專利名稱：用包含帶電荷的季氨基的聚合物的核酸載體的修飾的制作方法
用包含帶電荷的季氨基的聚合物的核酸載體的修飾
技術領域：
本發(fā)明涉及修飾優(yōu)選用于遞送治療性轉基因或活性的粒子載體(包括病毒、病毒片段及自組裝合成的載體)的生物學和/或物理-化學性質的改良的方法。本發(fā)明也涉及已根據(jù)本發(fā)明修飾造成它們的生物學和/或物理-化學性質修飾或變化的核酸載體、它們的制備方法及它們在各領域(包括醫(yī)學)中的各生物技術策略中的用途。
背景技術：
微生物，包括病毒，在貫穿生物技術的廣領域有許多應用。它們涉及醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、工業(yè)生產(chǎn)工藝(顯然包括油及釀造工業(yè))及生物除污。已鑒定了許多有用的應用及功能，及開發(fā)用于所述生物學試劑。但是，常它們的活性的發(fā)展或增強被它們的精細的性質限制，限制它們實現(xiàn)理論上可能的但實際上超過它們的范圍的任務的能力。在此情況下，這相當常遇到，將常期望再改造病毒或微生物的性質以賦予其就其所需的目的更適當?shù)男再|。由此、生物學殺昆蟲劑(例如桿狀病毒)的有用性可受不適當?shù)陌刑禺愋约安焕脑诃h(huán)境中的存活特征所限；硫代謝細菌可在石油化學工業(yè)被不充分的發(fā)散及分布模式而有用的應用受限；及在人或獸醫(yī)學基因治療中，期望介導治療性基因的遞送的病毒的有用性可被在靶組織中轉基因表達的無效受限。體細胞基因治療領域在近年因為其改善許多不同的類型的疾病的治療的有效性而受到關注，所述疾病包括遺傳疾病(例如囊性纖維化、肌肉營養(yǎng)不良、酶缺陷)及由年齡相關的或損傷相關的生理劣化所致的疾病(癌，心臟病，成年型糖尿病)。但是，盡管該領域快速及廣泛發(fā)展，包括超過100例臨床試驗的起始，對患者的清楚的治療性益處的例子非常少。一項反義技術最近被許可給人使用，但尚無基因治療策略仍滿足它們的原許諾，及在可預見的將來在常規(guī)臨床應用中無可能獲得批準。也可將病毒用作疫苗抗原的有效遞送載體，例如通過編碼重組腺病毒‘載體’之內的瘧疾或流感蛋白。此類型的疫苗在實驗室研究中顯示針對廣范圍的重要的病原體的用途的巨大潛力。相關的技術領域已知為‘病毒治療’，其中裂解病毒(其可或不可加工為載荷治療性基因)能在癌細胞之內選擇性地復制，導致腫瘤之內的病毒擴增，腫瘤細胞的裂解及感染擴展到裂解復制循環(huán)重復的相鄰腫瘤細胞中。缺失治療性功效的原因部分反映患者群(被募集參加這些實驗治療的多數(shù)患者已患病頗重，從而甚至有效治療可顯示少的治療性益處)，但主要反映達到的治療性基因表達的不充分的水平、持續(xù)時間及分布。主要問題是，人受試者具有對病毒載體的先前既有的免疫(不像保持在無病原體環(huán)境中的實驗動物)。如果提供有先先前既有的對治療性病毒載體的免疫的實驗動物，它們未如它們在人中一樣在動物中顯示功效。甚至當可通過使用之前未暴露人群的病毒載體(及因此不前-免疫)避免人中先前既有的免疫時，仍有問題。 首次施用新病毒載體之后，我們的免疫系統(tǒng)將產(chǎn)生對其的應答，防止該載體隨后使用。這對于試劑的多次使用是必需的多數(shù)應用是尤其重要的。例如通常要求用第二或第三施用加強疫苗。簡言之，復雜的治療策略的成功的應用被不充分的用于基因遞送及表達的載體限制。迄今探究的用于基因治療應用的2種主要類型的載體是非-病毒(通?；陉栯x子脂質體)載體及病毒(通常反轉錄病毒、腺病毒、后來是腺伴隨病毒(aav)及慢病毒) 載體。開發(fā)用于病毒治療的裂解病毒包括腺病毒(全部血清型)、皰疹病毒、披膜病毒(有名的是α病毒例如辛德畢斯及西門利克森林病毒)、心臟病毒(有名的是義！^⑽ Valley病毒)、痘苗病毒、肺泡口炎病毒、新城疫病毒、麻疹病毒及呼腸孤病毒。病毒是作為用于基因遞送的載體的明顯的選擇，由于這基本上是它們在自然中的唯一功能。隨后病毒至今在基因治療中顯著使用，形成大部分載體用于臨床研究。腺病毒的限制它們的成功的應用的主要特征是它們的免疫原性。盡管它們是專業(yè)病原體，進化了百萬年成為高度有效基因遞送載體，它們的宿主類似地發(fā)展了非常有效的保護機理。來自癌患者的血清及腹水流體含甚至以高稀釋度可完全阻止病毒體外感染的抗體。涉及腺病毒的典型的人流程導致顯著的炎癥應答、以及無效的靶細胞感染。盡管非-病毒系統(tǒng)具有得多更佳安全性記錄，及更容易大量產(chǎn)生，它們具有低特異性轉染活性。靶組織中的基因表達效率也是與非-病毒系統(tǒng)相關的主要問題。對于目前可用的用于治療疾病的載體的成功的應用的另一主要限制是通過直接應用或通過動脈內施用直接將它們施用到疾病位點的需求。尚無載體能在靜脈內注射后靶向特異性細胞。陽離子脂質系統(tǒng)阻塞它們遇到的第一毛細管床、肺部床、而腺病毒/反轉錄病毒被肝臟快速攝取及(在動物研究中)介導局部毒性。盡管局部施用對于治療某些疾病 (例如器官上皮囊性纖維化)可行，其他疾病具有更廣泛的分布(有名的是臨床癌及動脈粥樣硬化)，且靜脈內靶向的基因遞送對于成功的基因治療的可能性是關鍵性的。已經(jīng)開發(fā)基因遞送載體(例如基于DNA的聚電解質復合物或聚合物-修飾的病毒)來克服這些問題。描述于WO 98/44143的一種用于輔助病毒的臨床應用的方法用有單官能基的聚合物(例如帶有末端胺-反應性基團的聚(乙二醇)(PEG))修飾病毒表面。此可導致被血清抗體感染的降低的中和。此方法(經(jīng)對于5型腺病毒的CAR受體)保持關于靶細胞的正常受體-結合及感染，但呈現(xiàn)不介導正常感染性的消失(以去除非-靶細胞的不想要的感染)，也不輔助病毒再-靶向選定的受體的問題，以獲得有用的及治療性地-相關的向性。WO 00/74722描述通過用具有多個反應性基團的多價聚合物包被提供來修飾生物學元件(例如病毒)的生物學和/或物理化學性質的方法。