專利名稱：Dna前處理緩沖液及菌體dna、核酸dna的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)境微生物樣本直接用于PCR反應(yīng)的DNA前處理緩沖液及菌體DNA、核酸DNA的制備方法。
背景技術(shù)：
目前，用于環(huán)境樣本中污水、污泥等DNA的制備的方法多數(shù)為人工配置藥品，采用溶菌酶、反復(fù)凍融結(jié)合CTAB或十二烷基磺酸鈉SDS法提取樣本中微生物的DNA，或用試劑盒制備，費(fèi)用較高而且DNA提取效果不好，多為彌散的條帶，或者得率低；對(duì)于含有特殊的化學(xué)物質(zhì)如油田污水更加不容易提取，需要的時(shí)間較長(zhǎng)，最后的效果不一定好。重要的是當(dāng)環(huán)境樣本用于微生物分子生態(tài)學(xué)和特定菌種的定量檢測(cè)研究時(shí)，DNA的損失率較大，對(duì)于數(shù)量少的微生物根本無(wú)法提取，這樣的DNA用于微生物分子生態(tài)學(xué)的研究就不能夠全面地反映種群的結(jié)構(gòu)和種群演替情況，用于環(huán)境樣本中微生物的定量檢測(cè)則更加不準(zhǔn)確。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)環(huán)境微生物樣本中DNA提取的難度較大、得率小，甚至無(wú)法提取，樣品損失較大、費(fèi)用較高，不能全面真實(shí)地反映環(huán)境樣本中微生物的種類和數(shù)量的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種環(huán)境微生物樣本(污水、生物反應(yīng)器污泥等)直接用于PCR反應(yīng)的DNA前處理緩沖液及菌體DNA、核酸DNA的制備方法，它具有成本低廉、快速，能夠獲得高質(zhì)量的DNA，獲得的DNA能夠真實(shí)的反映環(huán)境樣本中微生物的數(shù)量和種類的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的環(huán)境微生物樣本直接用于PCR反應(yīng)的DNA前處理緩沖液由貯存液和十二烷基磺酸鈉制成，其中貯存液由下述成分組成70gNaCl、2g KCl、12gNa2HPO4和2g KH2PO4。
環(huán)境微生物樣本直接用于PCR反應(yīng)的菌體DNA的制備方法是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的a、首先紫外線條件下對(duì)工作平臺(tái)滅菌20～40min，然后取環(huán)境微生物樣本0.1ml注入到經(jīng)滅菌的離心管中；b、樣本在震蕩器上充分震蕩5min，13000r/min離心1min后棄上清液0.9ml；c、在剩余的0.1ml樣本中加入上述DNA前處理緩沖液0.9ml，在震蕩器上充分震蕩5min，13000r/min離心2min，棄上清液0.98ml，繼續(xù)充分震蕩2min，得到菌體DNA。所述環(huán)境微生物樣本為OD值≤0.1的污水(例如油田水系統(tǒng)中污水或生活污水)。
環(huán)境微生物樣本直接用于PCR反應(yīng)的核酸DNA的制備方法是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的a、紫外線條件下對(duì)工作平臺(tái)滅菌20～40min，然后取環(huán)境微生物樣本0.1ml注入到經(jīng)滅菌的離心管中；b、樣本在震蕩器上充分震蕩5min，13000r/min離心1min后棄上清液0.9ml；c、在剩余的0.1ml樣本中加入上述DNA前處理緩沖液0.9ml，在震蕩器上充分震蕩5min，13000r/min離心2min，棄上清液0.98ml，繼續(xù)充分震蕩2min，得到菌體DNA；d、在PCR管內(nèi)加入10μl菌體DNA、4μlPCR緩沖液和6μl去離子水，在94℃反應(yīng)5min、4℃反應(yīng)1min的條件下循環(huán)5次，獲得核酸DNA。所述環(huán)境微生物樣本為OD值≤0.1的污水(例如油田水系統(tǒng)中污水或生活污水)。
環(huán)境微生物樣本直接用于PCR反應(yīng)的菌體DNA的制備方法是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的a、紫外線條件下對(duì)工作平臺(tái)滅菌20～40min，然后取環(huán)境微生物樣本0.1ml注入到經(jīng)滅菌的離心管中，同時(shí)加入0.9ml上述DNA前處理緩沖液，在震蕩器上充分震蕩5min；b、3600r/min離心1min，從管中搜集上清液移入另一個(gè)離心管中；c、加入與上清液等體積的DNA前處理緩沖液，再次在震蕩器上充分震蕩5min；d、重復(fù)b、c步驟；e、然后在13000r/min的條件下離心2min，棄上清液，管內(nèi)加入DNA前處理緩沖液20μl，在震蕩器上充分震蕩5min，制備完畢得到菌體DNA。所述環(huán)境微生物樣本為生物反應(yīng)器內(nèi)的污泥或污水。
