專利名稱：：核酸向組織細(xì)胞中的電轉(zhuǎn)移的制作方法核酸向組織細(xì)胞中的電轉(zhuǎn)移本發(fā)明涉及核酸經(jīng)電介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入組織細(xì)胞、特別是肌肉或腫瘤細(xì)胞中。電介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移也稱DNA電轉(zhuǎn)移或者電基因療法，已經(jīng)得到密切關(guān)注，因?yàn)檫@是體內(nèi)非病毒基因轉(zhuǎn)移的最有效方法之一(AndreandMir，2004)。所述方法已經(jīng)顯示有效地將質(zhì)粒DNA電轉(zhuǎn)移進(jìn)多種組織中肌肉(AiharaandMiyazaki，1998;Miretal"1998a;Miretal.,1999)，肝(Helleretal.,1996;Suzukietal.，1998),皮膚(Titomirovetal.，1991;Zhangetal.，1996)，月中瘤(Helleretal.，2000;Wellsetal"2000;HellerandCoppola,2002)，小鼠睪丸(Muramatsuetal.，1997;Muramatsuetal.，1998)等組織中(AndreandMir,2004)。電脈沖介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)靶細(xì)胞的機(jī)制還未十分明了。然而，普遍認(rèn)為為了改善DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)組織中，該組織中細(xì)胞必須是可通透的。這種通透可以使用簡(jiǎn)便的短方波電脈沖(在lOOjis范圍內(nèi))而實(shí)現(xiàn)(Miretal.,1991b;Gehletal.，1999;Miklavcicetal.,2000)。這種脈沖己經(jīng)在稱作"抗腫瘤電化學(xué)療法"的治療中廣泛用于局部輸送非通透性抗癌藥物(如博來(lái)霉素或順鉑(cisplatin))(Miretal.,1991a;Glassetal.，1997;Sersaetal"1998;Miretal"1998b;Rodriguezetal"2002)。事實(shí)上，在體外或體內(nèi)為腫瘤輸送例如8次1300V/cm和lOO^is脈沖足以誘導(dǎo)細(xì)胞膜瞬時(shí)重排，使得非通透性抗癌分子如博來(lái)霉素通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞并且充分發(fā)揮其胞毒性活性(Poddevinetal.，1991;Miretal.，1991b;Gehletal.，1998)。這些短通透性電脈沖也已經(jīng)顯示增加質(zhì)粒DNA向一些組織的轉(zhuǎn)移(Hdleretal.,1996;Helleretal.,2000)。然而，另一種類型的方波電脈沖被用于肌肉(AiharaandMiyazaki,1998;Miretal.，1999)、腫瘤(Rolsetal.,1998)、肝(Suzukietal.，1998)及一些其它組織(AndreandMir,2004)，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)于DNA電轉(zhuǎn)移更有效(Miretal.，1999;Helleretal，，2000)。這些脈沖通常是較低電壓但較長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間(在幾十毫秒范圍內(nèi))(AiharaandMiyazaki，1998;Rolsetal"1998;Miretal"1999;Bettanetal.，2000;Matsumotoetal.，2001)。推測(cè)這種類型的脈沖通過(guò)誘導(dǎo)兩種獨(dú)特的效應(yīng)而介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞中，所述獨(dú)特效應(yīng)包括細(xì)胞透化(如短脈沖)和在輸送電場(chǎng)期間DNA電泳遷移(Klenchinetal.,1991;Sukharevetal"1992;Neumannetal"1996;Miretal"1999;Golzioetal.，2002)。有效的電轉(zhuǎn)移進(jìn)肌細(xì)胞中已經(jīng)在WO-A-99/01158中使用一或多次(直至100,000次)1-800伏特/cm的單極電脈沖加以描述，并且在WO-A-98/43702中使用5-200伏特/cm電流刺激加以描述，其中所述電流可以是2-30,000方波雙極脈沖形式。電脈沖對(duì)于體內(nèi)DNA電轉(zhuǎn)移的雙重作用通過(guò)如下方式而證實(shí)，即使用由高壓短脈沖(或稱HV;例如800V/cm和lOOps)和隨后的低壓長(zhǎng)脈沖(或稱LV;例如80V/cm和100ms)組成的電脈沖組合而證實(shí)(Bureauetal.，2000;Satkauskasetal.，2002)。這項(xiàng)研究顯示這些HV和LV脈沖可以在HV與LV之間由不同的延遲(lag)隔開(kāi)，而不明顯喪失轉(zhuǎn)染效力。這些延遲的范圍在對(duì)于1次HV和1次LV處理而言為直至300s，對(duì)于1次HV和4次LV組合而言為直至3000s(Satkauskasetal.，2002)。本申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用HV與LV脈沖的特異性組合仍可以改善電轉(zhuǎn)移效力。出于相似目的對(duì)于腫瘤和/或其它組織例如肝的轉(zhuǎn)染也是感興趣的。對(duì)于HV和/或LV的優(yōu)選電場(chǎng)強(qiáng)度(V/cm)根據(jù)組織而改變。本發(fā)明的第一個(gè)目的是核酸在制備用以在體內(nèi)轉(zhuǎn)移進(jìn)組織細(xì)胞中的人用或獸用藥物中的應(yīng)用，其中所述藥物與組織細(xì)胞接觸，并如下對(duì)所述組織進(jìn)行電刺激-首先用至少一次200至2000伏特/cm高壓(HV)場(chǎng)強(qiáng)脈沖刺激，-其次用單次的50至200伏特/cm低壓(LV)場(chǎng)強(qiáng)脈沖刺激，持續(xù)300至2000ms。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"組織"是指動(dòng)物的腫瘤或非腫瘤組織，所述動(dòng)物例如人或非人哺乳動(dòng)物如嚙齒動(dòng)物(例如小鼠、兔或大鼠)、狗、貓或靈長(zhǎng)類動(dòng)物。非腫瘤組織可以是肌肉特別是骨骼肌或肝。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述組織是肌肉。對(duì)于這種但非限于這種組織而言，優(yōu)選所述組織首先用至少一次200至1400伏特/cm的HV場(chǎng)強(qiáng)脈沖進(jìn)行電刺激。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，所述組織是腫瘤組織。對(duì)于這種但非限于這種組織而言，優(yōu)選所述組織首先用至少一次400至2000伏特/cm的HV場(chǎng)強(qiáng)脈沖進(jìn)行電刺激。所述藥物與組織細(xì)胞優(yōu)選在應(yīng)用單次的LV脈沖處理之前及更優(yōu)選在應(yīng)用HV脈沖之前接觸。注射核酸與電脈沖之間的時(shí)間、特別是注射與HV脈沖之間的時(shí)間不是關(guān)鍵的。典型地，所述藥物與所述組織細(xì)胞接觸幾秒鐘至10分鐘，例如接觸30秒至5分鐘。在HV脈沖之前5-10分鐘的間隔也是可以接受的?？梢酝ㄟ^(guò)直接肌內(nèi)注射、全身給予(例如經(jīng)靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)途徑給予)或者通過(guò)局部或皮下給予使所述藥物與接觸。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，特別是對(duì)于肌肉，單次的LV脈沖的場(chǎng)強(qiáng)為50至140伏特/cm之間，特別是80至120伏特/cm之間，優(yōu)選在90至110伏特/cm之間，典型是大約100伏特/cm。