專(zhuān)利名稱(chēng)：：包含丙型肝炎病毒多肽和用于引起免疫應(yīng)答的Fc片段的嵌合抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及嵌合抗原(例如，融合蛋白)，用于耙向并活化抗原呈遞細(xì)胞(抗原提呈細(xì)胞，APC)，以引起(引發(fā)，elicit)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。特別地，本發(fā)明描述了包含或〗吏用一種或多種嵌合抗原的組合物和方法，所述嵌合抗原包含一種或多種預(yù)選的丙型肝炎病毒(HCV)抗原以及免疫球蛋白片段，其中所述嵌合抗原能夠結(jié)合并活化APC特別是樹(shù)突細(xì)胞，其加工并扭j亍抗原呈遞以引發(fā)(引起)細(xì)"包和體液免疫應(yīng)答。
背景技術(shù)：
：全世界有多于1.7億的人是慢性HCV攜帶者[Delwaideetal.(2000)Rev.Med.Liege55:337-340]。目前不存在可用于HCV的預(yù)防性或治療性疫苗。感染途徑是通過(guò)血液和其他體液，并且70%以上的患者成為慢性病毒攜帶者。持續(xù)感染引起可能導(dǎo)致進(jìn)展性肝病的慢性活動(dòng)性肝炎[Alteretal.(1999)N.Engl.J.Med.341:556-562]。目前，用于丙型肝炎感染的p舉一治療是干護(hù)C素-I(IFN-I)和利巴韋林(病毒唑)。然而，該治療昂貴，具有顯著副作用，并且^叉在約50%的患者選#^組中有效。增強(qiáng)宿主免疫應(yīng)答以消除'隻性HCV感染的治療性疫苗一等成為治療該疾病的一個(gè)主要進(jìn)展。免疫系統(tǒng)在HCV感染的結(jié)局中起關(guān)4建作用。暴露于HCV的大多婆t個(gè)體均會(huì)發(fā)起對(duì)病毒的廣泛強(qiáng)大且多抗原特異性CD4+(調(diào)節(jié)性)和CD8+(細(xì)胞毒性)T細(xì)胞應(yīng)答。這些個(gè)體僅發(fā)展成自限性感染(self-limitedinfection)。然而，在某些暴露于HCV的個(gè)體中，《敬弱或不可4企測(cè)且局部(narrowly)免疫應(yīng)答引起'("曼性感染。HCV是RNA病毒的黃病毒家族的一個(gè)成員。該HCV基因組是約9.5Kb的編碼單個(gè)多聚蛋白的正義單鏈RNA分子，該多聚蛋白可由宿主和病毒蛋白酶4崔4匕而切割成單個(gè)蛋白(individualprotein),以產(chǎn)生3種結(jié)構(gòu)蛋白(核心、El、E2)、p7蛋白以及6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)[卿kkataetal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:5547-5551],NS3蛋白是在所述非結(jié)構(gòu)蛋白的蛋白水解加工中涉及的病毒絲氨酸蛋白酶[Bartenschlagereta1.(1993)J.Virol.67:3835-3844]。病毒逃避宿主免疫過(guò)#呈(immunemachinery)的才幾制尚未;青楚地確立[Shoukryetal.(2004)Ann.Rev.Microbiol.58:391-424]。已經(jīng)證明幾種HCV蛋白與免疫逃避機(jī)制有關(guān)。這些蛋白包括NS5A,已表明其"i秀導(dǎo)IL-8(其抑制IFN誘導(dǎo)的抗病毒反應(yīng))生成[Polyakatal.(2001)J.Virol.75:6095-6106],并氺p命J細(xì)月包IFN-y-i秀導(dǎo)的PKR蛋白激酶，乂人而抑制抗病毒免疫應(yīng)答[Tanetal.(2001)Viro1284:1-12];核心和NS3，已表明其抑制DC分化[Dolganiucetal.(2003)J.Immunol.170:5615-5624];以及沖亥心和El[Sarobeetal.(2002)J.Virol.77:10862-10871;以及Grakouietal.(2003)Science302:659-662],已表明通過(guò)調(diào)節(jié)DC成熟而調(diào)節(jié)T細(xì)月包應(yīng)答；以及最后的缺乏記憶T細(xì)胞的輔助[Shojietal.(1999)Virology254:315-323]。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及用于耙向并活化APC(引發(fā)免疫應(yīng)答的最初步驟之一)的組合物和方法。本發(fā)明的組合物包4舌一類(lèi)新的分子(下文中指定為"嵌合抗原")，該分子包含免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域(功能區(qū))(IRD)例如重組蛋白，其連接于靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域(TBD)例如抗體片段部分。更具體地說(shuō)，嵌合抗原是使病毒抗原例如丙型肝炎核心、如El和E2的包膜蛋白、或非結(jié)構(gòu)蛋白與免疫球蛋白片段例如鼠免疫球蛋白GFc片段相偶聯(lián)的分子。在某些具體實(shí)施方式中，抗體片段是異源(p耆異寸生，xenotypic)#元體片4殳。物和方法可用于誘導(dǎo)抗任何與HCV有關(guān)的病毒抗原的細(xì)胞和/或體液宿主免疫應(yīng)答。本發(fā)明包括用于治療'l"曼性HCV感染的治療性疫苗以及用于予頁(yè)防HCV感染的予貞防性疫苗。本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)具體實(shí)施方式包4舌一種或多種適合于引起抗HCV的免疫應(yīng)答的嵌合抗原。在發(fā)明的這些具體實(shí)施方式中，將選4奪的HCV抗原連接于抗體的片l殳。得到的嵌合抗原能夠靶向并活化i者如一對(duì)突細(xì)力包的APC。本發(fā)明還包括用于克隆編碼融合蛋白的DNA構(gòu)建體(construct)以及在異源表達(dá)系統(tǒng)中生成融合蛋白的方法。在本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方式中，克隆和生產(chǎn)方法引入獨(dú)特的翻i%后<'務(wù)飾，該修飾包括但不限于表達(dá)的融合蛋白的糖基化(例如，甘露糖化(mannosylation))。為了提供抗原的有效呈遞(提呈)，本發(fā)明的發(fā)明人研發(fā)了一種新型病毒抗原-鼠單克隆抗體Fc片^a融合蛋白。借助于該Fc片^:,這種分子可由APC(例如，樹(shù)突細(xì)胞)通過(guò)特異性受體高效識(shí)別，加工融合蛋白，并將來(lái)自病毒抗原的肽表位與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)I類(lèi)一起作為復(fù)合體而呈遞。該加工和抗原呈遞導(dǎo)致細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的反應(yīng)(應(yīng)答)上調(diào)，由此消除病毒感染的細(xì)胞群。此外，由于MHCII類(lèi)分子的抗原呈遞以及輔助T細(xì);9包的活化,可誘導(dǎo)抗病毒抗原的體液反應(yīng)將有助于預(yù)防和/或消除病毒感染。J夂(例如，樹(shù)突細(xì)胞)，通過(guò)特異性靶向APC受體使其成為慢性感染性疾病治療中的獨(dú)特途徑(方法)。這一點(diǎn)可用于開(kāi)發(fā)用于治療慢性丙型肝炎感染的治療性疫苗。給予這些嵌合性融合蛋白可引起宿主廣泛的免疫應(yīng)答，包括細(xì)胞和體液應(yīng)答兩者。因此，可將它們用作治療性疫苗以治療對(duì)HCV感染為免疫耐受的受治療者。更具體地說(shuō)，本發(fā)明的特征在于一種用于引起免疫應(yīng)答的嵌合抗原，該嵌合抗原包含免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域(目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域)，該免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域包含丙型肝炎(HCV)抗原，而該靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含抗體片段。該抗體片段可為異源(異種型)抗體片段。該嵌合抗原可引起體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答，或體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答兩者。此外，該嵌合抗原可以引起Thl免疫應(yīng)答、Th2免疫應(yīng)答，或可引起Thl免疫應(yīng)答和Th2免疫應(yīng)答兩者。該免疫應(yīng)答可以為體內(nèi)(invivo)或體夕卜(離體，exvivo)免疫應(yīng)答。該免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)i或可以包含一個(gè)以上蛋白；例如，該免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)i或可以包含一種或多種蛋白的一個(gè)或多個(gè)免疫原部分，所述一種或多種蛋白包括，例如HCV核心(1-191)蛋白、HCV核心(1-177)蛋白、HCVp7蛋白、HCVE1蛋白、HCVE2蛋白、HCVEl-E2蛋白、HCVNS3蛋白、HCVNS4B蛋白、或HCVNS5A蛋白。該輩巴結(jié)合結(jié)構(gòu)域能與抗原呈遞細(xì)胞(APC)結(jié)合。該抗體片段可以為Fc片段。該嵌合抗原可以進(jìn)一步包括6xHis標(biāo)簽(tag)、蛋白酶切割位點(diǎn)以及用于連接免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和耙結(jié)合結(jié)構(gòu)域的連4妄子(連接體)中的一種或多種。該連接子可以選自亮氨酸拉鏈、結(jié)合于抗生物素蛋白的生物素以及共〗介肽4建。而且，該嵌合抗原可以為糖基化的，例如甘露糖糖基化的。該抗體片段可以包括免疫球蛋白重鏈片段，而所述免疫球蛋白重鏈片段可以包含鉸鏈區(qū)。此外，該免疫球蛋白重《連片段可以包含一個(gè)抗體片段的全部或部分，所述抗體片段逸自由Ch1、4交鏈區(qū)、Ch2結(jié)枸域、以及Ch3結(jié)構(gòu)域組成的組。本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式是一種將抗原遞送至抗原呈遞細(xì)胞的方法，該方法包括將本文中披露的任何嵌合抗原給予抗原呈遞細(xì)力包。該抗原呈遞細(xì)力包可以為初t突細(xì)月包。本發(fā)明還提供了一種活化抗原呈遞細(xì)胞的方法；該方法可以涉及4吏抗原呈遞細(xì)胞與本文中披露的任何一種嵌合抗原相接觸。該接觸可以發(fā)生在體外(離體)或體內(nèi)。例如，該接觸可以發(fā)生在人體內(nèi)。所述方法可以包括將包含本發(fā)明的任何嵌合抗原的組合物給予受治療者，而所述抗原呈遞細(xì)月包存在于受治療者體內(nèi)。4妾觸可以引起體液免疫應(yīng)答、細(xì)月包免疫應(yīng)答、或可以引起體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答兩者。該細(xì)胞免疫應(yīng)答可以為T(mén)hl應(yīng)答、Th2應(yīng)答、以及CTL應(yīng)答中的一種或多種。受治療者可以患有或可能患有免疫-可治療的疾病。免疫-可治療的疾病可以為急性感染(例如，急性病毒感染)或者其可以為慢性感染(例如，慢性病毒感染)。慢性感染可以是慢性丙型肝炎病毒感染。免疫-可治療的疾病可以是丙型肝炎病毒感染，而免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域可以包含一種或多種蛋白的一個(gè)或多個(gè)抗原部分，所述一種或多種蛋白選自由HCV核心(1-191)蛋白、HCV核心(1-177)蛋白、HCVE1蛋白、HCVE2蛋白、HCVE1-E2蛋白、HCVp7蛋白、HCVNS3蛋白、HCVNS4B蛋白、以及HCVNS5A蛋白組成的組。利用該方法，受治療者可接種以抵抗病毒感染，例如預(yù)防性接種以抵抗病毒感染或治療性接種以抵抗現(xiàn)有病毒感染。本發(fā)明的另一方面是一種生產(chǎn)嵌合抗原的方法。該方法可以包括(a)提供微生物或細(xì)胞，所述微生物或細(xì)胞包含編碼嵌合抗原的多核苷酸；以及(b)在表達(dá)嵌合抗原的條件下，培養(yǎng)所述微生物或細(xì)力包。該樣走生物或細(xì)力包可以為真核-微生物或細(xì)力包。該細(xì)力包可以為酵母細(xì)月包、才直物細(xì)月包或昆蟲(chóng)細(xì)月包。此外，嵌合4元原可以?xún)羝し璱奪后修飾以包括糖基化，例如其可以被翻譯后修飾以包括甘露糖糖基化。本發(fā)明的又一具體實(shí)施方式是一種編碼嵌合抗原的多核苷酸，該多核苷酸包含編碼免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域的第一多核苷酸部分以及編碼耙結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第二多核普酸部分，該靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含抗體片段。該抗體片段可以為異源抗體片段。該多核苷酸可以包含，例如選自由在SEQIDNO:39以及41-51中列出的核普酸序列組成的組中的核香酸序列。此外，該多核普酸可以編石馬嵌合4元原，其至少90%相同于選自由在SEQIDNO:40以及52-62中列出的氨基酸序列組成的組中的整個(gè)氨基酸序列。該多核香酸可以在嚴(yán)才各的條件下選褲r性地雜交于一種多核苷酸，所述一種多核苷酸具有選自由在SEQIDNO:39以及41-51中列出的一亥苷g^序列《且成的^L中的沖亥苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種包含本文中所披露的任何多核苷酸的載體，例如，其中所述多核香g吏可才喿作性地連4妄于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(TRE)的載體。此外，本發(fā)明還包括一種含有本文所才皮露的任何多核普酸的孩史生物或細(xì)月包。本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式是一種制品(產(chǎn)品)，該制品可以包含本文中披露的任何嵌合抗原以及用于將所述嵌合抗原給予需要該抗原的受治療者的i兌明書(shū)。本發(fā)明的又一個(gè)方面是一種藥物組合物，該組合物包含本文中披露的任何嵌合抗原以及藥用賦形劑。另外，本發(fā)明提供了另一種生產(chǎn)嵌合抗原的方法。該方法可以包括(a)提供微生物或細(xì)胞，所述微生物或細(xì)胞包含編碼耙結(jié)合結(jié)構(gòu)域-連接子分子(linkermolecule)的多核苦酸，該乾結(jié)合結(jié)構(gòu)域-連接子分子包含結(jié)合于連接子分子的靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域；(b)在表達(dá)所述把結(jié)合結(jié)構(gòu)域-連4妄子分子的條件下，；咅養(yǎng)所述樣t生物或細(xì)月包；以及(c)在適合于使連接子與免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域結(jié)合的條件下，使嵌合抗原。所述微生物或細(xì)胞、多核苷酸、靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域、連接子分子、以及免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域可以為本文中所4皮露的任<可一種。除非另有定義，本文中所4吏用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與如本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通才支術(shù)人員通常所理解的相同的含義。在矛盾的情況下，則將受包括該定義的本申請(qǐng)文件支配。下文將描述優(yōu)選的方法和材料，盡管與本文所描述的那些相似或等同的方法和材料也可用于實(shí)施或試驗(yàn)本發(fā)明。所有的出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利以及其他本文中提到的參考資料的全部?jī)?nèi)容均結(jié)合于此作為參考。本文中所纟皮露的材并牛(物質(zhì))、方法、以及實(shí)施例^f又是舉例i兌明并且不用于限制本發(fā)明。根據(jù)以下的說(shuō)明、附圖以及權(quán)利要求，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)，例如用于治療或預(yù)防免疫-可治療的疾病的嵌合抗原，將變得顯而易見(jiàn)。圖1是Chimigen3疫苗二聚化形式的示意圖。其包含兩個(gè)亞單位(亞單元)，每個(gè)亞單位均由免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域(IRD)和把結(jié)合結(jié)構(gòu)域(TBD)構(gòu)成。圖2A和2B分別是質(zhì)粒pFastBacHTa-TBD中ORF(開(kāi)方文閱讀框架(可譯框架))的核苷酸序列(SEQIDNO:9)以及由該ORF編石馬的氨基酸序列(SEQIDNO:IO)的一見(jiàn)圖。圖3A和3B分別是質(zhì)并立pFastBacHTa-NS5A-TBD中ORF的核苷酸序列(SEQIDNO:39)以及由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:40)的^L圖。圖3A和圖3B中的下劃線(xiàn)和粗體位置處存在^f呆守自發(fā)突變(TTC(Phe)至TTT(Phe))。在該一亥苷g臾序列中核香酸l-3:起始密碼子核芬酸13-30:6xHis表位標(biāo)簽(附加表位)核苦酸91-1431:HCVNS5A核苷酸1432-1461:連接肽核普酸1462-2157:TBD核苦酸2158-2187:末端肽核苦酸2188-2190:纟冬止密石馬子核香S臾1639-1641:TBDTTC-TTTM呆守突變?cè)谠摪被鵌H序列中氨基酸5-10:6xHis表位標(biāo)簽氨基酸31-477:HCVNS5A氨基酸478-487:連接肽氨基酸488-719:TBD氨基酸720-729:末端肽圖4A和B分別是質(zhì)粒pFastBacHTa-gp64-NS5A-TBD中ORF的核苷酸序列(SEQIDNO:41)以及由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:52)的—見(jiàn)圖。圖4A和圖4B中的下劃線(xiàn)和^L體^立置處存在人工突變(GAT(Asp)至TAT(Tyr))以及保守自發(fā)突變(TTC(Phe)至TTT(Phe))。在該核苷酸序列中核苷酸l-3:起始密石馬子核香酸1-72:gp64信號(hào)肽核苷酸97-114:6xHis表位標(biāo)簽核苷酸175-1515:HCVNS5A核香S復(fù)1516-1545:連4秦肽核芬酸1546-2241:TBD核普酸2242-2271:末端肽沖亥香酉臾2272-2274:纟冬止密石馬子沖亥香S臾61-63:〗言號(hào)力太GAT至TAT人工突變斗亥香f復(fù)1725:TBDTTC至TTT^f呆守突變?cè)谠摪被嵝蛄兄邪被?-24:gp64分泌信號(hào)氨基酸33-38:6xHis表位標(biāo)簽氨基酸59-505:HCVNS5A氨基酸506-515:連接肽氨基酸516-747:TBD氨基S臾748-757:末端肽圖5A和B分別是質(zhì)粒pPSC12-NS5A-TBD中ORF的核苷酸序列(SEQIDNO:42)以及由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:53)的3見(jiàn)圖。圖6A和B分別是質(zhì)粒pFastBacHTa-gp64誦NS3-TBD中ORF的核苷酸序列(SEQIDNO:43)以及由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:54)的碎見(jiàn)圖。存在由圖6A中的下劃線(xiàn)密碼子和圖6B中的氨基酸所示的兩個(gè)突變。對(duì)于圖6A乂人上游至下游以及對(duì)于圖6B從N末端至C末端，突變?yōu)?基因)工程CGG(Arg)至GCG(Ala)突變；以及自發(fā)CCA(Pro)至GGA(Gly)突變。圖7A和B分別是質(zhì)粒pFastBacHTaNS3mut-TBD中ORF的核香酸序列(SEQIDNO.'44)以及由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:55)的—見(jiàn)圖。存在由圖7A中的下劃線(xiàn)密石馬子和圖7B中的氨基酸所示的兩個(gè)突變。對(duì)于圖7A乂人上游至下游以及對(duì)于圖7B從N末端至C末端，突變?yōu)樽园l(fā)保守AGG(Arg)至CGG(Arg)突變；以及基因工程CGG(Arg)至GCG(Ala)突變。在核苷酸序列中核苷酸l-3:起始密碼子核芬酸13-30:6xHis表位標(biāo)簽核苦酸91-1965:HCVNS3mut核芬酸1966-1995:連接肽核芬酸1996-2691:TBD核香酸2692-2721:末端肽才亥苷l(shuí)吏2722-2724:纟冬止密；馬子核普酸1462-1464:NS3mutAGG至CGG自發(fā)突變核香酸1474-1476:NS3mutCGG至GCG基因工程突變?cè)谠摪被嵝蛄兄邪被?-10:6xHis表位標(biāo)簽氨基酸31-655:HCVNS3mut氨基酸656-665:連接肽氨基酸666-897:TBD氨基酸898-907:末端肽氨基酸488:NS3mutR至R自發(fā)突變氨基酸492:NS3mutR至A基因工程突變圖8A和B分別是質(zhì)粒pFastBacHTa-gp64-NS3mut-TBD中ORF的核普酸序列(SEQIDNO:45)以及由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:56)的一見(jiàn)圖。存在由圖8A中的突出顯示的密石馬子和圖8B中的氨基酸表示的三個(gè)突變。對(duì)于圖8A乂人上游至下游以及》于于圖8B從N末端至C末端，突變?yōu)?.人工突變(GAT(ASP)至TAT(Tyr));自發(fā)保守AGG(Arg)至CGG(Arg)突變；以及基因工程CGG(Arg)至GCG(Ala)突變。在該核苷酸序列中核苷酸l-3:起始密碼子核苦酸l-72:gp64信號(hào)肽核苦酸97-114:6xHis表位標(biāo)簽核芬酸175-2049:HCVNS3mut核苷酸2050-2079:連接肽核芬酸2080-2775:TBD核苦酸2776-2805:末端肽斗亥苦商臾2806-2808:纟冬止密石馬子核香酸61-63:信號(hào)肽GAT至TAT人工突變核香酸1546-1548:NS3mutAGG至CGG4呆守突變核苦酸1558-1560:NS3mutCGG-GCG基因工程突變?cè)谠摪被嵝蛄兄邪被?-24:gp64分泌信號(hào)氨基酸33-38:6xHis表位標(biāo)簽氨基酸59-683:HCVNS3mut氨基酸684-693:連接肽氨基酸694-925:TBD氨基酸926-935:末端肽氨基酸21:信號(hào)肽D至Y人工突變氨基酸520:NS3mutR至A基因工程突變圖9A和B分另'j是質(zhì)粒pFastBacHTa畫(huà)gp64NS3-NS4B-NS5A-TBD中ORF的4亥香@臾序列(SEQIDNO:46)以及由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:57)的一見(jiàn)圖。存在由圖9A中的下劃線(xiàn)且4且體密石馬子和圖9B中的氨基酸表示的四個(gè)突變。只十于圖9A/人上;桴至下;誇以及對(duì)于圖9B^人N末端至C末端，突變?yōu)槿斯ね蛔?GAT(Asp)至TAT(Tyr));基因工程TCG(Ser)至GCG(Ala)突變；基因工程CGG(Arg)至GCG(Ala)突變；以及自發(fā)CCA(Pro)至GGA(Gly)突變。圖10A和B分別是質(zhì)粒pFastBacHTa-gp64-NS3-NS5A-TBD中ORF的核香酸序列(SEQIDNO:47)以及由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:58)的一見(jiàn)圖。存在由圖IOA中的下劃線(xiàn)密碼子和圖10B中的氨基酸表示的四個(gè)突變。對(duì)于圖10A從上游至下游以及只于于圖10B乂人N末端至C末端，突變?yōu)槿斯ね蛔?GAT(Asp)至TAT(Tyr));基因工程TCG(Ser)至GCG(Ala)突變；基因工程CGG(Arg)至GCG(Ala)突變；以及自發(fā)CCA(Pro)至GGA(Gly)突變。在該才亥苷酸序列中核苷酸1-3:起始密石馬子核芬酸l-72:gp64信號(hào)肽核普酸97-114:6xHis表位標(biāo)簽核香酸175-2049:HCVNS3mut核普酸2050-2058:連接肽核普酸2059-3402:HCVNS5A核香酸3403-3426:連4妄肽核香酸3427-4122:TBD4亥香酸4123-4152:末端肽片亥香S吏4153-4155:纟冬止密石馬子核普酸61-63:信號(hào)肽GAT至TAT人工突變核苦酸589:NS3mutTCG至GCG基因工程突變核香酸1558-1559:NS3mutCGG至GCG基因工程突變核苷酸2050-2052:NS3mutCCA至GGA自發(fā)突變?cè)谠摪被嵝蛄兄邪被醠-24:gp64分泌信號(hào)氨基酸33-38:6xHis表位標(biāo)簽氨基酸59-683:HCVNS3氨基酸684-686:連4妄肽氨基酸687-1134:HCVNS5A氨基酸1135-1374:TBD氨基酸1375-1384:末端肽氨基酸21:信號(hào)肽D至Y人工突變氨基酸197:NS3mutS至A基因工程突變氨基酸520:NS3mutR至A基因工程突變氨基酉臾684:NS3mutP至G自發(fā)突變圖11A和B分別是質(zhì)粒pFastBacHTaHCV核心(1-177)-TBD中ORF的核香酸序列(SEQIDNO:48)以及由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:59)的一見(jiàn)圖。圖12A和B分別是質(zhì)4立pFastBacHTa-E1-TBD中ORF的核香酸序列(SEQIDNO:49)以及由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:60)的^L圖。圖13A和B分別是質(zhì)粒pFastBacHTa-E2-TBD中ORF的核普酸序歹'j(SEQIDNO:50)以及由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:61)的#見(jiàn)圖。圖14A和B分別是質(zhì)粒pFastBacHTa-El-E2-TBD中ORF的核普酸序列(SEQIDNO:51)以及由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:62)的碎見(jiàn)圖。圖15是一系列示出了以三種不同的濃度使NS5AChimigen3蛋白與未成熟DC結(jié)合的熒光流式細(xì)胞儀(FFC)譜圖(外形，profile)。圖16是一對(duì)條形圖，示出了通過(guò)特異于CD32和CD206的抗體4中制NS5AChimigen3蛋白與未成熟DC的結(jié)合。圖17是一系列條形圖，示出了通過(guò)如在實(shí)施例中所描述而生成的成熟DC指定的細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)。通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)，并以"陽(yáng)性細(xì)胞％"(上圖)和"平均熒光強(qiáng)度"("MFI")(下圖)示出。圖18A-C是三組條形圖，示出了第4天時(shí)表達(dá)CD69的T細(xì)胞(圖18A)、表達(dá)CD69的CD8+T細(xì)胞(圖18B)、以及表達(dá)CD69的CD4+T細(xì)胞(圖18C)在不同濃度的T細(xì)胞和NS5AChimigen3蛋白或破傷風(fēng)類(lèi)毒素負(fù)載(致敏，loaded)的DC的培養(yǎng)物中的比率。通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)。5AC1和5AC2:NS5AChimigen3蛋白的兩種不同制備物(制劑)。圖19A-C是三組條形圖，示出了第4天時(shí)CFSEloT細(xì)胞(圖19A)、CFSEloCD8+T細(xì)胞(圖19B)、以及CFSEloCD4+T細(xì)月包(圖19C)在不同濃度的T細(xì)胞和NS5AChimigen3蛋白或破傷風(fēng)類(lèi)毒素負(fù)載的DC的培養(yǎng)物中的比率。通過(guò)FFC獲得l史據(jù)。5AC1和5AC2:NS5AChimigen3蛋白的兩種不同制備物。圖20A-C是三組條形圖，示出了第7天時(shí)表達(dá)CD69的T細(xì)胞(圖20A)、表達(dá)CD69的CD8+T細(xì)月包(圖20B)、以及表達(dá)CD69的CD4+T細(xì)胞(圖20C)在不同濃度的T纟田月包和NS5AChimigen3蛋白或破傷風(fēng)類(lèi)毒素負(fù)載的DC或植物凝集素(PHA;在圖20A中)的培養(yǎng)物中的比率。通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)。5AC1和5AC2:NS5AChimigen3蛋白的兩種不同制備物。圖21A-C是三組條形圖，示出了第7天時(shí)CFSEloT細(xì)胞(圖21A)、CFSEloCD8+T細(xì)胞(圖21B)、以及CFSEloCD4+T細(xì)胞(圖21C)在不同濃度的T細(xì)胞和NS5AChimigen3蛋白或石皮傷風(fēng)類(lèi)毒素負(fù)載的DC或PHA(在圖21A中)的培養(yǎng)物中的比率。