環(huán)境微生物樣本直接用于PCR反應(yīng)的核酸DNA的制備方法是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的a、紫外線條件下對(duì)工作平臺(tái)滅菌20～40min，然后取環(huán)境微生物樣本0.1ml注入到經(jīng)滅菌的離心管中，同時(shí)加入0.9ml上述DNA前處理緩沖液，在震蕩器上充分震蕩5min；b、3600r/min離心1min，從管中搜集上清液移入另一個(gè)離心管中；c、加入與上清液等體積的DNA前處理緩沖液，再次在震蕩器上充分震蕩5min；d、重復(fù)b、c步驟；e、然后在13000r/min的條件下離心2min，棄上清液，管內(nèi)加入DNA前處理緩沖液20μl，在震蕩器上充分震蕩5min，制備完畢得到菌體DNA；e、在PCR管內(nèi)加入10μl菌體DNA、4μlPCR緩沖液和6μl去離子水，在94℃反應(yīng)5min、4℃反應(yīng)1min的條件下循環(huán)5次，獲得核酸DNA。所述環(huán)境微生物樣本為生物反應(yīng)器內(nèi)的污泥或污水。
“菌體DNA”是將環(huán)境樣本中的除微生物菌體以外的雜質(zhì)去除，獲得在緩沖液中只含有微生物菌體的直接用于PCR擴(kuò)增的以菌體直接作為模板的DNA。本發(fā)明的快速制備直接用于PCR擴(kuò)增的菌體DNA的方法，是將環(huán)境樣本中的除微生物菌體以外的雜質(zhì)去除，獲得在緩沖液中只含有微生物菌體的菌體DNA，它的意義在于對(duì)于建立環(huán)境樣本的文庫(kù)和定量檢測(cè)具有重要的意義，適用的分子生物學(xué)操作主要包擴(kuò)常規(guī)的PCR、樣本中特意的基因的擴(kuò)增，以及基于菌體DNA的目的微生物的快速檢測(cè)的研究。在菌體DNA的基礎(chǔ)上，一步法快速獲得核酸DNA，核酸DNA是我們通常意義的菌體裂解后的含有堿基的核酸；它的意義和操作范圍是在分子生物學(xué)中必須以核酸為直接操作對(duì)象的分子生物學(xué)試驗(yàn)，如分子雜交等。
本發(fā)明涉及的環(huán)境微生物的樣本主要包括，如油田水系統(tǒng)中污水、生物反應(yīng)器內(nèi)的污泥、生活污水、土壤樣本等，能溶于水或部分溶于水的含有微生物的樣本。對(duì)于油田污水采用震蕩的方法制備菌體DNA和核酸DNA。對(duì)于生物反應(yīng)器內(nèi)的污水和污泥采用震蕩加“梯度離心”的方法，除去大量的固體顆粒和雜質(zhì)，能有效的使微生物從中分離開(kāi)來(lái)，對(duì)于土壤樣本、能溶于水或部分溶于水的含有微生物的樣本來(lái)說(shuō)，該方法同樣適用。本發(fā)明的方法其結(jié)果表明，快速制備直接用于PCR擴(kuò)增的菌體DNA的方法，可以直接用于PCR反應(yīng)，能夠有效的擴(kuò)增出目的片段，該法對(duì)于含有大量的化學(xué)物質(zhì)的油田污水效果較好。對(duì)于污水處理只需要20min，對(duì)于污泥處理需要30min；在此基礎(chǔ)上的一步法快速獲得核酸DNA的方法，可以獲得較高濃度的DNA。油田污水全部過(guò)程只需要45min即可，對(duì)于污泥需要55min，本發(fā)明的方法成本極其低廉，快速，菌體DNA和核酸DNA的得率為98％以上，獲得的DNA能夠真實(shí)的反映環(huán)境樣本中微生物的種類和數(shù)量，可以用于各種分子生物學(xué)試驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式的DNA前處理緩沖液的組成成分和藥品濃度為10×的貯存液(70g NaCl；2g KCl；12g Na2HPO4；2g KH2PO4)和SDS，所述SDS的加入量為貯存液質(zhì)量的1‰，工作液為稀釋10倍的DNA前處理緩沖液，pH為7.5。
具體實(shí)施例方式
