的信息(i)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置3...3(D)其它信息高精氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO46Pro Xaa Xaa Tyr Gln Ser Ser Ser1 5(2)SEQ ID NO47的信息(i)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息4-羥基脯氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO47Pro Xaa Ser Tyr Gln Ser Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO48的信息(i)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息4-羥基脯氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO48Pro Tyr Gln Ser Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO49的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息4-羥基脯氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO49Pro Xaa Ser Tyr Gln Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO50的信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息4-羥基脯氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO50Pro Tyr Gln Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO51的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置7...7(D)其它信息正亮氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO51Pro Xaa Ser Tyr Gln Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO52的信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置5...5(D)其它信息正亮氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO52Pro Tyr Gln Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO53的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置7...7(D)其它信息1，2，3，4-四氫異喹啉-3-甲酸(xi)序列描述SEQ ID NO53Pro Xaa Ser Tyr Gln Ser Xaa1 5(2)SEQ ID NO54的信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置5...5(D)其它信息1，2，3，4-四氫異喹啉-3-甲酸(xi)序列描述SEQ ID NO54Pro Tyr Gln Ser Xaa1 5(2)SEQ ID NO55的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO55Pro Xaa Ser Xaa Gln Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO56的信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置2...2(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO56Pro Xaa Gln Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO57的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置7...7(D)其它信息正亮氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO57Pro Xaa Ser Xaa Gln Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO58的信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置2...2(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置5...5(D)其它信息正亮氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO58Pro Xaa Gln Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO59的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置7...7(D)其它信息1，2，3，4-四氫異喹啉-3-甲酸(xi)序列描述SEQ ID NO59Pro Xaa Ser Xaa Gln Ser Xaa1 5(2)SEQ ID NO60的信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置2...2(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置5...5(D)其它信息1，2，3，4-四氫異喹啉-3-甲酸(xi)序列描述SEQ ID NO60Pro Xaa Gln Ser Xaa1 5(2)SEQ ID NO61的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息高精氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置3...3(D)其它信息4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO61Xaa Ser Pro Xaa Gln Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO62的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置2...2(D)其它信息4-羥基脯氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO62Asn Pro Ile Ser Tyr Gln Ser1 5(2)SEQ ID NO63的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置2...2(D)其它信息4-羥基脯氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO63Asn Pro Val Ser Tyr Gln Ser1 5(2)SEQ ID NO64的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息4-羥基脯氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO64Pro Ala Ser Tyr Gln Ser Ser1 5(2)SEQ ID NO65的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息3，4-二羥基脯氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO65Xaa Ala Ser Tyr Gln Ser Ser1 5(2)SEQ ID NO66的信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息3-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置3...3(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO66Xaa Ser Xaa Gln Ser1 5(2)SEQ ID NO67的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO67Pro Ala Ser Xaa Gln Ser Ser1 5(2)SEQ ID NO68的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-乙?；?4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO68Xaa Ala Ser Xaa Gln Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO69的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-琥珀?；?4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO69Xaa Ala Ser Xaa Gln Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO70的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO70Pro Ala Ser Xaa Gln Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO71的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-戊二酰基-4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO71Xaa Ala Ser Xaa Gln Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO72的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-乙?