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，特別是對(duì)于腫瘤組織，單次的LV脈沖的場(chǎng)強(qiáng)為100至200伏特/cm之間，優(yōu)選在120至160伏特/cm之間，典型是大約140伏特/cm。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面，對(duì)于肌肉和腫瘤組織而言，單次的LV脈沖的持續(xù)時(shí)間為300至800ms，優(yōu)選350至600ms，典型為大約400mso所述LV脈沖與HV脈沖可以是相同極性。然而，根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選方面，所述LV脈沖與HV脈沖的極性相反。優(yōu)選地，所述單次的LV脈沖是平方脈沖(squaredpulse)。其也可以是梯形或者不連續(xù)的。不受理論的限制，據(jù)認(rèn)為本發(fā)明的單次LV脈沖至少改善了核酸電泳遷移。在本文中揭示可以有多次HV脈沖，即2-10次HV脈沖。在這種情況中更便利的是具有相同的HV脈沖。然而，已經(jīng)證實(shí)了具有本文揭示特征的單次HV脈沖足以使細(xì)胞膜通透。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，應(yīng)用單次的HV脈沖。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，對(duì)于但非限于肌肉而言，HV脈沖的場(chǎng)強(qiáng)為300至1300、優(yōu)選400至1200伏特/cm，更優(yōu)選為500-900、更優(yōu)選為600-800伏特/cm，典型是大約700伏特/cm。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，對(duì)于但非限于腫瘤組織而言，HV脈沖的場(chǎng)強(qiáng)為600至2000、優(yōu)選800至1600伏特/cm，更優(yōu)選為900-1200、典型是大約1000伏特/cm。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，對(duì)于肌肉或腫瘤組織而言，HV脈沖的持續(xù)時(shí)間為10-1000(^s，優(yōu)選50-200|iis，典型為大約lOOjas。在單次HV脈沖的情況中，優(yōu)選方波脈沖。在多次HV脈沖的情況中，應(yīng)用單極或雙極脈沖，或者具有不同方向和/或極性的脈沖，優(yōu)選方波類型脈沖。所述HV和LV脈沖可以由延遲隔開(kāi)，這種延遲可優(yōu)選為300ms至3000s，優(yōu)選500ms至1000s，典型為大約1000ms。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，沒(méi)有延遲或者僅為很短的延遲，即低于300ms，所述HV脈沖的場(chǎng)強(qiáng)為300至1000伏特/cm，優(yōu)選為400至800伏特/cm。核酸可用于基因治療中，通過(guò)表達(dá)感興趣的分子或者通過(guò)調(diào)節(jié)或阻斷宿主內(nèi)的基因而具有治療作用。優(yōu)選地，本發(fā)明轉(zhuǎn)染的目的是-使得肌肉成為具有直接或間接治療作用包括免疫刺激或疫苗作用的分子的分泌器官，-糾正組織細(xì)胞、特別是肌細(xì)胞的功能失調(diào)。在一個(gè)優(yōu)選方面，核酸包含能在體內(nèi)在轉(zhuǎn)染的組織細(xì)胞中表達(dá)一或多種治療活性分子、優(yōu)選感興趣的一或多種蛋白質(zhì)的核酸序列。這種活性分子可以自身是治療活性的，或者通過(guò)所述分子的代謝物而間接具有活性。其可以在組織自身和/或機(jī)體內(nèi)所述組織外另一部位發(fā)揮作用，例如如果所述表達(dá)的分子具有抗腫瘤活性，則其對(duì)位于機(jī)體內(nèi)任何部位的腫瘤均具有活性。感興趣的治療分子的例子可以是WO-A-99/01158中列出的那些。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到對(duì)于根據(jù)本發(fā)明可以表達(dá)的分子的種類無(wú)限制，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員能使用己知編碼序列的感興趣的分子以及選擇最佳的構(gòu)建或表達(dá)載體常規(guī)實(shí)驗(yàn)而進(jìn)行本發(fā)明?？梢允褂萌魏魏怂?，例如質(zhì)粒DNA、線性DNA、反義DNA和RNA。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸是本領(lǐng)域熟知的DNA表達(dá)載體。通常地，表達(dá)載體含有與編碼感興趣的蛋白質(zhì)的DNA序列可操縱地連接的啟動(dòng)子，隨后是終止信號(hào)如聚腺苷酸化信號(hào)。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到本發(fā)明的應(yīng)用涵蓋了其中能在體內(nèi)表達(dá)不同活性的分子的兩或多種核酸用于制備藥物的情況。優(yōu)選對(duì)核酸進(jìn)行選擇以在治療疾病中發(fā)揮補(bǔ)充和/或協(xié)同作用。本發(fā)明還涵蓋了能在體內(nèi)表達(dá)至少兩種活性分子的至少一種核酸的應(yīng)用，所述活性分子優(yōu)選在治療疾病中起補(bǔ)充和/或協(xié)同作用。在這種情況中，編碼不同分子的核苷酸序列可以在相同啟動(dòng)子或不同啟動(dòng)子的控制下。根據(jù)本發(fā)明的不同方面，所述核酸表達(dá)一或多種(至少兩種)選擇的活性分子，以便-所述藥物有效降低、抑制或退行(regressing)腫瘤血管發(fā)生，-所述藥物降低或抑制腫瘤生長(zhǎng)，-所述藥物抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，-所述藥物是抗癌的。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是使用包含ADAM-15基因的重組人Desintegrin結(jié)構(gòu)域(RDD基因)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染組織細(xì)胞特別是肌細(xì)胞。這個(gè)基因、其序列及有用構(gòu)建體(例如表達(dá)載體pBi-RDD)已經(jīng)在本領(lǐng)域技術(shù)人員可查閱的文章Trochon-JosephV.etal.2004中充分描述。RDD基因和蛋白質(zhì)序列分別示于SEQIDNo.l和SEQIDN0.2。RDD可作為抗癌劑，可以降低或抑制腫瘤生長(zhǎng)，和/或作為抗血管發(fā)生和/或抗腫瘤轉(zhuǎn)移劑。本發(fā)明的一個(gè)特異方面因此是編碼RDD蛋白質(zhì)或其有效片段(有效是指由所述片段編碼的蛋白質(zhì)與完整的RDD多肽引起相同或相似的治療活性)的核酸在制備用于在體內(nèi)轉(zhuǎn)移進(jìn)組織細(xì)胞中并在此產(chǎn)生具有治療活性的RDD多肽或其片段的藥物中的應(yīng)用，其中所述藥物被注射進(jìn)組織中，并對(duì)所述組織如下進(jìn)行電刺激-首先用至少一次200至2000伏特/cm高壓(HV)場(chǎng)強(qiáng)脈沖刺激，—其次用單次的50至200伏特/cm及持續(xù)300至2000ms的低壓(LV)場(chǎng)強(qiáng)脈沖刺激。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述組織是肌肉。對(duì)于這種但非限于這種組織，優(yōu)選對(duì)所述組織首先用至少一次200至1400伏特/cm的HV場(chǎng)強(qiáng)脈沖進(jìn)行電刺激。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，所述組織是腫瘤組織。