二本實(shí)施方式的快速制備直接用于PCR擴(kuò)增的菌體DNA的方法是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的(以石油污水為例，OD值(吸光度)≤0.1)a、以下步驟在超凈工作臺(tái)下完成工作臺(tái)先紫外線滅菌20～40min，然后取樣將用含有高純氮?dú)獾膮捬豕苋』氐挠吞镂鬯乃畼?，?mL注入到經(jīng)滅菌的1.5mL的離心管中；b、在震蕩器上充分震蕩5min，13000r/min離心1min，從管中輕輕的棄上清液0.9mL；c、在剩余的0.1mL水樣中加入DNA前處理緩沖液0.9mL，在震蕩器上充分震蕩5min；d、13000r/min離心2min，棄上清液0.98mL，充分震蕩2min，制備完畢得到菌體DNA。短時(shí)間內(nèi)使用4℃保存即可，長(zhǎng)時(shí)間不用要-20℃保存。本實(shí)施方式所述DNA前處理緩沖液的組成成分和藥品濃度為10×的貯存液(70g NaCl；2g KCl；12g Na2HPO4；2g KH2PO4)和SDS，所述SDS的加入量為貯存液質(zhì)量的1‰，工作液為稀釋10倍的DNA前處理緩沖液，pH為7.5。
具體實(shí)施例方式
三對(duì)于生物反應(yīng)器內(nèi)的污泥處理主要采用梯度離心的方法，具體步驟為a、以下步驟在超凈工作臺(tái)下完成，紫外線滅菌工作臺(tái)20～40min，取樣將用滅菌管取回的反應(yīng)器污泥的水樣，取0.1mL注入到經(jīng)滅菌的1.5mL的離心管中，同時(shí)加入0.9mL DNA前處理緩沖液，在震蕩器上充分震蕩5min；b、3600r/min離心1min，從管中搜集上清液移入另一個(gè)1.5mL的離心管中；c、加入與上清液等體積的DNA前處理緩沖液，再次在震蕩器上充分震蕩5min；d、重復(fù)b、c步驟；e、13000r/min離心2min，棄上清液，管內(nèi)加入DNA前處理緩沖液20μL，在震蕩器上充分震蕩5min，制備完畢得到菌體DNA。短時(shí)間內(nèi)使用4℃保存即可，長(zhǎng)時(shí)間不用要-20℃保存。本實(shí)施方式所述DNA前處理緩沖液的組成成分和藥品濃度為10×的貯存液(70gNaCl；2g KCl；12g Na2HPO4；2g KH2HPO4)和SDS，所述SDS的加入量為貯存液質(zhì)量的1‰，工作液為稀釋10倍的DNA前處理緩沖液，pH為7.5。
具體實(shí)施例方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二、三不同的是，一步法快速獲得核酸DNA可以用于各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)的步驟在菌體DNA的方法的基礎(chǔ)上，增加兩步1、PCR管內(nèi)為20μL體系，管內(nèi)加入10μL的菌體DNA，4μL的PCR緩沖液Buffer(10×)，6μL的去離子水；2、PCR反應(yīng)的體系94℃5min，4℃1min，然后94℃1min，4℃1min，循環(huán)5次，即可獲得核酸DNA，想獲得高純度的DNA，也可以將PCR產(chǎn)物放入帶過(guò)濾膜的離心管中，1200r/min離心2min即可。
本實(shí)施方式中，對(duì)于水質(zhì)比較清澈的污水來(lái)說(shuō)，菌體DNA可以不經(jīng)過(guò)具體實(shí)施方式
二、三中的處理，直接進(jìn)行核酸DNA的制備，它同樣屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.DNA前處理緩沖液，其特征在于所述DNA前處理緩沖液由貯存液和十二烷基磺酸鈉制成，其中貯存液由下述成分組成70g NaCl、2g KCl、12gNa2HPO4和2g KH2PO4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA前處理緩沖液，其特征在于所述十二烷基磺酸鈉的加入量為貯存液質(zhì)量的1‰。
3.菌體DNA的制備方法，其特征在于所述菌體DNA的制備方法是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的a、紫外線條件下對(duì)工作平臺(tái)滅菌20～40min，然后取環(huán)境微生物樣本0.1ml注入到經(jīng)滅菌的離心管中；b、樣本在震蕩器上充分震蕩5min，13000r/min離心1min后棄上清液0.9ml；c、在剩余的0.1ml樣本中加入權(quán)利要求1所述DNA前處理緩沖液0.9ml，在震蕩器上充分震蕩5min，13000r/min離心2min，棄上清液0.98ml，繼續(xù)充分震蕩2min，得到菌體DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述菌體DNA的制備方法，其特征在于所述環(huán)境微生物樣本為OD值≤0.1的污水。