通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)。5AC1和5AC2:NS5AChimigen3蛋白的兩種不同制備物。圖22是一系列條形圖，示出了第7天時(shí)在不同濃度的T細(xì)胞和NS5AChimigen3蛋白或破傷風(fēng)類(lèi)毒素負(fù)載的DC或PHA的培養(yǎng)物中胚細(xì)胞的T細(xì)胞比例。通過(guò)FFC獲得凄史據(jù)。5AC1和5AC2:NS5AChimigen3蛋白的兩種不同制備物。圖23是一系列條形圖，示出了通過(guò)指示細(xì)月包表面標(biāo)記物的成熟的、抗原負(fù)載的DC的表達(dá)。通過(guò)FFC荻得數(shù)據(jù)。圖24是一對(duì)條形圖，示出了用成熟的、抗原負(fù)載的DC(其如實(shí)施例中所述而制備)刺激三次后胚細(xì)胞的T細(xì)胞的比率，通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)。5AC:NS5AChimigen3蛋白。圖25是一系列條形圖，示出了用成熟的、抗原負(fù)載的DC(其如實(shí)施例中所述而制備)剌激三次后含細(xì)胞內(nèi)干擾素K(IFN-K)的T細(xì)胞的比率。通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)。5AC:NS5AChimigen3蛋白；PMA:佛波醇肉豆蔻酸；杜爾貝科磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)。圖26是一對(duì)條形圖，示出了用成熟的、抗原負(fù)載的DC(其如實(shí)施例中所述而制備)刺激三次后含細(xì)胞內(nèi)IFN-K的CD8+T細(xì)胞的比率。通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)。5AC:NS5AChimigen3蛋白。圖27是一對(duì)條形圖，示出了用成熟的、抗原負(fù)載的DC(其如實(shí)施例中所述而制備)刺:敫三次后含細(xì)月包內(nèi)IFN-K的CD4+T細(xì)月包的比率。通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)。5AC:NS5AChimigen3蛋白。圖28是一對(duì)條形圖，示出了用成熟的、抗原負(fù)載的DC(其如實(shí)施例中所述而制備)刺激三次后含細(xì)胞內(nèi)腫瘤壞死因子I(TNF-I)的T細(xì)月包的比率。通過(guò)FFC獲4尋凄t才居。5AC:NS5AChimigen3蛋白；PMA:佛波醇肉豆蔻酸；杜爾貝科磷酸鹽；DPBS。圖29是一對(duì)條形圖，示出了用成熟的、抗原負(fù)載的DC(其如實(shí)施例中所述而制備)刺激三次后含細(xì)胞內(nèi)TNF-I的CD8+T細(xì)胞(左圖)和CD4+T細(xì)胞(右圖)的比率。通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)。5AC:NS5AChimigen3蛋白。圖30是一對(duì)條形圖，示出了用成熟的、抗原負(fù)載的DC(其如實(shí)施例中所述而制備)刺激三次后表達(dá)顆粒蛋白GrB(左圖)和Pfn(右圖)的CD8+T細(xì)胞的比率。通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)。5AC:NS5AChimigen3蛋白。圖31是一對(duì)條形圖，示出了用成熟的、抗原負(fù)載的DC(其如實(shí)施例中所述而制備)刺激三次后淋巴細(xì)月包的總l丈(Rl門(mén)細(xì)月包(gatedcell))以及母細(xì)胞的比率。在最后刺激6天后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)。5AC:NS5AChimigen3蛋白。圖32是一對(duì)條形圖，示出了用成熟的、抗原負(fù)載的DC(其如實(shí)施例中所述而制備)刺;:敫三次后表達(dá)CD69的CD8+T細(xì)月包(左圖)以及表達(dá)CD69的CD4+T細(xì)胞(右圖)的相對(duì)比率。在最后刺激6天后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)。5AC:NS5AChimigen3蛋白。圖33是一對(duì)條形圖，示出了用成熟的、抗原負(fù)載的DC(其如實(shí)施例中所述而制備)刺激三次后，具有抗原特異性T細(xì)胞受體(TCR)(其結(jié)合EBV肽/HLA-A2四聚體(陽(yáng)性對(duì)照)或?qū)φ账木垠w(陰性四聚體))的CD8+T細(xì)胞(左圖)以及CD4+T細(xì)胞(右圖)的相對(duì)比率。在最后刺激6天后對(duì)來(lái)自三個(gè)不同培養(yǎng)孔(對(duì)應(yīng)于測(cè)試組和對(duì)照組的三個(gè)條(bar))的細(xì)胞進(jìn)行分析。通過(guò)FFC獲得凄史據(jù)。圖34是一對(duì)條形圖，示出了用成熟的、抗原負(fù)載的DC(其如實(shí)施例中所述而制備)刺激三次(利用不同數(shù)量的T細(xì)胞和DC)后，具有結(jié)合NS5A肽/HLA-A2五聚體的TCR的CD8+T纟田胞的相對(duì)比率。在最后刺激6天后對(duì)來(lái)自三個(gè)不同i備養(yǎng)孔(對(duì)應(yīng)于測(cè)試組和對(duì)照組的三個(gè)條)的細(xì)胞進(jìn)行分析。通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)。5AC:NS5AChimigen3蛋白。圖35是一系列FFC譜圖，示出了在兩個(gè)不同濃度下NS3Chimigen3蛋白與未成熟DC的結(jié)合。圖36是一對(duì)條形圖，示出了通過(guò)對(duì)CD32和CD206特異性的抗體抑制NS3Chimigen3蛋白與未成熟DC的結(jié)合。圖37是一系列條形圖，示出了第4天(上圖)和第7天在含NS3Chimigen3蛋白或破傷風(fēng)類(lèi)毒素負(fù)載的DC的培養(yǎng)物中，表達(dá)CD69的CD8+T細(xì)胞(左圖)以及表達(dá)CD69的CD4+T細(xì)胞(右圖)的相對(duì)比率。通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)。3C:NS3Chimigen3蛋白。圖38是一系列條形圖，示出了第4天(上圖)和第7天在含NS3Chimigen3蛋白或石皮傷風(fēng)類(lèi)毒素負(fù)載的DC的i咅養(yǎng)物中，CFSEloCD8+T細(xì)胞(左圖)以及CFSEloCD4+T細(xì)胞(右圖)的比率。通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)。3C:NS3Chimigen3蛋白。圖39是一對(duì)條形圖，示出了用成熟的、抗原負(fù)載的DC(其如實(shí)施例中用于NS5AChimigen3蛋白所述而制備)刺激三次后胚細(xì)胞T細(xì)胞的比率(比例)。利用兩種不同T細(xì)胞和兩個(gè)不同DC濃度進(jìn)行刺激。通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)。3C:NS3Chimigen3蛋白。圖40是一系列條形圖，示出了用成熟的、抗原負(fù)載的DC(其如實(shí)施例中所述而制備)刺激三次后，含細(xì)胞內(nèi)IFN-K的T纟田胞的比率。通過(guò)FFC獲4尋凄a居。3C:NS3Chimigen3蛋白。圖41是一對(duì)條形圖，示出了用成熟的、抗原負(fù)載的DC(其如實(shí)施例中所述而制備)刺激三次后，含細(xì)胞內(nèi)IFN-K的CD8+T細(xì)胞(左圖)和CD4+T細(xì)胞(右圖)的比率。通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)。3C:NS3Chimigen3蛋白。圖42是一對(duì)條形圖，示出了用成熟的、抗原負(fù)載的DC(其如實(shí)施例中所述而制備)刺激三次后，含細(xì)胞內(nèi)TNF-I的CD8+T細(xì)胞(左圖)和CD4+T細(xì)胞(右圖)的比率。通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)。3C:NS3Chimigen3蛋白。圖43是一對(duì)條形圖，示出了用成熟的、抗原負(fù)載的DC(其如實(shí)施例中所述而制備)刺激三次后表達(dá)顆粒蛋白GrB(左圖)和Pfn(右圖)的CD8+T細(xì)胞的比率。通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)。3C:NS3Chimigen3蛋白。圖44是一對(duì)條形圖，示出了用成熟的、抗原負(fù)載的DC(其如實(shí)施例中所述而制備)刺激三次后表達(dá)CD69的CD8+T細(xì)胞(左圖)以及表達(dá)CD69的CD4+T細(xì)胞(右圖)的相對(duì)比率。在最后刺激6天后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)。3C:NS3Chimigen3蛋白。圖45是一對(duì)條形圖，示出了用成熟的、抗原負(fù)載的DC(其如實(shí)施例中所述而制備)刺激三次后'淋巴細(xì)胞的總凄t(Rl門(mén)細(xì)胞)(左圖)以及母細(xì)胞的比率(右圖)。在最后刺激6天后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)。3C，AS60-1:NS3Chimigen3蛋白。圖46是一對(duì)條形圖，示出了用成熟的、抗原負(fù)載的DC(其如實(shí)施例中所述而制備)刺激三次(利用不同lt量的T細(xì)胞和DC)后，具有結(jié)合NS3肽/HLA-A2五聚體的TCR的CD8+T細(xì)胞的相對(duì)比率。在最后刺激5天后對(duì)來(lái)自三個(gè)不同培養(yǎng)孔(對(duì)應(yīng)于測(cè)試組和對(duì)照組的三個(gè)條)的細(xì)胞進(jìn)行分析。通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)。3C:NS3Chimigen3蛋白。圖47是一系列熒光流式細(xì)胞儀(FFC)譜圖，示出了在三種不同的濃度下HCV核心Chimigen3蛋白與未成熟DC的結(jié)合。圖48是一對(duì)條形圖，示出了通過(guò)對(duì)CD32和CD206特異性的抗體、甘露糖化的牛血清白蛋白(mBSA)和鼠IgG片4殳來(lái)抑制HCVChimigen3核心蛋白與未成熟DC的結(jié)合。圖49是一對(duì)條形圖，示出了用成熟的、抗原負(fù)載的DC(其如實(shí)施例中所述而制備)刺激三次后，含細(xì)胞內(nèi)IFN-K的CD8+T細(xì)胞(左圖)和CD4+T細(xì)胞(右圖)的比率。通過(guò)FFC獲得數(shù)據(jù)。HCV核心-TBD:HCV核心Chimigen3蛋白。圖50是一對(duì)二維FFC點(diǎn)圖，示出了用負(fù)載有HCV核心Chimigen3蛋白(HCV核心-TBD)(右側(cè)點(diǎn)圖)或僅用TBD(TBD)(左側(cè)點(diǎn)圖)的DC刺激三次后，具有結(jié)合HCV核心肽/HLA-B7四聚體的TCR的CD8+T細(xì)力包的比率。具體實(shí)施例方式A,概述本文4皮露了用于引起針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的組合物和方法。在特定的具體實(shí)施方式中，該組合物和方法引起針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，該抗原以其它方式^皮宿主識(shí)別為"自體"抗原。通過(guò)將包括免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和把結(jié)合結(jié)構(gòu)i或的嵌合抗原呈遞纟合宿主免疫系統(tǒng)來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答，其中所述靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體片段。通過(guò)該靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域，APC內(nèi)化、加工并呈遞引起體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答兩者的嵌合抗原。HCV是黃病毒家族的成員，其可以感染人類(lèi)，引起急性和慢性肝炎，并且可能導(dǎo)致肝細(xì)胞癌[Hoofnagle(2002)Hepatology36:S21-S29]。HCV基因組是9.6Kb無(wú)帽正才及性(positivepolarity)單鏈RNA分子，并通過(guò)負(fù)《連中間體而實(shí)現(xiàn)復(fù)制[LindenbachandRice(2005)Nature436:933-938]。HCV基因組編碼單個(gè)開(kāi)放閱讀框架，該開(kāi)it閱讀框架編碼多聚蛋白，加工該多聚蛋白以生成核心或衣殼蛋白(C)、兩種包膜糖蛋白(El和E2)、一種小的疏水蛋白(p7)、以及6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。將該多聚蛋白加工成單個(gè)蛋白是通過(guò)宿主和病毒蛋白酶來(lái)催化的[Lohmannetal.(1996)J.H印atol.24:11-19，Penineta1.(2004)J.Hepatol.24:11-19]。當(dāng)健康宿主(人或動(dòng)物)遭遇異種蛋白(foreignantigen)(例如來(lái)自細(xì)菌、病毒和/或寄生蟲(chóng)的蛋白)時(shí)，宿主通常引發(fā)免疫應(yīng)答。適應(yīng)性的免疫應(yīng)答可以為體液、細(xì)胞或兩者[Whittonetal.(2004)Adv.VirusRes.63:181-238]。細(xì)胞應(yīng)答的特征在于選4奪并擴(kuò)增能直接消除包含該抗原的細(xì)胞的特異性T輔助細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞(CTL)。在體液反應(yīng)的情況下，響應(yīng)于纟元原刺激，抗體由B細(xì)"包生成并一皮分泌入血液,口/或、淋巴中。4元體中和(neutralize)#元原(侈'B口，病毒)，通過(guò)特異性地結(jié)合于抗原表面上的表位，對(duì)其進(jìn)4于標(biāo)記以用于吞噬細(xì)胞破壞和/或通過(guò)補(bǔ)體介導(dǎo)機(jī)制以裂解受感染細(xì)胞[Carro(2005)NatureImmunol.5:981-986]。專(zhuān)甫助細(xì)月包(多數(shù)為CD4T細(xì)月包)4是供CTL(多數(shù)為CD8T細(xì)胞)和B細(xì)胞介導(dǎo)的抗體反應(yīng)(應(yīng)答)所必需的^t助活性。在患有慢性病毒感染的個(gè)體中，免疫系統(tǒng)不對(duì)新來(lái)的病原體發(fā)生反應(yīng)以產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答乂人而清除感染，因Jt匕宿主變得^t該病原體耐受。雖然HCV用來(lái)逃避免疫監(jiān)視的機(jī)制尚未完全理解，但已經(jīng)提出了幾種可能性。這些可能的機(jī)制包括由NS3-4A、E2和NS5A序列阻斷IRF3介導(dǎo)的I型IFN誘導(dǎo)、阻斷PKR(雙鏈RNA活化的蛋白激酶)以及通過(guò)NK細(xì)月包的功能來(lái)干4尤HCV蛋白[Rehermannetal.(2005)NatureRev.Immunol.5:215-229]。最近的結(jié)果也表明T細(xì)胞在HCV感染的控制和消除中具有關(guān)4建作用[Bowenetal.(2005)Nature436:946-952;Wielandetal.(2005)J.Virol.79:9369-9380]。在急性HCV感染中，盡管HCV感染后7-8周可才全測(cè)到病毒特異性抗體[Pawlotsky(1999)J.Hepatol.31(suppl):71-79],但抗體的作用仍不清楚，因?yàn)橐炎C實(shí)黑猩猩體內(nèi)的HCV感染可在無(wú)抗HCV抗體的情況下消退[Cooperetal.(1999)Immunity10:439-449],而人體內(nèi)的HCV感染則可在無(wú)血清轉(zhuǎn)化的情況下消退[Postetal.(2004)J.Infect.Dis.189:1846-1855〗。jt匕夕卜，最近有i正據(jù)表明個(gè)體不能產(chǎn)生抗引起'f曼性感染的HCV的可4企測(cè)水平CD4+和CD8+T細(xì)J包應(yīng)答，[上文，Cooperetal.(1999);Thimmeetal.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:15661-15668;Thimmeetal.(2002)J.Exp.Med.194:1395-1406;Shoukryetal.(2003)J.Exp.Med.197:1645-1655]。盡管已表明如在I型IFN反應(yīng)中與在抗病毒復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的雙鏈RNA的免疫反應(yīng)中的轉(zhuǎn)錄變化的免疫功能存在相互作用，但在病毒感染的清除中尚未觀察到該效應(yīng)的直接證據(jù)[上文，Rehermannetal.(2005)]。已經(jīng)觀察到在消退HCV感染的患者中，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的多表位特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答[上文，Rehermannetal.(2005)],然而在患有'ft性HCV感染的患者中，T細(xì)月包應(yīng)答4交晚、短暫或局卩艮[上文，Thimmeetal.(2001);Diepolderetal.(1995)Lancet36:1006-1007;Lechneretal.(2000)J.Exp.Med.191:1499-1522]。導(dǎo)致慢性感染的強(qiáng)健的抗HCV抗原的T細(xì)胞應(yīng)答的缺乏還可能是由于缺乏將合適的病毒抗原呈遞至宿主免疫系統(tǒng)的適當(dāng)呈遞。消除病毒方面的成功可能由通過(guò)APC加工和呈遞抗原的方式以及涉及調(diào)節(jié)性T輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)而產(chǎn)生?？乖蔬f過(guò)程中的主要參與者是捕獲并加工抗原的樹(shù)突細(xì)胞>(DC)。此外，DC表達(dá)淋巴細(xì)胞協(xié)同刺激分子并將其遷移至淋巴器官，其中它們分泌細(xì)胞因子以引發(fā)免疫應(yīng)答。DC還控制B和T淋巴細(xì)胞增殖，而B(niǎo)和T淋巴細(xì)胞是免疫介導(dǎo)者[Steinmanetal.(l999)Hum.Immunol.60:562-567]。CTL反應(yīng)的產(chǎn)生在消除病毒感染的細(xì)月包并且由此在感染的消退方面是關(guān)4建的。取決于抗原定位通過(guò)APC對(duì)接觸到的抗原進(jìn)行不同的加工[上文，Steinmanetal.(l999)]。夕卜源性抗原在APC的內(nèi)涵體內(nèi)力卩工，并將生成的肽片段呈遞于與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)II類(lèi)分子復(fù)合的細(xì)胞表面上。將該復(fù)合物呈遞至CD4+T細(xì)胞可使其活化。結(jié)果，由輔助T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子提供B細(xì)胞活化所需的可溶性因子，以產(chǎn)生針對(duì)外源性抗原的抗體(體液反應(yīng))。相反，細(xì)胞內(nèi)抗原在蛋白酶體內(nèi)加工，并且得到的肽片段作為與MHCI類(lèi)分子的復(fù)合物而呈遞于APC的表面上。在該復(fù)合物結(jié)合于T細(xì)胞受體(TCR)后，可將抗原呈遞至CD8+T細(xì)胞，這引起CTL免疫應(yīng)答。CTL可以通過(guò)殺死受感染細(xì)力包以及生成i者如細(xì)胞因子千擾素-y(IFN-y)的因子(其發(fā)揮作用以抑制病毒復(fù)制)而消除病毒。由于病毒在患有慢性病毒感染的個(gè)體中復(fù)制活躍，因此在宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生病毒抗原，并且分泌的抗原存在于循環(huán)中。盡管存在這些抗原，但仍然缺乏抗病毒的有效免疫應(yīng)答。有效的免疫應(yīng)答將涉及生成CTL,其能夠以高親和力識(shí)別大量(boardarray)的病毒表位。因此，含病毒抗原的適宜治療性疫苗必須凈皮內(nèi)化并在適當(dāng)?shù)募?xì)月包腔隙內(nèi)加工，以使病毒肽可呈遞于MHCI類(lèi)分子的溝內(nèi)。在I類(lèi)呈遞的背景下，病毒表位的識(shí)別可允許CD8+T細(xì)胞的活化、生成并分化為功能性CTL,該功能性CTL能夠發(fā)起抗病毒感染的有效反應(yīng)(應(yīng)答)。因此，如果將含病毒抗原的治療性疫苗通過(guò)蛋白酶體(proteasomal)途徑加工并通過(guò)MHCI類(lèi)呈遞，則其將會(huì)是有歲丈的[Larssonetal.(2001)TrendsImmunol.22:141-148]。這可以通過(guò)在宿主細(xì)i包內(nèi)生成該抗原或通過(guò)遞送至適當(dāng)?shù)募?xì)l包腔隙以4吏該抗原以將引起期望細(xì)胞應(yīng)答的方式而被加工并呈遞來(lái)實(shí)現(xiàn)。在文獻(xiàn)中已記載了幾種用于抗原的細(xì)胞內(nèi)遞送的途徑，包括病毒載體[Lorenzetal.(2001)Hum.GeneTher.10:1095-1103],使用DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)月包[Donnellyetal.(1997)Annu.Rev.Immunol.15:617-648]以及通過(guò)注射的DNA載體表達(dá)該^t原[Laietal.(1998)Crit.Rev.Immunol.18:449-484]。4昔助于其APC功能性，已表明來(lái)源于單核細(xì)^^的DC具有作為能刺激原發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)劑的巨大潛能[Banchereauetal.(1998)Nature392:245-252]。DC能捕獲、力口工并有效地呈遞抗原的這種獨(dú)特性能使其成為治療性疫苗研發(fā)非常重要的工具[Laupezeetal.(1999)Hummmunol.60:591-597]。使抗原革巴向于DC是一個(gè)決定性步驟，并且已采用幾種存在于對(duì)單克隆抗體(mAb)的Fc區(qū)域特異性的DC上的受體用于該目的[Regnaultetal.(1999)J.Exp.Med.189:371-380]。這種途徑的實(shí)例包4舌卵巢癌mAb-B43.13[Berlynetal-pOOl)ClinImmunol.101:276-283]、抗PSAmAb、以及抗HBV抗體抗原復(fù)合物[Wenetal.(1999)Int.Rev.Immunol.18:251-258]。利用負(fù)載有腫瘤相關(guān)抗原的DC的癌癥免疫療法已表明可產(chǎn)生腫瘤特異性免疫應(yīng)答禾口4元月中瘤；舌寸生[Camptonetal.(2000)J.Invest.Dermatol.115:57-61;Fongetal.(2000)A醒.Rev.Immunol.18:245-273]。體內(nèi)使用腫瘤抗原搏動(dòng)的DC，在臨床試驗(yàn)中獲得了有前途的結(jié)果[Tarteetal.(1999)Leukemia13:653-663]。這些研究清楚地表明利用DC來(lái)產(chǎn)生抗癌癥抗原的免疫應(yīng)答的效力。治療性疫苗必須能夠引起抗病毒抗原的宿主免疫應(yīng)答，且宿主免疫系統(tǒng)能耐受該免疫應(yīng)答。該過(guò)程涉及將抗原遞送至DC、適當(dāng)?shù)目乖蔬f以及啟動(dòng)在'f曼性攜帶者中可引起治療效應(yīng)的HCV特異性CD8+T細(xì)胞。本發(fā)明的嵌合抗原疫苗是一類(lèi)新型的重組"嵌合抗原，，，其以選定抗原與抗體的特異性區(qū)域的融合蛋白的形式生成。分子的雙功能設(shè)計(jì)適合于將病毒抗原扭向于APC特別是DC,以引起抗選定抗原的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答兩者。圖1中示意性地示出了其二聚化(dimerized)形式的HCVChimigen疫苗。該疫苗具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域含有重組HCV病毒抗原的免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域(IRD)以及含有單克隆抗體的Fc片段的靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域(TBD)。該疫苗的設(shè)計(jì)為其功能賦予幾種獨(dú)特性能。該嵌合設(shè)計(jì)有利于形成抗體樣(抗體狀)結(jié)構(gòu)并引起適當(dāng)?shù)目乖蔬f，該抗體樣結(jié)構(gòu)能促進(jìn)其通過(guò)特異性受體而吸收。該嵌合i殳計(jì)可通過(guò)蛋白酶體途徑力口工，并且肽以與MHCI類(lèi)的復(fù)合體而凈皮呈遞，引起CTL反應(yīng)。ChimigenTM疫苗還可以通過(guò)內(nèi)f函體(endosomal)途^圣力口工，由MHCII類(lèi)呈遞，以產(chǎn)生體液反應(yīng)。TBD介導(dǎo)ChimigenTM疫苗與特異性APC受體例如Fcy受體的結(jié)合。雖然本發(fā)明不受任何特定的作用機(jī)制的限制，但似乎該分子與APC(例如，未成熟DC)上Fcy受體的結(jié)合可引起該抗原通過(guò)MHCI類(lèi)通路而加工。在某些具體實(shí)施方式中，異源TBD、重組抗原、結(jié)合于該抗原氨基和羧基末端的不同長(zhǎng)度的連接肽使得整個(gè)分子成為"異質(zhì)(foreign)"并允許宿主免疫系統(tǒng)發(fā)起抗包4舌HCV抗原的融合蛋白的多表位免疫應(yīng)答。融合蛋白Chimigen3蛋白還可以在非哺乳動(dòng)物細(xì)月包(例如，酵母或昆蟲(chóng)細(xì)月包)中生成，以7吏它們以非哺乳動(dòng)物方式糖基化，從而增強(qiáng)其在哺乳動(dòng)物(例如，人類(lèi))宿主體內(nèi)的免疫原性。昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)引入的甘露糖/寡甘露糖糖基化也允許該疫苗通過(guò)APC上的甘露糖受體而吸收。因此，ChimigenTM疫苗可以由APC通過(guò)特異性Fcy受體I、II和III(CD64、CD32、CD16)、甘露糖受體(CD206)、其他C型凝集素受體并通過(guò)吞噬作用而內(nèi)化[Geijtenbeeketal.(2004)Annu.Rev.Immunol.22:33-54]。通過(guò)特異性受體的吸收、通過(guò)內(nèi)涵體和蛋白酶體途徑的加工、以及在兩類(lèi)MHC分子上的呈遞，可以引起廣泛的能夠預(yù)防病毒感染或清除病毒感染的細(xì)胞的免疫應(yīng)答。CTL反應(yīng)的發(fā)生對(duì)于清除病毒感染的細(xì)胞是關(guān)鍵的[Whittonetal.(2004)Adv.VirusRes.63:181-238]。用于治療慢性HBV感染的HepaVaxxB，ViRexx，sfirstChimigen治療性疫苗，已經(jīng)在臨床前研究中表現(xiàn)出非常有前景的纟吉果[Georgeetal.(2003)Anovelclassoftherapeuticvaccinesforthetreatmentofchronicviralinfections:evaluationinduckschronicallyinfectedwithduckhepatitisBvims(DHBV),in:Hepdart2003，F(xiàn)rontiersinDrugDevelopmentforViralHepatitis:■December14-18，Kauai,Hawaii,USA;Georgeeta.(2003)Anovelclassoftherapeuticvaccinesforthetreatmentofchronicviralinfections.InternationalMeetingoftheMolecularBiologyofHepatitisBViruses.September7-10,CentroCongressiGiovanniXXIII,Bergamo,Italy;Georgeetal.(2004)ImmunologicalEvaluationofaNovelChimericTherapeuticVaccinefortheTreatmentofChronicHepatitisBInfections.(2004)InternationalMeetingoftheMolecularBiologyofHepatitisBViruses.WoodsHole，MA,USA，October24-27，2004;Georgeetal.(2005)BioProcessingJournal4:39-45;Georgeetal.(2006)AnewclassoftherapeuticvaccinesforthetreatmentofchronichepatitisBinfections.In"FramingtheKnowledgeofViralHepatitis"Schi腹i,R.F.Editor,IHLPressUSA]。B.定義本申請(qǐng)，指明)。"