對(duì)于這種但非限于這種組織，優(yōu)選對(duì)所述組織首先用至少一次400至2000伏特/cm的HV場(chǎng)強(qiáng)脈沖進(jìn)行電刺激。前述本發(fā)明的各個(gè)特點(diǎn)和方面、特別是關(guān)于電轉(zhuǎn)移特征和核酸組合物，確實(shí)是以與這種特定應(yīng)用相同的方式應(yīng)用，因此這方面參考上述內(nèi)容以進(jìn)一步鑒定這種特定用途。這種藥物可有利地用作抗血管發(fā)生和/或抗腫瘤轉(zhuǎn)移劑。在另一感興趣的方面，作為治療活性分子，所述核酸編碼在宿主體內(nèi)能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的一或多種免疫原(或者免疫原性肽、多肽或蛋白質(zhì)，包括糖蛋白)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫應(yīng)答對(duì)于宿主是保護(hù)性免疫應(yīng)答。在這個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)直接對(duì)抗微生物例如病毒或細(xì)菌或者對(duì)抗癌癥的免疫原性組合物或者疫苗或治療性疫苗。例如所述核酸編碼如下一或多種(至少兩種)免疫原HIV、HBV、Epstein-Barr病毒、偽狂犬病病毒、syndtiaforming病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用編碼最感興趣的分子的核酸進(jìn)行選擇性應(yīng)用，例如針對(duì)特定疾病應(yīng)用最有效的免疫原或免疫原組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫應(yīng)答引起抗體、特別是多克隆抗體產(chǎn)生，這些抗體從產(chǎn)生的血清中回收并以通常的方式應(yīng)用。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供治療人或動(dòng)物的方法，所述方法包括將核酸注射進(jìn)組織中，并對(duì)該組織如下進(jìn)行電刺激-首先用至少一次200至2000伏特/cm高壓(HV)場(chǎng)強(qiáng)脈沖刺激，-其次用單次的50至200伏特/cm及持續(xù)300至2000ms的低壓(IAO場(chǎng)強(qiáng)脈沖刺激，通過(guò)這種電刺激使得所述核酸被轉(zhuǎn)移進(jìn)所述組織細(xì)胞中。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述組織是肌肉。對(duì)于這種但非限于這種組織而言，優(yōu)選所述組織首先用至少一次200至1400伏特/cm的HV場(chǎng)強(qiáng)脈沖進(jìn)行電刺激。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，所述組織是腫瘤組織。對(duì)于這種但非限于這種組織而言，優(yōu)選所述組織首先用至少一次400至2000伏特/cm的HV場(chǎng)強(qiáng)脈沖進(jìn)行電刺激。如前所述，根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選方面，所述核酸一旦被體內(nèi)轉(zhuǎn)移進(jìn)組織細(xì)胞中，則能在此產(chǎn)生治療活性分子，即在肌細(xì)胞中和/或在機(jī)體另一部位或者仍在腫瘤組織細(xì)胞中直接或間接發(fā)揮治療作用。優(yōu)選地，如上所述，所述核酸是在應(yīng)用單次LV脈沖及更優(yōu)選在應(yīng)用HV脈沖之前注射。前文關(guān)于本發(fā)明的應(yīng)用描述的各個(gè)特征和方面確實(shí)以與所述治療方法相同方式應(yīng)用，因此加以參考以進(jìn)一步鑒定這種方法。本發(fā)明的一方面因此是這樣一種方法，其中所述核酸編碼RDD基因或其有效片段，所述方法旨在降低或抑制腫瘤生長(zhǎng)，和/或作為抗血管發(fā)生和/或抗腫瘤轉(zhuǎn)移劑本發(fā)明的另一方面因此是這樣一種方去，其中所述核酸編碼如本文所述一種免疫原，所述方法旨在對(duì)人或動(dòng)物進(jìn)行免疫，或者產(chǎn)生準(zhǔn)備回收的抗體。本發(fā)明的另一方面是電穿孔方法，所述方法包括將電極置于在組織間隙內(nèi)含有核酸的組織附近，然后對(duì)該組織如下進(jìn)行電刺激-首先用至少一次200至2000伏特/cm高壓(HV)場(chǎng)強(qiáng)脈沖刺激，-其次用單次的50至200伏特/cm及持續(xù)300至2000ms的低壓(LV)場(chǎng)強(qiáng)脈沖刺激，通過(guò)這種電刺激使得所述核酸被轉(zhuǎn)移進(jìn)所述組織細(xì)胞中。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述組織是肌肉。對(duì)于這種但非限于這種組織而言，優(yōu)選對(duì)該組織首先用至少一次200至1400伏特/cm的HV場(chǎng)強(qiáng)脈沖進(jìn)行電刺激。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，所述組織是腫瘤組織。對(duì)于這種但非限于這種組織而言，優(yōu)選對(duì)該組織首先用至少一次400至2000伏特/cm的HV場(chǎng)強(qiáng)脈沖進(jìn)行電刺激。所述核酸對(duì)于機(jī)體而言是異源的，其類型如前述。優(yōu)選核酸包含能在體內(nèi)在轉(zhuǎn)染的肌細(xì)胞或腫瘤組織中表達(dá)一或多種治療活性分子、優(yōu)選感興趣的一或多種蛋白質(zhì)的核酸序列。一方面，將電極放置于與皮膚接觸位置，即機(jī)體外部，這不需要進(jìn)行任何手術(shù)即可實(shí)現(xiàn)。另一方面，將電極放置于與自身所述組織接觸位置，特別是肌肉或腫瘤組織。在這種情況中，所述電極可以由既可以注射核酸又可以進(jìn)行電刺激的設(shè)備攜帶。所述電極也可以與注射設(shè)備分開(kāi)。電極被置于注射部位附近，由此電流通過(guò)電極流經(jīng)注射部位或注射的液體在注射時(shí)擴(kuò)散到的區(qū)域。前文關(guān)于電轉(zhuǎn)移特性和核酸組合物描述的各個(gè)特性和方面以與電穿孔相同方式應(yīng)用，因此參考上述內(nèi)容以進(jìn)一步鑒定這種方法。本發(fā)明也可以被定義為能表達(dá)分子的核酸在生產(chǎn)用于將所述核酸輸送至組織細(xì)胞、特別是腫瘤或非腫瘤組織細(xì)胞例如肌細(xì)胞的方法中的藥物中的應(yīng)用，其中a)所述核酸被注射進(jìn)組織中，b)對(duì)所述組織如下進(jìn)行電刺激-首先用至少一次200至2000伏特/cm高壓(HV)場(chǎng)強(qiáng)脈沖刺激，_其次用50至200伏特/cm及持續(xù)300至2000ms的單次低壓(LV)場(chǎng)強(qiáng)脈沖刺激。從上所述可以得知，所述應(yīng)用可以是-通過(guò)在宿主的肌細(xì)胞、特別是骨骼肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染所述核酸而對(duì)宿主進(jìn)行免疫，其中所述核酸編碼降低宿主中免疫應(yīng)答的免疫原；-或者通過(guò)在肌細(xì)胞、特別骨骼肌細(xì)胞或者在腫瘤組織細(xì)胞中轉(zhuǎn)染所述核酸，而在宿主體內(nèi)全身性輸送治療活性分子。這一應(yīng)用可以進(jìn)一步用上述定義的各種特征而定義，特別是電刺激條件、核酸給予條件、核酸組成、宿主性質(zhì)等等。本發(fā)明的另一目的是生產(chǎn)抗體、特別是多克隆抗體的方法，所述方法包括將免疫原編碼核酸注射進(jìn)活體動(dòng)物的組織、特別是肌肉中，對(duì)該組織如下進(jìn)行電刺激-首先用至少一次200至2000伏特/cm高壓(HV)場(chǎng)強(qiáng)脈沖刺激，-其次用50至140伏特/cm及持續(xù)300至2000ms的單次低壓(LV)脈沖刺激，通過(guò)這種電刺激使得所述核酸被轉(zhuǎn)移進(jìn)組織細(xì)胞中，并且在所述宿主中表達(dá)能激發(fā)宿主免疫應(yīng)答的免疫原，并回收所述抗體。