5.菌體DNA的制備方法，其特征在于所述菌體DNA的制備方法是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的a、紫外線條件下對(duì)工作平臺(tái)滅菌20～40min，然后取環(huán)境微生物樣本0.1ml注入到經(jīng)滅菌的離心管中，同時(shí)加入0.9ml權(quán)利要求1所述DNA前處理緩沖液，在震蕩器上充分震蕩5min；b、3600r/min離心1min，從管中搜集上清液移入另一個(gè)離心管中；c、加入與上清液等體積的DNA前處理緩沖液，再次在震蕩器上充分震蕩5min；d、重復(fù)b、c步驟；e、然后在13000r/min的條件下離心2min，棄上清液，管內(nèi)加入DNA前處理緩沖液20μl，在震蕩器上充分震蕩5min，制備完畢得到菌體DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述菌體DNA的制備方法，其特征在于所述環(huán)境微生物樣本為生物反應(yīng)器內(nèi)的污泥或污水。
7.核酸DNA的制備方法，其特征在于所述核酸DNA的制備方法是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的a、紫外線條件下對(duì)工作平臺(tái)滅菌20～40min，然后取環(huán)境微生物樣本0.1ml注入到經(jīng)滅菌的離心管中；b、樣本在震蕩器上充分震蕩5min，13000r/min離心1min后棄上清液0.9ml；c、在剩余的0.1ml樣本中加入權(quán)利要求1所述DNA前處理緩沖液0.9ml，在震蕩器上充分震蕩5min，13000r/min離心2min，棄上清液0.98ml，繼續(xù)充分震蕩2min，得到菌體DNA；d、在PCR管內(nèi)加入10μl菌體DNA、4μlPCR緩沖液和6μl去離子水，在94℃反應(yīng)5min、4℃反應(yīng)1min的條件下循環(huán)5次，獲得核酸DNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述核酸DNA的制備方法，其特征在于所述環(huán)境微生物樣本為OD值≤0.1的污水。
9.核酸DNA的制備方法，其特征在于所述核酸DNA的制備方法是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的a、紫外線條件下對(duì)工作平臺(tái)滅菌20～40min，然后取環(huán)境微生物樣本0.1ml注入到經(jīng)滅菌的離心管中，同時(shí)加入0.9ml權(quán)利要求1所述DNA前處理緩沖液，在震蕩器上充分震蕩5min；b、3600r/min離心1min，從管中搜集上清液移入另一個(gè)離心管中；c、加入與上清液等體積的DNA前處理緩沖液，再次在震蕩器上充分震蕩5min；d、重復(fù)b、c步驟；e、然后在13000r/min的條件下離心2min，棄上清液，管內(nèi)加入DNA前處理緩沖液20μl，在震蕩器上充分震蕩5min，制備完畢得到菌體DNA；e、在PCR管內(nèi)加入10μl菌體DNA、4μl PCR緩沖液和6μl去離子水，在94℃反應(yīng)5min、4℃反應(yīng)1min的條件下循環(huán)5次，獲得核酸DNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述核酸DNA的制備方法，其特征在于所述環(huán)境微生物樣本為生物反應(yīng)器內(nèi)的污水或污泥。
全文摘要
DNA前處理緩沖液及菌體DNA、核酸DNA的制備方法，它涉及環(huán)境微生物樣本直接用于PCR反應(yīng)的DNA前處理緩沖液及菌體DNA、核酸DNA的制備方法。針對(duì)環(huán)境微生物樣本中DNA提取的難度較大，得率小，甚至無(wú)法提取，樣品損失較大，費(fèi)用較高，不能全面真實(shí)反映環(huán)境樣本中微生物的種類和數(shù)量的問(wèn)題，本發(fā)明的DNA前處理緩沖液由貯存液和SDS制成。常規(guī)的污水(OD值≤0.1)菌體DNA制備震蕩、離心、棄上清液、剩余的樣本中加入DNA前處理緩沖液、震蕩、離心、棄上清液、震蕩。對(duì)于污泥處理主要采用梯度離心的方法。一步法快速獲得核酸DNA的方法是在菌體DNA的基礎(chǔ)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。本發(fā)明具有成本低廉、快速的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1752094SQ20051001045
公開(kāi)日2006年3月29日 申請(qǐng)日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月21日
發(fā)明者魏利, 馬放 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)