抗體"是指由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白分子。這些分子的特征在于具有與抗原特異性結(jié)合的能力，每一個(gè)分子均可根據(jù)另一個(gè)而確定。"抗體應(yīng)答"或"體液應(yīng)答"指一種免疫應(yīng)答，其中抗體由B-淋巴細(xì)l包產(chǎn)生，并響應(yīng)于^t原刺〗敫而分泌入血'液和/或'淋巴中。在適當(dāng)作用的免疫應(yīng)答中，抗體特異性結(jié)合于細(xì)胞(例如，病原體)表面上的抗原，4吏得該細(xì)胞纟皮吞噬細(xì)胞、抗體依賴(lài)的細(xì)胞毒性(ADCC)效應(yīng)纟田刀包、和/或補(bǔ)體介導(dǎo)才幾制而石皮壞。4元體還在全身4盾環(huán)，且可以結(jié)合于游離病毒體(freevirion)。這種抗體結(jié)合可以中和所述病毒體，并防止其感染細(xì)月包以及^f吏該病毒體在腎內(nèi)通過(guò)吞喧作用或過(guò)濾而/人宿主中清除。"抗原"指任何物質(zhì)，作為與適當(dāng)?shù)募?xì)胞接觸的結(jié)果，該物質(zhì)可i秀導(dǎo)每文感性和/或免疫應(yīng)答性狀態(tài)，且可在體內(nèi)或體外(invitro)以一種可i侖i正性方式與致敏受治療者的纟元體和/或免疫細(xì)力包反應(yīng)。因it匕，抗原可包纟舌，例如細(xì)力包或病毒顆外立和/或其紐—件(組成，component)中的一種。在病毒的情況下，該組件特異性地包括病毒蛋白。"抗原呈遞細(xì)胞"("APC")是指抗原誘導(dǎo)事件的輔助細(xì)胞(佐細(xì)胞)，其主要通過(guò)內(nèi)化抗原、加工抗原并在主要組織相容性復(fù)合物(MHC)I類(lèi)或II類(lèi)分子的背景下將抗原表位呈遞纟合淋巴細(xì)胞而起作用。APC與抗原的相互作用是免疫誘導(dǎo)中的一個(gè)必要步驟，因?yàn)槠?吏得淋巴細(xì)力包4妄觸并識(shí)別抗原性分子，并1"吏淋巴細(xì)胞變得活化。示例性的APC包括巨喧細(xì)胞、單核細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、交錯(cuò)樹(shù)突狀細(xì)胞、濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞，以及B細(xì)胞。"B細(xì)胞，，是指一類(lèi)淋巴細(xì)胞，該淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生與抗原相互作用的免疫球蛋白(抗體)。"CH1區(qū)"、"CH2區(qū)"、"CH3區(qū)"每一個(gè)均指抗體重《連恒定域(恒定結(jié)構(gòu)域)的不同區(qū)域。"細(xì)胞應(yīng)答"或"細(xì)胞宿主應(yīng)答"是指一類(lèi)由特異性輔助和殺傷T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，所述特異性輔助和殺傷T細(xì)胞能夠直4妾或間接清除病毒感染的細(xì)胞或癌細(xì)胞。如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"嵌合抗原"是指一種包括免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域(IRD)和耙結(jié)合結(jié)構(gòu)域(TBD)的多肽。該免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和把結(jié)合結(jié)構(gòu)域可通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)方式直接或間接地連接。"復(fù)合物"或"抗原-抗體復(fù)合物"是指抗體與抗原之間的反應(yīng)產(chǎn)物。由多Y介抗原形成的復(fù)合物在含水體系中傾向于不可溶。"細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞"是一種專(zhuān)門(mén)類(lèi)型的淋巴細(xì)胞，其能夠破壞外源細(xì)胞和感染有傳染性病原體(infectiousagent)(其能產(chǎn)生病毒^生:抗原)的宿主細(xì)胞。"表位"是指復(fù)雜抗原分子上抗原決定簇的最簡(jiǎn)單形式；其為由抗體或T細(xì)胞受體識(shí)別的抗原的特異性部分。"片段"是指已破壞的實(shí)體(entity)的一部分。在本發(fā)明的背景中，其還可以用來(lái)指相應(yīng)的實(shí)體的一部分。因此，包括Fc片,殳的融合蛋白可以指包括與天然片段相同肽序列的重組分子。"融合蛋白"指通過(guò)由合并兩個(gè)或多個(gè)編碼序列得到的雜合基因表達(dá)而形成的蛋白。"鉸鏈區(qū)"指抗體中連接Fab片段與Fc片段的部分；所述鉸鏈區(qū)包含將兩條重鏈共價(jià)地連接在一起以形成二聚分子的二硫鍵。術(shù)語(yǔ)"同系物"指與另一個(gè)分子表現(xiàn)出同源性的分子，例如在相應(yīng)位置具有相同或相似的化學(xué)殘基序列。短語(yǔ)"同源百分比，，或"同源性百分比"指在相同或類(lèi)似的同源多核普酸或多肽的相同位置處的核苷酸或氨基酸百分比。例如，如果在兩個(gè)蛋白中80個(gè)殘基中有75個(gè)是相同的，則所述兩個(gè)蛋白是93.75%同源的。同源性百分比可以使用本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員已知的各種軟件程序來(lái)確定。"宿主"指例如可纟合予嵌合抗原的溫血?jiǎng)游?。在本發(fā)明的背景中，"雜交"意思是指低聚化合物的互補(bǔ)鏈的配對(duì)。在本發(fā)明中，優(yōu)選的配對(duì)機(jī)制涉及氫鍵，該氫鍵可為低聚化合物的互^卜核苷或才亥苦酸石咸基(核芬&臾石威基(nucleobase))鏈之間的Watson-Crick、Hoogsteen或反Hoogsteen氪4建。侈'B口，^>口票令禾口胸腺嘧啶是通過(guò)形成氫鍵而配對(duì)的互補(bǔ)核苷酸石咸基。雜交可在不同的情況下發(fā)生。雜交可以在不同的環(huán)境下發(fā)生。在多核苷酸的背景中使用的術(shù)語(yǔ)"雜交"以及類(lèi)似用語(yǔ)，意思是指常規(guī)雜交條件，優(yōu)選例i口在50。/o甲酰胺/6XSSC/0.1%SDS/100pg/mLmDNA中的雜交，其中雜交的溫度高于37°C，而在0.1XSSC/0.1%SDS中的洗滌溫度高于55°C。"免疫性"或"免疫應(yīng)答"是指身體(body)對(duì)抗原的應(yīng)答(反應(yīng))。在特定的具體實(shí)施方式中，其指身體4氏抗感染性疾病或^f呆護(hù)自身免于感染性疾病的能力。免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域(IRD)"指嵌合分子的不同構(gòu)象的抗原部分。IRD包括一個(gè)或多個(gè)抗原或者一個(gè)或多個(gè)重組抗原。優(yōu)選的病毒抗原包括但不限于HCV核心、HCVE1-E2、HCVE1、HCVE2、HCVP7、HCVNS3-絲氨酸蛋白酶、HCVNS4A、HCVNS4B、以及HCVNS5A。如在本文中"f吏用的，短語(yǔ)"免疫-可治療的疾病"指一種可以通過(guò)在受治療者體內(nèi)引發(fā)或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答來(lái)預(yù)防、抑制或緩解的病癥或疾病。"淋巴細(xì)胞，，指的是存在于例如血液中的有核細(xì)胞的亞類(lèi)，其介導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答。"單克隆抗體"或"mAb"指由融合的雜交細(xì)胞(即，雜交瘤細(xì)胞)克隆或其遺傳同源性(同質(zhì))種群產(chǎn)生的抗體。克隆雜交細(xì)胞以建立產(chǎn)生特異性單克隆抗體的細(xì)胞系，所述特異性單克隆抗體是化學(xué)上或免疫學(xué)上同源的，即僅識(shí)別一類(lèi)抗原。如在本文中使用的，"可操作性(叩erably)連接"意思是結(jié)合入遺傳構(gòu)建體中，使得表達(dá)控制序列可有效控制感興趣編碼序列的表達(dá)。"肽鍵"指兩個(gè)或多個(gè)氨基酸之間的共價(jià)化學(xué)鍵。其是一個(gè)氨基酸的oc氨基與另一個(gè)氨基酸的oc羧基之間的取代的酰胺鍵。"藥物賦形劑"包括一種材料例如佐劑、載體、pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、張力(張度)調(diào)節(jié)劑、濕潤(rùn)劑、防腐劑等。"藥用"是指生理上可與人或其他動(dòng)物相容的無(wú)毒組合物。如在本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"是指任何長(zhǎng)度的核香酸(核糖核酸或脫氧核4唐核酸)的聚合形式(多聚形，polymericform)。該術(shù)語(yǔ)Y又指分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，該術(shù)語(yǔ)包括-雙鏈和單鏈DNA和RNA。其還包括已知類(lèi)型的修飾，例如本領(lǐng)域中已知的標(biāo)記物、曱基化，"帽(cap)"，用類(lèi)似物取代天然存在的核香酸中的一個(gè)或多個(gè)，核苷酸間^修飾例如i者如那些帶有不帶電4建(如，膦酸曱酯、磷酸三酯、磷酰胺化物(磷酰胺酶，phosphoamidate)、氨基曱酸酯等)和帶電4建(命J^!口，石危4戈石粦酉臾酉旨(phosphorothioate)、二石克^石壽酸酯)的修飾、那些含懸掛物(下垂物，pendant)部分的修飾例如蛋白(包括例如核酸酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚-L-賴(lài)氨酸等)、那些具有插入劑(例如，吖啶、補(bǔ)骨脂素等)的修飾、那些含有螯合劑(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的修飾、那些含有烷化物(alkylator)的修飾、那些具有改性鍵合的(modifiedlinkage)(例如，cc-端基核酸)，以及未修飾形式的多核苷酸。"多肽"和"蛋白，，可互換使用，并意思是指任何肽連接的(peptide-linked)氨基酸鏈，無(wú)i侖長(zhǎng)度或翻譯后的》務(wù)飾如4可。如在本文中所〗吏用的，"預(yù)防"意思是指完全防止疾病的癥狀、延鄉(xiāng)爰疾病癥狀發(fā)作、或減弱隨后發(fā)展的疾病癥4犬的嚴(yán)重性。"防止，，疾病意思是指該疾病的癥狀基本上不存在。"蛋白酶切割位點(diǎn)"是指一個(gè)位點(diǎn)，在該位點(diǎn)蛋白水解酶催化多肽鏈中氨基酸之間肽鍵的水解(斷裂)。在本發(fā)明中，短語(yǔ)"嚴(yán)格的雜交條件"或"嚴(yán)格的條件"是指這樣的條件，在該條件下本發(fā)明的化合物將雜交于其耙序列，但Z又雜交于最小數(shù)量的其他序列。術(shù)語(yǔ)"受治療者"指任何溫血?jiǎng)游铮瑑?yōu)選人。"標(biāo)簽"指用來(lái)分離或純化含該標(biāo)簽的分子的標(biāo)記物或標(biāo)記物序列。示例性的標(biāo)簽包括6xHis(即6個(gè)組氨酸的序列)標(biāo)簽。"T細(xì)胞，，指一類(lèi)淋巴細(xì)胞，其可以發(fā)起針對(duì)抗原的抗原特異性應(yīng)答并且在體液和細(xì)月包免疫應(yīng)答中起作用。"耙結(jié)合結(jié)構(gòu)域(TBD)"指免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的全部或一部分(例如，CH1(全部或部分)-CH2-CH3)。短語(yǔ)"治療有效量"指試劑(例如，嵌合抗原或編碼嵌合抗原的多核苷酸)的量足以引起有效的針對(duì)抗原的B細(xì)胞、細(xì)胞毒性T'淋巴細(xì)力包(CTL)和/或壽煮助T'淋巴細(xì)力包(Th)應(yīng)答并阻斷或治愈或至少部分地阻止或減'j"曼疾病或病癥的癥狀和/或并發(fā)癥。通過(guò)分泌細(xì)胞因子，一個(gè)T細(xì)胞亞群起T輔助細(xì)胞的作用，所述細(xì)胞因子有助于活化B細(xì)J包以分泌抗體或有助于另一種T細(xì)胞亞群4吏成為效應(yīng)子細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。如在本文中^f吏用的，術(shù)語(yǔ)"治療"覆蓋任何可通過(guò)嵌合抗原治療的動(dòng)物(特另"是人)體中的病癥的治療，并且包4舌(i)防止該病癥在受治療者體內(nèi)發(fā)生，該受治療者可能易感染所述病癥，4旦尚未診斷患有該病癥；(ii)抑制該病癥，例如阻止或減慢其發(fā)展；或(iii);咸i爰i亥病癥，例^W吏i亥病癥或其癥習(xí)犬消退。如在本文中〗吏用的，"治療性"的藥劑是指這樣的試劑，該藥劑能導(dǎo)致疾病的癥狀完全消失，或降4氐該疾病癥狀的嚴(yán)重性。"異源(異種型，xenotypic)"意思是指來(lái)自于除了宿主之外的種屬。例如，由小鼠基因組克隆的重組表達(dá)的抗體對(duì)人是異源的^f旦對(duì)小鼠并不是異源的，不管該重組表達(dá)的4元體在細(xì)菌、昆蟲(chóng)、人還是小鼠細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。因此，在本發(fā)明的嵌合抗原的背景中，異源TBD(例如，異源抗體分子或異源抗體片段)指衍生自不同于嵌合抗原結(jié)合的種屬。c.嵌合抗原本發(fā)明的組合物包括嵌合抗原，該嵌合抗原包括免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域(IRD)和耙結(jié)合結(jié)構(gòu)域(TBD)組成。在本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方式中，IRD部分能夠i秀導(dǎo)體液和/或T細(xì)胞應(yīng)答，而輩巴結(jié)合部分能夠結(jié)合APC如樹(shù)突細(xì)胞。本發(fā)明的嵌合抗原還可以包括下列中的一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白的鉸鏈區(qū)(或其節(jié)段)、免疫球蛋白的CH1區(qū)(或其節(jié)段)、肽連接子、蛋白酶切割位點(diǎn)、以及適用于提純步驟的標(biāo)簽。本發(fā)明的嵌合抗原能夠結(jié)合于APC并活化APC。通常<旦非必需的，該IRD是TBD的N末端。在本發(fā)明的某些具體實(shí)施方式中，嵌合抗原的IRD包4舌一種或多種(例3口，2、3、4、5、6、7、8、9或10)蛋白(4元原)，戶(hù)斤述蛋白(抗原)選自包括諸如本文中所述的一種或多種HCV蛋白或一種或多種重組HCV蛋白。在這樣的蛋白之間可以可選地是連接子，諸如本文中所披露的任何連接子。在本發(fā)明的嵌合抗原中，可以使用這些抗原的免疫原片段而非全長(zhǎng)抗原。如果嵌合抗原中存在一種以上抗原，則可僅使用全長(zhǎng)抗原、僅使用免疫原片段，或使用全長(zhǎng)抗原與全長(zhǎng)蛋白的混合物。本發(fā)明的嵌合抗原可以為單體(即，它們包含包括IRD和TBD的單個(gè)單^立)或者它們可以為多體(即，它們可以包含多個(gè)單^f立，每個(gè)單位包括IRD和TBD)。多體可以為例如二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、七聚體(septamer)、或八聚體。在這樣的多聚體中，單個(gè)單位可以相同或不同，或者某些相同而其他不同。圖1示出了二聚嵌合抗原。在本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式中，嵌合抗原的ID包4舌融合于一種或多種HCV蛋白或者一種或多種重組HCV蛋白的6xHis肽。在本發(fā)明的某些具體實(shí)施方式中，嵌合抗原的TBD可以為抗體片,殳。該TBD可以為與待給予相關(guān)嵌合抗原的宿主(受治療者)相同的種屬。另一方面，在本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方式中，嵌合抗原的TBD是與宿主異源的抗體片4史。例如，如果宿主是人，則示例性的異源抗體片段是非人動(dòng)物抗體片段，如小鼠抗體片段。在本發(fā)明的某些具體實(shí)施方式中，該異源抗體片段包括鼠Fc片段。在本發(fā)明的最優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，TBD包括異源Fc片段(或其節(jié)段)、鉸鏈區(qū)(或其節(jié)段)、CH1區(qū)(或其節(jié)段)、以及適合于將靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域連4秦于該IRD的肽4定。本發(fā)明還包括連4妄分子(linkingmolecule)的用途，該連接分子將IRD連接于TBD。示例性的連接子分子(連接分子，linkermolecule)包4舌亮氨@交4立《連、和生物素/4元生物素蛋白。其4也可4吏用的連接子(例如在融合蛋白中)是肽序列。這樣的肽連接子的長(zhǎng)度通常為約2至約40個(gè)氨基酸(例如，約4-10個(gè)氨基酸)。示例性的肽連接子包括氨基酸序列SRPQGGGS(SEQIDNO:l)。其他連接子在本領(lǐng)域中是眾所周知，并且通常富含甘氨酸和/或丙氨酸，以允許其區(qū)域之間連接的靈活性。通常，在本發(fā)明的嵌合抗原中，IRD和TBD不通過(guò)TBD(例如，抗體分子或抗體分子片段)的抗原結(jié)合部分與IRD上適當(dāng)?shù)目乖砦恢g的物理性抗原-抗體相互作用而連接。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的嵌合抗原是具有兩個(gè)部分的融合蛋白，即，含抗原序列(例如病毒抗原)的IRD、以及含異源Fc片段的TBD。異源鼠Fc片段結(jié)合于APC,特別是樹(shù)突細(xì)胞上的特異性受體。因此，嵌合抗原的結(jié)合區(qū)特異性地靶向抗原呈遞細(xì)胞。然后，APC的內(nèi)^卩工具(internalmachinery)力o工i亥嵌合^t原，并呈遞MHCI類(lèi)和II類(lèi)分子上的特異性肽以接觸并活化T細(xì)胞并且纟田月包^口癌纟田月包。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，該嵌合抗原可以為具有兩個(gè)部分的融合蛋白，即修飾的病毒抗原或多種抗原、抗原蛋白片段或肽、或者其特異位點(diǎn)具有糖基化的任何一種、以及也可以被糖基化的異源鼠Fc片#殳。在又一具體實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了另一種修飾的嵌合抗原，其中所述抗原(IRD)是生物素化的，而所述TBD(例如，F(xiàn)c片^殳)與抗生物素蛋白(如抗生物素蛋白《連菌素)軛合，例如在融合蛋白中。這樣的抗生物素蛋白軛合的TBD促進(jìn)了一大類(lèi)IRD-TBD扼合物的生成。當(dāng)然，應(yīng)該理解，IRD可與抗生物素蛋白輒合(例如，以融合蛋白的形式)，而TBD(例如，F(xiàn)c片,殳)可為生物素4b的。在又一具體實(shí)施方式中，本發(fā)明^是供了IRD(抗原)與TBD(例如，抗體Fc片革殳)之間通過(guò)化學(xué)扼合的結(jié)合。本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式包括HCV的重組抗原(其通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)融合于抗體片段)的用途、在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中生成融合蛋白以及其用作(useas)抵抗慢性HCV感染的治療性疫苗。本發(fā)明4是供了一種有歲丈的方法，用于在體內(nèi)^)夸HCV4元原遞送至APC以1"更產(chǎn)生廣泛的免疫應(yīng)答，涉及CTL和Th2(抗體)應(yīng)答的Thl應(yīng)答。預(yù)選的病毒抗原(例如，不能被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別的抗原)的免疫原性可由于異源抗體片段的存在以及昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中特異性糖基化的存在而^是高。由于存在抗體組分，抗原-抗體片賴(lài)二的融合蛋白將結(jié)合于在免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞(例如APC)上存在的特異性受體，其中所述多種細(xì)胞包括樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)胞、以及粒細(xì)胞。給予人或動(dòng)物的融合蛋白將由APC,特別是DC內(nèi)化，將被水解為小肽，并與MHCI類(lèi)和/或MHCII類(lèi)分子形成復(fù)合物而呈遞于細(xì)胞表面，T細(xì)胞具有適當(dāng)特異性的抗原特異性T細(xì)胞受體(TCR)。以這種方式，該嵌合抗原(融合蛋白)可以引起廣泛的免疫應(yīng)答并清除病毒感染。如在本文中所^吏用的，術(shù)^吾"耙結(jié)合結(jié)構(gòu)域(TBD)"指免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的全長(zhǎng)或部分，其是能夠結(jié)合于APC上Fc受體的抗體片段。根據(jù)本發(fā)明，TBD是一種能夠結(jié)合于APC，特別是樹(shù)突細(xì)胞上的Fc受體的蛋白，并且隨后可通過(guò)受體介導(dǎo)的吸收(才聶取)而轉(zhuǎn)運(yùn)到APC內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明，F(xiàn)c片段的存在增加了嵌合抗原通過(guò)APC,特別是DC上的Fc受體的吸收。通過(guò)特異性吸收，可加工該病毒抗原并作為異質(zhì)而呈遞；因此，可有效地引起針對(duì)該病毒抗原的免疫應(yīng)答，其本身可^皮宿主耐受或引起宿主體內(nèi)極其微:弱的免疫應(yīng)答。此外，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，嵌合抗原能夠結(jié)合于巨噬細(xì)胞甘露糖受體/C-型凝集素受體。巨噬細(xì)胞甘露糖受體(MMR)，也稱(chēng)為CD206，在諸如DC的APC上表達(dá)。該分子是內(nèi)吞受體的C型凝集素家族的一個(gè)成員。甘露糖化的嵌合抗原可以被CD206結(jié)合并內(nèi)化。通常，認(rèn)為外源性抗原主要通過(guò)MHCn類(lèi)途徑加工和呈遞。然而，在通過(guò)CD206靶向的情況下，有證據(jù)表明，涉及MHCI類(lèi)和MHCII類(lèi)途徑[Apostolopoulosetal.(2000)Eur.J.Immunol.30:1714;Apostolopoulosetal.(2001)CumMol.Med.1:469;Ramakrishnaetal.(2004)J.Immunol.172:2845-2852]。因此，用特異性靶向CD206的嵌合抗原負(fù)載的單核細(xì)胞源樹(shù)突細(xì)胞將i秀導(dǎo)potentI類(lèi)依賴(lài)性CD8+CTL應(yīng)答和II類(lèi)依賴(lài)性增殖T輔助細(xì)胞應(yīng)答[Ramakrishnaetal.(2004)J.Immunol.172(5):2845-52]。示例性的TBD來(lái)自小鼠抗HBVsAgmAb(雜交瘤2C12)(如在pFastBacHTa表達(dá)載體中克隆的)，并且在昆蟲(chóng)細(xì)月包表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)中表達(dá)。/人小鼠抗HBVsAgmAb的N末端到C末端，該TBD由部分CH1(含有氨基酸序列VDKKI;SEQIDNO:2)和鉸鏈-CH2-CH3組成。用于實(shí)施本發(fā)明的IgGl分子的恒定區(qū)可以包含連接肽、部分CHl-鉸鏈以及CH2和CH3區(qū)。單體TBD的4交鏈區(qū)可以與另一個(gè)TBD分子形成雙碌J建。該蛋白可以表達(dá)為N末端融合蛋白，該N末端融合蛋白具有6xHis標(biāo)簽、7個(gè)氨基酸rTEV(重組性煙草蝕纟丈病毒)蛋白酶切割位點(diǎn)、以及抗HBVsAg(雜交瘤2C12)而生成的異源(鼠)mAb革巴結(jié)合結(jié)構(gòu)h戈(TBD)的N末端融合。該示例性的TBD是來(lái)自2C12的IgGlmAb恒定鏈的片段，其中氨基酸序列包括8個(gè)氨基酸的肽連接子、CH1區(qū)的5個(gè)氨基酸、4交鏈序列、Ch2和Ch3區(qū)序列，以及可選地，由來(lái)源于表達(dá)載體的核苷酸編碼的另夕卜10個(gè)氨基酸的C末端肽。本文中限定的示例性TBD片段形成親代分子，用于與來(lái)自HCV病毒的4元原一起生成融合蛋白。D.新型多核苷酸本發(fā)明的另一方面涉及編碼本文所披露的所有嵌合抗原的多核香酸。該多核苷酸包括編碼免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域的第一多核苷酸部分以及編碼耙結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第二多核苷酸部分。該第一和第二多核苷酸部分可以4立于相同或不同的核苷酸《連上。除了上文所描述的本發(fā)明嵌合抗原區(qū)域外，本發(fā)明的多核普酸通常包含前導(dǎo)序列，該前導(dǎo)序列編碼促進(jìn)使嵌合抗原從其生成細(xì)胞(如，酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞)中分泌出來(lái)的前導(dǎo)肽。相關(guān)前導(dǎo)序列通常在從細(xì)胞中分泌前而從該嵌合抗原中切割。前導(dǎo)序列可以是本文所披露的那些序列中的任何一種并且可以是本領(lǐng)域中已知的其他序列，例如具有的氨基酸序列為MPLYKLLNVLWLVAVSNAI(SEQIDNO:37)的AcNPV甲殼酶信號(hào)序列，該氨基酸序列由核苷酸序列TTTCTAACGCGATT(SEQIDNO:38)以及a-交配因子前導(dǎo)序列(leader)編碼，其中該核苷S臾序列可用于昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)；而該oc-交配因子前導(dǎo)序列可用于在酵母細(xì)胞(例如，巴類(lèi)斤德畢赤(朽c/2Z》/flW0"、)酵母纟田月包)中的表達(dá)。本發(fā)明4是供了對(duì)應(yīng)于或互補(bǔ)于編碼嵌合抗原、mRNA的基因、和/或編石馬序列的多核苷酸，4尤選以隔離型(isolatedform),包括編碼嵌合抗原變異蛋白的多核苷酸；DNA、RNA、DNA/RNA雜合體，以及相關(guān)分子、多核苷酸或寡核苷酸(其互補(bǔ)于編碼嵌合抗原或mRNA序列或其部分的基因或與其具有至少90%的同源4生)；以及雜交于編石馬嵌合4元原、mRNA的基因、或雜交于編石馬嵌合4元原的多核普酸的多核苷酸或寡核苷酸。此夕卜，本發(fā)明還包括本文中所披露的可特異性編碼嵌合抗原的基因的類(lèi)似物。類(lèi)似物包括例如突變體，該突變體保留可引起免疫應(yīng)答的能力，且優(yōu)選與任何一種編碼嵌合抗原的多核苷酸具有至少80%、更優(yōu)選90%、并且最優(yōu)選95%的同源性，如由在SEQIDNO:39和41-51中列出的序列所特別描述的。典型地，這樣的類(lèi)似物^又通過(guò)1-10個(gè)密碼子變化而區(qū)分。實(shí)例包括具有來(lái)自病毒抗原或抗體片段的天然氨基酸序列的較小氨基酸變異的多肽；特別地，具有保守性氨基酸置換的多肽。保守性置換是那些發(fā)生在其側(cè)鏈中相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)的置換。可遺傳性編碼的(genetically-encoded)氨基酸通常分為四個(gè)家族(1)酸性=天冬氨酸、谷氨酸；(2)石咸性=賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性=丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；以及(4)不帶電荷的極性=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸、以及酪氨酸有時(shí)共同地分類(lèi)為芳香族氨基酸。例如，預(yù)計(jì)用異亮氨酸或纈氨酸置換亮氨酸、用谷氨酸置換天冬氨酸、用絲氨酸置換蘇氨酸的隔離置換(isolatedreplacement),或用結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸置換氨基酸的相似保守性置換將不會(huì)對(duì)生物活性產(chǎn)生大的影響，是合情合理的。與本文中所扭:露的任一多肽具有基本上相同的氨基g臾序列，但具有基本上并不影響該嵌合抗原引起免疫應(yīng)答能力的較小氨基酸置換(取代)的多肽分子也在嵌合抗原的定義范圍內(nèi)。4汙生物包括具有其他嵌合抗原分子的聚集軛合物以及具有非相關(guān)化學(xué)基團(tuán)(moieties)的共^f介軛合物。通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方式，將官能團(tuán)連接于嵌合抗原氨基酸鏈中或在N或C末端殘基中存在的基團(tuán)來(lái)制備共價(jià)衍生物。表1中給出了氨基酸的縮寫(xiě)。表l:氨基酸縮寫(xiě)丙氨酸AlaA精氨酸ArgR天冬酰胺AsnN天冬氨酸AspD半胱氨酸CysC谷氨酸GluE谷氨酰胺GinQ甘氨酸GlyG組氨酸HisH異亮氨酸lieI亮氨酸LeuL賴(lài)氨酸LysK蛋氨酸MetM苯丙氛酸PheF月甫氨酸ProP絲氨酸SerS蘇氨酸ThrT色氛酸TrpW酪氨酸TyrY纈氨酸ValV可在蛋白內(nèi)進(jìn)4亍保守性氨基酸置換而不改變?cè)摰鞍椎臉?gòu)象或功能。