所述動(dòng)物可以是小鼠、大鼠或兔或者任何其它動(dòng)物，特別是通常用于產(chǎn)生抗體的嚙齒動(dòng)物?；厥昭搴涂贵w、純化和/或濃縮所述抗體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法進(jìn)行。這一方法可以進(jìn)一步用上述定義的各種特征而定義，特別是電刺激條件、核酸給予條件、核酸組成、宿主性質(zhì)等等?，F(xiàn)在通過(guò)如下非限制性實(shí)驗(yàn)并參考附圖進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。圖1:組合使用1或8次HV脈沖(800V/cm;0.1、0.2或0.5ms)及4次LV脈沖(80V/cm;100ms)(xHV+4LV脈沖組合)，在DNA電轉(zhuǎn)移之后的螢光素酶表達(dá)。數(shù)據(jù)以平均值士SD表示。使用T檢驗(yàn)計(jì)算每個(gè)xHV+4LV組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，NS表示無(wú)顯著性。圖2:組合使用1次HV脈沖(800V/cm;100ps)及各種次數(shù)LV脈沖(80V/cm;100ms)(HV+xLV脈沖組合)，在DNA電轉(zhuǎn)移之后的螢光素酶表達(dá)。數(shù)據(jù)以平均值士SD表示。圖中顯示的相鄰組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異是使用T檢驗(yàn)計(jì)算的，以星號(hào)表示(**PO.01;***PO.001;NS表示無(wú)顯著性)。圖3:組合使用1次HV脈沖(800V/cm;100ns)及各種次數(shù)LV脈沖(80V/cm;50ms)(HV+xLV脈沖組合)，在DNA電轉(zhuǎn)移之后的螢光素酶表達(dá)。數(shù)據(jù)以平均值士SD表示。圖中顯示的相鄰組之間的統(tǒng)15計(jì)學(xué)差異是使用T檢驗(yàn)計(jì)算的，以星號(hào)表示(*PO.05;**PO.01;NS表示無(wú)顯著性)。圖4:組合使用一次HV脈沖(800V/cm，100ns)和作為L(zhǎng)V脈沖的脈沖次數(shù)與脈沖持續(xù)時(shí)間的函數(shù)的LV脈沖在DNA電轉(zhuǎn)移之后螢光素酶表達(dá)，其中所述函數(shù)為保持LV總持續(xù)時(shí)間恒定。數(shù)據(jù)以平均值土SD表示。1HV+1LV(400ms)組與其它每組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異使用T檢驗(yàn)計(jì)算，以星號(hào)表示(^PO.05;**P<0.01;***P<0.001)。圖5:在pBi(對(duì)照組)或pBi-RDD電轉(zhuǎn)移之后小鼠中腫瘤轉(zhuǎn)移的數(shù)目。圖6:組合使用不同HV脈沖(200至1800V/cm，IOOiis)并在HV之后1秒鐘進(jìn)行一次LV脈沖(80V/cm;400ms)，在DNA電轉(zhuǎn)移進(jìn)脛骨肌之后螢光素酶表達(dá)。數(shù)據(jù)以平均值士SD表示。圖7:組合使用不同HV脈沖(200至1800V/cm，100ps)并在HV之后立即進(jìn)行一次LV脈沖(80V/cm;400ms)，在DNA電轉(zhuǎn)移進(jìn)脛骨肌之后螢光素酶表達(dá)。數(shù)據(jù)以平均值土SD表示。圖8:組合使用不同HV脈沖(400-2000V/cm;100ps)并隨后一次LV脈沖(80V/cm;400ms)，在DNA電轉(zhuǎn)移進(jìn)腫瘤中之后的螢光素酶表達(dá)。數(shù)據(jù)以平均值士SD表示。圖9:組合使用1次HV脈沖(800V/cm;IOOiis)并隨后一次LV脈沖(60、80、100、120或140V/cm;400ms)或無(wú)LV脈沖，在DNA電轉(zhuǎn)移進(jìn)腫瘤中之后的螢光素酶表達(dá)。數(shù)據(jù)以平均值士SD表示。圖10:在兔和大鼠中產(chǎn)生的抗-RDDIgG抗體的測(cè)量。實(shí)施例1材料和方法質(zhì)粒DNA使用質(zhì)粒pXL3031(pCMV-Luc+)，其含有插入在編碼螢火蟲(chóng)螢光素酶(Soubrierefal.,1999)的經(jīng)修飾的胞質(zhì)luc+基因的編碼序列上游的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(pcDNA3的第229-890位核苷酸，Invitrogen)。使用通常的方法制備質(zhì)粒DNA(Ausubeletal.,1994)?；蛘撸褂胮EGFP-Nl質(zhì)粒(BDBiosciencesClontech,SaintQuentinYvelines,France),特征在于綠色熒光蛋白(GFP)的基因在CMV啟動(dòng)子控制下，用EndoFreePlasmidGiga試劑盒(QIAGEN，Courtabeuf,France)在PBS(磷酸鹽緩沖鹽水，Gibco，Cergy-Pontoise,France)中制備。動(dòng)物對(duì)于所有實(shí)驗(yàn)方法而言，將雌性7-9周齡的C57BI/6小鼠通過(guò)腹膜內(nèi)給予麻醉劑氯胺酮(IOOmg/kg;Ketalar,Pa叩harma,France)和賽拉嗪(40mg/kg;Rompun,Bayer,Fmnce)進(jìn)行麻醉。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，將腿部用電動(dòng)剃須刀刮剃。為了進(jìn)行螢光素酶測(cè)定，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組包括至少10塊肌肉(5只小鼠)。在GFP定性數(shù)據(jù)情況中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件使用4塊肌肉。DNA注射為了進(jìn)行螢光素酶實(shí)驗(yàn)，注射于的0.9%NaCl中制備的3叱質(zhì)粒DNA。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中(圖l-5)，為所述DNA溶液補(bǔ)充120IU/ml月干素(LaboratoiresLeo，SaintQuentinenYvelines,France;lmg肝素(MW10-12kDa)相當(dāng)于大約137IU)。使用具有26號(hào)針頭的Hamilton注射器將所述DNA注射進(jìn)前脛骨肌(tibialcranialmuscles)。對(duì)于GFP實(shí)驗(yàn)，在每個(gè)處理的脛骨肌中注射于20^1的PBS中4嗎質(zhì)粒DNA，始終沒(méi)有肝素。DNA電轉(zhuǎn)移HV和LV脈沖組合通過(guò)由用于HV的方波電脈沖儀PS-15(Jouan，StHerblain，F(xiàn)rance)禾口用于LV的UniversityofLjubljana,FacultyofElectricalEngineering,Slovenia制造的微處理器驅(qū)動(dòng)的開(kāi)關(guān)/功能(switch/flinction)發(fā)生器組成的設(shè)備產(chǎn)生。該設(shè)備可以精確控制HV+LV脈沖組合中的每個(gè)電學(xué)參數(shù)(Satkauskasetal.，2002)。HV和LV脈沖組合在肌內(nèi)注射DNA之后(40+15秒)立即發(fā)送。在所有實(shí)驗(yàn)中，HV與LV之間的延遲固定為ls。為了為肌肉輸送脈沖，使用間隔4.4mm的不銹的板狀電極。所述lcm的電極板環(huán)繞小鼠的整個(gè)腿部。為了保證暴露的腿部前脛骨肌與電極板之間良好的接觸，使用導(dǎo)電凝膠。電場(chǎng)值(V/cm)總是以施加的電壓(V)與電極之間的距離(cm)的比值表示。為了進(jìn)行GFP實(shí)驗(yàn)，使用CLINIPORATOR(IGEA，s.r.I.，Carpi(MO),Italy)發(fā)生器和同一公司生產(chǎn)的5mm間隔電極發(fā)送脈沖組合。螢光素酶活性測(cè)定在DNA電轉(zhuǎn)移之后2天處死小鼠。