此方法可致使一些生物學元件在宿主生物學系統(tǒng)中靶向或再-靶向到特定位點及可與用于基因治療或抗腫瘤治療的病毒載體聯(lián)用。但是，這些既有的方法不能夠完全包被核酸載體，它們也不能夠選擇性地包被那些最易被抗體識別的載體的區(qū)。意外地發(fā)現(xiàn)，當采用包括帶正電的季氨基的反應性聚合物時，核酸載體被更快速且有效包被。而且，意外地發(fā)現(xiàn)，當用本發(fā)明包被時，可掩蓋某些核酸載體區(qū)，其將經(jīng)歷被抗體識別。所述區(qū)一般帶負電或是在核酸載體表面的酸區(qū)。也發(fā)現(xiàn)，用帶有正電的多價反應性聚合物包被的核酸載體(尤其是病毒)可喪失它們感染細胞的能力。但是，當將可降解的或可生物降解的序列導入包被聚合物時，意外地發(fā)現(xiàn)，感染靶細胞的能力可恢復。有時由帶正電的聚合物包被與細胞表面的靜電相互作用介導的進入細胞后，此恢復的感染發(fā)生，且有時感染可恢復的通過將受體-結合配體導入到聚合物包被的病毒，以經(jīng)選擇的細胞-表面受體促進細胞進入。在任一情況中，成功的感染依賴于聚合物包被中有可生物降解的序列?？梢?種方式將生物降解性導入聚合物，即(i)聚合物主鏈可為可生物降解的， ( )聚合物主鏈和核酸載體之間的連鍵可為可生物降解的，或(iii)聚合物主鏈和帶正電的季氨基之間的連鍵可為可生物降解的?？缮锝到獾倪B鍵一般是可還原的、可水解的或可通過酶切割。本發(fā)明的此特定優(yōu)勢被認為產(chǎn)生自核酸載體通過遞送到細胞內側或外側的靶位點期間或到達在細胞內側或外側的靶位點后處理從聚合物包被釋放的能力。由此，在聚合物或聚合物主鏈與核酸載體之間的連鍵可生物降解的任一情況中，這些可降解的連鍵分裂后，聚合物將僅通過載體表面和帶正電的季氨基之間的靜電相互作用松散結合到核酸載體。當聚合物主鏈和帶正電的季氨基之間的連鍵是可生物降解的時，這些可降解的連鍵分裂后，得到的中性聚合物將欠強烈結合到載體表面。初始測試顯示，通過包括腙基的接頭連接到核酸載體的聚合物具有意外高的靶細胞感染性。發(fā)明概述本發(fā)明因此提供聚合物修飾的核酸載體，其中核酸載體共價連接于聚合物，該聚合物包括一個或多個帶正電的季氨基，其中所述核酸載體是選自下列的微生物病毒、細菌或噬菌體、真菌、孢子、真核細胞核或含遺傳信息的其他微生物片段或成分，且其中(a)聚合物和/或其與核酸載體之間的連鍵可水解地、還原性地或酶學地降解；和 /或(b)其中各帶正電的季氨基均經(jīng)一個或多個可降解的或可生物降解的連鍵連接到聚合物主鏈。也提供修飾核酸載體的生物學和/或物理化學性質的方法，所述方法包括使所述核酸載體與聚合物反應，該聚合物包括一個或多個帶正電的季氨基及一個或多個反應性基團，從而將核酸載體通過一個或多個共價連鍵連接到聚合物，以獲得聚合物修飾的核酸載體，其中所述核酸載體是選自下列的微生物病毒、細菌或噬菌體、真菌、孢子、真核細胞核或含遺傳信息的其他微生物片段或成分，且其中(a)聚合物和/或其和核酸載體之間的一個或多個共價連鍵可水解地、還原性地或酶學地降解；和/或(b)其中各帶正電的季氨基均經(jīng)一個或多個可降解的或可生物降解的連鍵連接到聚合物主鏈。也提供可通過本發(fā)明的方法獲得的聚合物修飾的核酸載體。 也提供組合物，其包括本發(fā)明的聚合物修飾的核酸載體及適宜稀釋劑或載質。也提供基因治療方法(包括遺傳疫苗接種)，該方法包括給需要所述治療的患者施用有治療活性的、非毒性量的本發(fā)明的聚合物修飾的核酸載體或本發(fā)明的組合物，該聚合物修飾的核酸載體包括治療性遺傳物質。也提供本發(fā)明的聚合物修飾的核酸載體在制備用于疫苗接種或基因治療的藥物中的用途，其中所述聚合物修飾的核酸載體包括治療性遺傳物質。發(fā)明詳述如本文所用，術語"核酸載體"指包括核酸的媒質。一般而言，核酸載體包括治療性遺傳物質。需知，本文中使用術語"治療性遺傳物質"來廣義表示施用以獲得治療效果的任何遺傳物質或核酸，例如通過治療性地有用的蛋白或RNA的表達。需知，在本發(fā)明的聚合物修飾的核酸載體中，通常不存在未反應的反應性基團。但是，可有其中一些未反應的反應性基團保留在聚合物修飾的核酸載體中的情況，從而可導入生物學活性劑，例如。在那些情況中，因此，聚合物修飾的核酸載體還包括一個或多個反
應性基團。一般而言、聚合物與核酸載體的連接及后者的修飾導致核酸載體在宿主生物學系統(tǒng)中與會與其正常相互作用的其他分子相互作用的能力的抑制，或導致核酸載體與會與其正常結合的位點或受體結合的能力的抑制。核酸載體的某些期望相互作用，當然，將保留。 聚合物與核酸載體的連接一般導致抑制與分子(例如將正常中和核酸載體的血清抗體)相互作用的核酸載體的能力。一般而言、核酸載體是選自下列的微生物病毒、細菌、噬菌體、真菌、孢子或真核細胞核。優(yōu)選病毒及病毒粒子。更優(yōu)選地，核酸載體是含治療性遺傳物質的病毒載體或有固有的治療性活性的病毒。原理上，任何已知的病毒可在本發(fā)明中使用作為核酸載體。病毒優(yōu)選重組遺傳加工的病毒。重組病毒任選含轉基因。需知，本文中使用術語"轉基因" 來表示對于病毒不是天然的核酸。例如、轉基因可編碼生物學有功能的蛋白或肽、反義分子或標記物分子。病毒是RNA或DNA病毒，及可選來自以下科及組之一腺病毒科；苜?