本發(fā)明的蛋白，或可用于本發(fā)明的蛋白，可以包4舌不超過(guò)1546個(gè)(例^r，不超過(guò)14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或l)保守置換。這樣的變化包括用異亮氨酸(1)、纈氨酸(V)和亮氨酸(L)中任何一種置換(代替)這些疏水性氨基酸中其他任何一種；用天冬氨酸(D)置換谷氨酸(E)，并且反之亦然；用谷氨酰胺(Q)置換天冬酰胺(N)，并且反之亦然；以及用絲氨酸(S)置換蘇氨酸(T)，并且反之亦然。根據(jù)特定氨基酸的環(huán)境及其在蛋白三維結(jié)構(gòu)中的作用，其他置換也可以認(rèn)為是保守的。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)經(jīng)?？苫Q，正如可以是丙氨酸(A)和纈氨酸(V)。相對(duì)疏水的蛋氨酸(M)通常可以與亮氨酸和異亮氨酸互換，并且有時(shí)與纈氨酸互換。在某些位置賴(lài)氨酸(K)和^青氨酸(R)經(jīng)?？苫Q，其中在所述位置中氨基酸殘基的顯著特征是其帶電并且這兩個(gè)氨基酸殘基的pK's差別不顯著，在特殊環(huán)境中，還有一些變4b可i人為是"呆守的，，[參見(jiàn)例如，Biochemistry4thEd.,LubertStryered.(W.H.FreemanandCo.),pages18-23;Henikoffetal.(1992)ProcNatlAcadSciUSA89:10915-10919;Leietal.(1995)J.Biol.Chera.270:11882-11885]。其他類(lèi)似多核香酸包括那些在任一TBD和/或任一IRD中具有一個(gè)或多個(gè)(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、或20)插入(添加)或缺失的多核苦酸，其中TBD和/或IRD用來(lái)增加相關(guān)嵌合抗原的可;容性。所述插入或缺失可以為該嵌合抗原中由多核香酸編碼的一個(gè)或多個(gè)(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、或更多)氨基酸(以及多核香酸本身內(nèi)相應(yīng)凄t量的核苷酸)。本發(fā)明還包括與編碼嵌合抗原的多核苷酸選擇性雜交的多核香酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苦酸將在嚴(yán)才各的條件下與SEQIDNO:39和41-51中所列出的序列中的一個(gè)或多個(gè)雜交。雜交反應(yīng)的嚴(yán)格性可由本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員很容易地確定，并且通常是根據(jù)探針長(zhǎng)度、洗滌溫度以及鹽濃度的經(jīng)驗(yàn)計(jì)算。通常，較長(zhǎng)的探針需要較高的適當(dāng)退火溫度，而較短的探針則需要較低的溫度。當(dāng)互補(bǔ)鏈存在于低于其解鏈溫度的環(huán)境中時(shí)，雜交通常取決于變性核酸序列對(duì)重新退火的能力。探針與可雜交序列之間的期望同源性程度越高，則所使用的相對(duì)溫度越高。因此，其遵循如下規(guī)則，即，較高的相對(duì)溫度將傾向于使雜交條件更嚴(yán)格，而較低溫度則使得雜交條件不那么嚴(yán)才各。關(guān)于雜交反應(yīng)嚴(yán)格性的另外的細(xì)節(jié)和解釋?zhuān)瑓⒁?jiàn)例如Ausubeletal"CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyIntersciencePublishers,(1995,4乍為April2004才卜充的，i曾開(kāi)'j66)在2.9.1-2.10.8和4.9.1-4.9.13頁(yè)。如本文中所定義的，"嚴(yán)格性條件"或"高嚴(yán)格性條件，，可以通過(guò)但不限于以下來(lái)鑒別(1)在50。C利用低離子強(qiáng)度和高洗滌溫度，例如0.015M氯化鈉/0.0015M一科蒙酸鈉/0.1%十二烷基石克酸鈉；(2)在雜交過(guò)程中，在42。C下，采用變性劑如曱酰胺，例如50%(v/v)曱酰胺(含0.1%牛血清白蛋白)/0.1。/。菲柯?tīng)?Fico11)/0.10/0聚乙烯吡咯烷酮/50mM、pH6.5的石岸酸鈉緩沖液(含750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉)；或者(3)在42。C下，采用50%曱酰胺、5XSSC(0.75M氯化鈉、0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5XDenhardt溶液、超聲魚(yú)4青DNA(50pg/mL)、0.1%SDS、以及10%石克酸葡聚糖，其中洗滌為在42。C的0.2XSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)和55。C的50%曱酰胺，接著在55。C下高嚴(yán)格性洗液由含EDTA的0.1XSSC組成。"中度嚴(yán)格性條件"是那些由在(但不卩艮于)Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.,NewYork:ColdSpringHarborPress,1989中4苗述的條件，并且包括-使用那些不如上述條件嚴(yán)格的洗滌液和雜交條件(例如，溫度、離子強(qiáng)度和。/。SDS)。中度嚴(yán)格條件的一個(gè)實(shí)例是在37。C下、在包含20%甲酰胺、5XSSC(150mM氯化鈉、15mM一寧檬三鈉)、50mM石岸酸鈉(pH7.6)、5XDenhardt溶液、10%石危酸葡聚4唐以及20mg/mL變性(denaturedsheared)魚(yú)一青DNA的溶液中孵育過(guò)夜，隨后在約37-5(TC下、在IXSSC中洗滌濾膜(過(guò)濾器，filters)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到如何調(diào)節(jié)溫度、離子強(qiáng)度等，如對(duì)適應(yīng)諸如探針長(zhǎng)度等因素所必需的。本發(fā)明的多核苷酸的具體實(shí)施方式包括編碼嵌合抗原的多核苷酸，其中所述嵌合抗原具有選自如在SEQIDNo:40和52-62中所列出的任一序列中的序歹'J,嵌合抗原的核苷酸序列選自如在SEQIDNo:39和41-51中所列出的序列中的任何一個(gè)，^f旦用U核苦酸置換(取^)T核苷酸。例如，嵌合抗原核苷酸的具體實(shí)施方式包括l旦不限于(a)多核香酸，該多核普酸包含選自如在SEQIDNo:39和41-51中所列出的4壬一序列中的序列，其中T還可以為U;(b)多核苦酸，其序列至少80%與選自如在SEQIDNo:39和41-51中所列出的4壬一序列中的序列同源；(c)多核苷酸，其編碼嵌合抗原，該嵌合抗原的序列由包含在本文所披露的任一質(zhì)粒中的DNA編碼；(d)多核苷酸，其編碼嵌合抗原，該嵌合抗原的序列是選自如在SEQIDNo:40和52-62中所列出的4壬一序列中的序列；(e)多核苷酸，其編碼嵌合抗原相關(guān)的蛋白，該蛋白至少90%等同于其序列為選自如在SEQIDNo:40和52-62中所列出的序列中的任何一個(gè)的全長(zhǎng)氨基酸序列；(f)多核苷酸，其完全互補(bǔ)于(a)-(e)中任一個(gè)的多核苷酸；(g)多核苷酸，其在嚴(yán)格的條件下選擇性雜交于(a)-(f)中的多核苷酸；以及(h)多核苦酸，其包含選自如在SEQIDNo:39和41-51中所列出的任一序列的序列，但缺乏除IRD(例如，本文中所列出的HCV蛋白)和TBD之外的全部或部分序列，并且可選地包含例如一個(gè)或多個(gè)可^,替換的連4妄子和/或可^,替」換的分泌(前導(dǎo))肽。此外，可將額外序列(例如，編碼TBD的C末端的氨基酸的載體衍生序列)從本發(fā)明的多核苷酸中缺失掉。這樣的額外序列可以為那些編石馬1-15(例:^2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、或14)個(gè)氨基酸的序列。本發(fā)明還提供了包含嵌合抗原多核苷酸、其類(lèi)似物或同源物的重組DNA或轉(zhuǎn)錄的RNA分子，包括f旦不限于噬菌體、質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、YAC(酵母人工染色體)、BAC(細(xì)菌人工染色體)、以及各種本領(lǐng)域中眾所周知的病毒和非病毒載體，以及用這樣的重組DNA或RNA分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。用于生成這樣的分子的方法是眾所周知的[參見(jiàn)，例如上文Sambrooketal.，1989]。本發(fā)明進(jìn)一步4是供了一種在適合的原核或真核宿主細(xì)胞內(nèi)包括重組DNA分子的宿主-載體系統(tǒng)，該重組DNA分子包含嵌合抗原多核香S交、其類(lèi)似物或同源物。適合的真核宿主細(xì)月包的實(shí)例包括-酵母細(xì)月包、才直物細(xì)月包、或動(dòng)物細(xì)月包如哺乳動(dòng)物細(xì)月包或昆蟲(chóng)細(xì)月包(例如，桿狀病毒可感染的細(xì)胞如Sf9、Sf21、expressSF+、果蠅S2或HighFive細(xì)胞)。適合的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括各種前列腺癌纟田胞系如DU145和TsuPrl、其他可轉(zhuǎn)染或可轉(zhuǎn)導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞系、原代細(xì)胞(PrEC)以及多種常規(guī)用于表達(dá)重組蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)月包(例^口，COS、CHO、293、293T細(xì)月包)。更具體i也i兌，利用本領(lǐng)域中常規(guī)采用且廣為人知的任何數(shù)量的宿主-載體系統(tǒng)，包含嵌合抗原或其片段、類(lèi)似物或同系物的編碼序列的多核苷酸可以用來(lái)生成其嵌合抗原。各種各樣的適合于表達(dá)其嵌合抗原的宿主-載體系統(tǒng)是可獲得的，參見(jiàn)侈寸^口上文Sambrooketal.,1989;上文Ausubel,CurrentProtocolsinMolecularBiology,1995。^尤選的用于昆蟲(chóng)細(xì)月包表達(dá)的載體包括^旦不限于轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pFastBacHTa(Invitrogen)。利用這樣的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒，可在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)生成重組桿狀病毒，并可以4吏用其來(lái)感染幾種包括例如Sf9、Sf21、expressSF+、果蠅S2以及HighFiveTM的昆蟲(chóng)細(xì)胞系，以表達(dá)嵌合抗原。一個(gè)實(shí)例是Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)。可*#換地，優(yōu)選的酵母表達(dá)系統(tǒng)包4舌西良酒酵母、粟酒裂歹直酵母(schizosaccharomycespombe)、巴其斤《老、畢赤酵母(pichiapastoris)、以及^V月畢赤酵母(pichiaaugust)。本發(fā)明的宿主-載體系統(tǒng)可以用于生產(chǎn)嵌合抗原。嵌合抗原或者其類(lèi)似物或同系物還可以通過(guò)用含有適當(dāng)?shù)膯?dòng)子(例如，昆蟲(chóng)細(xì)胞啟動(dòng)子)并編碼嵌合抗原的質(zhì)粒構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)月包(例3口，昆蟲(chóng)細(xì)月包)而生成。例如，編^馬嵌合^元原或者其類(lèi)似物或同系物的重組質(zhì)4立pMIB-V5(Invitrogen)可用于穩(wěn)、定4爭(zhēng)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)月包。在Sf9細(xì)月包中表達(dá)嵌合抗原或相關(guān)蛋白，并利用標(biāo)準(zhǔn)的純化方法分離該嵌合抗原。還可以采用各種本領(lǐng)域中眾所周知的其他表達(dá)系統(tǒng)。編碼在框架內(nèi)連4妄于所述嵌合抗原編碼序列的前導(dǎo)肽的表達(dá)構(gòu)建體可以用于生成分泌形式的嵌合抗原。如本文中討論的，遺傳密碼的冗余度允許嵌合抗原基因序列中的變異。特別地，本領(lǐng)域已知，特異性宿主種屬經(jīng)常具有特異性密主。例如，優(yōu)選的類(lèi)似物密碼子序列通常具有用專(zhuān)交高頻率的密碼子取代的稀有密碼子(即，其在期望宿主的已知序列中的使用頻率低于約20%)。特異種屬的密碼子偏好例如通過(guò)利用互聯(lián)網(wǎng)例如環(huán)球網(wǎng)URLwww.kazusa.or.jp/codon上可獲4尋的密石馬子^f吏用表來(lái)計(jì)算。已知另外的序列修飾可增強(qiáng)細(xì)胞宿主內(nèi)的蛋白表達(dá)。這些修飾包括去除編碼假性多腺苷酸化信號(hào)、外顯子/內(nèi)含子剪接位點(diǎn)信號(hào)、轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)序列，和/或其他這樣的已確定對(duì)基因表達(dá)有害的序列。將序列的GC含量調(diào)整為給定細(xì)胞宿主的平均水平，如通過(guò)參照在宿主細(xì)胞中表達(dá)的已知基因所計(jì)算的。在可能的情況下，修飾序列以避免預(yù)測(cè)的發(fā)夾二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)。其他有用的修飾包括在開(kāi);故閱讀框架起始位置插入翻i奪起始共有序列，如在Kozak[(1989)Mol.CellBiol.9:5073-5080]中所描述的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，真核生物核糖體〗義在5，附近AUG密碼子啟動(dòng)翻i奪的一^:失見(jiàn)則^f又在才及少凄t條件下會(huì)失效[參見(jiàn)，例如Kozak(1995)Proc.Natl.Acad.SciUSA92:2662-2666;Kozak(1987)Nucl.AcidsRes.15:8125-8148]。大腸桿菌(大腸埃希斥干菌，Escherichiacoli)克隆(每一種均用下面列出的質(zhì)^i中的一種壽爭(zhēng)化)于2006年10月11曰在布達(dá)j風(fēng)斯條約下保藏于加拿大國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)(IDAC)，1015ArlingtonStreetWinnipeg,Manitoba,R3E3R2Canada(電話(huà)號(hào)碼(204)789-6030;傳真號(hào)(204)789-2018)。通過(guò)指定的IDAC登錄號(hào)很容易地鑒別每一克隆。質(zhì)粒IDAC登錄號(hào)pFastBacHTa-gp64HCVNS3mutS-TBD'pFastBacHTa-gp64HCV鵬mut-TBDpFastBacHTa-gp64NS3-NS5A-TBDpFastBacHTa-gp64HCV測(cè)5A-TBDpFastBacHTaHCVNS3mut-TBDpFastBacH丁aHCVNS3-NS4B陽(yáng)NS5A-TBDU1,-06川006-05111006-041U006-02111006-03從提交本申請(qǐng)之前，通過(guò)IDAC保藏的樣品取自與由ViRexxMedicalCorporation4呆存的相同的4呆藏物。所述{呆藏物將在IDAC保藏處無(wú)限制的保存30年或最后一次索耳又(要求)后5年或該專(zhuān)利的有效年限，哪個(gè)更長(zhǎng)則將選用哪個(gè)，并且如果在該期限內(nèi)所述保藏物變得無(wú)法存活，則其將被取代。E.本發(fā)明的藥物組合物本發(fā)明的一個(gè)方面涉及包含藥用JU武形劑和嵌合抗原的藥物組合物，該嵌合抗原包括免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和耙結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體片卓史。在治療性應(yīng)用中，可將藥物組合物以一定量給予患者，其中所述量足以引起有效的針對(duì)抗原的B細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和/或輔助T淋巴細(xì)胞(Th)應(yīng)答并預(yù)防感染或者治愈或至少部分i也阻止或減i爰感染的癥;]夫和/或并發(fā)癥。對(duì)該用途有效的用量將才艮據(jù)例如所給予的特定組合物、給藥方式、4寺治療疾病的分期(階4史)和嚴(yán)重性、受治療者的體重和總體Y建康狀態(tài)、以及開(kāi)藥醫(yī)生的判斷。對(duì)于初始治療性免疫(用嵌合抗原)的劑量通常存在于單位劑量范圍中，其中較低值為約l、5、50、500或l，000ng,而較高值為約10,000、20，000、30,000或50,000jig。對(duì)于人類(lèi)的劑量值通常在約500ng至約50,000kg受治療者體重?？筛鶕?jù)受治療者的反應(yīng)和病癥(情況)給予按照幾天至幾個(gè)月的加強(qiáng)方案的約1.0ng至約50,000(ig之間的嵌合抗原的加強(qiáng)劑量。給藥應(yīng)持續(xù)直到至少臨床癥狀或?qū)嶒?yàn)室檢測(cè)表明該病癥已被防止、阻止、減緩或消除并持續(xù)一段時(shí)間。根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法學(xué)來(lái)調(diào)整劑量、給藥途徑，以及纟合藥方案。人嵌合抗原的單位劑型通常包括在藥物組合物中，該藥物組合物包括可接受的載體(在一個(gè)具體實(shí)施方式中為含水載體)的人類(lèi)單位劑量并且以本領(lǐng)i或普通沖支術(shù)人員已知的體積/用量纟會(huì)予以1更用于一夸這類(lèi)多月太纟會(huì)予人類(lèi)(參見(jiàn)仿H口，Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy.20thEdition,A.Gennaro，Editor,LippincottWilliams&Wilkins,Baltimore,Md.，2000)。^口本4貞i或普通才支術(shù)人員所理解的，多種因素可影響特定病例的理想劑量。這4^的因素包4舌例如嵌合抗原的半衰期、嵌合抗原的親合力、組合物的免疫原性、期望的穩(wěn)態(tài)濃度水平、給藥途徑、治療頻率、和與本發(fā)明的治療方法聯(lián)合使用的其他藥劑的影響、以及特定受治療者的健康狀態(tài)。通常，給予受治療者可引起針對(duì)嵌合抗原的免疫應(yīng)答的足夠的嵌合抗原。TBD4吏該嵌合抗原靶向于APC如DC上的特異性受體。該嵌合抗原經(jīng)抗原呈遞途徑被內(nèi)化、力。工以引起體液以及細(xì)胞免疫應(yīng)答兩者。在某些具體實(shí)施方式中，將本發(fā)明的組合物應(yīng)用于嚴(yán)重疾病狀態(tài)，即威脅生命或潛在威脅生命的情形。在這樣的情況中，由于本發(fā)明優(yōu)選的組合物的嵌合抗原的相對(duì)無(wú)毒性質(zhì)，給予比這些所述的劑量超過(guò)很多的嵌合抗原是可能的并且被治療醫(yī)師認(rèn)為是理想的。本發(fā)明的嵌合抗原在藥物制劑中的濃度可很大的變化，即重量從低于約0.1%，通常為或至少約2%至高達(dá)20%至50%或更高，并且將按照所選擇的特定給藥模式主要通過(guò)液體體積、粘度等進(jìn)行選擇。該藥物纟且合物可以通過(guò)本^貞Jt或中已知的4壬4可途徑來(lái)遞送，例^口胃腸外、鞘內(nèi)、血管內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、經(jīng)皮、皮內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、局部、口服、直腸、陰道、肺或腹膜內(nèi)。優(yōu)選地，該組合物通過(guò)胃腸外途徑遞送，例如皮下或皮內(nèi)給藥。該藥物組合物可以通過(guò)將期望的嵌合抗原與適當(dāng)?shù)倪m合于預(yù)期給藥途徑的載體混合來(lái)制備。在制備本發(fā)明的藥物組合物時(shí)，通常將該嵌合抗原與賦形劑混合、用賦形劑稀釋或包裝在載體內(nèi)，該載體可以是膠嚢、嚢劑、紙或其他外殼(容器，container)形式。當(dāng)藥用U武形劑用作稀釋劑時(shí)，其可以為固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)材^",該才才4+用作用于治療劑的f武形物、載體或介質(zhì)。因ot匕，該ia合物可以是片劑、丸劑、粉劑(散劑)、錠劑、嚢劑、扁膠嚢(扁嚢劑)、酏劑、懸浮液、乳劑、溶液、糖漿、氣溶膠(固態(tài)或在液體介質(zhì)中)、軟膏(例如，含按重量計(jì)達(dá)10%的嵌合抗原)、軟和硬明膠膠嚢、栓劑、無(wú)菌可注射溶液、以及無(wú)菌包裝粉末。適合的賦形劑的某些實(shí)例包括但不限于葡萄糖、蔗糖、丙三醇、山梨醇、甘露醇、淀#分、阿^立伯月交、^粦酸鈣、藻(朊)酸鹽、西黃蓍膠、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、無(wú)菌水、糖漿、以及曱基纖維素。所述制劑還可以包括潤(rùn)滑劑如滑石、石更脂酸4美和礦物油；濕潤(rùn)劑；乳化和懸浮劑；防腐劑如羥基苯甲酸曱酯和羥基苯甲酸丙酯；甜味劑；以及調(diào)味劑(增香劑)?？梢酝ㄟ^(guò)采用本領(lǐng)域已知的程序來(lái)配制本發(fā)明的組合物以-使在給予受治療者后提供嵌合抗原的快速、持續(xù)或緩釋。參見(jiàn)，例如上文Remington第903-92頁(yè)和1015-1050頁(yè)。為了制備固態(tài)組合物如片劑，可將嵌合抗原與藥用賦形劑混合，以形成包含本發(fā)明嵌合抗原的同源混合物的固態(tài)預(yù)制劑組合物。當(dāng)將這些預(yù)制組合物稱(chēng)為同源的時(shí)，是指使該嵌合抗原在整個(gè)組合物中均勻分散，以使該組合物可以容易地再分為同等有效的單位劑型如片劑、丸劑和月交嚢?？蓪?duì)本發(fā)明的片劑或丸劑進(jìn)行包衣(涂敷)或以其他方式混合以提供一種能提供延長(zhǎng)作用的優(yōu)勢(shì)的劑型。例如，該片劑或丸劑可以包括內(nèi)部劑量和外部劑量組分，后者為前者上的包膜形式。該兩個(gè)組分可以由腸層分開(kāi)，該腸層用來(lái)抵抗胃內(nèi)分解并允許內(nèi)部組分完整通過(guò)十二指腸或延緩釋》文。各種物質(zhì)可以用于這樣的腸層或涂層，這樣的物質(zhì)包括大量聚合物酸(高分子酸，polymerciacid)以及聚合物酸與這才羊的物質(zhì)諸如蟲(chóng)月交、鯨蠟醇和醋酸纖維素的混合物。其中可結(jié)合本發(fā)明的新型組合物并用于口服或通過(guò)注射的液態(tài)形式包括含水溶液、適合地調(diào)口未的糖漿、含水或油懸浮液以及調(diào)口未乳濁液(具有食用油如玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油、或花生油)、以及酏劑及類(lèi)似藥用載體。在制備用于胃腸外給藥的組合物時(shí)，必須嚴(yán)格注意進(jìn)行緊張性i周整以P!H氐刺;敫。可重纟且寸生纟且合物(reconstitutablecomposition)是以干燥形式包裝的無(wú)菌固體。優(yōu)選可重組性組合物，因?yàn)楫?dāng)其以干燥固體而非即時(shí)給予的溶液儲(chǔ)存時(shí)會(huì)更穩(wěn)定。干燥固體通常包裝于具有丁基橡膠塞的無(wú)菌容器中，以確保該固體以最佳濕度范圍保存?？芍亟M性干燥固體通過(guò)干式充填法、噴霧千燥法、或凍干法形成。這些方法的描述可在例如上文Remington,第681-685頁(yè)和802-803頁(yè)中找到。用于胃腸外注射的組合物通常是稀釋的，且其中以較高比例存在的組分是載體。該載體通常不具有治療活性且是無(wú)毒的，但能以適于吸收的形式將嵌合抗原呈遞給身體組織。當(dāng)嵌合抗原以含水溶液呈遞時(shí)，吸收通常將最迅速且完全地發(fā)生。然而，用水溶性液體對(duì)載體進(jìn)行修飾或者用水不溶性液體對(duì)載體進(jìn)行置換(取代)可以影響吸收速率。優(yōu)選地，用于該組合物的最有價(jià)值的載體是等張鹽水。在制備適合于注射的組合物時(shí)，可以使用含水載體、水溶性載體、以及非水性載體。在本發(fā)明的可注射性《且合物中還可以包4舌其4也物質(zhì)以改善或保障組合物的質(zhì)量。因此，加入的物質(zhì)可以影響溶解性，適于受治療者舒適度、增強(qiáng)化學(xué)穩(wěn)定性或保護(hù)該制備物免于微生物生長(zhǎng)。因此，該組合物可以包括適當(dāng)?shù)脑鋈軇⒆鳛榭寡趸瘎┑奈镔|(zhì)、以及用作防腐劑以防止微生物生長(zhǎng)的物質(zhì)。這些物質(zhì)將以適合于其功能4旦并不不利地影響該組合物的作用的量存在。適當(dāng)?shù)目?鼓生物藥劑的實(shí)例包括硫柳汞、氯化芐乙氧銨、氯化苯曱烴銨、酚、對(duì)羥基苯曱酸曱酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯。適當(dāng)?shù)目寡趸瘎┛梢栽谏衔腞emington,第1015-1017頁(yè)中才戈到。在某些具體實(shí)施方式中，脂質(zhì)體、毫微型膠嚢、微粒、脂質(zhì)顆粒、小嚢泡等用于本發(fā)明的嵌合抗原的給藥。特別地，本發(fā)明的組合物可被配制成用于包封在脂質(zhì)顆粒、脂質(zhì)體、小嚢泡、毫微球或毫微型顆粒等的遞送?？商鎿Q地，本發(fā)明的組合物可共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合于這樣的載體賦形劑的表面。通過(guò)脂質(zhì)體給予的組合物還可以用來(lái)1)^f吏嵌合抗原耙向于特定組織如淋巴組織；2)選擇性靶向于APC;3)攜帶另外的刺激性或調(diào)節(jié)性分子；或4)增加嵌合抗原組合物的半衰期。脂質(zhì)體包括乳液、泡沫、微團(tuán)、不溶性單層、液晶、磷脂分散體、薄片狀層(lamellarlayer)等。在這些制備物中，將待遞送的嵌合抗原單獨(dú)合并為脂質(zhì)體的一部分，或者與結(jié)合于淋巴細(xì)胞中常見(jiàn)受體的分子如結(jié)合于CD45抗原的單克隆抗體或與其他治療性或免疫原性組合物一起合并。因此，用本發(fā)明期望的嵌合抗原填充或裝飾的的脂質(zhì)體可以直接定向于淋巴細(xì)胞的位置，隨后脂質(zhì)體在該位置遞送所述嵌合抗原。根據(jù)本發(fā)明使用的脂質(zhì)體由標(biāo)準(zhǔn)的成泡脂質(zhì)形成，所述脂質(zhì)通常包括中性和帶負(fù)電荷的磷脂和固醇如膽固醇。通常，通過(guò)考慮例如脂質(zhì)體大小、用于期望給藥途徑的脂質(zhì)體如在血流中的酸不穩(wěn)定性和穩(wěn)定性而指導(dǎo)脂質(zhì)的選擇。多種方法可用于制備脂質(zhì)體[^口在侈寸^口Szokaetal.(1980)Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467-508;以及美國(guó)專(zhuān)利第4,235,871號(hào)、第4,501,728號(hào)、第4,837,028號(hào)和第5,019,369號(hào)中所描述的]。包含嵌合抗原的脂質(zhì)體懸浮液可經(jīng)靜脈、附近或局部等途徑以一定劑量給予，所述劑量才艮據(jù)特別是給藥方式、4寺遞送的嵌合抗原、以及4寺治療疾病的階羊殳而變4匕。用于吸入法或吹入法的組合物包括藥用、含水或有機(jī)溶劑中的溶液和懸浮液，或其混合物以及粉末。該液態(tài)或固態(tài)組合物可以包含如本文所描述的適合的藥用賦形劑。該組合物可以通過(guò)口服或鼻呼吸途徑纟會(huì)予，以用于局部或全身步文應(yīng)。藥用;容劑中的組合物可以通過(guò)〗吏用惰性氣體來(lái)霧化。噴化溶液可以直4妄乂人噴化裝置吸入或者該霧化裝置可以連接到面罩支管上或間歇正壓呼吸才幾上。溶液、懸浮液或并分末組合物可以?xún)?yōu)選口服或經(jīng)鼻從以適合方式遞送制劑的裝置來(lái)給予。本發(fā)明的方法中所采用的另一種制劑采用經(jīng)皮遞送裝置("貼片，，)。這樣的經(jīng)皮貼片可以用來(lái)以可控量4是供連續(xù)或間斷輸注本發(fā)明的嵌合抗原。用于遞送藥物試劑的經(jīng)皮貼片的構(gòu)建和用途在本領(lǐng)域是眾所周知的。參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利第5,023,252號(hào)，將其結(jié)合于此作為參考。這樣的貼片可構(gòu)建用于連續(xù)、力永沖或按要求遞送藥并勿i式劑。此外，除了嵌合4元原和藥用I武形劑外，包4舌至少一種4元病毒性治療劑或化療劑可能是有利的。這些藥劑包括但不限于干擾素-Ct2a/b以及纟元病毒劑如利巴韋4木。在某些具體實(shí)施方式中，可能期望在本發(fā)明的藥物組合物中包括至少一種初始化B淋巴細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞的組分。脂質(zhì)已鑒定為能在體內(nèi)初始化CTL的藥劑。例如，可將棕櫚酸殘基連接于賴(lài)氨酸殘基的s-和a-氨基，然后例如通過(guò)一種或多種連4妻殘基如Gly、Gly-Gly-、Ser、Ser-Ser等連4妄于免疫原肽。隨后可以^]夸該脂質(zhì)月太以微團(tuán)或顆粒直接給予、合并入脂質(zhì)體或在佐劑如不完全福氏(Freund)佐劑中乳化。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，一種特別有效的免疫原性組合物包括連接于賴(lài)氨酸的s-和ot-氨基的棕櫚酸，其通過(guò)4建例如Ser-Ser連4妄于所述免疫原肽的氨基末端。