取下肌肉(凈重為大約60mg)，在lml細(xì)胞培養(yǎng)裂解試劑溶液(IOml細(xì)胞培養(yǎng)裂解試劑(PromegaCharbonniferes,France),用40ml蒸餾水稀釋并補(bǔ)充BoehringerMannheim,Mannheim,Germany生產(chǎn)的1片蛋白酶抑制劑混合物)中均質(zhì)。在4。C在12,000rpm離心10分鐘后，對(duì)lOpl上清測(cè)定螢光素酶活性，使用WalacVictor2發(fā)光計(jì)，通過(guò)積分(integration)在向所述肌肉裂解物中加入50^11螢光素酶分析底物(Promega)之后開(kāi)始的1秒鐘期間產(chǎn)生的光而確定。從發(fā)光計(jì)中收集相對(duì)光單位(relativelightunits,RLU)結(jié)果。使用純化的螢火蟲(chóng)螢光素酶蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)顯示106RLU，相當(dāng)于大約70ng表達(dá)的螢光素酶。最終結(jié)果以pg螢光素酶/肌肉表示。GFP熒光觀測(cè)小鼠在注射pEGFP-Nl質(zhì)粒3天后被處死，使用具有LeicaGFPPlus濾光裝置的LeicaMZ12熒光立體顯微鏡(Art.No.10446143:發(fā)射濾片480/40nm，分色鏡505nmLP，二次濾片510nmLP)(Leica，RueilMalmaison,France)觀測(cè)轉(zhuǎn)染的組織。使用冷卻的數(shù)碼彩色攝像機(jī)(AxioCamHRc,Zeiss,LePecq，F(xiàn)rance)采集圖像，綜合由攝像機(jī)檢測(cè)的光通過(guò)軟件(AxioVisionLightEditionRelease4丄1.0)量化GFP表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析為了對(duì)幾組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，對(duì)不成對(duì)的數(shù)值使用雙尾Student'st-檢驗(yàn)。在圖中，螢光素酶表達(dá)數(shù)據(jù)以平均值士SD表示。結(jié)果在螢光素酶實(shí)驗(yàn)情況中，由于測(cè)量的高敏感性，注射補(bǔ)加了少量肝素(120IU/ml)的質(zhì)粒DNA溶液。在此劑量的肝素使得肌肉對(duì)DNA的自發(fā)吸收大大降低，但是不明顯削弱DNA電轉(zhuǎn)移進(jìn)肌纖維中的效率(Satkauskaseta1.，2001)。因此，在存在肝素的條件下，可以更精確地分析HV和LV脈沖各自對(duì)DNA電轉(zhuǎn)移效率的作用。另夕卜，HV與LV脈沖之間的延遲固定為ls。HV脈沖持續(xù)時(shí)間和次數(shù)的影響為了分析電通透化(HV)脈沖的作用，使用根據(jù)先前數(shù)據(jù)(Satkauskasetal.，2002)提供最佳水平基因表達(dá)的LV脈沖。根據(jù)這種教導(dǎo)，這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的LV組成參數(shù)固定為4次80V/cm和100ms持續(xù)時(shí)間的LV，在脈沖之間延遲l秒鐘。嘗試通過(guò)增加HV脈沖次數(shù)(l-8次)或者HV持續(xù)時(shí)間(100p至500las)而改善肌肉通透性。如圖1所示，HV持續(xù)時(shí)間的增加及HV次數(shù)的增加均不明顯增強(qiáng)肌肉轉(zhuǎn)染。LV脈沖次數(shù)的影響從圖1所示結(jié)果可以看出，總是使用一次單次的800V/cm的HV和100w來(lái)分析LV組成的作用。首先，撿驗(yàn)LV次數(shù)的影響。將LV脈沖強(qiáng)度固定在80V/cm，持續(xù)100ms及在LV之間延遲ls。當(dāng)LV次數(shù)從1增加至4次時(shí)，螢光素酶表達(dá)明顯增加(圖2)。與先前的數(shù)據(jù)(Satkauskasetal.，2002)—致，使用4次LV較1次LV使得螢光素酶表達(dá)高10倍。使用更多次數(shù)(6或8次)LV脈沖未觀測(cè)到顯著增加(圖2)。隨后使用50ms持續(xù)時(shí)間LV進(jìn)行脈沖次數(shù)對(duì)基因轉(zhuǎn)移效力的影響的實(shí)驗(yàn)(圖3)。觀測(cè)到與在100ms持續(xù)時(shí)間LV情況(圖2)中相同的趨勢(shì)。在這兩種情況中，螢光素酶基因表達(dá)達(dá)到平臺(tái)時(shí)的幵始時(shí)間均是在整個(gè)400ms脈沖持續(xù)時(shí)間幵始時(shí)。同樣，使用更多次數(shù)(12或16次)LV脈沖未觀測(cè)到進(jìn)一步明顯增加。進(jìn)一步使用和對(duì)比4種不同LV次數(shù)和持續(xù)時(shí)間的組合，所有結(jié)果均顯示低壓脈沖的總持續(xù)時(shí)間等于400ms(圖4)。發(fā)現(xiàn)伴隨各個(gè)脈沖持續(xù)時(shí)間減少和脈沖次數(shù)增加，螢光素酶基因表達(dá)的漸進(jìn)性降低趨勢(shì)(圖4)。顯然并出乎意料地，使用單次的400msLV的HV和LV組合導(dǎo)致螢光素酶基因表達(dá)進(jìn)一步增加并到達(dá)最佳，例如較使用8次50ms的LV高大約2倍(p〈0.001)。GFP熒光觀測(cè)在使用1次100ps和800V/cm的HV及在延遲1秒鐘后使用1次400ms、60、80或100V/cm的LV的GFP基因電轉(zhuǎn)移之后，使用熒光立體顯微鏡定性及半定量測(cè)定肌肉內(nèi)熒光的分布和強(qiáng)度。在恒定曝光時(shí)間(IOOms，A、B和C組)或者在可變曝光時(shí)間采集圖像，所述可變曝光時(shí)間即使得攝像機(jī)調(diào)節(jié)曝光時(shí)間以獲得圖像與圖像之間的光量相等(D、E和F組)。采集的圖像代表在每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下4個(gè)肌肉中觀測(cè)到的圖像。采集的兩個(gè)系列圖片顯示所述結(jié)果的可再現(xiàn)性以及隨著LV脈沖場(chǎng)強(qiáng)度的增加熒光明顯增加(A、B和C組)。對(duì)這些圖像中綠色的平均密度進(jìn)行定量分析證實(shí)了定性數(shù)據(jù)在256個(gè)強(qiáng)度水平的相對(duì)數(shù)值范圍中，第41級(jí)(左側(cè)肌肉)和33級(jí)(右側(cè)肌肉)達(dá)到60V/cm(A組)，而第111級(jí)和89級(jí)達(dá)到80V/cm(B組)，第138級(jí)和127級(jí)達(dá)到100V/cm(C組)。這些圖片顯示無(wú)論LV場(chǎng)強(qiáng)如何，熒光"光學(xué)表面(opticalsurface)"是相同的(D、E和F組)。熒光的這種增加得自每個(gè)纖維較多的熒光，但是受電轉(zhuǎn)移影響的組織的體積相同。電轉(zhuǎn)移進(jìn)纖維中的質(zhì)粒分子的數(shù)目增加解釋了觀測(cè)到的在各個(gè)纖維中熒光的增加。實(shí)施例2這個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用的表達(dá)載體根據(jù)Trochon-JosephV.etal.2004所述制備。將20昭的pBi(對(duì)照)或者pBi-RDD(實(shí)驗(yàn)處理)與10昭的Tet-tTS和20嗎的Tet-On質(zhì)粒于無(wú)菌0.9%NaCl(終體積30jal)中一起注射進(jìn)前脛骨肌(Tibialiscranialismuscles)中。對(duì)每只動(dòng)物的兩條腿進(jìn)行電轉(zhuǎn)移。如下所述進(jìn)行電轉(zhuǎn)移。在進(jìn)行電轉(zhuǎn)移之前當(dāng)天用電動(dòng)剃須刀刮剃C57BL/6小鼠的腿部。在進(jìn)行電轉(zhuǎn)移之前，通過(guò)腹膜內(nèi)注射氯胺酮(100mg/kg體重)和賽拉嗪(40mg/kg)混合物對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉。使用Hamilton注射器注射質(zhì)?；旌衔铩?yīng)用導(dǎo)電凝膠以保證腿部皮膚與兩個(gè)不銹板狀電極之間的良好接觸(電極之間間隔5mm)。隨后，首先應(yīng)用1次經(jīng)皮方波700V/cm和100ps(1Hz)的HV電脈沖以使膜通透化。在暫停1000ms之后，不移動(dòng)電極，應(yīng)用l次經(jīng)皮方波100V/cm和400ms的LV電脈沖，以使得DNA通過(guò)電泳遷移進(jìn)入細(xì)胞中。使用電脈沖儀Cliniporator(IGEA，Italy)進(jìn)行電轉(zhuǎn)移。對(duì)于每組動(dòng)物和每條腿進(jìn)行相同程序處理。每組使用IO只小鼠。在植入腫瘤之前3天通過(guò)在動(dòng)物飲用水中加入強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)電轉(zhuǎn)移的肌肉中RDD產(chǎn)生。在實(shí)驗(yàn)期間維持強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)。將對(duì)數(shù)期培養(yǎng)的B16F10黑素瘤細(xì)胞用0.02%EDTA分離，重懸于無(wú)菌0.9。/。NaCl中，終濃度為4Xl()S/ml。將lOOpl懸浮液I.V.注射進(jìn)小鼠的眶后竇(retro-orbitalsinus)中。細(xì)胞注射7天后，處死小鼠，切下肺，在解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。如圖5所示，在存在RDD的條件下，在實(shí)驗(yàn)組中檢測(cè)到較對(duì)照組少70.5%的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。RDD抑制黑素瘤B16F10的發(fā)展。實(shí)施例3圖6禾Q7顯示了使用不同HV脈沖(200至1800V/cm，100ps)及在HV脈沖之后1秒后(圖6)或者在HV脈沖之后立即(圖7)使用1次LV脈沖(80V/cm，400ms)的組合，在DNA經(jīng)電轉(zhuǎn)移進(jìn)小鼠脛骨肌之后的螢光素酶表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)己經(jīng)如在實(shí)施例1中針對(duì)螢光素酶方案進(jìn)行，每組6只小鼠，使用CUNIPORATORTM發(fā)送沖動(dòng)，螢光素酶活性以pg/mg肌肉表示。實(shí)施例4:腫瘤實(shí)驗(yàn)使用傳統(tǒng)方法和補(bǔ)充了100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素和8。/。胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，在體外培養(yǎng)B16F10黑素瘤細(xì)胞。為年幼的(6-8周)C57BI/6雌性小鼠左側(cè)腰部皮下接種1X106同源B16細(xì)胞(于100^1的MEM培養(yǎng)基中)。當(dāng)腫瘤達(dá)到平均直徑為6-7mm時(shí)(接種后7-8天)，對(duì)其進(jìn)行處理。使用具有4型、26號(hào)、長(zhǎng)度為16mm的針頭的RN型Hamilton注射器將的50嗎的DNA(質(zhì)粒pCMV-Luc+)局部注射進(jìn)腫瘤中。在15-25秒鐘內(nèi)進(jìn)行注射。將兩個(gè)寬lcm、厚lmm外用不銹鋼板狀電極間隔5mm(IGEA,Carpi，Italy)置于腫瘤每一側(cè)的皮膚上，以環(huán)繞整個(gè)腫瘤。利用超聲波掃描術(shù)使用的導(dǎo)電凝膠(EKO-GEL，Egna，Italy)保證電極接觸。當(dāng)使用固定的LV組成時(shí)(l次400ms、140V/cm的LV)，作為HV場(chǎng)強(qiáng)函數(shù)獲得的結(jié)果與在骨骼肌上獲得的那些結(jié)果相似，不同之處是需要應(yīng)用較高的場(chǎng)強(qiáng)以達(dá)到最佳表達(dá)平臺(tái)。見(jiàn)圖8。當(dāng)使用固定的HV組成時(shí)(l次100ns、800V/cm的HV)，作為L(zhǎng)V場(chǎng)強(qiáng)函數(shù)獲得的結(jié)果與在骨骼肌上獲得的那些結(jié)果相似，不同之處是再一次需要應(yīng)用較高的場(chǎng)強(qiáng)以達(dá)到最佳表達(dá)平臺(tái)。發(fā)現(xiàn)最佳HV+LV脈沖的最大效率較在先前公布的最佳條件(相同方波脈沖序列(train))下使用相同脈沖序列的效率高10倍。實(shí)施例5:多克隆抗體的產(chǎn)生材料和方法質(zhì)粒DNA將在鼠尿激酶分泌信號(hào)控制下的人RDD基因插入含有巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子和牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化信號(hào)的pVAXl質(zhì)粒(Invitrogen,V260-20)中，產(chǎn)生pVAX-RDD質(zhì)粒?？瞻纵d體pVAXl用作陰性對(duì)照。使用EndoFreeNucleoSpin質(zhì)粒試劑盒(MachereyNagel)在無(wú)菌0.9%NaCl中制備質(zhì)粒。動(dòng)物雌性Wistar大鼠通過(guò)腹膜內(nèi)給予麻醉劑氯胺酮(40mg/kg)和賽拉嗪(5.5mg/kg)麻醉。雌性新西蘭兔首先經(jīng)皮下注射Calmivet(1ml/kg)處理，然后通過(guò)靜脈內(nèi)注射戊巴比妥麻醉。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，將動(dòng)物腿部用電動(dòng)剃須刀刮剃。DNA注射和電轉(zhuǎn)移將穿透針頭電極導(dǎo)入兔的股薄肌和大鼠的臀肌中。在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)在電極線之間注射于10(^1的0.9%NaCl中制備的100嗎每種質(zhì)粒DNA。在肌內(nèi)注射DNA之后立即用CLINIPORATORTM進(jìn)行如前述肌肉電轉(zhuǎn)移1次700V/cm和100|us電脈沖(lHz)，暫停1000ms，然后不移動(dòng)電極進(jìn)行1次100V/cm和400ms電脈沖。對(duì)于每只動(dòng)物的兩條腿均進(jìn)行該程序，兔的每塊肌肉進(jìn)行2次(即每只動(dòng)物注射4次)，大鼠的每塊肌肉進(jìn)行1次(即每只動(dòng)物注射2次)。動(dòng)物在第0、6和12周免疫?？贵w應(yīng)答的測(cè)量在第一次免疫之前收集血液，然后在第4、9(兔的處死時(shí)間)和16周(大鼠的處死時(shí)間)收集血液。通過(guò)離心收集血清?？?RDD抗體(IgG)通過(guò)如下ELISA測(cè)定。將96孔微滴定平板(NuncMaxisorb，Roskilde，Denmark)的每個(gè)孔均用在大腸桿菌(E.coli)中產(chǎn)生的100ng重組RDD包被。在4'C保溫過(guò)夜后，將孔用TBST(Tris-緩沖鹽水TBS，0.02%Tween20)洗滌6次，然后與TBST-5y。牛奶在室溫?fù)u動(dòng)保溫3h。如上述洗滌一次后，將孔與于TBST-5。/。牛奶中的100pl血清系列稀釋液(1:125至l:8000)保溫。由肽免疫(Neosystem)而產(chǎn)生的抗-RDD兔多克隆血清用作陽(yáng)性對(duì)照。在搖動(dòng)保溫2h后，洗滌孔并與于TBST-5%牛奶中1:5000稀釋的lOOpl過(guò)氧化物酶綴合的抗體保溫1小時(shí)，結(jié)合的兔抗體使用過(guò)氧化物酶綴合的抗兔IgG(ref.NA934,Amersham)檢測(cè)，結(jié)合的大鼠抗體使用山羊F(ab')2片段大鼠IgG(H+L)過(guò)氧化物酶(ref.IM0825，Beckmanlmmunotech)檢測(cè)。如上述洗滌后，將孔與200Hl底物o陽(yáng)二氫氯化苯二月安(SigmaFastOPDperoxidasesubstratetabletset)保溫30分鐘。