；ㄈ~病毒屬；雀麥花葉病毒科；α隱病毒屬；分病毒科；桿狀病毒科；桿狀DNA病毒屬；β隱病毒屬；分病毒科；二聯(lián)病毒屬；雙粒病毒科；雙RNA病毒科；雀麥草花葉病毒；雀麥草花葉病毒科；大麥黃化花葉病毒屬；馬鈴薯Y病毒科；布尼亞病毒科；嵌杯病毒科；毛狀病毒組；石竹隱潛病毒組；麝香石竹斑駁病毒屬病毒組；花椰菜花葉病毒組；線形病毒組；鴨跖草黃斑駁病毒組；豇豆花葉病毒組；冠狀病毒科；ΡΜ2噬菌體組；環(huán)狀構象病毒科；潛隱病毒組；隱病毒組；黃瓜花葉病毒屬病毒CD6噬菌體組；囊病毒科；質型彈狀病毒屬；彈狀病毒科；康乃馨環(huán)斑病組；石竹病毒病毒組；蠶豆萎蔫病毒組；碗豆耳突花葉病毒；豆病毒屬病毒組；斐濟病毒呼腸病毒科；纖絲病毒科；黃病毒科；真菌傳棒狀病毒組；雙粒病毒組； 賈第蟲病毒組；嗜肝DNA病毒科；皰疹病毒科；大麥病毒組；Hybrigeminiviruses ；雙粒病毒科；懸鉤子病毒屬；等軸不穩(wěn)定環(huán)斑病毒組；絲桿病毒科；甘薯輕型斑駁病毒屬；馬鈴薯 Y病毒科；虹膜病毒科；輕病毒科；脂毛病毒科；黃矮病毒組；玉米褪綠斑駁病毒屬；橙桑花葉病毒屬；玉米雷亞多非納病毒組；玉米褪綠矮縮病毒組；微病毒科；Monogeminiviruses ； 雙粒病毒科；肌病毒科；Nanaviruses ；壞死病毒組；蠕傳多角體病毒組；野田村病毒科；核型彈狀病毒屬；彈狀病毒科；正粘病毒科；水稻矮縮病毒呼腸病毒科；Ourmia甜瓜病毒屬；乳多空病毒科；副粘病毒科；歐防風黃點病毒組；分病毒科；包括腺伴隨病毒的細小病毒科；豌豆耳突花葉病毒組；藻DNA病毒科；植物呼腸病毒屬呼腸病毒科；小RNA病毒科；Plasmarviridae ；短尾病毒科；多DNA病毒科；馬鈴薯X病毒組；馬鈴薯Y病毒屬；痘病毒科；呼腸病毒科；逆轉錄病毒科；彈狀病毒科；根前毛菌噬菌體組；黑麥草花葉病毒屬馬鈴薯Y病毒科；衛(wèi)星RNA;衛(wèi)星病毒屬Jequi病毒屬fequi病毒科；南方菜豆花葉病毒組；管狀病毒科；南方菜豆花葉病毒組；SSVI-型噬菌體；覆蓋層病毒科；纖細病毒屬； Tetravirirdae ；煙草花葉病毒組；煙草脆裂病毒組；披膜病毒科；蕃茄叢矮病毒屬；蕃茄斑萎病毒屬；布尼亞病毒科；環(huán)曲病毒組；全病毒科；蕪箐花葉病毒屬；蕪箐花葉病毒組；植物病毒衛(wèi)星；傘形植物病毒屬；未指定的馬鈴薯Y病毒；馬鈴薯Y病毒科；未指定的棒狀病毒；彈狀病毒科；巨脈病毒屬；矮化病毒屬Aequi病毒科；未分組的病毒。一般而言，核酸載體是在宿主中與特定位點或受體正常相互作用的病毒，其中所述帶有帶正電的季氨基的單價或多價反應性聚合物掩蓋病毒的正常受體-結合活性和/或能使其在宿主中重新靶向新的或不同的位點或受體。核酸載體可為反轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、桿狀病毒、皰疹病毒、乳多泡病毒或痘病毒。對于一些應用而言，核酸載體可為基于腺病毒、皰疹病毒、痘苗病毒或α病毒的重組病毒。優(yōu)選地、核酸載體是基于腺病毒、皰疹病毒、細小病毒、痘病毒、披膜病毒、輪狀病毒或小核糖核酸病毒的病毒。腺病毒是尤其優(yōu)選的。腺病毒包括非-人腺病毒例如禽類腺病毒CEL0。在核酸載體是具有外部包膜的病毒的一些情況中，將其與聚合物反應之前的初步步驟可包括剝離包膜。適宜于用作核酸載體的核酸載體成分可由例如、病毒核心或原病毒(來自例如痘病毒)提供。病毒核心之一例是可通過公開于Russell，W. C.，Μ.，K.，Skehel, J. J. (1972). “ The preparation and properties of adenovirus cores" Journal of General Virology 11，35-46的方法及其修飾制備的腺病毒核心。一般而言，核酸載體是病毒或病毒核心。本發(fā)明實施中使用的細菌核酸載體可包括，例如實驗基因治療中使用的細菌(例如沙門氏菌屬)、用作生物學殺蟲劑的細菌或桿狀病毒(殺蟲劑農(nóng)藥)(例如核 polydedrosis病毒NPD、非封閉病毒NV、顆粒體病毒或蘇云金芽孢桿菌)、作為降解油污泥 /泄漏有用的細菌株或其遺傳修飾形式(例如腸桿菌科、硝酸鹽陰性、假單胞菌屬、微球菌屬、叢毛平胞菌屬、黃單胞菌屬、無色桿菌屬或Vidrio-氣膽胞菌)、負責在油中將硫還原成 H2S的細菌株(例如petrotoga snobilis、petrotoga miotherma、致黑脫硫腸狀菌、脫硫弧菌屬)或能氧化來自油的硫的細菌株(例如紅球菌屬株ECRD-1)。適宜于用作核酸載體的細菌的其他實施例選自下列之一日本甲蟲立克次小體、 日本甲蟲芽胞桿菌、蘇云金桿菌(包括其亞種，以色列亞種、庫斯塔克亞種及球形桿菌)、乳病芽胞桿菌、球形桿菌、壞死梭菌、銅綠假單胞菌及嗜線蟲致病桿菌。適宜于用作核酸載體的噬菌體是例如來自以下科之一藻病毒，人字形噬菌體，絲桿病毒屬，輕病毒科，長尾病毒科，微病毒科，短桿病毒屬，原生病毒科，Corticoviridae，衛(wèi)星噬菌體、肌病毒科，短尾病毒科，T-偶噬菌體。特定噬菌體之一例是MV-L3，PI, P2，P22， P29, SPOI，T4, T7, MV-L2, PM2, Fl, MV-L51, oul74, 06，MS2, M13, Qp，覆蓋層病毒科(例如 PRD1)。適宜于用作核酸載體的真菌是例如來自下列家族之一擔子菌綱(其產(chǎn)生擔孢子，其包括下列類，例如腹菌綱、層菌綱、銹菌綱、黑粉菌綱)、白僵菌屬、綠僵菌屬、蟲霉屬或雕蝕菌屬。適宜于用作核酸載體的孢子是擔孢子、放線菌屬、節(jié)桿菌屬、細桿菌屬、梭菌屬、 紅球菌屬、高溫單孢菌屬或煙曲霉菌。適宜于用作核酸載體的細菌的其他實施例是選自下列之一日本甲蟲立克次小體、日本甲蟲芽胞桿菌、蘇云金桿菌(包括其亞種，以色列亞種、庫斯塔克亞種及球形桿菌)、乳病芽胞桿菌、球形桿菌、壞死梭菌、銅綠假單胞菌及嗜線蟲致病桿菌。在某些情況下，核酸載體通過核酸與帶正電的聚合物和/或脂質之間的自裝配形成。術語核酸包括合成的分子，例如siRNA、反義RNA及反義DNA。通常、核酸是mRNA或DNA。 在此實施方式中，由此形成的聚電解質載體通常帶有靜陰性表面帶電性。由此，核酸及帶正電的脂質或聚合物的帶電性比(+/_) —般小于1. 0。優(yōu)選0. 8 0. 9的帶電性比。一般而言，存在于本發(fā)明的聚合物修飾的核酸載體的聚合物是多價聚合物。一般而言，通過2或多個連鍵將聚合物連接到核酸載體，使用的聚合物是多價聚合物，即其包括多個反應性基團。聚合物和核酸載體之間的連鍵的數(shù)優(yōu)選3或多個、更優(yōu)選 4或多個。連鍵的數(shù)可為例如12或14個。