作為初始化CTL應(yīng)答的脂質(zhì)的另一個(gè)實(shí)例，當(dāng)共價(jià)連4妻于適合的肽時(shí)，Eco//脂蛋白如三棕櫚酰-S-甘油基半胱氨酰絲氨酰-絲氨酸(P3CSS)可以用來(lái)初始化病毒特異性CTL[參見(jiàn)，例如Deresetal.(1989)A^w"342:561]。例如，本發(fā)明的嵌合抗原可偶聯(lián)于P3CSS,雖然本發(fā)明的組合物并不必須使用佐劑，但可以使用佐劑。根據(jù)宿主種屬，可使用不同佐劑來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答，并且包括但不限于福氏佐劑(完全和不完全)、礦物凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、去垢劑、復(fù)合多元醇、聚陰離子、肽、油乳膠、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基酚、免疫刺激性多核苷酸序列，以及可能有用的人類(lèi)佐劑如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌。另外的佐劑在本領(lǐng)域中也是眾所周知的。F.利用嵌合抗原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的另一方面提供了增強(qiáng)通過(guò)APC的抗原呈遞，所述方法包括將包含免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原給予該APC，其中，所述靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體片段(例如，異源抗體片段)。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，該APC是樹(shù)突細(xì)胞。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及活化APC的方法，包括使該APC與包含免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原^妄觸，其中，所述耙結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體片段(例如，異源抗體片段)。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，所述APC在體內(nèi)與該嵌合抗原4妄觸。在另一個(gè)伊C選的具體實(shí)施方式中，所述^妄觸在人體內(nèi)進(jìn)4亍。本發(fā)明的又一方面4是供了引起免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括:將包含免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原給予動(dòng)物，其中，所述輩巴結(jié)合結(jié)構(gòu)i或包括抗體片段(例如，異源抗體片^:)。該免疫應(yīng)答可以為體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，所述細(xì)胞免疫應(yīng)答是Thl、Th2、和/或CTL應(yīng)答。本發(fā)明的另一方面提供了治療免疫-可治療性病癥的方法，包括將包含免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原給予需要該抗原的動(dòng)物，其中，所述把結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括異源抗體片,殳。優(yōu)選地，該免疫-可治療的病癥是慢性丙型肝炎病毒感染。對(duì)于HCV的治療，優(yōu)選地所述免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域包括一種蛋白，所述蛋白選自由HCV核心(1-191)蛋白、HCV核心(1-177)蛋白、HCVEl蛋白、HCVE2蛋白、HCVE1隱E2蛋白、HCVNS2蛋白、HCVNS3蛋白、HCVNS4A蛋白、HCVNS4B蛋白、HCVNS5A蛋白、HCVNS5B蛋白、HCVp7蛋白、以及其組合組成的組。本發(fā)明的另一方面提供了接種動(dòng)物抵抗病毒感染的方法，包括將包含免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原給予動(dòng)物，其中，所述靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體片段。本發(fā)明的方法可預(yù)防性地或治療'J"生地4妾種i亥動(dòng)4勿以4氐4元病毒感染。的方法。本發(fā)明還包括使用本發(fā)明的組合物來(lái)活化T細(xì)胞的方法。本發(fā)明還包括將抗原遞送至免疫系統(tǒng)細(xì)胞如APC的方法。本發(fā)明或方法，所述方法包括給予本發(fā)明的一種或多種嵌合抗原?？寺〔⒈磉_(dá)后，對(duì)嵌合抗原在產(chǎn)生免疫應(yīng)答中的效力進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)涉及將嵌合抗原離體或在體內(nèi)呈遞給DC。該DC評(píng)價(jià)結(jié)合并內(nèi)化該嵌合抗原。將用嵌合抗原負(fù)載的幼稚DC呈遞給T淋巴細(xì)胞并評(píng)價(jià)干擾素-Y(作為T(mén)細(xì)胞應(yīng)答的標(biāo)記物)的產(chǎn)生。具體地，在離體情形下，單核細(xì)胞從外周血中分離并分化為DC。DC將抗原結(jié)合、內(nèi)化、加工并呈遞至幼稚自體T淋巴細(xì)胞。識(shí)別由DC呈遞的力口工過(guò)的4元原的T細(xì)月包4皮活4匕為步文應(yīng)細(xì)月包例如壽甫助T細(xì)月包或細(xì)月包毒性T淋巴細(xì)胞。隨后，通過(guò)樹(shù)突細(xì)胞的T細(xì)胞活化通過(guò)已知步驟測(cè)定標(biāo)記物如干4尤素-y水平來(lái)評(píng)^介[例如Berlyn，etal.(2001)Clin.Immunol.101(3):276-283]。相乂于于背景，產(chǎn)生千4尤素-y的T細(xì)胞百分比增加至少50%,則預(yù)測(cè)體內(nèi)效力。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，所述百分比增加為至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%或100%。在體內(nèi)情形的情況下，將嵌合抗原經(jīng)胃腸外直接導(dǎo)入宿主體內(nèi)，其中可獲得的4對(duì)突和其他抗原呈遞細(xì)胞具有與所有抗原相互作用并從而處3里該-坑原的能力。G.耳關(guān)合治療本發(fā)明的另一方面提供了用于治療病毒感染的組合物，其包含嵌合抗原和抗病毒劑。本發(fā)明還纟是供了治療病毒感染的方法，包括同時(shí)或依次鄉(xiāng)會(huì)予嵌合抗原和抗病毒劑。在治療患有慢性丙型肝炎的受治療者的過(guò)程中，可表明將嵌合抗原與抗病毒劑如核苷類(lèi)似物耳關(guān)合應(yīng)用，在誘導(dǎo)持續(xù)應(yīng)答方面高度有效。這兩種藥劑聯(lián)合應(yīng)用的作用機(jī)制在治療丙型肝炎受治療者中可以產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。例如，HCV抗病毒劑如利巴韋林與本文中所描答，從而清除慢性感染受治療者體內(nèi)的HCV感染。H.制備嵌合抗原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于生產(chǎn)嵌合抗原的方法，包括(a)才是供孩吏生物或細(xì)胞系(或細(xì)力包)，優(yōu)選地真核，更優(yōu)選地非哺乳動(dòng)物樣i生物或細(xì)胞系(或細(xì)月包)，其包含編碼嵌合抗原的多核苷酸；以及(b)在表達(dá)所述嵌合抗原的條件下，培養(yǎng)所述微生物或細(xì)胞系(或細(xì)胞)。優(yōu)選地，所述樣史生物或細(xì)胞系(或細(xì)胞)是酵母、植物細(xì)胞系(或細(xì)胞)或昆蟲(chóng)細(xì)胞系(或細(xì)胞)。更優(yōu)選地，所述細(xì)胞系(或細(xì)胞)是選自由Sf9、Sf21、expressSF+、果錄S2、以及HighFive細(xì)胞系(或細(xì)胞)組成的組的昆蟲(chóng)細(xì)胞系(或纟田胞)。本發(fā)明利用已建立的重組DNA沖支術(shù)，以生產(chǎn)給定抗原與TBD的融合蛋白，所述TBD對(duì)于實(shí)施本發(fā)明是必需的。融合蛋白構(gòu)建體在結(jié)合特異性限制性酶切位點(diǎn)的DNA水平產(chǎn)生，所述酶切J立點(diǎn)在將期望的DNA片段結(jié)合到表達(dá)載體的過(guò)程中采用，并用來(lái)在異源表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)期望的融合蛋白。如在本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"載體"表示能夠攜帶編碼期望蛋白的DNA的質(zhì)粒。本發(fā)明中所使用的質(zhì)粒載體包括^旦不限于pFastBacHTa以及在DHlOBac五.co/《Invitrogen)中產(chǎn)生的相應(yīng)重組"4干粒"(細(xì)菌人工染色體)?？梢詣?dòng)員(mobilize)期望蛋白的ORF,并產(chǎn)生用于在本發(fā)明中采用的除8&010-830@桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)之外的其他系統(tǒng)(細(xì)菌或哺乳動(dòng)物)中表達(dá)該蛋白的其他重組質(zhì)粒。術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"用來(lái)表示將DNA序列轉(zhuǎn)錄成mRNA，并將該mRNA轉(zhuǎn)錄體翻譯成融合蛋白。這可通過(guò)將感興趣基因轉(zhuǎn)座入桿粒中，轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中且產(chǎn)生重組桿狀病毒而實(shí)現(xiàn)。這些重組桿狀病毒可用來(lái)感染Sf9或HighFive昆蟲(chóng)細(xì)胞，其產(chǎn)生感興趣的蛋白。所產(chǎn)生的重組蛋白可以具有N末端6xHis標(biāo)簽，其可用于通過(guò)采用Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen，Hilden,Germany)純4b蛋白的過(guò)禾呈中。戶(hù)斤述蛋白還可以具有N末端rTEV蛋白酶或其他已克隆入的切割位點(diǎn)。將Ni純化的蛋白用例3口rTEV蛋白酶(Invitrogen)進(jìn)4亍消4匕，該蛋白也具有N末端6xHis標(biāo)簽。蛋白酶消化后，將混合物加載到Ni-NTA瓊脂糖柱上，并可以將純蛋白洗出，同時(shí)6xHis標(biāo)記的片^a將結(jié)合于該柱上。這種純化方法是標(biāo)準(zhǔn)步驟，并且本領(lǐng)i或的普通纟支術(shù)人員能夠理解該方法而無(wú)需進(jìn)一步解釋。DNA序列的克隆和表達(dá)可以通過(guò)兩種途徑實(shí)現(xiàn)，該DNA序列編碼病毒抗原和鼠單克隆抗體的Fc片,爻以生成嵌合抗原。第一種途徑涉及將所述兩種蛋白克隆為融合蛋白，而第二種途徑涉及將特異性"生物連接子"如生物素或抗生蛋白鏈菌素整合入兩種分子之一中、將其單獨(dú)純化并生成嵌合抗原。在示例性的具體實(shí)施方式中，雜交瘤2C12(其產(chǎn)生抗乙肝病毒表面抗原的單克隆抗體)用作鼠免疫5求蛋白G的總RNA的來(lái)源。分離總RNA并用來(lái)克隆鼠Fc片段。具體地，利用Trizo產(chǎn)試劑(Invitrogen/GibcoBRL,產(chǎn)品目錄號(hào)10551-018，10298-016;酚和異石危氰酸胍的單相溶液，如在美國(guó)專(zhuān)利第5,346,994中所描述的)從表達(dá)鼠IgG的雜交瘤中分離所述總RNA。通過(guò)親和層析在寡dT柱(Invitrogen/GibcoBRL，產(chǎn)品目錄號(hào)15939-010)上4尋mRNA乂人總RNA中純化出來(lái)。利用逆轉(zhuǎn)錄酶在聚合酶鏈反應(yīng)中生成互補(bǔ)DNA(cDNA)。-i殳計(jì)寡核苷酸引物以添加獨(dú)特的限制性酶識(shí)別^f立點(diǎn)，以利于克隆。該cDNA利用6&(^0-:6&0@桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen/GibcoBRL,產(chǎn)品目錄號(hào)15939-010)克隆。優(yōu)先使用桿狀病毒系統(tǒng)，這是因?yàn)椴粌H其生成大量異源性蛋白，而且在受感染昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了蛋白的翻i奪后修飾如石壽酸化和糖基化。在該表達(dá)系統(tǒng)中，可以將所述DNA克隆入稱(chēng)為pFastBacTM(Invitrogen/GibcoBRL,產(chǎn)品目錄號(hào)15939-010)的載體中。在Bac-to-Bac⑧系統(tǒng)中，重組物的生成基于通過(guò)細(xì)菌轉(zhuǎn)座子Tn7的位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座。將感興趣基因克隆入pFastBac⑧中，其在克隆位點(diǎn)側(cè)翼具有樣吏型Tn7元件。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌4朱DHlOBac(Invitrogen/GibcoBRL，產(chǎn)品目錄號(hào)10361-012)中，其具有桿狀病毒穿梭質(zhì)粒(桿粒)，該質(zhì)粒在LacZ基因內(nèi)含有Tn7附著位點(diǎn)。轉(zhuǎn)座破壞LacZ基因，使得僅重組體產(chǎn)生白色克隆并易于選擇。在Eco//中使用轉(zhuǎn)座的優(yōu)勢(shì)在于單個(gè)克隆僅包含重組體，以致無(wú)需空斑純化和篩選。將重組桿粒轉(zhuǎn)染入昆蟲(chóng)細(xì)胞中以產(chǎn)生表達(dá)重組蛋白的桿狀病毒。所述Bac-to-Bac⑧神干狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可/人Invitrogen商業(yè)上購(gòu)得，并且所采用的方案(程序)如在司協(xié)議(如www.Invitrogen.com)中所描述的。^!夸感興趣的基因克隆入例^口pFastBacHTa供體質(zhì)粒中，而重組蛋白的生產(chǎn)基于Bac-to-BacTM桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)。在接著的步驟中，為了將所克隆的基因轉(zhuǎn)移入桿狀病毒穿梭載體(桿粒)中，將包含感興趣基因的pFastBacHTa供體質(zhì)粒用于位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座中。這是在五.co//菌株DH10BacTM中完成的。將具有感興趣基因的重組pFastBacHTa質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DHlOBac細(xì)胞中用于轉(zhuǎn)座，以生成重組4干粒。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方案(Sambrook,上文)來(lái)分離重組桿4立；所述DNA樣品用于轉(zhuǎn)染。為了生產(chǎn)桿狀病毒，將該桿粒轉(zhuǎn)染入Sf9昆蟲(chóng)細(xì)月包中。轉(zhuǎn)染后，將該細(xì)胞在適當(dāng)條件下孵育，收集并儲(chǔ)存包含桿狀病毒的培養(yǎng)基。一旦已經(jīng)確認(rèn)了桿狀病毒的生成和蛋白的表達(dá)，則擴(kuò)增病毒原種(virusstock)，以生產(chǎn)攜帶感興趣基因的濃縮桿狀病毒原種。將桿狀病毒擴(kuò)增至少兩次是本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)操作，并且在本文所描述的所有方案中均遵循該標(biāo)準(zhǔn)操作。在第二輪擴(kuò)增后，可才艮據(jù)由制造商描述的試劑盒(Invitrogen)方案，利用空斑測(cè)定(嗟菌斑測(cè)定)來(lái)定量所生成的桿狀病毒的濃度。還建立了感染昆蟲(chóng)細(xì)月包的最適合的病毒濃度以及用于生成期望蛋白的最佳時(shí)間點(diǎn)。編碼感興趣蛋白的DNA可利用寡核苷酸引物通過(guò)PCR而生成，所述引物含有來(lái)自質(zhì)粒的獨(dú)特限制性酶切^/立點(diǎn)，而該質(zhì)粒含有一個(gè)拷貝的全病毒基因組并與FcDNA—起克隆為融合蛋白。該嵌合蛋白通過(guò)Ni-NTA、凝集素、蛋白A或蛋白G親和層析或本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員已知的其他標(biāo)準(zhǔn)純化方法而純化。用于連接IRD和TBD的第二種途徑涉及將特異性"生物連接子"如生物素或抗生物素蛋白(例如抗生蛋白鏈菌素)整合入兩種分子之一中、將其單獨(dú)純化并生成所述嵌合抗原。將感興趣的病毒抗原克隆入質(zhì)粒中，該質(zhì)粒通過(guò)噬菌體T7啟動(dòng)子控制蛋白表達(dá)。隨后將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Kco/,'菌沖朱如BL21(DE3)CodonPlusRIL細(xì)月包(Stratagene,產(chǎn)品目錄號(hào)230245)中，該細(xì)月包中T7RNA聚合酶的產(chǎn)生通過(guò)lac抑制子調(diào)節(jié)。T7RNA聚合酶對(duì)T7啟動(dòng)子高度特異，并且比宿主的RNA聚合酶顯著快得多(快約8倍)。當(dāng)T7RNA聚合酶的生成由異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)時(shí)，T7RNA聚合酶的特異性和持續(xù)合成能力(processivity)引起在T7啟動(dòng)子控制下的高水平基因轉(zhuǎn)錄。為了將兩種蛋白偶聯(lián)在一起，利用生物素與抗生物素蛋白(例如抗生蛋白鏈菌素)之間的緊密結(jié)合。在五.co"中，BirA酶將特異性識(shí)別序列內(nèi)的生物素共價(jià)4建催化為確定的賴(lài)氨酸殘基。如上所述，將鼠Fc片革殳在4干狀病毒系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)為具有抗生物素蛋白的融合蛋白。通過(guò)生物素-抗生蛋白鏈菌素結(jié)合，可以混合這兩種蛋白以形成二聚蛋白復(fù)合物。除非另有指明，本發(fā)明的實(shí)施采用分子生物學(xué)、孩i生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)4支術(shù)，其為本領(lǐng)域才支術(shù)人員所掌握。這才羊的:J支術(shù)在文獻(xiàn)中有充分解釋。參見(jiàn)，例如上文Sambrook;及上文Ausubcl。I.制品和試劑盒本發(fā)明的另一方面提供了一款產(chǎn)品，其包括容納包含嵌合抗原的組合物的容器，所述組合物適合于注射或適合于重建用于注射；與印刷的標(biāo)簽i兌明書(shū)結(jié)合，4是供如<可在胃腸外，例如皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)、經(jīng)鼻或血管內(nèi)全會(huì)予該組合物的"i侖述。該《且合物可以包含在^壬何適合的容器中，該容器不會(huì)與所述組合物發(fā)生顯著的相互作用，并且可以標(biāo)記有適當(dāng)?shù)臉?biāo)記表明其適于胃腸外4吏用。所述標(biāo)記i兌明書(shū)可與容器結(jié)合在一起，且該i兌明書(shū)與上文所述的治療方法一致。容納本發(fā)明組合物的容器可以是具有適合于注射的液態(tài)組合物的容器。該容器可以被改造適于注射器針頭進(jìn)入。該款產(chǎn)品可以包括用于注射的適當(dāng)?shù)尼橆^和注射器，使得受治療者、醫(yī)生、護(hù)士或其他執(zhí)業(yè)者均可給予所述嵌合抗原?？商鎿Q地，組合物可以為包含可溶性形式的嵌合抗原的干燥或濃縮組合物，可與含水或不含水載體結(jié)合或用其稀釋?zhuān)匀芙饣驊腋≡摻M合物?？梢?#:地，所述容器可以含有以液體的懸浮液，或可以為與載體結(jié)合的不溶性形式的鹽，其中所述不溶性形式將被懸浮。適當(dāng)?shù)娜萜髟谏衔腞emington第788-789、805、850-851和1005-1014頁(yè)中力口以i寸i侖。本發(fā)明的試劑盒通常將包括上文所述的容器以及一種或多種其他容器，所述一種或多種其他容器容納有乂人商業(yè)和4吏用者立場(chǎng)所需的物質(zhì)，所述材料包括緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、以及帶有使用i兌明書(shū)的藥品說(shuō)明書(shū)。該容器上可存在標(biāo)簽，以指示所述組合物用于特殊療法或非治療性應(yīng)用，并且還可以指示用于體內(nèi)或離體應(yīng)用的說(shuō)明，如上文所述的那些。說(shuō)明和/或其他信息還可以包括在試劑盒內(nèi)的說(shuō)明書(shū)上。V.實(shí)施例下面的非限制性實(shí)施例提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1.桐4+禾口方法材料用于在這些實(shí)施例中描述的Chimigen3分子中的TBD(并且，為了方便，在這些實(shí)施例中稱(chēng)為"TBD")來(lái)自雜交瘤2C12,其產(chǎn)出鼠HBsAg特異性mAb，并且其來(lái)自Tyrrell實(shí)-驗(yàn)室，通過(guò)Aberta大學(xué)，Edmonton,Alberta,Canada殺匕準(zhǔn)。包含編石馬HCV抗原的DNA的質(zhì)粒pCV-H77C從Alberta大學(xué)的Tyrrell實(shí)-險(xiǎn)室獲得。pFastBacHTa克隆載體、昆蟲(chóng)細(xì)胞系Sf9、Cellfectin⑧試劑、磷酸緩沖鹽(PBS)、鉑P&DNA聚合酶、TRizol試劑、SuperscriptFirst-StrandSynthesis逆轉(zhuǎn)錄酶、X-gal、異丙基-(3-D-石克代半乳吡喃外唐香(thiogalactopyranoside)(IPTG)和胎牛血清(FBS)乂人Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)購(gòu)買(mǎi)。昆蟲(chóng)細(xì)胞生長(zhǎng)和表達(dá)培養(yǎng)基ESF921A人表達(dá)系統(tǒng)(ExpressionSystems)(Woodland,CA，USA)購(gòu)買(mǎi)。限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI、SpeI、HindIII、RsrII、AvaII和Notl乂人新英才各蘭Biolabs(Ipswich,MA,USA)購(gòu)買(mǎi)。病毒原種利用ExpressionSystems桿狀病毒滴定分沖斤來(lái)進(jìn)4亍;農(nóng)度測(cè)定。將IgG2A-PE(BDBiosciences,SanDiego,USA)l:lO稀釋并用作同種型對(duì)照。桿狀病毒滴度利用FACS采集和分析而確定。BectonDickinsonBiosciencesFACSCalibur3(四色、只又;敫光)采集纟田月包，并采用CELLQuestPro3壽欠^f牛(BDBiosciences)分才斤凄t據(jù)。由ExpressionSystems提供微軟Excel電子表格，以輸入數(shù)據(jù)并才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)確定病毒滴度。純4t利用Ni-NTASuperflow3(Qiagen,Hilden,Germany)和ToyopearlSuper650C(TosohBiosciences,GroveCity,OH,USA)來(lái)實(shí)施。用于制備十二烷基好u酸鈉聚丙晞酰胺凝月交電泳(SDSPAGE)的30。/o丙烯酰胺;容液乂人Bio-Rad(Hercules,CA，USA)購(gòu)買(mǎi)。頁(yè)藍(lán)3染料、5x加樣緩沖液、頁(yè)藍(lán)3預(yù)染的蛋白梯和20X還原劑乂人Fermentas(Burlington,ON,Canada)購(gòu)買(mǎi)。Hybond3ECL硝'基纖維素和ECLWestern檢測(cè)試劑盒(GEHealthcare)用于蛋白質(zhì)印跡。吐溫20、溴化十六烷基三曱基4妄(CTAB)、抗小鼠IgG(Fc特異)辣才艮過(guò)氧化物酶軛合的抗體、抗小鼠(Fab特異)辣才艮過(guò)氧化物酶軛合的第二抗體、羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶軛合的第二抗體以及抗生素卡那霉素、氨千西林和慶大霉素從Sigma(St丄ouis，MO，USA)購(gòu)買(mǎi)。兔抗NS5A、羊抗NS3和羊抗NS4多克隆^t體以及鼠抗NS5A單克隆抗體乂人Abeam(Cambridge,MA,USA)獲4尋。6xHis-束才艮過(guò)氧化物酶軛合的單克隆抗體從Clontech(PaloAlto,CA,USA)購(gòu)買(mǎi)。Slide-a畫(huà)lyzer3盒式錄4象帶(cassette)和MicroBCA3分^N式劑盒乂人Pierce(Rockford,IL,USA)購(gòu)買(mǎi)。Pro-QEmerald300并唐蛋白;疑月交和BlotStaini式劑盒乂人MolecularProbes(Carlsbad,CA,USA)購(gòu)買(mǎi)。來(lái)自健康供者的白細(xì)胞分離法樣品從SeraCareLifeSciences(Oceanside,CA,USA)購(gòu)買(mǎi)。用于T細(xì)月包陰性分離的DynalDynabeads3乂人Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)購(gòu)買(mǎi)。含L-谷氨酰胺、石克酸鏈霉素(50)Lig/mL)和碌u酸慶大霉素(10jig/mL)的AIMV⑧i咅養(yǎng)基/人Invitrogen獲4尋。匹酉己的供者血清乂人Ficoll-Hypaque血液制備物離心后的血清餾分獲得。將血清(濃度為50%/AIMV⑧培養(yǎng)基)熱滅活、等分并儲(chǔ)存于-20。C。Dulbecco磷酸緩沖鹽(PBS)從Invitrogen獲得。具有下列特異性的軛合單克隆抗體(mAbs)從BDBiosciences(SanDiego,CA)獲得CD64-異碌u氰酸焚光素(FITC)、CD32-R-藻紅蛋白(PE)、CD16-PE、CD206國(guó)PE-Cy5、CD80-PE、CD86-FITC、CD83-PE、CD40-FITC、CDllc-PE、CD14-FITC、CD19-F1TC、CD3-FITC、CD3-PE、CD3-別藻藍(lán)蛋白(APC)、CD8-PE腸Cy5、CD4-APC、CD69-FITC、CD69-APC、HLA畫(huà)ABC-FITC、HLA-DR-PE、IFN-y-PE、TNF-a-PE、grB-FITC、pfn-FITC和小鼠IgGl隱生物素。生物素化抗6xHis從Qiagen(Mississauga，Ontario,Canada)獲得。羊抗兔IgG畫(huà)生物素抗體來(lái)自JacksonImmunoResearchLaboratories(WestGrove,PA)。鼠同種型mAbs和SA-PE-Cy5乂人BDBiosciences獲得?；旌系耐之悩?gòu)體5-(和6-)二醋酸羧基焚光素、琥詢(xún)酰亞胺酯(succinimidylester)(5(6)-CFDA，SE;CFDA)從Invitrogen獲得。通過(guò)使用特異性PE軛合的四聚體(BeckmanCoulter,Mississauga,Ontario,Canada)或五聚體(Prolmmune,Springfield,VA)測(cè)定T細(xì)胞對(duì)抗原的特異性。所使用的五聚體包括HCVNS5A肽VLSDFKTWL(SEQIDNO:3)/HLA畫(huà)A2和HCVNS3肽CINGVCWTV(SEQIDNO:4)/HLA_A2。所4吏用的四聚體包4舌EBV肽GLCTLVAML(SEQIDNO:5)/HLA-A2、HCVNS3肽KLVALGINAV(SEQIDNO:6)/HLA-A2和陰性對(duì)照四聚體(多等位基因的)。下列細(xì)月包因子乂人R&DSystems(Minneapolis,MN):白介素-ip(IL-ip)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子I(TNF-ot)、干擾素-K(IFN-y)和干擾素-i(IFN-ot)購(gòu)買(mǎi)。才艮據(jù)制造商的說(shuō)明重建細(xì)胞因子、等分并儲(chǔ)存于-70。C。聚IC從Sigma荻得。WaveBioreactorSystem23/10EH和Cellbag10L/O乂人WaveBiotech(Somerset,NJ"USA)購(gòu)買(mǎi)。方法表達(dá)質(zhì)4立構(gòu)建。FastBacHTa-TBD,親代質(zhì)粒構(gòu)建體編碼CHl-鉸鏈-CH2-CH3區(qū)氨基酸的小鼠IgGlDNA序列由從雜交瘤2C12分離的mRNA生成，所述雜交瘤2C12產(chǎn)生抗HBV表面抗原(sAg)的mAb?？俶脂A利用TRizol試劑分離，而TBD的cDNA通過(guò)利用SuperscriptFirst-StrandSynthesis的RT-PCR而生成。PCR引物包含連4妄子序列，該連4妄子序列編碼5'末端的連4妻肽-SRPQGGGS-(SEQIDNO:l)、5'末端獨(dú)特的NotI位點(diǎn)和3，末端獨(dú)特的HindIII限制性位點(diǎn)。