通過(guò)加入50^1的3NHC1終止反應(yīng)，在490nm獲得分光光度計(jì)讀數(shù)。用作陽(yáng)性對(duì)照的抗-RDD兔多克隆血清是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)肽免疫方案產(chǎn)生的(由NeosystemSA，Strasbourg,France生產(chǎn))。選擇的肽包含RDD序列(SEQIDN0.2)第57-68位氨基酸殘基，與Gluta-KLH(匙孔血藍(lán)蛋白，一種增強(qiáng)小肽免疫原性的載體蛋白)綴合。在第0、2、4和8周將2mg這種肽經(jīng)皮下注射進(jìn)兔體內(nèi)。在第一次注射之前收集血液，然后在第6、10和12周(處死時(shí)間)收集血液。在第12周收集的血清用作陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果如圖10所示，在通過(guò)肌肉電轉(zhuǎn)移對(duì)兔和大鼠進(jìn)行免疫之后第9周，產(chǎn)生抗RDDIgG抗體。這種通過(guò)電轉(zhuǎn)移進(jìn)行的免疫誘導(dǎo)抗RDD抗體產(chǎn)生，與將肽注射進(jìn)兔中進(jìn)行的傳統(tǒng)免疫具有同樣效力(見(jiàn)對(duì)照組兔曲線)。在第16周對(duì)于大鼠獲得相同結(jié)果。另外，在兔和大鼠中獲得的這些多克隆抗RDD血清在western印跡實(shí)驗(yàn)中能特異性檢測(cè)重組RDD。參考文獻(xiàn)AIHARA,H.,andMIYAZAKI,J.(1998).Nat.Biotechnol.16,867-870.ANDRE,F.，andMIR,L.M.(2004).GeneTher.11Suppl1,S33-S42.Ausubel，RM.etal.(1994).CurrentProtocolsinMolecularBiology-Wiley,NewYork.BETTAN，M.etal.(2000).Mol.Ther.2,204-210.BUREAU,M.F.etal.(2000).Biochim.Biophys.Acta1474,353-359.GEHL,J.,andMIR，L.M.(1999).Biochem.Biophys.Res.Commun.261,377-380.GEHL,J"SKOVSGAARD,T.，andMIR，L.M.(1998).AnticancerDrugs9,319-325.GEHL,J.etal.(1999).Biochim.Biophys.Acta1428,233-240.GLASS,L.F.etal.(1997).J.Am.Acad.Dermatol.37，596-599.GOLZIO,M.etal.(2002).Proc.Natl.Acad.Sci.USA99，1292-1297.HELLER,L.etal.(2000).GeneTher.7，826-829.HELLER,L.G.,andCOPPOLA,D.(2002).GeneTher.9，1321-1325.HELLER，R.etal.(1996).FEBSLett.389,225-228.KLENCHIN，V.A.etal.(1991).Biophys.J.60，804-811.MATS而OTO,T.etal.(2001).GeneTher.8,1174-1179.MIKLAVCIC，D.etal.(2000).Biochim.Biophys.Acta1523,73-83.MIR，LM.etal.(1991a).C.R.Acad.Sci.Ill313，613-618.MIR,L.M.etal.(1999).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A96，4262-4267.MIR，L.M.etal.(1998a).C.R.Acad.Sci.Ill321,893-899.MIR,L.M.etal.(1998b).Br.J.Cancer77，2336-2342.MIR，LM.etal.(1991b).Eur.J.Cancer27，68-72.MURAMATSU，T，etal.(1997).Biochem.Biophys.Res.Commun.233,45-49,NEUMANN,E.etal.(1996).Biophys.J.71,868-877.PODDEVIN,B.etal.(1991).Biochem.Pharmacol.42Suppl，S67-S75.etal.，BARROSO,B.etal.(2002).Arch.Med.Res.32，273-276.ROLS,M.P.etal.(1998).Nat.Biotechnol.16，168-171.SATKAUSKAS,S.etal.(2001).Mol.Ther.4,317-323.SATKAUSKAS，S.etal.(2002).Mol.Ther.5，133-140.SERSA，Getal.Z.(1998).Eur,J.Cancer34，1213-1218.SOUBRIER,Retal.(1999).GeneTher.6,1482-1488.SUKHAREV，S.I.etal.(1992).Biophys.J.63,1320-1327.SUZUKI,T.etal.(1998).FEBSLett.425，436-440.TITOMIROV,A.V.etal.(1991).Biochim.Biophys.Acta1088,131-134.TROCHON-JOSEPH,V.etal.,CancerResearch2004,64:2062-2069.WELLS，J.M.etal.(2000).GeneTher.7，541-547.ZAHAROFF，D.A.etal.(2002).GeneTher.9,1286-1290.ZAHAROFF,D.A.，andYUAN,F.(2004).Bioelectrochemistry62,37-45.ZHANGL.etal.(1996).Biochem.Biophys.Res.Commun.220,633-636.權(quán)利要求1.核酸在制備用于在體內(nèi)轉(zhuǎn)移進(jìn)組織細(xì)胞中的藥物中的應(yīng)用，其中如下所述將所述藥物與組織細(xì)胞接觸，并對(duì)所述組織進(jìn)行電刺激-首先用至少一次200至2000伏特/cm的高壓場(chǎng)強(qiáng)脈沖刺激，-其次用單次的50至200伏特/cm及持續(xù)300至2000ms的低壓場(chǎng)強(qiáng)脈沖刺激。2.權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中所述單次的低壓脈沖的場(chǎng)強(qiáng)為50至140伏特/cm。3.權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中所述單次的低壓脈沖的場(chǎng)強(qiáng)為80至120伏特/cm。4.權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中所述單次的低壓脈沖的場(chǎng)強(qiáng)為90至110伏特/cm。5.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述單次的低壓脈沖的場(chǎng)強(qiáng)為100伏特/cm。6.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中使用200至1400伏特/cm的高壓場(chǎng)強(qiáng)。7.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中使用400至1200伏特/cm的高壓場(chǎng)強(qiáng)。8.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中使用600至800伏特/cm的高壓場(chǎng)強(qiáng)。9.權(quán)利要求7的應(yīng)用，其中使用700伏特/cm的高壓場(chǎng)強(qiáng)。10.權(quán)利要求l-9任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述組織是肌肉。11.權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中單次的低壓脈沖的場(chǎng)強(qiáng)為100至200伏特/cm。