具有更高的數(shù)連接的優(yōu)勢是聚合物修飾的核酸載體更穩(wěn)定。聚合物主鏈優(yōu)選基于如下單體單元N-2-羥基丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)、 N-(2-羥基乙基)-1-谷氨酰胺(HEG)、乙二醇-寡肽或是聚唾液酸或聚甘露糖聚合物。優(yōu)選HPMA。其中主鏈基于乙二醇-寡肽，寡肽基優(yōu)選包括1 4肽基。一般情況下，本發(fā)明中使用的聚合物使用活基多聚化方法(例如如ScaleS，C. W.； Vasilieva, Y. A. ；Convertine, A. J. ；Lowe, Α. B. ；McCormick，C. L. Biomacromolecules 2005，6，1846-1850 ；Yanjarappa，Μ. J. ；Gujraty，K. V. ；Joshi, Α. ；Saraph，Α. ；Kane， R. S. Biomacromolecules 2006，7，1665—1670 ；Convertine，A. J. ；Ayres，N. ；Scales，C. W.； Lowe ,Α. B. ；McCormick, C. L Biomacromolecules2004，5，1177-1180 中所述的 ATRP (原子轉移自由基多聚化)或RAFT(可逆添加-片段化鏈轉移)，其通過引用整體并入本文)制備。相關教導也可見于 iMacromolecular design via reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT)/xanthates(MADIX) polymerization.，Perrier, Sebastien ；Takolpuckdee, Pittaya. J. Polym. Sci.，Part A Polym. Chem. (2005)，43 (22)，5347-5393，其通過引用并入本文。
聚合物和/或其與核酸載體之間的連鍵可水解地、還原性地或酶學地降解。在一實施方式中、聚合物和/或其與核酸載體之間的連鍵可水解或酶解。優(yōu)選地，聚合物和/或其與核酸載體之間的連鍵可水解性地降解。優(yōu)選地，聚合物和核酸載體之間的連鍵可水解地、還原性地或酶學地降解。一般而言，可水解地、還原性地或酶學地降解的聚合物和/或其與核酸載體之間的連鍵包括二硫化物、腙或酰胼基團，優(yōu)選酰胼或腙基，更優(yōu)選腙基。以下更詳細討論這些基團及它們的切割條件。在一實施方式中，當所述可水解性地，還原性地或酶學地降解的聚合物和/或其與核酸載體之間的連鍵包括二硫基時，則本文定義的生物學活性劑偶聯(lián)于或包括于聚合物。在此實施方式中，生物學活性劑優(yōu)選糖，更優(yōu)選甘露糖。此具有體內再靶向載體的效應。在另一實施方式中，當可水解性地，還原性地或酶學地降解的聚合物和/或其與
12核酸載體之間的連鍵包括腙基時，則帶正電的聚合物本身具有體內再靶向載體的效應?？善谕伤庑越到庑蕴峁┑牟环€(wěn)定性，由于其允許調節(jié)核酸載體被保護的時間。由此，如果聚合物用組織-特異性靶向基團(即本文定義的生物學活性劑)提供，可將聚合物(或聚合物和核酸載體之間的連鍵)設計為，只要其在崩解、游離核酸載體而與組織相互作用之前使修飾的核酸載體達到靶組織之內的適當?shù)奈恢?，聚合物保護核酸載體?；蛘?，聚合物可設計為以產(chǎn)生核酸載體的釋放的最佳動力學的速度崩解?？伤庑缘亟到獾倪B鍵的實施例包括酰胼及腙連鍵?？善谕擅复倏山到庑蕴峁┑牟环€(wěn)定性，由于其允許設計聚合物(或聚合物和核酸載體之間的連鍵)用于通過選擇的酶選擇性地切割。所述酶可存在于靶位點，賦予修飾的核酸載體在靶位點激發(fā)的解離的可能性，由此釋放核酸載體而與靶組織相互作用。酶也可為可造成修飾的核酸載體在靶細胞的選定的細胞分區(qū)中的解離的細胞內酶，以增強核酸載體的活性?；蛘撸?切割位點可設計為促進修飾的核酸載體響應適當?shù)纳飳W活性解離(例如到達表達金屬硫蛋白酶的侵襲或轉移性腫瘤細胞)。在其他變化中，可在適當?shù)臅r間或位點施用能活化修飾的核酸載體的酶，以介導修飾的核酸載體的所需的解離及隨后核酸載體與組織的相互作用?？擅笇W地降解的連鍵的實施例包括作為用于通過特異性酶(例如組織蛋白酶D或弗林蛋白酶)切割的底物的寡肽序列，例如用于通過組織蛋白酶B降解的GlyPheLeuGly。在至少一些實施方式中，用于修飾核酸載體的聚合物優(yōu)選交聯(lián)，以至于形成水凝膠。水凝膠優(yōu)選水解性地不穩(wěn)定或可通過酶(例如基質金屬硫蛋白酶2或9)降解。這是以便核酸載體固定在水凝膠之內及從而可調節(jié)核酸載體的釋放。由此，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的特征，本發(fā)明的方法在可能促進交聯(lián)及水凝膠形成的條件下(例如高濃度的試劑，無過量存在)或在試劑(例如可能促進交聯(lián)的二胺)的存在下實施。含修飾的核酸載體的水凝膠的形成將通常使用描述于 Subr, V.，Duncan, R. and Kopeck, J. (1990) “ Release of macromolecules and daunomycin from hydrophilic gels containing enzymatically degradable bonds"，J. Biomater. Sci. Polymer Edn.，1 (4)61—278 的化學方法進對亍。本發(fā)明中使用的聚合物一般在聚合物主鏈或在側鏈，優(yōu)選在側鏈包括一個或多個帶正電的季氨基?！愣?、一個或多個帶正電的季氨基各自直接或經(jīng)間隔物基團連接于聚合物主鏈。一般而言，間隔物基團如本文定義。在一實施方式中，所述間隔物基團是本文定義的基團L。