得到的cDNA包含(5'-Notl)-連接子序列-部分CH1(VDKKI;SEQIDNO:2)-CH2-CH3(3，HindIII)。用各個(gè)酶消化后，利用相同的限制性酶切位點(diǎn)將片段與pFastBac-HTa表達(dá)載體質(zhì)粒相連接。用于PCR擴(kuò)增的5'引物是(正義)5，-TGTATTGTGCCAGG-3，(SEQIDNO:7)，并且3，引物是(反義)5'IDNO:8)，其分別含有NotI和HindIII位點(diǎn)。將擴(kuò)增的DNA用Notl和HindIII消化，所述片段通過(guò)瓊脂糖凝膠純化并與用相同限制性酶消化的pFastBac-HTa表達(dá)載體質(zhì)粒相連接，以生產(chǎn)表達(dá)載體質(zhì)粒pFastBacHTa-TBD。該產(chǎn)物用于表達(dá)所述融合蛋白6xHis標(biāo)簽-rTEV蛋白酶切割位點(diǎn)-TBD。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序法來(lái)驗(yàn)證DNA序列及開(kāi)》丈閱讀沖匡架(ORF)的準(zhǔn)確性。pFastBacHTa-TBD中ORF的核苷酸序列(SEQIDNO:9)及由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:10)在圖2中示出。pFastBacHTa-gp64的構(gòu)建為了分泌、，4夸來(lái)自苜藉^艮纟丈夜蟲(chóng)我(ca/z/orw'ca)才玄型多角體病毒(AcNPV)gp64蛋白的信號(hào)序列克隆入pFastBac-HTa中。合成兩種寡核苷酸并將其復(fù)性(對(duì)合，anneal)在一起。所述寡核香酸序列是5，-GCATGGTCCATGGTAAGCGCTATTGTTTTATGCAGGTACGGTCCGATGC-3'(SEQIDNO:11)和5'-GGACCATGC-3，(SEQIDNO:12)。所述寡核苷酸包含5，Avail位點(diǎn)和3，RsrlI位點(diǎn)。在用Avail和RsrII消化以后，將該片卓殳克隆入Rsrll消4匕的pFastBac-HTa中，該消4匕的pFas氾ac-HTa將所述gp64信號(hào)序列置于6xHis標(biāo)簽的緊鄰上游，以生成pFastBacHTa-gp64。pFastBacHTaHCVNS5AChimigen疫苗融合蛋白表達(dá)載體質(zhì)jf立的構(gòu)建利用PCR法從質(zhì)粒pCV-H77C模板得到編碼HCVNS5A片段的DNA。用于PCR的5，引物是含有限制性酶EcoRI位點(diǎn)的(正義)5,一CCGGAATTCTCCGGTTCCTGGCTAAGG-3'(SEQIDNO:13)。用于3，末端的PCR引物是含有限制性酶SpeI位點(diǎn)的(反義)5，_GGACTAGTCCGCACACGACATCTTCCGT-3，(SEQIDNO:M)。擴(kuò)增的DNA用各個(gè)酶消4b并連4妾于pFastBacHTa-TBD,以生成表達(dá)質(zhì)粒pFastBacHTaHCVNS5AChimigenTM疫苗(或pFastBacHTa畫(huà)NS5A畫(huà)TBD)。核苷酸序列(SEQIDNO:39)和由pFastBacHTa-NS5A-TBD中ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:40)在圖3中示出。對(duì)于僅NS5A，將該NS5A片段連接入EcoRI/SpeI消化的pFastBac-HTa，以生成pFastBacHTa-NS5A。用于分泌的pFastBacHTa-g。64NS5AChimigenTM疫苗表達(dá)質(zhì)4立的構(gòu)建為了將NS5AChimigen疫苗克隆入pFastBacHTa-gp64中，用RsrII和HindIII消化質(zhì)粒pFastBacHTaHCVNS5AChimigen疫苗(如上所述)，并且所述NS5AChimigenTM疫苗片段通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳純化。將NS5AChimigen疫苗片段連接于RsrII和Hindffl消化的pFastBacHTa-gp64質(zhì)粒，以得到pFastBacHTa-gp64HCVNS5AChimigenTM疫苗(pFastBacHTa-gp64-NS5A-TBD)表達(dá)質(zhì)粒(IDAC登錄號(hào)111006-04)。pFastBacHTa-gp64-NS5A-TBD中ORF的核苷酸序列(SEQidNO:41)和由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:52)在圖4中示出。用于分泌的pPSC12-NS5A-TBDChimigenTM疫苗表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)為了促進(jìn)NS5AChimigenTM疫苗分子的分泌，將其克隆入質(zhì)粒pPSC12(ProteinSciencesCorporation)中。該質(zhì)并立具有來(lái)自斥干4犬病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)的曱殼酶基因信號(hào)肽。將感興趣基因克隆入轉(zhuǎn)移載體需要四種PCR引物。感興趣基因利用兩種獨(dú)特引物擴(kuò)增(引物〗gtitctaacgcgtcgtactaccatcaccatcac(seqidNO:i5)和2CCGGGGTACCTTACAGCCCAGGAGAGTGGGAGAG(SEQIDNO:16))。擴(kuò)增多面體上游區(qū)i或需要兩種不同的引物，所述區(qū)域包括上游多面體啟動(dòng)子和信號(hào)肽序列(引物3ctggtagttcttcggagtgtg(seqidno:17)和4ggtagtacgacgcgttagaaacggcgaccaac(seqidno:，8))最終，將兩種外部引物(引物3和2，上述序列)用于關(guān)鍵的重疊延伸PCR中。NS5A-TBD利用引物1和引物2通過(guò)PCR從pFastBacHTa-NS5A-TBD擴(kuò)增而來(lái)，其中引物1包含將與引物4的5，末端退火的序列，而引物2則添加了3，Kpnl位點(diǎn)，用于克隆入載體中。pPSC12的上游多面體區(qū)域通過(guò)引物3和引物4擴(kuò)增，所述引物允許其在重疊延伸PCR過(guò)程中退火于引物1的3，末端。該上游區(qū)域還包含獨(dú)特的NgoMIV位點(diǎn)，該位點(diǎn)用于克隆入載體中。所述上游多面體啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列、以及期望基因通過(guò)利用引物2和3的重疊延伸PCR而嚴(yán)密地融合。全長(zhǎng)融合產(chǎn)物用NgoMIV和KpnI消化，并將得到的片段連接入同樣消化的pPSC12,以生成pPSC12-NS5A-TBD。pPSC12隱NS5A-TBD中ORF的核苷酸序列(SEQIDNO:42)和由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:53)在圖5中示出。pFastBacHTaHCVNS3Chimigen疫苗質(zhì)粒的構(gòu)建編碼NS3的DNA利用下列引物通過(guò)PCR從質(zhì)粒pCV-H77C才莫才反(HCV多蛋白的氨基酸1027至1652(nt3420至5294))生成。NS3C末端最后6個(gè)氨基酸未包括在該構(gòu)建體中，這是因?yàn)樵撔蛄惺荖S3絲氨酸蛋白酶活性的靶序列。所使用的5，末端引物是含有EcoRI限制性位點(diǎn)的5'-CCGGAATTCGCGCCCATCACGGCGTA-3，(SEQIDNO:19),而3,末端引物是含有SpeI限制性位點(diǎn)的5，-CCGGACTAGTCCGGCCGACATGCATGTCATGAT-3，(SEQIDNO:20)。用EcoRI和SpeI進(jìn)行雙消化，得到的產(chǎn)物與質(zhì)粒pFastBacHTa-TBD連接，以生成pFastBacHTaNS3-TBD。pFastBacHTaHCVNS3Chimigen疫苗質(zhì)粒載體的i秀變Shojietal.[(1999)Virology254:315-323]已經(jīng)才艮道了當(dāng)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，NS3蛋白的內(nèi)部切割發(fā)生于1488位的精氨酸殘基，可能由細(xì)胞蛋白酶介導(dǎo)。重疊延伸(OE)PCR用來(lái)產(chǎn)生氨基酸精氨酸至丙氨酸的突變，從而避免這樣的NS3Chimigen蛋白中NS3部分的切割。乂人親^CpFastBacHTaNS3-TBD質(zhì)并立生成兩個(gè)NS3DNA片,殳。5，NS3片l殳通過(guò)含Ecori卩艮制性位點(diǎn)的引物5，-ccggaattcgcgcccatcacggcgta-3，(SEQidNO:19)和突變引物(含精氨酸至丙氨酸的突變)5，-ctgccagtcctgcccgcgcgttgagtcctggag-3，(seqidNO:21)。3，NS3片,殳通過(guò)5，引物5，-ggcaggactggcagggggaagccaggcat-3，(seqidno:22)和含SpeI限制性位點(diǎn)的3，引物5，-CCGGACTAGTCCGGCCGACATGCATGTCATGAT-3，(SEQIDNO:20)而生成。OEPCR通過(guò)5，和3，NS3片段以及所述兩個(gè)外部引物而實(shí)現(xiàn)。用EcoRI和Spel進(jìn)4亍雙消化，得到的產(chǎn)物可與質(zhì)粒pFastBacHTa國(guó)TBD連4妄，以生成pFastBacHTaNS3mut-TBD(IDAC登錄號(hào)111006-05)。pFastBacHTaNS3mut-TBD中ORF的核苷酸序列(SEQIDNO:44)和由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:55)在圖7中示出。預(yù)測(cè)該蛋白的分子量是98.3kDa。對(duì)于僅NS3mut，通過(guò)EcoRI和SpeI消化而分離NS3mut片段，并克隆入pFastBac-HTa中，以生成pFastBacHTa-NS3mut。pFastBacHTa鄰64HCVNS3mutChimigen疫苗載體質(zhì)粒的構(gòu)建將pFastBacHTaHCVNS3mut-TBD質(zhì)粒用RsrII和HindIII限制酶消化，并將該NS3mut-TBD片段克隆入RsrII和HindIII消化的pFastBacHTa-gp64中，以生成pFastBacHTa-gp64-NS3mut-TBD(IDAC登錄號(hào)111006-02)。pFastBacHTa-gp64-NS3mut-TBD中ORF的核芬酸序列(SEQIDNO:45)和由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:56)在圖8中示出。預(yù)測(cè)該蛋白的分子量是101.5kDa。將類(lèi)似于用來(lái)制備pFastBacHTa-gp64-NS3mut-TBD(但缺乏自發(fā)突變并包含另一個(gè))的片,殳的突變NS3mut-TBD片l殳克隆也連4妄入pFastBacHTa-gp64中，以生成第二克隆pFastBacHTa-gp64-NS3mut-TBD。第二克隆pFastBacHTa-gp64-NS3mut-TBD中ORF的核香酸序列(SEQIDNO:43)和由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:54)在圖6中示出。pFastBacHTaHCV多抗原Chimigen融合蛋白表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建為了制備HCV多抗原載體質(zhì)粒，首先克隆NS4B-NS5A序列。其中利用用于5，末端的引物5，-GCGCACTAGTGTCTCAGCACTTACCGTACATC-3，(SEQIDNO:23)和用于3，末端的5,-CGGCGCGGCCGCCCGCAGCACACGACATCTTCCG-3，(SEQIDNO:24)。利用這些引物的PCR得到的產(chǎn)物具有獨(dú)特的限制性酶切位點(diǎn)5，末端SpeI位點(diǎn)和3，末端NotI位點(diǎn)。用SpeI和NotI消化該P(yáng)CR產(chǎn)物，并連4妻入SpeI和NotI消化的pFastBacHTa-gp64中，以生成pFastBacHTa-gp64NS4B-NS5A。4妻著，將TBD部分添至構(gòu)建體中。用SpeI和HindIII消化質(zhì)粒pFastBacHTa-TBD和pFastBacHTa畫(huà)gp64NS4B-NS5A。分離SpeI/HindIU消4匕的TBD并連接至所述消化的pFastBacHTa-gp64NS4B畫(huà)NS5A,以生成pFastBacHTa-gp64NS4B-NS5A-TBD。NS3活性位點(diǎn)絲氨酸殘基的誘變?cè)贜S3中，將活性位點(diǎn)絲氨酸(serl165)突變?yōu)楸盨交，以使蛋白酶活性失效。利用四種不同引物(兩種巢式引物，兩種互補(bǔ)于5，和3，末端的引物)，以pFastBacHTa-gp64NS3mut-TBD作為模板，通過(guò)OEPCR生成兩種NS3片段。5，NS3片段利用含限制性酶EcoRI4立點(diǎn)的5，末端引物(正義)5，CCGGAATTCGCGCCCATCACGGCGTA-3，(SEQIDNO:19)和突變引物(含ser畫(huà)ala突變)(反義)5，-CAACAGC(3GACCCCCCGCGGAGCCTTTCAAGTAC}-3,(SEQIDNO:25)來(lái)生成。3，NS3片革殳利用5，末端引物(正義)5，GTCCGCTGTTGTGC:CCCGCGGGACACG-3，(SEQIDNO:26)和含限制性酶SpeI位點(diǎn)的3，末端引物(反義)5，"CCGGACTAGTCCC3GCCGACATGCATGTCA-3，(SEQIDNO:27)來(lái)生成。全長(zhǎng)NS3(ser1165—ala)通過(guò)OE-PCR從5，和3，片段和兩種外部引物生成。得到的具有在Argl488突變?yōu)锳la以及在Serl165突變?yōu)锳la的產(chǎn)物稱(chēng)為NS3mutS。將該片革殳克隆入pFastBacHTa-gp64中，以生成FastBacHTa-gp64-NS3mutS-TBD(IDAC登錄號(hào)111006-001)。pFastBacHTa-gp64HCVNS3-NS4B-NS5A多抗原融合蛋白載體質(zhì)j^的構(gòu)建為了制備可用于表達(dá)融合蛋白HCVNS3mutS-NS4B-NS5A的構(gòu)建體，用限制性酶EcoRI和SpeI消化所述NS3mutSOE-PCR產(chǎn)物。將消化的NS3mutS連接入EcoRI和SpeI消化的質(zhì)粒pFastBacHTa-gp64NS4B隱NS5A-TBD中，以制備pFastBacHTa-gp64NS3畫(huà)NS4B-NS5A畫(huà)TBD(IDAC登錄號(hào)111006-06)，其是pFastBacHTa-gp64HCV多抗原質(zhì)斗立。pFastBacHTa-gp64NS3-NS4B-NS5A-TBD中ORF的核苷酸序列(SEQIDNO:46)和由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:57)在圖9中示出。pFastBacHTa-gp64HCVNS3-NS5A多抗原融合蛋白載體質(zhì)粒的構(gòu)建通過(guò)PCR乂人才莫才反pFastBacHTa-gp64HCVNS3-NS4B-NS5A-TBDChimigen疫苗融合蛋白表達(dá)載體質(zhì)粒生成用于HCVNS5A和TBD的DNA。用于PCR的5，引物是含有限制寸生酶SpeI的i口、另'J^f立點(diǎn)的(正義)5，-gagggactag丁gtccggttcctggctaagggac-3，(seqidno:28)。用于3，末端的PCR引物是(反義)5，-ccggtctagattatgatcctctagtacttctcgac-3，(seqidNO:29)。將PCR產(chǎn)物(NS5A-TBD)用凝月交純化，隨后用SpeI和Hindni限制性酶消化。用限制性酶SpeI和HindIII消化質(zhì)粒pFastBacHTa-gp64NS3-NS4B-NS5A-TBD，釋放由編碼HCVNS4B-NS5A和所述TBD的序列組成的片,殳。將得到的pFastBacHTa-gp64HCVNS3載體骨架經(jīng)凝膠純化并連接至所述NS5A-TBD片4殳，以生成表達(dá)質(zhì)4立pFastBacHTa-gp64HCVNS3-NS5AChimigen疫苗(pFastBacHTa-gp64NS3-NS5A畫(huà)TBD)(IDAC登錄號(hào)111006-03)。pFastBacHTa畫(huà)gp64-NS3畫(huà)NS5A-TBD中ORF的核香酸序列(SEQIDNO:47)和由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:58)在圖10中示出。pFastBacHTaHCV核心(1-177)畫(huà)TBD融合蛋白質(zhì)4立和pFastBacHTaHCV核心(1-177)的構(gòu)建編碼HCV多蛋白的氨基酸1-177(nt342-872)的HCV核心DNA序列通過(guò)PCR利用5，引物CGGAATTCATGAGCACGAATCCTAAAC(SEQIDNO:30)和3，引物GGACTAGTCCGAAGATAGAGAAAGAGC(SEQIDNO:3i)從pCV-H77C來(lái)擴(kuò)增。所采用的引物添加了獨(dú)特的5，EcoRI和3，SpeI位點(diǎn)。將PCR產(chǎn)物用EcoRI和SpeI消化并連4姿入pFastBacHTa-TBD和pFastBac-HTa中，以分別生成ChimigenTM疫苗構(gòu)建體pFastBacHTaHCV核心(1-177)-TBD和pFastBacHTaHCV核心(1-177)。pFastBacHTaHCV核心(1-177)-TBD中ORF的核苷酸序列(SEQIDNO:48)和由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:59)在圖11中示出。為了生成分泌形式的蛋白，將HCV核心(1-177)克隆入pFastBacHTa-gp64和pPSC12中。為了克隆入pFastBacHTa畫(huà)gp64中，將HCV核心(1-177)-TBD片,殳通過(guò)RsrII和HindIII消化而從pFastBacHTaHCV核心(1-177)-TBD中分離出來(lái)，并克隆入同樣消化的pFastBacHTa-gp64中，以生成pFastBacHTaHCV核心(1-177)-TBD。為了克隆入pPSC12中，采用與如NS5A-TBD所述類(lèi)似的方案，只是引物2編石馬獨(dú)凈爭(zhēng)的3，BglII4立點(diǎn)(AGTAAGATCTTTACAGCCCAGiGAGAGTGGGAGAG;SEQIDNO:32)。得到的構(gòu)建體是pPSC12-HCV核心(1-177)-TBD。pFastBacHTaHCVE1-TBD融合蛋白質(zhì)粒和pFastBacHTa-El的構(gòu)建編碼HCV多蛋白的氨基酸192-369(914-1452)的DNA序列通過(guò)5，引物CCGGAATTCTACCAAGTGCGCAATTCCT(SEQIDNO:33)和3，引物GCGCACTAGTCCCTTCGCCCAGTTCCCCACC(SEQIDNO:34)乂人pCV-H77C而擴(kuò)增，所述引物添加獨(dú)特的5，EcoRI位點(diǎn)和獨(dú)特的3，Spel位點(diǎn)。整個(gè)El開(kāi)放閱讀框架終止于氨基酸383，但氨基酸370至383之間的區(qū)域是E2的信號(hào)序列，因此不被擴(kuò)增。用EcoRI和SpeI消化PCR產(chǎn)物，并連4妄入同樣消化的pFastBacHTa-TBD中，以生成HCVElChimigenTM構(gòu)建體pFastBacHTa-El-TBD。為了僅表達(dá)El,將消化的PCR產(chǎn)物克隆入EcoRI和SpeI消4b的pFastBac-HTa中，以生成pFastBacHTa-El。pFastBacHTa-El-TBD中ORF的核苦酸序列(SEQIDNO:49)和由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:60)在圖12中示出。pFastBacHTaE2-TBD融合蛋白質(zhì)粒和pFastBacHTa-E2的構(gòu)建從氨基酸384至718(HCV多蛋白的nt1494-2495)的E2序列利用PCR通過(guò)5，引物GCGCACTAGTCACCCACGTCACCGGGGGAAATG(SEQIDNO:35)和3，可I物GCGCGCGGCCGCCCGTACTCCCACTTAATGGC(SEQIDNO:36)從pCV-H77C而擴(kuò)增，所述引物添加獨(dú)特的5，SpeI4立點(diǎn)和獨(dú)特的3，Notl位點(diǎn)。氨基酸719至746是p7的信號(hào)序列，因此不包括在構(gòu)建體中。用SpeI和NotI消化PCR產(chǎn)物，并連接于同樣消化的pFastBacHTa-TBD,以生成HCVE2ChimigenTM構(gòu)建體pFastBacHTaE2-TBD。為了僅表達(dá)E2蛋白，將消化的E2也克隆入pFastBac-HTa中，以生成pFastBacHTa-E2。pFastBacHTaE2-TBD中ORF的核苦酸序列(SEQIDNO:50)和由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:61)在圖13中示出。pFastBacHTa-E1-E2-TBD融合蛋白質(zhì)#立和pFastBacHTa-E1-E2的構(gòu)建El和E2的融合蛋白通過(guò)將pFastBacHTa-El中的El序列亞克隆入pFastBacHTa-E2中而生成。將該pFastBacHTa-El質(zhì)粒用EcoRI和SpeI消化，并將片,殳克隆入EcoRI和SpeI消化的pFastBacHTa-E2中，以生成pFastBacHTa-El-E2。為了制備E1畫(huà)E2ChimigenTM構(gòu)建體，將pFastBacHTa-El-E2用EcoRI和NotI消化，并克隆入同才羊消化的pFastBacHTa-TBD中，以生成pFastBacHTa-El-E2-TBD。pFas氾acHTa-El-E2-TBD中ORF的核芬酸序列(SEQIDNO:51)和由該ORF編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:62)在圖14中示出。在8&010-830@表達(dá)系統(tǒng)中生成重組桿狀病毒五.co/,'的轉(zhuǎn)化已連接的質(zhì)粒用來(lái)轉(zhuǎn)化五.co//DH5oc，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方案來(lái)分離質(zhì)粒。序列和開(kāi)放閱讀框架通過(guò)測(cè)序一驗(yàn)證，并用于生成重組桿狀病毒。轉(zhuǎn)座(轉(zhuǎn)位)重組體的生成基于Bac-to-Bac⑧克隆系統(tǒng)(Invitrogen),該系統(tǒng)利用具有細(xì)菌轉(zhuǎn)座子Tn7的位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座。這可在Eco//菌抹DH10Bac內(nèi)實(shí)現(xiàn)。所述DH10Bac細(xì)月包包含桿粒pMON14272和輔助質(zhì)粒(pMON7124)，其中桿粒pMON14272賦予對(duì)卡那霉素的耐藥性，而輔助質(zhì)粒編碼轉(zhuǎn)座酶并賦予四環(huán)素抗性。將感興趣基因克隆入pFastBac質(zhì)粒中，該質(zhì)粒具有位于克隆位點(diǎn)側(cè)翼的mini-Tn7元件。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入具有桿狀病毒穿梭質(zhì)粒(桿粒)的五.co//菌抹DH10Bac，其中所述桿狀病毒穿4炎質(zhì)粒(在LacZoc基因內(nèi)含有Tn7的附著位點(diǎn)。轉(zhuǎn)座破壞LacZot基因，以致僅重組體產(chǎn)生白色克隆，因此易于選擇。在五.co//中4吏用轉(zhuǎn)座的優(yōu)勢(shì)在于單個(gè)克隆4義包含重組體。該重組桿粒利用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分離步驟而分離，并用于轉(zhuǎn)染入昆蟲(chóng)細(xì)胞中，以生成表達(dá)重組蛋白的桿狀病毒。Donor(供體)質(zhì)粒和pFastBacHTa-gp64ChimigenTM疫苗載體用于將克隆的基因位點(diǎn)特異性地轉(zhuǎn)座入桿狀病毒穿梭載體(桿粒)中。將含有感興趣基因的重組pFastBacHTa-gp64質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH10Bac細(xì)胞中用于轉(zhuǎn)座以生成重組桿粒。將40|aL等份的感受態(tài)DH10Bac細(xì)胞在冰上解凍，加入基于pFastBacHTa-gp64的質(zhì)粒，并通過(guò)電穿孔進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化混合物加入到1mL的SOC培養(yǎng)基(介質(zhì))中，并在37。C下孵育4小時(shí)。所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(變異細(xì)胞)用LB連續(xù)地稀釋至10"和l(T2，并將100(_iL的每種稀釋物涂于LB瓊脂平一反上，該瓊脂平板中補(bǔ)充了卡那霉素(50ng/mL)、慶大霉素(7ng/mL)、四環(huán)素(10昭/mL)、X-gal(200pg/mL)和IPTG(40(ig/mL)，并在37。C下將育至少36小時(shí)。慶大霉素抗性由所述pFastBacHTa-gp64質(zhì)粒U武予，而X-gal和IPTG用來(lái)將白色克隆(重組桿粒)與藍(lán)色克隆(非重組)區(qū)分開(kāi)。挑選白色克隆并接種入2mL的LB中，該LB中補(bǔ)充了卡那霉素(50Hg/mL)、慶大霉素(7pg/mL)和四環(huán)素(10(ag/mL),并在37。C下振蕩孵育過(guò)夜。用無(wú)菌環(huán)來(lái)取少量過(guò)夜培養(yǎng)物，并將該樣品劃線(xiàn)在新鮮LB瓊脂平氺反上，該瓊脂平^^中補(bǔ)充了卡那霉素(50|dg/mL)、慶大霉素(7pg/mL)、四環(huán)素(10ng/mL)、X-gal(100pg/mL)和IPTG(40|ag/mL)，并在37。C下孵育至少36小時(shí)以確定白色表型。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方案來(lái)分離重組桿粒[Sambrooketal.(2001)InMolecularCloning,ALaboratoryManual.ColdSpringHarborPress],將DNA才羊品;容解于40的TE(10mMTris-HClpH8,lmMEDTA)中并用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染重組桿狀病毒的產(chǎn)生為了產(chǎn)生重組桿狀病毒，將相關(guān)桿粒轉(zhuǎn)染入Sf9昆蟲(chóng)細(xì)月包中。一尋Sf9細(xì)月包(9x105)4妻種于6孑L細(xì)月包i備養(yǎng)皿(35mm孑L)的每一個(gè)孑L的2mLESF921內(nèi)，并允許其在27。C下貼附至少1小時(shí)。通過(guò)Sf9細(xì)胞供應(yīng)商提供的方案，利用Cellfectin⑧試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后，將所述細(xì)胞在27。C下孵育72小時(shí)。收集含桿狀病毒的培養(yǎng)基并在4。C下^f渚存于暗處。通過(guò)檢查桿狀病毒DNA的產(chǎn)生，確定轉(zhuǎn)染效率。對(duì)分離的桿狀病毒DNA進(jìn)行PCR,以篩選感興趣的插入基因。利用6xHis標(biāo)簽-HRP扼合的單克隆抗體或抗小鼠IgG(Fc特異)辣才艮過(guò)氧化物酶軛合的抗體作為探針，細(xì)胞內(nèi)異種蛋白的表達(dá)可通過(guò)SDS-PAGE禾口蛋白質(zhì)印跡而馬全i正。重組桿狀病毒原種的擴(kuò)增一旦已經(jīng)確認(rèn)了桿狀病毒的生成和期望蛋白的表達(dá)，則增大病毒濃度，以生成攜帶感興趣基因的濃縮桿狀病毒原種。在本文所描述的所有方案中，均遵循將桿狀病毒擴(kuò)增至少兩次的標(biāo)準(zhǔn)操作。第二專(zhuān)侖擴(kuò)增后，利用^N犬病毒滴定分才斤(ExpressionSystems)定量所生成的桿狀病毒的濃度。還建立了感染Sf9細(xì)胞的最適合病毒濃度以及用于生成期望蛋白的最佳時(shí)間。才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步"^驟，開(kāi)發(fā)用于單層以及懸浮培養(yǎng)的Sf9細(xì)力包表達(dá)的方案。桿狀病毒滴定分才斤所有的病毒原種均利用ExpressionSystems斥干狀病毒滴定分牙斤來(lái)測(cè)定濃度。將病毒原種^人10"至10-4連續(xù)進(jìn)4于稀釋。將100等7分的每種,希釋才羊品力口入到CostarLowAttachment396孑14反的孑L內(nèi)，隨后，將100[xL的Sf9細(xì)胞以2x1(^細(xì)力包/mL的濃度加入到每個(gè)孔內(nèi)，并在27。C下將該板在振蕩搖床孵箱中以200-250rpm孵育18小時(shí)。孵育后，將gp64-PE輒合的抗體1:200稀釋?zhuān)⑼N型對(duì)照(IgG2A-PE)1:10稀釋。將該—反以1800rpm離心3分鐘。通過(guò)翻轉(zhuǎn)板來(lái)去除培養(yǎng)基，并往孔內(nèi)加入50jaL的gp64-PE軛合的抗體或50jiiL的同種型對(duì)照。隨后將該^反在4'C下在暗處孵育20分鐘。通過(guò)向每個(gè)孑L內(nèi)力口入150fiL冷PBS并^。