12.權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中單次的低壓脈沖的場(chǎng)強(qiáng)為120至160伏特/cm。13.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中單次的低壓脈沖的場(chǎng)強(qiáng)為140伏特/cm。14.權(quán)利要求1及11-13任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中使用400至2000伏特/cm的高壓場(chǎng)強(qiáng)。15.權(quán)利要求14的應(yīng)用，其中使用800至1600伏特/cm的高壓場(chǎng)強(qiáng)。16.權(quán)利要求14的應(yīng)用，其中使用900至1200伏特/cm的高壓場(chǎng)強(qiáng)。17.權(quán)利要求14的應(yīng)用，其中1000伏特/cm的高壓場(chǎng)強(qiáng)。18.權(quán)利要求1和11-17任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述組織是腫瘤組織。19.權(quán)利要求l-18任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述單次的低壓脈沖的持續(xù)時(shí)間為300至800ms。20.權(quán)利要求19的應(yīng)用，其中所述單次的低壓脈沖的持續(xù)時(shí)間為350至600ms。21.權(quán)利要求19的應(yīng)用，其中所述單次的低壓脈沖的持續(xù)時(shí)間為400ms。22.權(quán)利要求要求1-21任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述單次的低壓脈沖的極性與高壓脈沖的極性相反。23.權(quán)利要求l-22任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中使用單次的高壓脈沖。24.權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中使用的高壓場(chǎng)脈沖的持續(xù)時(shí)間為10至1000(is。25.權(quán)利要求24的應(yīng)用，其中使用的高壓場(chǎng)脈沖的持續(xù)時(shí)間為50至200|is。26.權(quán)利要求25的應(yīng)用，其中使用的高壓場(chǎng)脈沖的持續(xù)時(shí)間為100|is。27.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的應(yīng)用，其中高壓脈沖和低壓脈沖由延遲隔開(kāi)。28.權(quán)利要求27的應(yīng)用，其中所述延遲為300ms至3000s。29.權(quán)利要求28的應(yīng)用，其中所述延遲為500ms至1000s。30.權(quán)利要求29的應(yīng)用，其中所述延遲是1000ms。31.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的應(yīng)用，其中所述核酸在組織細(xì)胞中能產(chǎn)生一種治療活性分子或一些治療活性分子。32.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的應(yīng)用，其中使用在組織細(xì)胞中能產(chǎn)生不同治療活性的兩或多種核酸。33.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的應(yīng)用，其中所述核酸編碼RDD蛋白質(zhì)或其有效片段。34.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的應(yīng)用，其中所述藥物有效降低或抑制腫瘤血管發(fā)生。35.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的應(yīng)用，其中所述藥物降低或抑制腫瘤生長(zhǎng)。36.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的應(yīng)用，其中所述藥物抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。37.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的應(yīng)用，其中所述藥物是抗癌的。38.權(quán)利要求l-10和19-32任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述組織是肌肉，所述核酸編碼一或多種免疫原。39.權(quán)利要求38的應(yīng)用，其中所述一或多種免疫原是HIV免疫原。40.權(quán)利要求l-10和19-37任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述組織是肌肉。41.一種電穿孔方法，其包括將電極置于接觸皮膚的組織附近，其中所述組織在組織間隙含有核酸，然后如下對(duì)所述組織進(jìn)行電剌激-首先用至少一次200至2000伏特/cm的高壓(HV)場(chǎng)強(qiáng)脈沖刺激，-其次用50至140伏特/cm及持續(xù)300至2000ms的單次的低壓(LV)場(chǎng)強(qiáng)脈沖刺激，通過(guò)這種電刺激使得所述核酸被轉(zhuǎn)移至組織細(xì)胞中。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述刺激如權(quán)利要求2-29任一項(xiàng)所述。43.權(quán)利要求41或42的方法，其中所述核酸如權(quán)利要求31、32或33所述。44.權(quán)利要求41-43任一項(xiàng)的方法，其中所述組織是肌肉。45.權(quán)利要求41-43任一項(xiàng)的方法，其中所述組織是腫瘤組織。46.能表達(dá)分子的核酸在生產(chǎn)藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于將所述核酸輸送至組織細(xì)胞、特別是腫瘤或非腫瘤組織細(xì)胞例如肌細(xì)胞中的方法中，其中a)將所述核酸注射進(jìn)組織中，b)如下對(duì)所述組織進(jìn)行電刺激-首先用至少一次200至2000伏特/cm的高壓(HV)場(chǎng)強(qiáng)脈沖刺激，_其次用單次的50至200伏特/cm及持續(xù)時(shí)間為300至2000ms的低壓(LV)場(chǎng)強(qiáng)脈沖刺激。47.產(chǎn)生抗體、特別是多克隆抗體的方法，所述方法包括將免疫原編碼核酸注射進(jìn)活體動(dòng)物的組織、特別是肌肉中，對(duì)組織進(jìn)行如下電刺激-首先用至少一次200至2000伏特/cm的高壓(HV)場(chǎng)強(qiáng)脈沖刺激，一其次用單次的50至140伏特/cm及持續(xù)時(shí)間為300至2000ms的低壓(LV)場(chǎng)強(qiáng)脈沖刺激，通過(guò)這種電刺激使得所述核酸被轉(zhuǎn)移進(jìn)組織細(xì)胞中，在所述宿主中表達(dá)能激發(fā)宿主免疫應(yīng)答的免疫原，并回收所述抗體。全文摘要通過(guò)如下所述對(duì)組織進(jìn)行電刺激而將核酸電轉(zhuǎn)移進(jìn)組織細(xì)胞、特別是肌肉或腫瘤組織中首先用至少一次優(yōu)選單次的200至2000伏特/cm高壓場(chǎng)強(qiáng)脈沖刺激，其次用單次的50至200伏特/cm并持續(xù)300ms至2000ms的低壓場(chǎng)強(qiáng)脈沖刺激。文檔編號(hào)A61K48/00GK101252953SQ200680031640公開(kāi)日2008年8月27日申請(qǐng)日期2006年9月1日優(yōu)先權(quán)日2005年9月2日發(fā)明者D·米克拉夫契奇,L·米爾申請(qǐng)人:生物聯(lián)盟制藥公司;國(guó)立科學(xué)研究中心;古斯塔夫·魯西研究所