聚合物中帶正電的季氨基的數(shù)優(yōu)選例如以基于聚合物的總重量提供0.25 IOmol %、更優(yōu)選0. 5 7. 5mol%及最優(yōu)選1. 5 5mol %的帶正電的季氨基。通常，帶正電的季氨基在聚合物之內隨機間隔。當聚合物是單價聚合物，即具有僅1個反應性基團時，帶正電的季氨基優(yōu)選定位接近于反應性基團。一般而言，連接于聚合物主鏈的帶正電的季氨基選自本文定義的式la、lb、Ic、Id 及Ie的帶正電的季氨基。優(yōu)選式Ia的帶正電的季氨基。在一些優(yōu)選的實施方式中，各帶正電的季氨基均經(jīng)一個或多個可降解的或可生物降解的連鍵、優(yōu)選1個可降解的或可生物降解的連鍵連接到聚合物。這些連接可為帶正電的季氨基和聚合物主鏈之間的直接鍵或，或者，所述間隔物基團內的鍵。一般而言，所述連接指可還原的、可水解的或別樣地可切割的鍵。所述鍵的實施例包括二硫鍵、-N-N-鍵(例如存在于酰胼或腙基)、縮醛部分或可酶學地切割的鍵。二硫鍵、-S-S- 一般使用弱的還原條件(例如金屬亞硫酸鹽)或使用適宜地選擇的酶(例如硫氧還蛋白)切割。一般而言，選擇切割條件以便載體活力不受影響?？纱嬖谟邗ｋ莼螂昊?N-N-鍵一般使用低pH或弱的氧化性或還原性條件切割。 優(yōu)選地，所述鍵在含水酸條件下切割，一般在約4 約7，優(yōu)選4 6. 5，更優(yōu)選4. 4 6. 4 的PH下。再次，一般選擇切割條件，從而載體活力不受影響。酰胼基團是含部分-N-NR-的基團，其中R是?；糠?。這樣的基團為本領于技術人員熟知。腙基是含部分-C = N-N-的基團。這樣的基團為本領于技術人員熟知?？s醛部分為本領于技術人員熟知及容易使用含水酸切割。酶學地可切割的鍵一般如本文中關于反應性基團和聚合物主鏈之間的連鍵討論。在一些實施方式中，將核酸載體及帶正電的季氨基經(jīng)可降解的鍵連接到聚合物。 在此實施方式中，核酸載體和聚合物之間的鍵及帶正電的季氨基和聚合物之間的鍵可在相同的條件下切割。但是，優(yōu)選核酸載體和聚合物之間的鍵及帶正電的季氨基和聚合物之間的鍵不在相同的條件下切割。由此，可切割帶正電的季氨基和聚合物之間的鍵而保持核酸載體和聚合物主鏈之間的鍵完整。以此方式，可從聚合物修飾的核酸載體除去帶正電的季氨基，保留附接到核酸載體的聚合物。發(fā)現(xiàn)正常感染核酸載體(例如根據(jù)本發(fā)明修飾的病毒)喪失它們的原感染性向性。在某些優(yōu)選的實施方式中，帶正電的包被聚合物的存在可本身用于促進經(jīng)與細胞膜的靜電相互作用攝取入細胞，其可導致感染；另外，感染性可通過將生物學活性劑偶聯(lián)于聚合物來恢復或取代。生物學活性劑是可選在其與核酸載體結合前或后偶聯(lián)于聚合物。優(yōu)選地， 在靶向試劑(即生物學活性劑)具有多個反應性基團的情況中，其在聚合物包被核酸載體后偶聯(lián)于聚合物，以避免其干擾偶聯(lián)反應，但在其他情況中，在包被核酸載體之前將其連接到聚合物即可。一般而言，生物學活性劑偶聯(lián)于或包括于聚合物。生物學活性劑可使用與用于連接反應性聚合物和核酸載體的相同類型的反應性基團合并入，或其可使用不同的化學偶聯(lián)。在后者，將使用異源多官能反應性聚合物(例如含混合的ONp酯及硫醇基)。優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明合并所述生物學活性劑以改善靶向、組織滲透、藥代動力學或免疫刺激或懸浮。生物學活性劑可為例如，生長因子或細胞因子、糖、激素、脂質、磷脂、脂肪、 載脂蛋白、細胞粘接促進劑、酶、毒素、肽、糖蛋白、血清蛋白質、維生素、礦物、佐劑分子、核酸、免疫調節(jié)元件、Toll-樣受體的配體或識別受體的抗體，例如生長因子受體或識別組織-特異性抗原或腫瘤-相關的抗原。試劑可為Sialyl Lewis X，其可用于靶內皮組織?？贵w優(yōu)選用作的生物學活性劑，以使修飾的核酸載體再-靶向不同的靶位點，其可包括例如，各受體、不同的細胞、細胞外環(huán)境及其他蛋白。可使用廣范圍的不同的形式的抗體，包括單克隆抗體、多克隆抗體、二體、嵌合抗體、人源化抗體、雙特異性抗體、camalid 抗體、Fab片段、Fc片段及Fv分子。對于用于靶向腫瘤而言，適宜生物學活性劑為例如抗體識別癌相關的抗原例如癌胚胎抗原或α -甲胎蛋白、腱糖蛋白、HER-2原癌基因、前列腺特異性抗原或MUC-I或識別與腫瘤-相關的內皮細胞相關的抗原(例如血管內皮生長因子(VEGF)、Tiel、Tie2、P-選擇素、E-選擇素的受體或前列腺-特異性膜抗原(PSMA))的抗體。用作發(fā)揮允許應用的柔性的一般的接頭的作用的生物學活性劑的適宜多目的蛋白是蛋白G(此將結合抗體，允許用來自多數(shù)物種的任何IgG類抗體表面修飾)，蛋白A(其具有類似于蛋白G的性質)，親和素(其以允許任何生物素標記的元件摻到表面的非常高的親和性結合生物素)，鏈霉親和素(其具有類似于親和素的性質)，外親和素(extravidin) (其具有類似于親和素的性質)，金環(huán)蛇毒素-結合肽(其結合金環(huán)蛇毒素融合蛋白)，麥胚凝集素(其結合糖)，六組氨酸(其允許在鎳螯合柱上溫和純化)，GST (其允許通過親和層析溫和純化)。用作生物學活性劑的適宜生長因子或細胞因子是例如腦來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子、纖毛神經(jīng)營養(yǎng)因子、b-內皮生長因子、表皮生長因子(EGF)、酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、粒細胞集落-刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落-刺激因子、生長激素釋放激素、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子-I、胰島素樣生長因子-II、白細胞介素_la、白細胞介素-lb、白細胞介素2、白細胞介素3、白細胞介素4、白細胞介素5、白細胞介素6、白細胞介素7、白細胞介素8、白細胞介素9、白細胞介素10、白細胞介素11、白細胞介素12、白細胞介素13、角質形成細胞生長因子、瘦素、肝臟細胞生長因子、巨噬細胞集落刺激因子、巨噬細胞炎癥蛋白la、巨噬細胞炎癥蛋白lb、單核細胞趨化蛋白1，2_甲氧基雌二醇、b-神經(jīng)生長因子、2. 