上文所述離心板而;先滌細(xì)胞。接著，向每個(gè)孑L內(nèi)力口入200(aL的冷PBS,隨后另一旋轉(zhuǎn)，最后向每個(gè)孔內(nèi)加入200nL的PBS/O.1%BSA以重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至FACS管中用于分析。所述同種型對(duì)照用來(lái)在熒光流式細(xì)胞儀上i殳定門(mén)(gate)。通過(guò)將表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞群的百分比插入到所^是供的Excel電子表格中并生成一條基于對(duì)照病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)而確定病毒濃度。蛋白表達(dá)的優(yōu)化將ChimigenTM蛋白表達(dá)在一定的MOI和時(shí)間范圍內(nèi)優(yōu)化。將ESF921中的4^f分50mL的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)物以2xio6細(xì)月包/mL4妻種并以0.5、1.5和10的MOI感染，在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)收集1mL的培養(yǎng)物。將取^羊的培養(yǎng)物以12,000xg離心1分鐘，并分離上清液和細(xì)l包。立即制備細(xì)胞和上清液用于SDS-PAGE分析。將細(xì)力包重懸于500jaL的PBS中，并將150(iL的懸浮液加入到40pL5x加樣緩沖液和10[iL20x還原劑中。此夕卜，將150fiL上清液與405x加樣緩沖液和1020x還原劑混合。將才羊品煮沸5分鐘，并加樣到12%SDS-PAGE凝膠上用于蛋白質(zhì)印跡分析。經(jīng)評(píng)估，對(duì)于NS5AChimigenTM蛋白，蛋白生成以36小時(shí)和0.5MOI為最適；對(duì)于NS3ChimigenTM蛋白，以48小時(shí)和2MOI為最適；而對(duì)于多抗原ChimigenTM蛋白，則以36小時(shí)和1.5MOI為最適。細(xì)胞內(nèi)ChimigenTM疫苗的純化NS5AChimigen蛋白的大量表達(dá)以及細(xì)胞裂解物(溶解產(chǎn)物)的制備在ESF921培養(yǎng)基中的5升Sf9細(xì)胞培養(yǎng)物(密度約2x106細(xì)胞/mL)用桿狀病毒以0.5MOI感染。當(dāng)細(xì)胞存活達(dá)約95°/。時(shí)，在感染開(kāi)始后約36小時(shí)收獲細(xì)胞。較長(zhǎng)的表達(dá)時(shí)間導(dǎo)致細(xì)胞生存力喪失增加以及NS5AChimigenTM蛋白強(qiáng)烈降解。通過(guò)離心收集感染細(xì)胞并^f諸存在-8(TC下直到^f吏用。通過(guò)在;水上在200ml含高)農(nóng)度。土溫20的裂解IC沖液(6MGuHCl,50mMNaH2PO4，0.5MNaCl，1%吐溫20,10mMP-3克基乙醇，pH8.0)中旋渦，將來(lái)自1L感染細(xì)胞培養(yǎng)物的冰凍沉淀迅速重懸。高濃度的吐溫20對(duì)于NS5AChimigenTM蛋白與Ni-NTA樹(shù)脂的有效結(jié)合是必需的。將重懸的懸浮液在冰上超聲處理3次，每次1分鐘，其中每次超聲脈沖之間的間隔為2分鐘。隨后將超聲處理的裂解物在室溫下攪拌2小時(shí)。攪拌的裂解物通過(guò)離心(約27,000xg，15分鐘，l(TC)而澄清，并將上清液用于在Ni-NTAsuperflow上親和層析。NS3ChimigenTM蛋白的表達(dá)以及細(xì)胞裂解物的制備使用標(biāo)準(zhǔn)化的感染多重性(MOI)的編碼HCVNS3Chimigen蛋白的重組桿狀病毒來(lái)感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞用于表達(dá)。將Sf9細(xì)胞以6xl05細(xì)月包/mL的密度4妄種于2LErlenmeyer并瓦中的500mL的ESF921培養(yǎng)基中。將該細(xì)胞培養(yǎng)物在27.5。C下以120rpm振蕩孵育，直到細(xì)胞密度達(dá)到2-3x1()6細(xì)胞/mL。對(duì)于HCVNS3Chimigen蛋白，將細(xì)胞以MOI2感染48小時(shí)。對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，用于監(jiān)測(cè)感興趣蛋白的表達(dá)。通過(guò)在4。C下以3000rpm(1593xg，JA10,BeckmanCoulterAvantiTMJ25)離心10分4中來(lái)收獲細(xì)胞，并將新鮮細(xì)胞沉淀用于純化重組蛋白?？商鎿Q地，用條件培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，分散于50mL錐形管(每管250mL細(xì)胞i咅養(yǎng)物)中，在4°C下在BeckmanGS-6R離心才幾中以2,200rpm^走轉(zhuǎn)8分鐘。將細(xì)胞沉淀快速冰凍于液氮中，并儲(chǔ)存于-8(TC。通過(guò)78W(設(shè)置為(setting)6.5)超聲處理1分鐘，將冰凍細(xì)胞沉淀(相當(dāng)于2x500mL細(xì)胞培養(yǎng)基)重懸于200mL冰凍裂解緩沖液(6MGuHCl，150rnMNaCl，20mMTris-HCl，pH8.00中的冰上。將該混合物轉(zhuǎn)移至250mL玻璃燒杯中，并超聲處理4次以上，每次1分鐘，78W,且具有5分鐘的冷卻間歇期。將混合物移至室溫，并加入CTAB至鄉(xiāng)冬濃度為1%(w/v)。沖企查pH并調(diào)至pH8.00，并3尋裂解物孵育2小時(shí)。利用JA25.50轉(zhuǎn)頭在BeckmanAvantiJ-25離心機(jī)內(nèi)將所述裂解物在10。C下以15,000rpm(27,000xg)離心30分鐘，然后對(duì)上清液進(jìn)4于Ni-NTA親和層析。多抗原ChimigenTM蛋白的大量表達(dá)以及細(xì)胞裂解物的制備3奪4升ESF921i咅養(yǎng)基壽爭(zhēng)移入Cellbag中，并在WaveBioreactorSystem2/10EH上力口熱至27.5°C。^!尋1升Sf9細(xì)月包i咅養(yǎng)物以6xl06細(xì)胞/mL加入該Cellbag中。隨后將該袋在27.5。C與注射空氣(0.3L/min)—起孵育，并以130rpm振蕩。當(dāng)細(xì)月包密度達(dá)到2x106細(xì)胞/mL時(shí)，將重組桿狀病毒以MOI1.5接種。注射后36小時(shí)，在冰上冷凍該袋，并通過(guò)在4。C下以4500xg離心10分鐘而收獲細(xì)月包。將細(xì)胞沉淀懸浮于冰凍PBS中然后轉(zhuǎn)移至50mL錐形管(來(lái)自300mL;咅養(yǎng)物沉淀/管的沉淀)中。所述細(xì)胞沉淀通過(guò)在4°C下以2800xg離心15分鐘而回收。該沉淀立即在液氮中冷凍，并i者存于-80。C水箱中直至使用。將來(lái)自250mL培養(yǎng)物的冰凍Sf9細(xì)胞沉淀懸浮于20mlIXPBS、1%吐溫20、50mMDTT、5mMEDTA，pH8.0中，并于水上孵育30分鐘。用NaOH將該裂解物的pH調(diào)至pH12.0,并在室溫下攪拌30分鐘。用HCl將pH降至8.0,并以39191xg離心30分鐘。去除上清液，并將沉淀懸浮于20ml1XPBS、1%吐溫20、10mMDTT、lmMEDTA，pH8.0中。如上戶(hù)斤述，將pH升至12.0然后降至8.0。收集上清液并對(duì)20mMTris、0.05%吐溫20、O.lmMEDTA、10mM(3巰基乙醇，pH8.0(用于體積排阻(大小排阻)和疏水作用層析)透析。對(duì)于Ni-NTA親和層析，將來(lái)自500mlJ咅養(yǎng)物的冰凍Sf9細(xì)月包沉淀懸浮于50mL冰凍裂解緩沖液(6M鹽酸胍、50mM碳酸鈉、20%乙醇，pH10)中。通過(guò)超聲儀3000(MisonicInc.)將該細(xì)胞裂解物冰上以80W超聲5次(1分鐘)。將吐溫20加入裂解物中(終濃度1%)，并在室溫下攪拌該裂解物2小時(shí)。通過(guò)在4。C下以39191xg離心30分鐘而去除裂解物中的不溶性顆粒，并進(jìn)行Ni-NTA親和層析。HCV核心ChimigenTM蛋白的表達(dá)以及細(xì)胞裂解物的制備HCV核心ChimigenTM在兩種系統(tǒng)中表達(dá)。重組病毒通過(guò)在Sf9細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染pPSC12-HCV核心(1-177)-TBD和線(xiàn)性化桿狀病毒基因組而生成、經(jīng)空斑純化并擴(kuò)增。優(yōu)化后，Sf9培養(yǎng)物以M015感染，并在27.5。C下孵育50小時(shí)后收獲。重組病毒還可利用Bac-to-Bac⑧系統(tǒng)，通過(guò)用pFas但acHTa-gp64HCV核心(1-177)-TBD轉(zhuǎn)染E.coliDH10Bac細(xì)胞而生成。分離重組桿并立并用來(lái)轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞以產(chǎn)生重組桿狀病毒。將Sf9培養(yǎng)物以MOI5在27.5。C感染49小時(shí)，隨后通過(guò)離心而收獲。裂解物以與如上所述用于其他Chimigen蛋白基本相同的方式而制備，并進(jìn)行Ni-NTA親和層析。Ni-NTA親和層析將細(xì)胞裂解物加樣到Ni-NTAsuperflow柱(10ml杉于脂床體積/2.5L細(xì)胞培養(yǎng)物沉淀)，該柱已經(jīng)用10倍床體積的裂解緩沖液加以平4軒。用含有百分比降低的吐溫20的洗滌纟爰沖液(6MGuHCl,50mMNaH2PO4，0.5MNaCl，0.1%口土溫20,10mMP3?；掖?，pH8.0)的洗滌緩沖液洗滌該柱，直至A280<0.01，隨后用含15mM咪唑的相同洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌。隨后用10ml床體積的洗脫緩沖液(6MGuHCl，50mMNaH2P04,250M咪唑，0.1%吐溫20,10mMP巰基乙醇，pH8.0)/床體積餾分來(lái)洗脫靶蛋白。收集包含洗脫蛋白的餾分并對(duì)透析緩沖液3x4L(8M尿素、20mMTris、0.1%口土溫20、25mM氨茶石咸、10mMP畫(huà)巰基乙醇，pH8.5)透4斤。所有含尿素的緩沖液均用去離子尿素制備，以防止蛋白氨曱酰化。尿素通過(guò)AmberiiteMB-1(Supelco，PA^USA)(!0g/L/hr)去離子，并向纟爰沖液中力口入氰酸鹽清除劑乙二胺(終濃度25mM)。離子交換層析接下來(lái)，使通過(guò)Ni-NTA親和層析獲得的含已透析的NS5AChimigen3蛋白的樣品通過(guò)已在透析緩沖液中平4軒過(guò)的ToyopearlSuperQ3樹(shù)脂柱(2.5ml床體積/2.5L細(xì)胞培養(yǎng)物沉淀)。所述離子交換柱用離子交換洗滌緩沖液(8M尿素、20mMTris、0.05%吐溫20、25mM乙二胺、10mM(3-巰基乙醇，pH8.5)洗滌直至A28。<0.01。隨后用IO倍床體積含鹽濃度遞增(75mM、150mM和500mMNaCl)的洗滌緩沖液將蛋白從柱上洗脫。收集1倍床體積的餾分。該NS5AChimigenTM蛋白主要在150mMNaCl餾分中洗脫下來(lái)。輕纟鼓較低MW的污染蛋白則以75mMNaCl洗脫下來(lái)。收集洗脫的蛋白餾分，并在4。C下立即對(duì)最終透析i爰沖液(150mMNaCl、10mMNaH2PO4、0.05%吐溫20，pH8.5)進(jìn)4亍透析。每次透析2L，并更換5次透析緩沖液。將透析的蛋白通過(guò)已預(yù)濕的0.2pm濾器過(guò)濾,以防止蛋白黏連于此。純化的NS5AChimigenTM蛋白儲(chǔ)存于4。C。為了進(jìn)一步?jīng)_是純NS3Chimigen3蛋白，^1奪CM-S印harose3FastFlow基質(zhì)用8M尿素(去離子)、25mMNaH2P04、5mM乙二胺、0.05%(v/v)口土5顯20、10mMDTT,pH8.5力口以平#f。矛J用纟戔4生才弟度(0-至0.6M)氯化鈉在相同ll沖液中以1mL/min的流速洗脫蛋白。收集含該蛋白的餾分(25-50mMNaCl)。將通過(guò)Ni-NTA柱捕獲的含多抗原Chimigen3蛋白的樣品進(jìn)一步通過(guò)HiTrap3QXLlml柱利用AKTAexplorer3100FPLC系統(tǒng)而純化。來(lái)自Ni-NTA親和層析洗脫緩沖液中的蛋白通過(guò)AmiconUltra-15(MWCO30,000Da)濃縮，隨后將該緩沖液換成緩沖液A(8M尿素、50mM碳酸鈉、25mM乙二胺、1%吐溫20，pH10)。將蛋白加樣到HiTrapQ^XL柱上，用50ml的緩沖液A平衡，流速60mL/小時(shí)。用《爰沖液A洗滌該柱直至洗脫A280<0.01。蛋白通過(guò)線(xiàn)性梯度洗脫(100%緩沖液A至100%緩沖液B)在20倍柱體積中洗脫。HCV多抗原Chimigen蛋白在無(wú)逆流鎦分(flow-throughfraction)和在40%至50%1￡沖液B之間洗脫的餾分中洗脫。尺寸排阻層析在3MPa壓力下，利用AKTAexplorer100FPLC系統(tǒng)(GEhealthcare)將制備級(jí)Superdex3200填充于Tricon3柱10/300(1x30cm，PharmaciaBiotech)中。用100ml6M胍、50mM石友酸4內(nèi)，pH10洗滌該柱。將0.5mL含Chimigen3多抗原蛋白的裂解物加才羊到Superdex200柱上。以30ml/小時(shí)的流速洗脫蛋白，并收集0.5mL餾分。通過(guò)在280nm處的吸收監(jiān)測(cè)蛋白洗脫。疏水作用層沖斤S夸Phenyl-650CToyopearl(0.5mL,TOSOHCorp.)裝載到Poly-prep柱(Bio-Rad)中。該柱用20mLHIC結(jié)合纟爰沖液(0.1MTris、2M氯化鈉，pH8)進(jìn)行平^"。將終濃度為2M的氯化鈉加入到0.5mL含Chimigen3多抗原蛋白的裂解物中，并用3.5mLHIC結(jié)合緩沖液稀釋該拔jf又物。通過(guò)以18,000rpm(39,191xg,利用JA25.50轉(zhuǎn)子，BeckmanColuterAvantiJ-25離心才幾)離心20分4中而除去不;容性顆粒。將上清液以30mL/小時(shí)的流速通過(guò)重力流加樣到柱上。隨后，用10mLHIC結(jié)合纟爰沖液洗滌該柱，并用5mLHIC洗脫緩沖液(8M尿素、50mM乙二胺、0.5%吐溫20，pH10.5)洗脫結(jié)合于柱上的蛋白。純化的ChimigenTM蛋白的生化評(píng)估按照制造商l是供的方案，利用MicroBCA3蛋白分析試劑盒以孩史板步驟評(píng)估蛋白濃度。對(duì)于SDS-PAGE分析，等份的純化的蛋白通過(guò)加入5X蛋白加樣緩沖液和20X還原劑而變性并煮沸5分鐘。變性蛋白在12%SDS聚丙烯酰胺凝月交上分離，并在由生產(chǎn)商提供的條件下用頁(yè)藍(lán)3對(duì)該凝膠染色。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡分析，通過(guò)12。/。SDS-PAGE分離蛋白并利用含48mMTris石威、39mM甘氨酸、20%甲醇和0.0375%SDS的緩沖液將其電轉(zhuǎn)染到Hybond3ECL3硝基纖維素膜上。該膜首先在室溫下在封閉IC沖液(1%脫月旨乳、在PBS中的0.1%。土溫20)中孵育1小時(shí)。將用于檢測(cè)的抗體在封閉緩沖液稀釋至期望濃度。在室溫下，通過(guò)持續(xù)混合使該膜與稀釋抗體一起孵育1小時(shí)。在與每種抗體孵育后，在室溫下用封閉緩沖液沖洗該膜3次，每次沖洗10min。通過(guò)利用ECL3蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)試劑盒的化學(xué)發(fā)光并暴露于KodakBiomaxXARX射線(xiàn)膜而進(jìn)行蛋白才企測(cè)。為了定性才全測(cè)蛋白糖基化，使用由MolecularProbes開(kāi)發(fā)的Pro-QEmerald3004唐蛋白凝月交和BlotStaini式劑盒。該試劑盒可以用于4企測(cè)在凝膠或印跡上已通過(guò)SDS-PAGE分離的蛋白上的糖類(lèi)。該染料(stain)與大多數(shù)全蛋白染色兼容，并且如果需要，可利用質(zhì)譜進(jìn)行分析。當(dāng)染料與高碘酸氧化的糖基相互作用時(shí)，產(chǎn)生亮綠色螢光信號(hào)，每條帶均檢測(cè)低至0.5ng的糖蛋白。該染料是高石典酸和Schiff法的一種改良，并且制造商宣稱(chēng)可達(dá)504咅高的每文感度水平。試劑盒中還包括CandyCaneTM分子量標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)由改變糖基化和非糖基化蛋白(分別用作陽(yáng)性和陰性對(duì)照)而構(gòu)成。蛋白樣品SDS-PAGE后，將凝膠在50%MeOH和5%醋酸中固定過(guò)夜。在3%冰醋酸中洗滌凝膠2次(20分鐘)，隨后在氧化溶液高石典酸中聚糖氧化30分鐘。用3%冰醋酸洗滌凝膠3次(20分鐘)，隨后在新鮮Pro-Q3Emerald300染色液中暗處染色最長(zhǎng)120分鐘。成像前，還需要在3%冰醋酸中暗處再洗滌兩個(gè)20分鐘。染料的刺激/發(fā)射最大值是280/530nm,其中最佳可一見(jiàn)度在約300nm。利用GeneGenius(Syngene)透照器和相應(yīng)壽欠件可一見(jiàn)^b并掃描凝月交。Chimigen疫苗的免疫學(xué)鑒定人PBMC(外周血單核細(xì)胞)PBMC通過(guò)白細(xì)月包分離制備物的Ficoll-Hypaque梯度離心而獲4尋，所述制備物來(lái)自具有HLA-A2單元型(BiologicalSpecialtyCorporation)的非HCV感染個(gè)體。在液氮中，PBMC以3x107細(xì)月包/冷凍管4諸存于凍存培養(yǎng)基(50%HumanABserum，40%AIMV，和10%DMSO)中。單核細(xì)胞的分離并分化為未成熟DC(樹(shù)突細(xì)胞)在100mm纟且織J咅養(yǎng)4反(BDBiosciences)上，S尋PBMC在37。C下在AIMV⑧培養(yǎng)基(含2.5。/。配型血清)中培養(yǎng)l小時(shí)。培養(yǎng)后，去除非貼壁細(xì)胞(非粘附細(xì)胞)，并用AIMV⑧培養(yǎng)基洗滌該板。隨后用含IL-4和GM-CSF(每種1000IU/mL)的2mLAIMV/2.5%配型血清培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。HCVChimigenTM蛋白與未成熟DC的結(jié)合未生熟DC是由在IL-4和GM-CSF存在的情況下i咅養(yǎng)單核細(xì)胞24-72小時(shí)而獲得的。培養(yǎng)后，收獲細(xì)胞，用含2.5%配型血清的AIMV㊣培養(yǎng)基洗滌一次，隨后用含0.1%(w/v)BSA的Dulbecco石粦酸緩沖鹽(Invitrogen)(PBSB)洗滌2次。所述細(xì)胞用來(lái)評(píng)估ChimigenTM蛋白的結(jié)合和內(nèi)化。未成熟DC的表型通過(guò)標(biāo)記多種細(xì)胞表面標(biāo)記物而評(píng)估，該細(xì)月包表面標(biāo)記物包4舌CD64、CD32、CD16、CD206、HLA-ABC、HLA-DR、CD14、CDllc、CD86、CD80、CD40、CD83、CD19、CD3、和CD4。對(duì)于結(jié)合分析，所有步-驟均在4。C下進(jìn)^f于，孵育后進(jìn)行洗滌。將細(xì)胞與不同濃度的Chimigen蛋白或相應(yīng)的透析緩沖液一起在PBSB中卯孚育60min(96孑L>/-底*反，2x105纟田月包/孑L,體禾口、25孩吏升)。蛋白結(jié)合通過(guò)將細(xì)胞與生物素化抗小鼠IgGl或抗6xHis抗體在PBSB中一起孵育20min，隨后SA-PE-Cy520分鐘而檢測(cè)。將細(xì)胞重懸于含2%低聚曱醛(PF)的PBSB中。在采用NS5AChimigen蛋白的實(shí)一瞼中，通過(guò):f關(guān)用兔抗NS5A多克隆抗體、羊抗兔IgG-生物素、SA-PE-Cy5來(lái)檢測(cè)結(jié)合。將細(xì)胞重懸于含2%低聚曱醛(PF)的PBSB中，并通過(guò)熒光流式細(xì)胞儀(FFC)評(píng)估細(xì)胞結(jié)合。利用結(jié)合抑制劑鑒定用于ChimigenTM疫苗的DC受體將未成熟DC與抗CD32mAb(IgG2b同種型)、抗CD206(IgGl同種型)、或同種型對(duì)照小鼠IgG2b或IgGlmAbs—起在4。C下孵育60分鐘。隨后，將所述細(xì)胞與Chimigen疫苗一起在PBSB中4X:孵育60分鐘。洗滌后，通過(guò)FFC分4斤，利用生物素化抗小鼠IgGlmAb或生物素化抗-6xHismAb以及隨后的SA-PE-Cy5來(lái)4企測(cè)與該細(xì)月包的結(jié)合。熒光流式細(xì)胞4義(FFC)分析細(xì)胞通過(guò)裝配有CellQuestPro采集和分析軟件(BDBiosciences)的FACSCalibur而獲4f。對(duì)活細(xì)月包群i殳定門(mén)，如通過(guò)FFC和SSC散射譜確定的，并采集了220,000個(gè)事件。特異性陽(yáng)性細(xì)胞的百分比計(jì)算如下(陽(yáng)性細(xì)胞一企測(cè)樣品％-陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)照％)/(100-對(duì)照陽(yáng)性細(xì)胞％)xioo。相對(duì)平均熒光強(qiáng)度(MFI)如下確定4全測(cè)沖羊品的MFU十照才羊品的MFI。4元原呈遞分一斤(APA)APA用來(lái)測(cè)定T細(xì)i包對(duì)由APC所呈遞的抗原的免疫應(yīng)答。所述分析將功能性T細(xì)胞免疫應(yīng)答以及抗原負(fù)載的成熟DC對(duì)誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞增殖的能力加以量化。步驟包括將PBMC衍生的單核細(xì)胞分化為未成熟DC、用抗原(ChimigenTM蛋白或TT)負(fù)栽該未成熟DC、將該未成熟DC分化為成熟DC以及隨后將成熟的抗原負(fù)載的DC與自體幼稚T細(xì)胞一起培養(yǎng)。對(duì)于活化和增殖分析，培養(yǎng)7天后對(duì)T細(xì)胞進(jìn)4于分析。為了分析T細(xì)胞功能和特異性，將T細(xì)胞用抗原負(fù)載的成熟DC再刺激兩次，并評(píng)估IFN-y、TNF-a、粒酶B(grB)和穿孔素(pfn)的生成。T細(xì)胞對(duì)抗原的特異性用特異性MHCI類(lèi)四聚體或五聚體進(jìn)行評(píng)估?？乖?fù)載的成熟DC的生成如上所述生成未成熟DC并與抗原或緩沖液(對(duì)照)一起孵育8小時(shí)。隨后將該細(xì)胞與催熟劑polyIC(20|ag/mL)、重組人(rh)IL-l(K10ng/mL)、rhTNF畫(huà)a(10ng/mL)、rhIL-6(10ng/mL)、rhIFN-aA(1000U/mL)和rhIFN-y(1000U/mL)—起培養(yǎng)16小時(shí)。所述DC的成熟程度通過(guò)表型分析而評(píng)估。將細(xì)胞標(biāo)記多種細(xì)胞表面才示i己物，包4舌CD64、CD32、CD16、CD205、CD206、CD209、HLA-ABC、HLA-DR、CD14、CDllc、CD86、CD80、CD83、CD40、CD19、CD3、CD8和CD4。洗滌該成熟的抗原負(fù)載DC并將其與T細(xì)月包一起i備養(yǎng)。人PBMC(外周血單核細(xì)胞)衍生的T細(xì)胞的分離按照制造商的步驟，利用DynalBiotechT細(xì)胞陰性選擇試劑盒(Invitrogen)通過(guò)陰性選才奪而/人PBMC中分離T細(xì)月包。4吏用匹配血清來(lái)代替BSA和FBS。通過(guò)多種細(xì)胞標(biāo)記物的表型標(biāo)記而評(píng)估分離細(xì)胞的表型。T細(xì)胞(CD3+細(xì)胞)構(gòu)成所分離細(xì)胞群的98%以上。該T細(xì)胞用CFSE標(biāo)記(見(jiàn)下文)，或直接加入到含有DC的細(xì)月包培養(yǎng)物中。T細(xì)月包的CFSE才示i己將新鮮分離的T細(xì)胞(1-5x107細(xì)胞)懸浮于500pl的PBSB中并與500jil新鮮制備的10iug/ml的CFSE工作貯存液混合。在37。C下孵育10min后，用含血清培養(yǎng)基(AIM￥@/10%匹配血清)充分洗滌細(xì)胞，以除去未結(jié)合的CFSE。T細(xì)月包的CFSE標(biāo)記通過(guò)FFC而確定。人PBMC々f生的T細(xì)l包的i咅養(yǎng)將T細(xì)月包與抗原負(fù)載的成熟DC以AIMV/2.5%匹配血清中的1-20x104T細(xì)胞至1-5x1()4DC/孔的比例一起孵育。為了進(jìn)行T細(xì)胞活化和增殖APA實(shí)—險(xiǎn)，培養(yǎng)4天和7天后收獲T細(xì)胞(見(jiàn)下文)。對(duì)于T細(xì)胞功能和特異性APA實(shí)驗(yàn)，將T細(xì)胞培養(yǎng)7天，隨后用抗原負(fù)載的成熟DC再次刺激并再培養(yǎng)7天。隨后將培養(yǎng)14天的T細(xì)月包分為兩組(細(xì)月包內(nèi)細(xì)月包因子(ICC)才反和四聚體4反)，并用抗原負(fù)載的DC進(jìn)行第三次刺激。將1嗎/mL布雷菲德菌素A(BDBiosciences)力口入到ICCIFN-y才反的孑L內(nèi)，并將該細(xì)月包i咅養(yǎng)6小時(shí)。94IFN-y、TNF-a、grB和pfn的表達(dá)如下文所列出的進(jìn)4亍評(píng)估。刺激后5-6天進(jìn)行四聚體分析，如下文所述。T細(xì)胞活化和增殖分析為了活化/增殖APA,與抗原負(fù)載的DC—起培養(yǎng)4或7天后，收獲T細(xì)胞。評(píng)估該T細(xì)胞的CD69(早期活化標(biāo)記物)表達(dá)和CFSE強(qiáng)度(增殖程度)。用抗CD3-PE、抗CD3-PE-Cy5和抗CD69-APC標(biāo)記收獲的細(xì)胞。利用纟爰沖液對(duì)照樣品可鑒定未經(jīng)過(guò)^壬何倍增的T細(xì)胞群。在FL1通道中檢測(cè)到標(biāo)記有高度熒光的細(xì)胞群，并命名為CFSEhi。經(jīng)過(guò)一次分裂的細(xì)胞群具有CFSEhi細(xì)胞群的MFI的一半。類(lèi)似地，經(jīng)過(guò)兩次分裂的細(xì)胞群具有CFSEhi細(xì)胞群的MFI的約25%(小于4倍)。所具有的CFSE熒光低于CFSEhi熒光的細(xì)胞命名為CFSE1。。某些細(xì)胞群具有接近背景FL1通道熒光，并且可以稱(chēng)為CFSE-(CFSE陰性)。然而，為了此處所列出實(shí)驗(yàn)的目的，可認(rèn)為T(mén)細(xì)胞是CFSEhi(無(wú)細(xì)胞分裂)或CFSE1。(至少一次細(xì)胞分裂)。T細(xì)胞活化通過(guò)評(píng)估CD69的表達(dá)而定量。在某些實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)圏定高FSC和SSC強(qiáng)度CD3+T細(xì)胞而定量T母細(xì)胞。因此，與細(xì)胞群中小(GO)的靜息細(xì)胞相比，細(xì)胞群中母細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量表示為具有較大直徑(FSChi)和較高細(xì)胞復(fù)雜度(SSChi)的細(xì)胞的比例。細(xì)月包內(nèi)IFN-y、TNF-oc、grB和pfn的4企觀'J利用標(biāo)準(zhǔn)ICC(細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子)方案(BDBiosciences),定量IFN-y和TNF-a的生成和絲氨酸蛋白酶#立酶B(grB)[Lobeetal.(1986)Science232:858-861]以及成孔蛋白穿孔素(pfn)[Hameedetal.(1992)Am.J.Pathol.140:1025-1030]的表達(dá)。簡(jiǎn)單的i兌，該過(guò)禾呈包4舌用特異性熒光染料扼合的mAbs標(biāo)記所述細(xì)胞，用于^f企測(cè)CD3(抗CD3-APC)和CD8(抗CD8-PE-Cy5)，然后進(jìn)行固定和滲透。隨后將細(xì)月包才羊品分為兩^f分，一份與抗IFN-y-PE抗體和抗-grB-FITC抗體一起孵育，而另一〗分與抗TNF-a-PE和抗穿孔素-FITC—起孵育。利用BDFACSCalibur，平均每份樣品可采集到20,000-100,000個(gè)細(xì)胞。四聚體和五聚體分析將T細(xì)月包用抗CD8-PE-Cy5、抗CD4-APC和抗CD69-FITC抗體以及下列PE輒合的iTagTM四聚體(BeckmanCoulter)或五聚體(Prolmmune)中的一種進(jìn)4亍才示"i己HCV鄉(xiāng)5A(VLSDFKTWL;SMQIDNO:3)HLA-A*0201,EBV(GLCTLVAML鄰QIDN0:5)HLA-A*0201,HCVNS3peptide(ON(3VCWTV;SBQE)恥:4)H1AA*0201，HCV!NS3peptide(KLVALG1NAV;SEQIDN0:6)HLA-A*0201,以及一種陰性對(duì)照四聚體(多等位基因的)。利用FACSCalibur可采集到約100,000個(gè)細(xì)萬(wàn)包。通過(guò)共聚焦顯孩t鏡分析ChimigenTM蛋白結(jié)合、內(nèi)化和加工利用共聚焦顯微鏡研究ChimigenTM蛋白被未成熟DC結(jié)合、內(nèi)化和加工的過(guò)程。這些研究中所〗吏用的未成熟DC通過(guò)在GM-CSF和IL-4存在的情況下，使貼壁的PBMC起源單核細(xì)胞在含2.5%供體匹配血清的AIMV㊣培養(yǎng)基中分化2天而得到。第2天，將未成熟DC轉(zhuǎn)移至腔室玻片，使用前再孵育一天。