；?3，4-二羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO72Xaa Ala Ser Xaa Gln Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO73的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-(PEG-2)-4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO73Xaa Ala Ser Xaa Gln Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO74的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-乙酰基-4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置7...7(D)其它信息2-氨基-4，4-二甲基丙酸(xi)序列描述SEQ ID NO74Xaa Ala Ser Xaa Gln Ser Xaa1 5(2)SEQ ID NO75的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-琥珀?；?4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO75Xaa Ala Ser Xaa Gln Ser Val1 5(2)SEQ ID NO76的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-戊二?；?4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO76Xaa Ala Ser Xaa Gln Ser Val1 5(2)SEQ ID NO77的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-戊二?；?4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO77Xaa Ala Ser Xaa Gln Ser Ile1 5(2)SEQ ID NO78的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-琥珀?；?4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO78Xaa Ser Ser Xaa Gln Ser Ile1 5(2)SEQ ID NO79的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-琥珀酰基-4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO79Xaa Ala Ser Xaa Gln Ser Ile1 5(2)SEQ ID NO80的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-琥珀?；?4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置7...7(D)其它信息2-氨基丁酸(xi)序列描述SEQ ID NO80Xaa Ala Ser Xaa Gln Ser Xaa15(2)SEQ ID NO81的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-戊二?；?4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO81Xaa Ser Ser Xaa Gln Ser Ile1 5(2)SEQ ID NO82的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-戊二?；?4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO82Xaa Ser Ser Xaa Gln Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO83的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-(PEG-2)-4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO83Xaa Ser Ser Xaa Gln Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO84的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-琥珀?；?4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置7...7(D)其它信息噻吩丙氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO84Xaa Ala Ser Xaa Gln Ser Xaa1 5(2)SEQ ID NO85的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-(PEG-4)-4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO85Xaa Ser Ser Xaa Gln Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO86的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-(PEG-4)-4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置7...7(D)其它信息噻吩丙氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO86Xaa Ala Ser Xaa Gln Ser Xaa1 5(2)SEQ ID NO87的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-琥珀?；?3，4-二羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO87Xaa Ala Ser Xaa Gln Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO88的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-丙二?；?4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO88Xaa Ala Ser Xaa Gln Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO89的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-乙?；彼?A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO89Xaa Ser Ser Xaa Gln Ser Val1 5(2)SEQ ID NO90的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-乙酰基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO90Xaa Ala Ser Xaa Gln Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO91的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-乙?；?3，4-脫氫脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO91Xaa Ala Ser Xaa Gln Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO92的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-乙?；?4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置2...2(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO92Xaa Xaa Gln Ser Ser Ser Leu1 5(2)SEQ ID NO93的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-乙酰基-4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置7...7(D)其它信息噻吩丙氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO93Xaa Ala Ser Xaa Gln Ser Xaa1 5(2)SEQ ID NO94的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-乙?；?4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置7...7(D)其它信息1，2，3，4-四氫異喹啉-3-甲酸(xi)序列描述SEQ ID NO94Xaa Ala Ser Xaa Gln Ser Xaa1 5(2)SEQ ID NO95的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息N-(羥基乙?；?-4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸(xi)序列描述SEQ ID NO95Xaa Ala Ser Xaa Gln Ser Val1 5(2)SEQ ID NO96的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/要點其它(B)位置1...1(D)其它信息4-羥基脯氨酸(A)名稱/要點其它(B)位置4...4(D)其它信息環(huán)己基甘氨酸