5s神經(jīng)生長因子、7s神經(jīng)生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、神經(jīng)營養(yǎng)因子-4、血小板來源的生長因子AA、血小板來源的生長因子AB、血小板來源的生長因子BB、性激素結合球蛋白、干細胞因子、轉化生長因子-β 1、轉化生長因子-β 3、 腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子β、血管內皮生長因子及血管內皮生長因子C。用作用于摻入的生物學活性劑的適宜糖是單糖、二糖或多糖，包括分支的多糖，例如、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、L-巖藻糖及乳糖。在一些實施方式中，尤其優(yōu)選甘露糖。糖一般通過氨基衍生化摻入。適宜于用作生物學活性劑的激素是例如，腎上腺髓質素、促腎上腺皮質激素、絨毛膜促性腺激素、皮質酮、雌二醇、雌三醇、促卵泡激素、促胃液素1、高血糖素、促性腺激素、生長激素、氫化可的松、胰島素、瘦素、黑色素細胞刺激激素、褪黑激素、縮宮素、甲狀旁腺素、 催乳素、孕酮、胰泌素、促血小板生成素、促甲狀腺素、甲狀腺刺激激素及加壓素。用作用于靶向聚合物修飾的核酸載體或用于提供立體保護的生物學活性劑的適宜脂質、脂肪或磷脂是例如，膽留醇、甘油、糖脂、長鏈脂肪酸，尤其不飽和的脂肪酸，例如油酸、血小板活化因子、鞘磷脂、磷脂酰膽堿或磷脂酰絲氨酸。用作生物學活性劑的適宜細胞粘接促進劑可由以下提供，例如，纖連蛋白、層粘連蛋白、凝血酶敏感蛋白、玻連蛋白、聚陽離子、整聯(lián)蛋白或由寡肽序列結合整聯(lián)蛋白或四跨距跨膜蛋白提供。用作也可提供立體保護的生物學活性劑的適宜載脂蛋白是例如，高-密度脂蛋白或低-密度脂蛋白或其成分。用作生物學活性劑的為促進修飾的核酸載體通過特定環(huán)境的遷移率的適宜酶是例如，能降解細胞外基質的酶(例如明膠酶、例如1 11型基質金屬蛋白酶、或透明質酸酶)、能降解核酸的酶(例如脫氧核糖核酸酶I、脫氧核糖核酸酶II、核酸酶、核糖核酸酶 A)、能降解蛋白的酶(例如羧肽酶、纖溶酶、組織蛋白酶、內蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、凝血酶、胰蛋白酶、組織類型纖溶酶原活化物或尿激酶類型纖溶酶原活化物)、酶輔助檢測 (例如熒光素酶、過氧化物酶、b-半乳糖苷酶)或其他有用的酶，例如淀粉酶，內切糖苷酶， 內_b-半乳糖苷酶，半乳糖苷酶，肝素酶，HIV反轉錄酶，b-羥基丁酸脫氫酶，胰島素受體激酶，溶菌酶，神經(jīng)氨酸酶，氧化氮合酶，蛋白二硫化物異構酶。用作生物學活性劑來結合受體或來與細胞膜相互作用的適宜毒素是例如，霍亂毒素B亞基，響尾蛇毒素B亞基，樹眼睛蛇毒素，蓖麻毒素B鏈。用作生物學活性劑的適宜肽可由以下提供，例如，轉鐵蛋白、綠/藍/黃色熒光蛋白、腎上腺髓質素、淀粉樣肽、血管緊張素I、血管緊張素II、Arg-Gly-Asp、房肽素、內皮縮血管肽、纖維蛋白肽A、纖維蛋白肽B、加蘭肽、促胃液素、谷胱甘肽、層粘連蛋白、神經(jīng)肽、 Asn-Gly-Arg、含整聯(lián)蛋白結合基序的肽、使用噬菌體庫鑒定的靶向肽、含核定位序列的肽及含線粒體歸巢序列的肽。用作生物學活性劑的適宜血清蛋白質是例如，白蛋白、補體蛋白、轉鐵蛋白、纖維蛋白原或纖溶酶原。用作生物學活性劑的適宜維生素或礦物是例如，維生素B 12、維生素B 16或葉酸。適宜Toll-樣受體的配體為本領于技術人員熟知。實施例包括脂肽Pam3cyS。一般而言，核酸載體的修飾具有在生物學宿主中將核酸載體再靶向不同的受體的效應。由此觀察到，根據(jù)本發(fā)明的聚合物修飾的核酸載體可合成，以使靶向高度特異性組的細胞，例如腫瘤細胞。但是，同時發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的聚合物修飾的核酸載體通常不被中和抗體致使失活。此被認為是因為修飾的核酸載體被聚合物罩住。核酸載體被聚合物罩住已發(fā)現(xiàn)具有其他潛在優(yōu)點，包括增加的架存期及更佳抗性低PH。而且，可能使用相比對于既有的未修飾的核酸載體可行的技術更攻擊性的技術純化所述核酸載體。任選聚合物可偶聯(lián)于放射性同位素，以便允許例如在生物學環(huán)境中檢測核酸載體。在一實施方式中，核酸載體的修飾具有修飾非含水環(huán)境中核酸載體的溶解度及分散性及穩(wěn)定性特征的效應。在此實施方式中，核酸載體通常是具有油降解活性的微生物。 優(yōu)選地，核酸載體是桿狀病毒粒子。在此實施方式中，聚合物一般摻入油烯基或其他疏水基團。待包被的病毒粒子正常必需經(jīng)高度純化及無污染蛋白或肽。包被反應正常在 7. 4 8. 4的pH范圍之內進行，優(yōu)選在7. 8 8. 0進行。任何適宜緩沖液可用于實現(xiàn)期望的 PH，除了可與聚合物反應緩沖液(例如基于Tris的緩沖液)之外。反應可在生理鹽(150mM NaCl)濃度及可用于穩(wěn)定病毒制劑的其他穩(wěn)定劑(例如Mg2+或Ca2+)的存在下發(fā)生。反應處理期間不建議使用疊氮化鈉或其他防腐劑。于室溫1小時后聚合物包被反應達到飽和， 但在更低溫度可需要更長持續(xù)時間。對于再靶向或額外的官能性而言，可能在如前所述的包被反應期間添加額外的生物學試劑(例如抗體、配體或肽)，見例如Fisher KD, Stallwood Y, Green NK5Ulbrich K,Mautner V, Seymour Lff. Polymer-coated adenovirus permits efficient retargeting and evades neutralising antibodies. Gene Ther. Mar 2001 ；8(5) :341-348,期通過引用并入本文。另外，包被可用聚合物前-綴合物到靶向元件進行，見例如Stevenson M, Hale AB, Hale SJ, Green NK, Black G, Fisher KD, Ulbrich K, Fabra A, Seymour Lff. Incorporation of a laminin-derived peptide (SIKVAV) on polymer-modified adenovirus permits tumor-specific targeting via alpha6-integrins. Cancer Gene Ther. Apr2007 ；14(4) :335_345，其通過引用并入本文。需知，本文中使用術語"反應性基團"表示顯示顯著的化學反應性(尤其有關與其他分子的互補反應性基團(一般與核酸載體表面上的基團)偶聯(lián)或連接反應)的基團。一般而言、反應性基團是能與存在于核酸載體表面的基團形成共價鍵的基團，例如與胺基團、硫醇、羥基、醛、酮、酪氨酸殘基、羧酸或糖基團。所述存在于核酸載體表面的基團可通過遺傳加工導入，例如，通過加工腺病毒來含在纖維分子中帶有游離的硫醇的半胱氨酸殘基。但是，通常所述存在于核酸載體表面的基團是天然存在的基團。在一實施方式中，反應性基團能與核酸載體表面的胺基團形成共價鍵。在此實施方式中適宜類型的反應性基團的實施例包括酰氯、?；?噻唑烷-2-硫酮、馬來酰亞胺、 N-羥基-琥珀酰亞胺酯(NHS酯)硫-N-羥基-琥珀酰亞胺酯(硫-NHS酯)、4_硝基苯酚酯、環(huán)氧化物、2-亞氨基-2-甲氧基乙基-1-硫代糖苷、氰尿酰氯、咪唑基甲酸酯、琥珀酰亞胺基琥珀酸酯、琥珀酰亞胺基戊二酸酯、酰疊氮、酰腈、二氯三嗪、2，4，5_三氯苯酚、二氫惡唑酮及氯仿。這樣的基團容易與胺反應。優(yōu)選?；?噻唑烷-2-硫酮及硫-NHS酯。優(yōu)選酰基-噻唑烷-2-硫酮，由于它們在水溶液中的高反應性及相對穩(wěn)定性。在另一實施方式中，反應性基團能與核酸載體表面的硫醇基形成共價鍵。在此實施方式中適宜類型的反應性基團的實施例包括烷基鹵、鹵代乙酰胺及馬來酰亞胺。在另一實施方式中，反應性基團能與核酸載體表面的羥基形成共價鍵。在此實施方式中適宜類型的反應性基團的實施例包括氯仿及酰鹵?；蛘?，核酸載體表面的羥基可用氧化劑(例如高碘酸鹽)氧化，然后是與包括胼、羥胺或胺的反應性基團反應。在另一實施方式中，反應性基團能與核酸載體表面的酪氨酸殘基形成共價鍵。在此實施方式中適宜類型的反應性基團的實施例包括磺酰氯及碘乙酰胺。在另一實施方式中、反應性基團能與核酸載體表面的醛或酮基形成共價鍵。在此實施方式中，適宜類型的反應性基團的實施例包括酰胼、氨基脲、脂肪族伯胺、芳族胺及碳酰胼。在另一實施方式中，反應性基團能與核酸載體表面的羧酸形成共價鍵。此可如下實現(xiàn)，例如，使用水溶性碳二亞胺(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)活化羧酸，然后是與胺作為反應性基團反應。在另一實施方式中，反應性基團能與核酸載體表面的糖反應形成共價鍵。此可如下實現(xiàn)，例如，用半乳糖氧化酶的糖的酶-介導的氧化以形成醛，然后是與醛反應性化合物 (例如酰胼)作為反應性基團反應。聚合物上反應性基團的數(shù)優(yōu)選例如為提供基于聚合物總重量的0. 5 IOmol %、 更優(yōu)選1 6mol%及最優(yōu)選2 5mol%的反應性基團。—般而言，聚合物是生物學惰性聚合物。聚合物主鏈通常經(jīng)所述反應性基團取
在另一優(yōu)選的實施方式中，聚合物包括一個或多個式IVa的單元
權利要求
1.聚合物修飾的核酸載體，其中核酸載體共價連接于聚合物，該聚合物包括一個或多個帶正電的季氨基，其中所述核酸載體是選自下列的微生物病毒、細菌或噬菌體、真菌、孢子、真核細胞核或含遺傳信息的其他微生物片段或成分，且其中(a)聚合物和/或其與核酸載體之間的連鍵可水解地、還原性地或酶學地降解；和/或(b)其中各帶正電的季氨基均經(jīng)一個或多個可降解的或可生物降解的連鍵連接到聚合物主鏈。
2.根據(jù)權利要求1的聚合物修飾的核酸載體，其中所述聚合物和核酸載體之間的連鍵可水解地、還原性地或酶學地降解。
3.根據(jù)權利要求1或2的聚合物修飾的核酸載體，其中所述可水解地、還原性地或酶學地降解的聚合物和/或其與核酸載體之間的連鍵包括腙、酰胼或二硫基團。
4.根據(jù)以上權利要求中任一項的聚合物修飾的核酸載體，其中各帶正電的季氨基均通過含可還原的或可水解的鍵的接頭連接到聚合物主鏈。
5.根據(jù)以上權利要求中任一項的聚合物修飾的核酸載體，其中所述連接各帶正電的季氨基與聚合物主鏈的一個或多個可降解的或可生物降解的連鍵包括二硫鍵、酰胼鍵、縮醛部分或可酶學地切割的鍵。
6.根據(jù)以上權利要求中任一項的聚合物修飾的核酸載體，其中所述核酸載體是選自下列的微生物病毒、細菌或噬菌體、真菌、孢子或真核細胞核。
7.根據(jù)以上權利要求中任一項的聚合物修飾的核酸載體，其中所述核酸載體包括治療性或抗原性遺傳物質。
8.根據(jù)以上權利要求中任一項的聚合物修飾的核酸載體，其中所述聚合物與核酸載體的連接及后者的修飾導致核酸載體在宿主生物學系統(tǒng)中與會與其正常相互作用的其他分子相互作用的能力的抑制，或導致核酸載體與會與其正常結合的位點或受體結合的能力的抑制。
9.根據(jù)以上權利要求中任一項的聚合物修飾的核酸載體，其中所述核酸載體是含治療性或抗原性遺傳物質的病毒載體。