權(quán)利要求
1.用于治療前列腺癌的偶聯(lián)物或其藥用鹽，其中含有連接在寡肽上的細胞毒試劑，其中該寡肽含有被游離前列腺特異性抗原以選擇性蛋白水解的方式裂解的氨基酸序列，而其中連接方式是共價鍵或通過化學連接劑，所述氨基酸序列含有最少一個環(huán)氨基酸，該氨基酸帶有親水取代基。
2.權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其中細胞毒試劑選自如下一些類型的細胞毒試劑或其藥用鹽a)蒽環(huán)類藥物，b)長春花屬生物堿藥物，c)絲裂霉素類，d)博萊霉素類，e)細胞毒核苷，f)蝶啶類藥物，g)二炔類(diynenes)，h)雌莫司汀i)環(huán)磷酰胺，j)紫杉烷類和k)鬼臼毒素類。
3.權(quán)利要求所述的偶聯(lián)物，其中細胞毒試劑選自如下一些細胞毒試劑或其藥用鹽a)阿霉素，b)洋紅霉素，c)柔紅霉素，d)氨基蝶呤，e)甲氨蝶呤，f)甲基葉酸，g)二氯甲氨蝶呤，h)絲裂霉素C，i)紫菜霉素(porfiromycine)j)5-氟尿嘧啶，k)6-巰基嘌呤，l)阿糖胞苷，m)鬼臼毒素，n)依托泊苷，o)依托泊苷磷酸鹽，p)馬法蘭，q)長春堿，r)長春新堿，s)異長春堿，t)長春地辛，u)雌莫司汀(estramustine)，v)順鉑，w)環(huán)磷酰胺，x)紫杉醇，和y)環(huán)氧長春堿。
4.權(quán)利要求2所述的偶聯(lián)物，其中細胞毒試劑選自阿霉素和長春堿或其細胞毒衍生物。
5.權(quán)利要求2所述的偶聯(lián)物，其中細胞毒試劑是阿霉素或其細胞毒衍生物。
6.權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其中寡肽含有選自如下的寡聚體a)HaaXaaSerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.1)；b)HaaTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.2)；c)HaaXaaLysTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.3)；d)HaaXaaLysTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.4)；e)HaaXaahArgTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.5)；f)HaaXaahArgChaGln|SerSer (SEQ.ID.NO.6)；g)HaaXaaSerTyrGln|SerXaa (SEQ.ID.NO.7)；h)HaaTyrGln|SerXaa (SEQ.ID.NO.8)；i)HaaXaaSerChgGln|SerXaa (SEQ.ID.NO.9)；j)HaaChgGln|SerXaa (SEQ.ID.NO.10)；其中Haa是被親水部分取代的環(huán)氨基酸，Xaa是任何氨基酸，hArg是高精氨酸，Cha是環(huán)己基丙氨酸而Chg是環(huán)己基甘氨酸。
7.權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其中寡肽含有選自如下的寡聚體a)HaaXaaSerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.11)，b)HaaXaaSerTyrGln|SerAla (SEQ.ID.NO.12)，c)AlaHaaXaaSerTyrTyr|Ser (SEQ.ID.NO.13)，d)AlaAsnHaaXaaSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.14)，e)HaaXaaSerTyrGn|SerSerThr (SEQ.ID.NO.15)，f)HaaTyrGln|SerSerThr (SEQ.ID.NO.16)，g)HaaXaaSerTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.17)，h)HaaTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.18)，i)HaaXaaLysTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.19)，j)HaaXaahArgTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.20)，k)HaaXaaSerTyrGln|SerSerLeu (SEQ.ID.NO.21)；l)HaaTyrGln|SerSerLeu (SEQ.ID.NO.22)；m)HaaXaaSerTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.23)；n)HaaTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.24)；p)HaaXaaSerTyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.25)；q)HaaTyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.26)；r)HaaXaaSerTyrGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.27)；s)HaaTyrGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.28)；t)HaaXaaSerChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.29)；u)HaaChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.30)；v)HaaXaaSerChgGln|SerNle (SEQ.ID.NO.31)；w)HaaChgGln|SerNle (SEQ.ID.NO.32)；x)HaaXaaSerChgGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.33)；y)HaaChgGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.34)；z)hArgChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.35)；andaa)hArgTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.36).
8.權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其中寡肽含有選自如下的寡聚體a)4-HypXaaSerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.37)，b)4-HypXaaSerTyrGln|SerAla (SEQ.ID.NO.38)，c)Ala4-HypXaaSerTyrTyr|Ser (SEQ.ID.NO.39)，d)AlaAsn4-HypXaaSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.40)，e)4-HypXaaSerTyrGln|SerSerThr (SEQ.ID.NO.41)，f)4-HypTyrGln|SerSerThr (SEQ.ID.NO.42)，g)4-HypXaaSerTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.43)，h)4-HypTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.44)，i)4-HypXaaLysTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.45)，j)4-HypXaahArgTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.46)，k)4-HypXaaSerTyrGln|SerSerLeu (SEQ.ID.NO.47)；l)4-HypTyrGln|SerSerLeu (SEQ.ID.NO.48)；m)4-HypXaaSerTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.49)；n)4-HypTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.50)；p)4-HypXaaSerTyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.51)；q)4-HypTyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.52)；r)4-HypXaaSerTyrGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.53)；s)4-HypTyrGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.54)；t)4-HypXaaSerChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.55)；u)4-HypChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.56)；v)4-HypXaaSerChgGln|SerNle (SEQ.ID.NO.57)；w)4-HypChgGln|SerNle (SEQ.ID.NO.58)；x)4-HypXaaSerChgGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.59)；y)4-HypChgGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.60)；其中4-Hyp是4-羥基脯氨酸，Xaa是任何氨基酸，hArg是高精氨酸，Cha是環(huán)己基丙氨酸而Chg是環(huán)己基甘氨酸.