10.根據(jù)以上權利要求中任一項的聚合物修飾的核酸載體，其中所述核酸載體是在宿主中與特定位點或受體正常相互作用的病毒，其中所述帶有帶正電的季氨基的聚合物掩蓋病毒的正常受體-結合活性和/或能使其在宿主中重新靶向新的或不同的位點或受體。
11.根據(jù)以上權利要求中任一項的聚合物修飾的核酸載體，其中所述核酸載體是基于腺病毒、皰疹病毒、細小病毒、痘病毒、披膜病毒、輪狀病毒或小核糖核酸病毒的病毒。
12.根據(jù)以上權利要求中任一項的聚合物修飾的核酸載體，其中所述聚合物是多價聚合物。
13.根據(jù)以上權利要求中任一項的聚合物修飾的核酸載體，其中所述聚合物通過至少 2個連鍵，一般通過至少3個連鍵連接到核酸載體。
14.根據(jù)以上權利要求中任一項的聚合物修飾的核酸載體，其中所述聚合物主鏈基于如下單體單元N-2-羥基丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)、N-(2-羥基乙基)-1-谷氨酰胺(HEG)、 乙二醇-寡肽、或是聚唾液酸或聚甘露糖聚合物。
15.根據(jù)以上權利要求中任一項的聚合物修飾的核酸載體，其中所述用于修飾核酸載體的聚合物交聯(lián)而形成水凝膠。
16.以上權利要求中任一項的聚合物修飾的核酸載體，其中各帶正電的季氨基均直接或經(jīng)間隔物基團連接于聚合物主鏈。
17.根據(jù)以上權利要求中任一項的聚合物修飾的核酸載體，其中生物學活性劑偶聯(lián)于或包括于聚合物。
18.權利要求17的聚合物修飾的核酸載體，其中所述生物學活性劑是下列之一種或多種生長因子或細胞因子、糖、激素、脂質、磷脂、脂肪、載脂蛋白、細胞粘接促進劑、酶、毒素、 肽、糖蛋白、血清蛋白質、維生素、礦物、Toll-樣受體的配體、和/或識別受體的抗體。
19.權利要求18的聚合物修飾的核酸載體，其中所述生物學活性劑是抗體或抗體片段。
20.以上權利要求中任一項的聚合物修飾的核酸載體，其中所述核酸載體的修飾具有在生物學宿主中將核酸載體再靶向不同的受體的效應。
21.修飾核酸載體的生物學和/或物理化學性質的方法，所述方法包括使所述核酸載體與聚合物反應，該聚合物包括一個或多個帶正電的季氨基及一個或多個反應性基團，從而將核酸載體通過一個或多個共價連鍵連接到聚合物，以獲得聚合物修飾的核酸載體，其中所述核酸載體是選自下列的微生物病毒、細菌或噬菌體、真菌、孢子、真核細胞核或含遺傳信息的其他微生物片段或成分，且其中(a)聚合物和/或其和核酸載體之間的一個或多個共價連鍵可水解地、還原性地或酶學地降解；和/或(b)其中各帶正電的季氨基均經(jīng)一個或多個可降解的或可生物降解的連鍵連接到聚合物主鏈。
22.根據(jù)權利要求21的方法，其中所述核酸載體附加地包括權利要求6 11中任一項的特征和/或其中所述聚合物附加地包括權利要求2 5或12 20中任一項的特征。
23.根據(jù)權利要求21或權利要求22的方法，其中所述聚合物是具有被一個或多個所述反應性基團取代的主鏈的生物學惰性聚合物。
24.根據(jù)權利要求21 23中任一項的方法，其中各反應性基團均直接或經(jīng)間隔物基團連接于聚合物主鏈。
25.根據(jù)權利要求M的方法，其中各反應性基團均經(jīng)間隔物基團連接于聚合物主鏈， 且間隔物基團包括一個或多個可切割基團。
26.根據(jù)權利要求25的方法，其中所述一個或多個可切割基團是可水解的基團。
27.根據(jù)權利要求沈的方法，其中所述可水解的基團是腙或酰胼基團。
28.根據(jù)權利要求21 27中任一項的方法，其中一個或多個帶正電的季氨基各自經(jīng)權利要求1、4及5中任一項定義的一個或多個可降解的或可生物降解的連鍵連接于聚合物主鏈，且其中所述方法包括切割所述一個或多個帶正電的季氨基和聚合物主鏈之間的可降解的或可生物降解的連鍵的額外的步驟。
29.根據(jù)權利要求21 觀中任一項的方法，其中所述聚合物包括一個或多個式IVa的單元
30.根據(jù)權利要求21 觀中任一項的方法，其中所述聚合物包括一個或多個下式的單元
31.根據(jù)權利要求21 觀或30中任一項的方法，其中所述聚合物包括以下3單體單元
32.根據(jù)權利要求21 四中任一項的方法，其中所述聚合物包括以下4單體單元
33.聚合物修飾的核酸載體，其可通過權利要求21 32中任一項的方法獲得。
34.根據(jù)權利要求1 20或33中任一項的聚合物修飾的核酸載體，其中所述聚合物掩蓋將經(jīng)歷被可中和聚合物修飾的核酸載體的活性的抗體識別的核酸載體的區(qū)，所述區(qū)一般帶負電或是核酸載體表面的酸區(qū)。
35.組合物，其包括權利要求1 20、33或34中任一項定義的聚合物修飾的核酸載體， 及適宜稀釋劑或載質。
36.基因治療方法，該方法包括給需要所述治療的患者施用有治療活性的、非毒性量的權利要求1 20、33或34中任一項定義的聚合物修飾的核酸載體或權利要求33中定義的組合物，該聚合物修飾的核酸載體包括治療性遺傳物質。
37.權利要求1 20、33或34中任一項定義的聚合物修飾的核酸載體在制備用于疫苗接種或基因治療的藥物中的用途，其中所述聚合物修飾的核酸載體包括治療性遺傳物質。
全文摘要
本發(fā)明提供聚合物修飾的核酸載體，其中核酸載體共價連接于聚合物，該聚合物包括一個或多個帶正電的季氨基，其中所述核酸載體是選自下列的微生物病毒、細菌或噬菌體、真菌、孢子、真核細胞核或含遺傳信息的其他微生物片段或成分，且其中(a)聚合物和/或其與核酸載體之間的連鍵可水解地、還原性地或酶學地降解；和/或(b)其中各帶正電的季氨基均經(jīng)一個或多個可降解的或可生物降解的連鍵連接到聚合物主鏈。
文檔編號A61K35/76GK102245213SQ200980149460
公開日2011年11月16日 申請日期2009年12月11日 優(yōu)先權日2008年12月11日
發(fā)明者K·烏爾布里希, K·費希爾, L·W·西摩, V·舒布爾 申請人:普西奧庫斯治療有限公司