9.權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其中環(huán)氨基酸帶有的親水取代基選自
其中R5選自HO-和C1-C6烷氧基；R6選自氫原子、鹵素、C1-C6烷基、HO-和C1-C6烷氧基；而t是3或4。
10.用于治療前列腺癌的通式I的偶聯(lián)物或其藥用鹽
其中寡肽是被游離前列腺特異性抗原(PSA)選擇性識別并能被游離前列腺特異性抗原的酶活性以蛋白水解的方式裂解的寡肽，其中該寡肽包括下列通式的環(huán)氨基酸
并且其中C末端羰基與阿霉素的氨基以共價鍵的方式連接；R選自如下a)氫原子b)-(C＝O)R1a，
R1和R2獨立地選自氫原子、OH、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6芳烷基和芳基；R1a是C1-C6烷基、羥基化芳基、多羥基化芳基或芳基；R5選自HO-和C1-C6烷氧基；R6選自氫原子、鹵素、C1-C6烷基、HO-和C1-C6烷氧基；并且n是1、2、3或4；p是0或1至100之間的整數(shù)；q是0或1，條件是如果p是0，則q是1；r是1至10之間的整數(shù)；而t是3或4。
11.權(quán)利要求10所述的偶聯(lián)物或其旋光異構(gòu)體或其藥用鹽其中環(huán)氨基酸是
R選自如下a)氫原子，b)-(C＝O)R1a，
R1和R2獨立地選自氫原子、C1-C6烷基和芳基；R1a是C1-C6烷基或芳基，n是1、2、3或4；n′是0、1、2或3；p是0或1至14之間的整數(shù)；q是0或1，條件是如果p是0，則q是1；r是1至10之間的整數(shù)；t是3。
12.權(quán)利要求10所述的偶聯(lián)物，其中寡肽是含有選自如下氨基酸序列的寡聚體或其旋光異構(gòu)體或其藥用鹽a)4-HypXaaSerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.37)，b)4-HypXaaSerTyrGln|SerAla (SEQ.ID.NO.38)，c)Ala-4-HypXaaSerTyrTyr|Ser (SEQ.ID.NO.39)，d)AlaAsn4-HypXaaSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.40)，e)4-HypXaaSerTyrGln|SerSerThr (SEQ.ID.NO.41)，f)4-HypTyrGln|SerSerThr (SEQ.ID.NO.42)，g)4-HypXaaSerTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.43)，h)4-HypTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.44)，i)4-HypXaaLysTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.45)，j)4-HypXaahArgTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.46)，k)4-HypXaaSerTyrGln|SerSerLeu (SEQ.ID.NO.47)；l)4-HypTyrGln|SerSerLeu (SEQ.ID.NO.48)；m)4-HypXaaSerTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.49)；n)4-HypTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.50)；p)4-HypXaaSerTyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.51)；q)4-HypTyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.52)；r)4-HypXaaSerTyrGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.53)；s)4-HypTyrGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.54)；t)4-HypXaaSerChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.55)；u)4-HypChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.56)；v)4-HypXaaSerChgGln|SerNle (SEQ.ID.NO.57)；w)4-HypChgGln|SerNle (SEQ.ID.NO.58)；x)4-HypXaaSerChgGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.59)；y)4-HypChgGln|SerTIC (SEQ.ID.NO.60)；其中4-Hyp是4-羥基脯氨酸，Xaa是任何氨基酸，hArg是高精氨酸，Cha是環(huán)己基丙氨酸而Chg是環(huán)己基甘氨酸。
13.權(quán)利要求12所述的偶聯(lián)物，其中Xaa是丙氨酸或異亮氨酸。
14.權(quán)利要求10所述的偶聯(lián)物，選自如下
其中X是
或其旋光異構(gòu)體或其藥用鹽。
15.權(quán)利要求10所述的偶聯(lián)物，它們是
或其旋光異構(gòu)體或其藥用鹽。
16.權(quán)利要求10的偶聯(lián)物是[N-Ac-(4-反式-L-Hyp)]-Ala-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu-Dox(SEQ.ID.NO.68)
或其旋光異構(gòu)體或其藥用鹽。
17.權(quán)利要求10的偶聯(lián)物，是
(SEQ.ID.No.71)或其旋光異構(gòu)體或其藥用鹽。
18.權(quán)利要求10的偶聯(lián)物是
(SEQ.ID.No.70)或其旋光異構(gòu)體或其藥用鹽。
19.權(quán)利要求1所述的通式II的偶聯(lián)物或其藥用鹽
其中寡肽是被游離前列腺特異性抗原(PSA)選擇性識別并能被游離前列腺特異性抗原的酶活性以蛋白水解的方式裂解的寡肽，且該寡肽包括下列通式的環(huán)氨基酸
XL是-NH-(CH2)u-NH-，R選自如下a)氫原子b)-(C＝O)R1a，
R1和R2獨立地選自氫原子、OH、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6芳烷基和芳基；R1a是C1-C6烷基、羥基化芳基、多羥基化芳基或芳基；R19是氫原子、(C1-C3烷基)-CO或氯取代的(C1-C3烷基)-CO；n是1、2、3或4；p是0或1至100之間的整數(shù)；q是0或1，條件是如果p是0，則q是1；r是1、2或3；t是3或4；u是1、2、3、4或5。
20.權(quán)利要求16所述的偶聯(lián)物，選自如下
或其藥用鹽或其旋光異構(gòu)體。
21.權(quán)利要求1所述的通式III的偶聯(lián)物或其藥用鹽
其中寡肽是被游離前列腺特異性抗原(PSA)選擇性識別并能被游離前列腺特異性抗原的酶活性以蛋白水解的方式裂解的寡肽，且該寡肽包括下列通式的環(huán)氨基酸
Rg和Rh獨立地選自氫原子、OH、C1-C6烷基、C1-C6烷基-OH、-C1-C6烷基-二-OH、-C1-C6烷基-三-OH和
條件是Rd和Re中至少一個不是氫原子或C1-C6烷基，或者Rg和Rh聯(lián)合形成-CH2CH2OCH2CH2-雙游離基；R19選自氫原子、(C1-C3烷基)-CO或氯取代的(C1-C3烷基)-CO；p是0或1至100之間的整數(shù)；q是0或1，條件是如果p是0，則q是1。
22.權(quán)利要求18所述的偶聯(lián)物是
或其藥用鹽或其旋光異構(gòu)體。
23.含有藥物載體和分散在其中的治療有效量的權(quán)利要求1化合物的藥物組合物。
24.含有藥物載體和分散在其中的治療有效量的權(quán)利要求10化合物的藥物組合物。
25.含有藥物載體和分散在其中的治療有效量的權(quán)利要求14化合物的藥物組合物。
26.含有藥物載體和分散在其中的治療有效量的權(quán)利要求17化合物的藥物組合物。
27.治療前列腺癌的方法，該方法包括給需要的哺乳動物使用治療有效量的權(quán)利要求23的組合物。
28.治療前列腺癌的方法，該方法包括給需要的哺乳動物使用治療有效量的權(quán)利要求24的組合物。
29.治療前列腺癌的方法，該方法包括給需要的哺乳動物使用治療有效量的權(quán)利要求25的組合物。
30.治療前列腺癌的方法，該方法包括給需要的哺乳動物使用治療有效量的權(quán)利要求26的組合物。
31.治療良性前列腺增生的方法，該方法包括給需要的哺乳動物使用治療有效量的權(quán)利要求23的組合物。
32.治療良性前列腺增生的方法，該方法包括給需要的哺乳動物使用治療有效量的權(quán)利要求24的組合物。
33.治療良性前列腺增生的方法，該方法包括給需要的哺乳動物使用治療有效量的權(quán)利要求25的組合物。
34.治療良性前列腺增生的方法，該方法包括給需要的哺乳動物使用治療有效量的權(quán)利要求26的組合物。
35.通過將權(quán)利要求1化合物和藥用載體混合而制備的藥物組合物。
36.藥物組合物的制備方法，包括將權(quán)利要求1所述的化合物與藥用載體混合。
全文摘要
本發(fā)明公開了含有寡肽和已知細胞毒試劑的化學偶聯(lián)物,其中所述的寡肽含被游離前列腺特異性抗原(PSA)以選擇性蛋白水解的方式裂解的氨基酸序列。這些偶聯(lián)物用于治療前列腺癌和良性前列腺增生。
文檔編號C07CGK1242708SQ97181168
公開日2000年1月26日 申請日期1997年10月27日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月30日
發(fā)明者V·M·加斯凱, 馮冬梅, D·德菲奧－瓊斯 申請人:麥克公司