第3天，則選擇為具有適當(dāng)細(xì)月包表面受體和形態(tài)的細(xì)月包之間的中間物。為了研究ChimigenTM蛋白與DC表面的結(jié)合，將細(xì)胞用5Tg/mLChimigenTM蛋白或緩沖液(僅作為陰性對(duì)照)在4。C下在PBSB中孵育1小時(shí)。1小時(shí)后，用PBSB洗滌細(xì)胞并用生物素化的抗小鼠IgGl抗體標(biāo)記，隨后用抗生蛋白鏈菌素AlexaFluoKg)5^標(biāo)記。每一個(gè)步驟之間均進(jìn)行PBSB洗滌。標(biāo)記并洗滌后，用4%低聚曱醛(在PBSB中制備)將細(xì)胞在4。C下固定10min。隨后用含4',6-二脒基-2-苯基吲咮、二氫氯^:物(DAPI;Invitrogen)的SlowFadeGoJd抗淬滅劑封片，并將蓋玻片用指甲油密封于所述玻片上。通過(guò)DC內(nèi)化ChimigenTM蛋白(5Tg/mL)的研究可通過(guò)直接將該細(xì)胞在37°C(7%C02)含ChimigenTM蛋白的培養(yǎng)基中孵育，或通過(guò)首先在PBSB中在4'C下標(biāo)記表面受體、洗去未結(jié)合蛋白，隨后研究該受體結(jié)合的蛋白在37°C(7%C02)AIM￥@/2.5%匹配血清的i咅養(yǎng)基中隨時(shí)間(0min、15min、60min和240min)的吸收。用PBSB洗滌在37。C下孵育的細(xì)l包，隨后用BDBiosciencesCytofix/Cytoperm溶液固定并滲透10分鐘。隨后用在BDBiosciencesPerm/WashTM-容液中的生物素抗小鼠IgGl對(duì)細(xì)月包洗滌并標(biāo)"i己(1小時(shí))，"t妻著用^t生蛋白鏈菌素AlexaFhio滯546才示i己。如有需要，可用其他抗體共同標(biāo)記。最后一次洗滌該細(xì)月包后，如上所述安裝玻片。為了確定Chimigen蛋白被內(nèi)吞，實(shí)施了脈沖追蹤試驗(yàn)，用ChimigenTM蛋白(5Tg/mL)在冰上沖擊未成熟DC30分鐘。用PBSB洗滌細(xì)胞，并在不含ChimigenTM蛋白的AIMV⑧/2.5。/。匹配血清的培養(yǎng)基中追蹤，然后在37。C下(7%C02)孵育15分鐘。月永沖追蹤的細(xì)胞用PBSB洗滌、用4%低聚甲醛固定并用MHCn類(lèi)抗體標(biāo)記，以^又標(biāo)記質(zhì)膜。為了確定如果ChimigenTM蛋白存在于內(nèi)涵體中，則隨后用BDBiosciencesCytofix/CytopermTM溶液將質(zhì)膜標(biāo)記的細(xì)胞固定并滲透10分鐘。如上所述，在用BDPerm八VashTM洗滌后，利用抗小鼠IgGl生物素/抗生蛋白鏈菌素檢測(cè)Chimigen蛋白。為了研究微胞々欠作用，5mg/ml的FITC葡聚糖(MW70,000，陰離子，賴(lài)氨酸可固定的，Invitrogen)在含或不含Chimigen蛋白(5Tg/mL)的AIMV⑧/2.5。/。匹配血清的培養(yǎng)基中用作液相標(biāo)記物。為了研究受體介導(dǎo)的胞吞作用，將20Tg/mL的AlexaFluor488轉(zhuǎn)鐵蛋白軛合物(Invitrogen)用于含ChimigenTM蛋白(5Tg/mL)的PBSB中。乳胞素(Sigma)既用作半胱氨酸蛋白酶抑制劑又用作蛋白酶體抑制劑(終濃度5Tg/mL)。在體內(nèi)動(dòng)物^:莫型中免疫應(yīng)答的評(píng)估這些研究利用兩種近親實(shí)^^室動(dòng)物(小鼠和大鼠)和一種遠(yuǎn)親大動(dòng)物(小豬)種屬。特別地，采用BALB/c小鼠(6-8周大，來(lái)自CharlesRiver實(shí)—驗(yàn)室)、Wistar大鼠(4-6周大，來(lái)自CharlesRiver實(shí)驗(yàn)室)和雜交小豬(4-6周大，來(lái)自PrairieSwineCenter,UniversityofSaskatchewan)。所述研究確定ChimigenTM蛋白的免疫應(yīng)答和保護(hù)效力。安全性評(píng)估HCVChimigenTM蛋白經(jīng)皮下(s.c.)或皮內(nèi)(i.d.)給予。下列方案和劑量用于注射。動(dòng)物經(jīng)s.c.或i.d.接種4次，分別是第0天、第14天、第28天和第42天，每?jī)芍芤淮?。?duì)于小鼠s.c.和i.d.注射，采用0.1Tg、lug或10Tg/小鼠。用于大鼠接種的劑量將為0.15Tg、1.5Tg或15Tg/大鼠，而對(duì)于小豬則為0.2Tg、2Tg或20Tg/小豬。接種前(第1天)以及每次注射后7天(第7、21、35、49天)收集血液樣品，通過(guò)ELISA4支術(shù)用于分坤斤特異抗體的量以及IgGl/IgG2a比率。最后一次接種后兩周處死動(dòng)物。通過(guò)接種后每周至少三次對(duì)動(dòng)物進(jìn)行體檢，而評(píng)估HCVChimigenTM蛋白的安全譜。這包括體重和不良事件〗現(xiàn)測(cè)。對(duì)于全身毒性，采用以固定間隔收集的血液才羊品來(lái)監(jiān)測(cè)血清化學(xué)物質(zhì)的變化，包括天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將尸體剖檢時(shí)從脾、肝、腎、心、肺、肌肉和腦收集的組織在10%緩沖福爾馬林中固定并在石蠟中包埋，用于將來(lái)分析可能的病理學(xué)變化。周齡匹配的動(dòng)物用作對(duì)照。對(duì)Chimigen蛋白的免疫應(yīng)答預(yù)測(cè)ChimigenTM蛋白可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。實(shí)施動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以確定小豬體內(nèi)的宿主對(duì)HCVChimigen疫苗的免疫應(yīng)答。核心、NS5A、NS3和多抗原Chimigen蛋白用于這些研究。在第一l侖中，評(píng)估對(duì)HCVChimigenTM蛋白的免疫應(yīng)答。如上所述，該蛋白經(jīng)s.c.或i.d.,合予。小鼠或大鼠的脾細(xì)胞以及小豬的外周血單核細(xì)胞(PBMC)用來(lái)確定在s.c.和i.d.途徑給藥后對(duì)HCVChimigenTM蛋白的免疫應(yīng)答的質(zhì)和量，如下文所述。這些實(shí)-瞼允許我們確定哪種Chimigen疫苗以及哪種給藥途徑將能夠-秀導(dǎo)最強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。除了強(qiáng)烈的體液應(yīng)答之外，靶向性遞送所述HCVChimigenTM蛋白還能引起潛在的Thl偏離的免疫應(yīng)答。來(lái)自VIDO對(duì)HCV疫苗的研究已經(jīng)證明用DNA疫苗初始化并隨后用蛋白加強(qiáng)可i秀導(dǎo)強(qiáng)烈的和Thl/Th2平衡的免疫應(yīng)答Yueta1.(2004)J.Gen.Virol.85:533-1543。免疫應(yīng)答的評(píng)估/y>拔^M吝。通過(guò)ELISA來(lái)確定HCV抗原特異性抗體的存在，以才企測(cè)總IgG以及IgGl和IgG2a抗體水平。所述IgG水平表明免疫應(yīng)答的數(shù)量，而IgGl和IgG2a的相對(duì)水平則表明免疫應(yīng)答的性質(zhì)(Thl或Th2)。這些實(shí)驗(yàn)利用已建立的方案而實(shí)施。/"^S細(xì)應(yīng)增崖i^定。用HCV抗原在體外刺激小鼠或大鼠的脾細(xì)胞、小豬的外周血單核細(xì)胞(PBMC)。增殖反應(yīng)通過(guò)將[曱基」H]胸腺嘧啶整合入分裂細(xì)胞的DNA而測(cè)定。///J細(xì)i^西子五U5"尸Or測(cè)定。為了進(jìn)一步確定免疫應(yīng)答的性質(zhì)，按照我們已建立的方案用HCV抗原刺激后，在ELISPOT測(cè)定中確定脾細(xì)胞(小鼠和大鼠)或PBMC(小豬)中分泌干擾素-Y和白介素_4的細(xì)月包凄丈量。由HCVChimigenTM蛋白豫導(dǎo)的保護(hù)性抗病毒免疫HCV具有非常窄的宿主范圍，Y又在人和黑猩猩體內(nèi)復(fù)制。用活HCV激發(fā)接種動(dòng)物是不實(shí)際的，因?yàn)楹谛尚少M(fèi)用昂貴且供應(yīng)受限。然而，用編碼HCV抗原的重組牛痘病毒接種后激發(fā)是一種替代性模型，用于評(píng)估由HCV預(yù)防性疫苗在動(dòng)物模型中誘導(dǎo)的保護(hù)性能力。ChimigenTM蛋白，單獨(dú)或作為組合物，用來(lái)免疫4妾種動(dòng)物。為了評(píng)估接種后誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫，完成利用預(yù)定策略的計(jì)劃免疫4妻種后2周，通過(guò)編碼相同HCV抗原的重組牛痘病毒作為相關(guān)Chimigen3蛋白而腹膜內(nèi)激發(fā)動(dòng)物。激發(fā)劑量將為小鼠1x107空斑形成單4立(PFU)、大鼠2x107PFU以及小豬1x109PFU。5天后，處死動(dòng)物并通過(guò)空J(rèn)趕測(cè)定4姿照已建立的方案確定病毒滴度。鑒定最適合的用于HCV治療性和預(yù)防性疫苗的候選物治療性疫苗基于HCV病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(例如NS5A、NS3),而預(yù)防性疫苗則基于結(jié)構(gòu)蛋白(例如El、E2)以及非結(jié)構(gòu)蛋白。所述Chimigen疫苗中的一種或多種的組合物用于離體DC/T細(xì)胞抗原呈遞分析以及動(dòng)物;溪型中，并評(píng)估免疫學(xué)結(jié)局。目前正在研究用于治療性和預(yù)防性用途的Chimigen疫苗的免疫4妄種方案以及纟會(huì)藥途徑。通過(guò)測(cè)定^t體K平、'淋巴細(xì)l包增殖以及細(xì)胞因子生成而評(píng)估免疫應(yīng)答。由預(yù)防性HCVChimigenTM疫苗候選物i秀導(dǎo)的保護(hù)性抗病毒免疫還可在激發(fā)試3全中輛:評(píng)估，如上文所述。實(shí)施例2.NS5AChimigen3蛋白的結(jié)果NS5AChimigenTM蛋白已4皮4是純并鑒定純化的NS5AChimigenTM蛋白通過(guò)SDS-8%PAGE遷移為一條約105kDA的帶，盡管該蛋白的預(yù)測(cè)分子量是約81kDA。觀察到的分子量與預(yù)測(cè)的分子量之間的差異可能部分由于該蛋白中的高脯氨酸含量(~11%)、糖基化以及其他可能的翻譯后修飾而引起。該純化蛋白用抗小鼠IgGlFc、6xHis和NS5A的抗體進(jìn)4亍才企測(cè)。對(duì)該純化蛋白(從凝膠上切下的條帶)進(jìn)行MS/MSID(質(zhì)譜)分析，得到明顯的NS5A、小鼠IgGl重鏈以及HCV多蛋白點(diǎn)，表明其的確是NS5AChimigenTM蛋白。將純化的NS5AChimigenTM蛋白在8%SDS凝月交上分離，并利用Pro-QEmerald300糖蛋白;疑月交以及BlotStain試劑盒染色糖基化，并用UV光照進(jìn)朽"險(xiǎn)測(cè)。該揭:作表明所述純化的NS5AChimigenTM蛋白的糖基化。NS5AChimigenTM蛋白結(jié)合于未成熟DC對(duì)NS5AChimigenTM蛋白結(jié)合于未成熟DC的能力加以檢測(cè)。在不同濃度的NS5AChimigenTM蛋白存在或缺失的情況下，將該細(xì)胞在4。C下孵育1小時(shí)。通過(guò)生物素化的抗小鼠IgGlmAb和SA-PE-Cy54全測(cè)結(jié)合的疫苗。結(jié)合該疫苗的細(xì)力包百分比(陽(yáng)性細(xì)月包%)以及結(jié)合蛋白的相對(duì)量(MFI)通過(guò)流式細(xì)胞儀確定(圖15)。當(dāng)NS5AChimigenTM蛋白為4-50昭/mL時(shí)，大多數(shù)DC結(jié)合均為陽(yáng)性，且結(jié)合蛋白的量存在劑量依賴(lài)性遞增(圖15和16)。相比于50昭/mL,20|Lig/mL時(shí)蛋白的結(jié)合并不是更大，表明與未成熟DC的結(jié)合是可飽和的。觀察到的高結(jié)合MFI提示NS5AChimigen蛋白與未成熟DC的結(jié)合非常有效且處于高水平。4。C時(shí)的結(jié)合是可飽和的，表明該過(guò)程是受體介導(dǎo)的。該結(jié)合也非常迅速，因?yàn)榻Y(jié)合的蛋白在4。C孵育5分鐘后即可4企測(cè)到，其中結(jié)合MFI約為孵育1小時(shí)后觀察到該值的一半(數(shù)據(jù)未示出)。NS5AChimigenTM蛋白結(jié)合于未成熟DC上的特異性受體通過(guò)其所包含的Fc片段，推測(cè)所述NS5AChimigenTM蛋白通過(guò)其TBD區(qū)結(jié)合于未成熟DC上的CD32(FcyRII)。此外，由于其甘露糖糖基化，推測(cè)該NS5AChimigenTM蛋白還結(jié)合于C型凝集素受體如CD206(MMR)。為了確定所述疫苗候選物的結(jié)合特異性，在阻斷性抗CD32和/或抗CD206mAbs存在的情況下，將未成熟DC與NS5AChimigenTM蛋白一起孵育。將未成熟DC與》爰沖液對(duì)照、或5|ig/ml同種型對(duì)照mAb、抗CD32mAb、抗CD206mAb、或者抗CD32mAb和抗CD206mAb在4。C下一起孵育1小時(shí)，隨后在4。C下與NS5AChimigenTM蛋白一起孵育1小時(shí)。結(jié)合的NS5AChimigenTM蛋白用生物素化的抗6xHismAb隨后是SA-PE-Cy5進(jìn)行檢測(cè)。相比于緩沖液對(duì)照，同種型對(duì)照mAb(鼠IgGl和IgG2b)并未抑制結(jié)合。然而，相比于緩沖液對(duì)照，抗CD32和抗CD206分別抑制結(jié)合達(dá)約60%和40°/。。加入兩種mAb進(jìn)一步抑制NS5AChimigenTM蛋白結(jié)合，導(dǎo)致80%抑制。這些凝:才居表明CD32和CD206兩者在結(jié)合NS5AChimigenTM蛋白過(guò)程中的作用。通過(guò)共聚焦顯微鏡，相比于僅用緩沖液，在4。C下與NS5AChimigenTM蛋白一起孵育的細(xì)胞表面上表現(xiàn)出強(qiáng)烈的標(biāo)記，表明ChimigenTM蛋白結(jié)合于細(xì)胞表面。通過(guò)未成熟DC的NS5AChimigenTM蛋白內(nèi)化在37。C下力。以評(píng)估。與ChimigenTM蛋白一起于37。C孵育1小時(shí)的未成熟DC表現(xiàn)為點(diǎn)狀標(biāo)記模式，常位于核附近，提示ChimigenTM蛋白被內(nèi)化且(即使有)幾乎非常小的表面標(biāo)記。DC能夠通過(guò)幾種途徑吸收抗原，包括吞噬、巨胞飲、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用以及非網(wǎng)格蛋白/細(xì)胞膜穴樣凹陷胞吞作用。已報(bào)道巨月包々大是未成熟DC內(nèi)的一個(gè)纟且成')"生過(guò)禾呈(TrombettaandMellman2005)。未成熟DC通過(guò)巨胞飲在37°C下對(duì)內(nèi)化NS5AChimigen蛋白的能力，利用巨胞飲標(biāo)記物FITC葡聚糖加以評(píng)估[Hewletteta.(1994)J.CellBiology124:689-703〗。^)尋未成熟DC與ChimigenTM蛋白和FITC葡聚糖一起孵育15分鐘和60分鐘后，觀察到嚢泡樣結(jié)構(gòu)，其包含蛋白和FITC葡聚糖，表明在37。C所述Chimigen蛋白可通過(guò)巨胞飲吸收。還應(yīng)注意到，F(xiàn)ITC葡聚糖可結(jié)合于巨噬細(xì)胞甘露糖受體(CD206)，因此通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用，可以出現(xiàn)一些包含ChimigenTM蛋白和FITC葡聚糖的內(nèi)涵體受體介導(dǎo)的胞吞作用在ChimigenTM蛋白吸收中的作通過(guò)脈沖-追蹤實(shí)-驗(yàn)而研究。未成熟DC用熒光標(biāo)記的ChimigenTM蛋白于4°C下進(jìn)4亍沖擊、洗滌并在37。C下孵育15分鐘。將該細(xì)月包固定、滲透并用抗體標(biāo)記，以檢測(cè)ChimigenTM蛋白以及轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。所述轉(zhuǎn)鐵蛋白受體通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用而吸收，隨后從早期內(nèi)涵體循環(huán)回質(zhì)月莫。在4。C下，所述NS5AChimigenTM蛋白結(jié)合于該細(xì)月包表面，而轉(zhuǎn)鐵蛋白受體則主要存在于細(xì)胞內(nèi)部。變至37。C后，觀察到形成內(nèi)涵體，其中一部分內(nèi)涵體包含Chimigen蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體兩者。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)(4。C),大量細(xì)胞內(nèi)已存在的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體很可能對(duì)多個(gè)包含轉(zhuǎn)鐵蛋白的內(nèi)涵體(與ChimigenTM蛋白并非共定位)負(fù)責(zé)。利用共聚焦顯微鏡，通過(guò)與抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的抗體共同標(biāo)記，還可評(píng)估NS5AChimigenTM蛋白通過(guò)DC的吸收及其與轉(zhuǎn)鐵蛋白的共定位。轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，并已知通過(guò)受體介導(dǎo)的過(guò)程而內(nèi)化。該分析表明兩種分子的共定位，從而表明NS5AChimigenTM蛋白通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用而被吸收。在嘗試增加Chimigen蛋白與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體信號(hào)之間的重疊時(shí)，將細(xì)胞與輒合于人轉(zhuǎn)4失蛋白的AlexaFluor488—起孵育，以<更間接檢測(cè)僅最近內(nèi)吞的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體而非細(xì)胞內(nèi)全部轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。在4。C下，將未成熟DC用ChimigenTM蛋白與軛合于轉(zhuǎn)鐵蛋白的AlexaFluor488混合物一起進(jìn)4亍表面標(biāo)i己。幾乎未，見(jiàn)察到AlexaFluor488轉(zhuǎn)鐵蛋白陽(yáng)性?xún)?nèi)涵體，但當(dāng)存在時(shí)，則其包含NS5AChimigen蛋白，表明Chimigen蛋白確實(shí)是通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用而吸收的。這些結(jié)果表明Chimigen3蛋白主要通過(guò)受體介導(dǎo)的月包吞作用而4皮內(nèi)4匕。研究了NS5AChimigenTM蛋白通過(guò)未成熟DC的力口工過(guò)程。因?yàn)橐呙?特別是)被設(shè)計(jì)成治療慢性感染，需要通過(guò)MHCI類(lèi)受體CD8+細(xì)胞的活化以及抗原交叉呈遞。已經(jīng)提出了兩種不同的力口工途徑用于抗原交叉呈遞〖Liz6eetA(2005)TrendsImmunol.26(3):141-149]。第一種途徑涉及通過(guò)吞噬吸收的抗原的加工，而第二種途徑則涉及由其他胞吞作用途徑(如受體介導(dǎo)的胞吞作用)吸收的抗原的加工。在第二種途徑中，蛋白吸收入早期內(nèi)涵體并耙向于晚期內(nèi)涵體，其中它們通過(guò)《且織蛋白酶降解并裝載到MHCI類(lèi)受體上。因此，進(jìn)行實(shí)-驗(yàn)，以確定NS5AChimigenTM蛋白能否在晚期內(nèi)涵體中;f全測(cè)到，并確定其是否與這樣的結(jié)構(gòu)中的MHCI類(lèi)受體共定位。對(duì)已經(jīng)在4。C下用NS5AChimigenTM蛋白沖擊并隨后在37°C下追蹤的細(xì)胞進(jìn)行共標(biāo)記，以檢測(cè)Chimigen蛋白和LAMP1(晚期內(nèi)涵體/溶酶體的標(biāo)記物)兩者。第4小時(shí)和24小時(shí)，觀察到NS5AChimigen蛋白與LAMP1之間的重疊，表明該NS5AChimigen蛋白處于晚期內(nèi)涵體/溶酶體內(nèi)。在另一個(gè)共標(biāo)記實(shí)一驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)所述NS5AChimigenTM蛋白存在于與MHCI類(lèi)分子相似的結(jié)構(gòu)中，從而表明該ChimigenTM蛋白通過(guò)MHCI類(lèi)分子加工而用于呈遞。相信蛋白酶體與抗原破壞有關(guān)，用于通過(guò)吞噬溶酶體途徑的交叉呈遞。用細(xì)胞可透過(guò)的蛋白酶體抑制劑乳胞素(以5(ig/mL的濃度)處理細(xì)胞。最近已表明乳胞素在抑制溶酶體蛋白酶CathepsinA方面不3口之前^H人為的凈爭(zhēng)異[Kozlowskietal.(2001)TumourBioL22(4):211-215]。如果NS5AChimigenTM蛋白的加工如在吞噬溶酶體途徑中一樣涉及到蛋白酶體，則將能預(yù)料到不完全降解的肽在胞質(zhì)溶月交中部分累積，且這樣的累積預(yù)期不再晚期內(nèi)涵體中加工[上文，Liz6eetal.(2005)]。4小時(shí)追if宗后，用5pg/mL的乳月包素處理的J5永沖細(xì)胞(脈沖和追蹤)表現(xiàn)為較大數(shù)量含有NS5AChimigenTM蛋白的內(nèi)涵體。此夕卜，與那些乂寸照細(xì)月包的內(nèi)涵體相比，所述內(nèi)涵體似乎包含更多的該蛋白。用抗鼠IgGl的單克隆抗體未檢測(cè)到細(xì)胞質(zhì)NS5AChimigenTM蛋白的增加。這些凄t據(jù)再次表明受體介導(dǎo)的胞吞作用而非吞噬溶酶體途徑是Chimigen3蛋白內(nèi)化于DC內(nèi)的機(jī)制。通過(guò)DC的NS5AChimigenTM蛋白呈遞導(dǎo)致CD8+和CD4+T細(xì)胞活化和增殖兩者對(duì)NS5AChimigenTM蛋白的功能性免疫應(yīng)答通過(guò)離體APA加以評(píng)估。該分析可用來(lái)在用抗原負(fù)載的DC刺激T細(xì)胞后測(cè)定功能性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的多個(gè)參數(shù)。該分析包括首先通過(guò)加入IL-4和GM-CSF由PBMC起源的單核細(xì)胞生成未成熟DC。隨后將該未成熟DC與疫苗候選物、載體緩沖液(陰性對(duì)照)或;皮傷風(fēng)類(lèi)毒素(TT)(陽(yáng)性對(duì)照)一起孵育。隨后用細(xì)胞因子處理所述DC以促進(jìn)成熟、洗滌并與自體幼稚T細(xì)胞一起孵育。為了測(cè)定細(xì)胞因子的生成、細(xì)胞毒性顆粒組分的存在、以及NS5A特異性T細(xì)胞的生成，再刺激所述T細(xì)胞兩次以允許ChimigenTM蛋白特異性T細(xì)胞的擴(kuò)增。活化通過(guò)測(cè)定早期T細(xì)月包活化標(biāo)記物CD69而評(píng)估，而增殖則通過(guò)追蹤C(jī)FSE標(biāo)記的T細(xì)胞熒光而測(cè)定。與抗原負(fù)載的DC—起培養(yǎng)4天和7天后，評(píng)估CD69表達(dá)和CFSE熒光兩者。初步分析已經(jīng)表明培養(yǎng)液中DC和T細(xì)胞的濃度是確定T細(xì)月包免疫應(yīng)答的重要參數(shù)。因此，設(shè)計(jì)APA，以便評(píng)估6種不同的T細(xì)胞:DC的比率。采用兩組DC濃度，高濃度為5x10"DC/孔，而^[氐濃度為1x1()4DC/孔。培養(yǎng)48小時(shí)后，將所述未成熟DC與緩沖液(陰性對(duì)照)、NS5AChimigenTM蛋白(5AC,5昭/mL)的兩種不同制備物、TT(陽(yáng)性對(duì)照)或PBS—起孵育。隨后將該DC培養(yǎng)8小時(shí)，并通過(guò)加入polyIC、IL-1、IL-6、TNF畫(huà)oc、IFN-cc和IFN-y而催熟。過(guò)夜(16小時(shí))培養(yǎng)后，洗滌來(lái)自PBS對(duì)照組的DC并才企測(cè)多種成熟DC標(biāo)記物的表達(dá)。高濃度和低濃度DC均表達(dá)高7jC平HLA-ABC(MHCI類(lèi))、HLA-DR(MHCII類(lèi))、CD86、CD80、CD83(圖17)。通常，所述高濃度DC表達(dá)輕微較高水平的DC成熟標(biāo)記物。通過(guò)陰性選擇步驟分離自體T細(xì)胞，并利用CFSE標(biāo)記來(lái)確定細(xì)胞分裂。向96孔板中100pl/孔的DC中，加入100pl/孔的T細(xì)胞，每孔濃度為20x104、5x104或2x104。對(duì)于高DC濃度孑L(5x104DC/孑1>),每孑L中T細(xì)胞/DC的比例組合為20xio4:5xi04(4:!)，5x104:5x104(1:1)，以及2x104:5x104(04:i)。對(duì)于低DC濃度孔(1x104DC"L),每孔中T細(xì)胞/DC的比例組合為20xK)4:lxlo4(20:l),5xl()4:lxio4(5:l)，以及2xio4:ix104(2:1)。在無(wú)4壬<可外源'1~生細(xì)月包因子的情況下，將T細(xì)月包力口入到DC中。作為對(duì)照，培養(yǎng)第3天時(shí)，將PHA(1|ig/mL)力口入到T細(xì)胞中，其中所述T纟田月包力卩載到PBS處理的DC組上。培養(yǎng)4天后，收獲一半細(xì)^^培養(yǎng)物(100pi)，用于活化和增殖分析。將100pi新鮮AIM￥@/2.5%匹配的血清加入到剩余的一半細(xì)胞培養(yǎng)物中，再培養(yǎng)細(xì)胞3天。培養(yǎng)4天后T細(xì)月包上CD69的表達(dá)示于圖18A-C中。圖18A示出了乂十于不同T細(xì)月包:DC的比率的表達(dá)CD69的CD3+細(xì)胞的百分比。無(wú)論T細(xì)胞:DC的比率如何，大多數(shù)PHA處理的細(xì)胞均表達(dá)CD69。與高DC濃度一起培養(yǎng)時(shí)，也在T細(xì)胞中^r測(cè)到了CD69;^f旦與低DC濃度一起培養(yǎng)時(shí)，則在T細(xì)胞中幾乎未纟企測(cè)到CD69。相比于緩沖液對(duì)照，抗原刺激的T細(xì)胞表達(dá)較高水平的CD69。第4天時(shí)，NS5AChimigen蛋白負(fù)載的DCi秀導(dǎo)的表達(dá)CD69的CD8+T細(xì)月包百分比高于CD4+T細(xì)月包(圖18B和C)。相比于回憶抗原TT,CD8+T細(xì)胞中表達(dá)CD69的百分比等于或大于Chimigen3蛋白的百分比。這表明NS5AChimigen蛋白是幼^維CD8+T細(xì)月包的強(qiáng)活化劑。培養(yǎng)4天后，經(jīng)過(guò)至少一次分裂的細(xì)力包(CFSE'。)的百分比示于圖19A-C中。用PHA處理24小時(shí)的T細(xì)胞3交早開(kāi)始分裂(圖19A)。用TT負(fù)載的DC處理的CD8+和CD4+T細(xì)胞在培養(yǎng)4天后出現(xiàn)可檢測(cè)性增殖，但僅在高DC濃度比較明顯(圖19B和C)。第4天時(shí)，在Chimigen蛋白處理組幾乎檢測(cè)不到T細(xì)胞增殖。因此，第4天時(shí)，幼稚T細(xì)胞通過(guò)NS5AChimigenTM蛋白負(fù)載的DC活化(如通過(guò)CD69表達(dá)而證明的)，但這些T細(xì)胞尚未分裂或其分裂尚不能通過(guò)所采用的分析檢測(cè)到。培養(yǎng)7天后，收獲細(xì)胞用于活化和增殖的分析。培養(yǎng)7天后，T細(xì)月包上CD69的表達(dá)示于圖20A-C中。圖20A示出了對(duì)于不同T細(xì)胞:DC的比率的表達(dá)CD69的CD3+細(xì)胞的百分比。用PHA處理的T細(xì)胞中CD69表達(dá)出現(xiàn)了顯著增加。然而，表達(dá)CD69的細(xì)胞百分比相比第4天時(shí)觀察到的值已經(jīng)有所下降，與預(yù)期的PHA反應(yīng)一致CD69快速誘導(dǎo)其后隨時(shí)間出現(xiàn)表達(dá)降低。對(duì)于Chimigen3蛋白刺激的T細(xì)胞，在與高濃度DC—起培養(yǎng)的T細(xì)月包中，以高于5%的水平才企測(cè)到CD69,但在與低濃度DC—起培養(yǎng)的T細(xì)胞中，則幾乎檢測(cè)不到。因此，4氐DC濃度(1x1(T"DC/孔)不足以用于抗原特異性T細(xì)胞活化。相比于緩沖液對(duì)照，對(duì)于5xl0、細(xì)胞和2x104T細(xì)胞:5x104DC的比率，較高凄t量的Chimigen3蛋白刺激的T細(xì)胞表達(dá)CD69。第7天時(shí)，回憶TT應(yīng)答的CD69表達(dá)有所降低。第7天時(shí)，與d4T細(xì)胞相反，NS5AChimigenTM蛋白負(fù)載的DC誘導(dǎo)的表達(dá)CD69的CD4+T細(xì)胞百分比高于CD8+T細(xì)胞(圖20B和C)。相比于緩沖液或回憶抗原TT,對(duì)于高DC濃度(5xioV孔)，CD8+和CD4+T細(xì)月包中表達(dá)CD69的百分比等于或大于表達(dá)Chimigen蛋白百分比。因此，NS5AChimigen首先活化幼稚CD8+T纟田胞，隨后活化CD4+T細(xì)胞。培養(yǎng)7天后，經(jīng)過(guò)至少一次分裂的細(xì)胞(CFSE1。)的百分比示于圖21A-C中。結(jié)果表明基本上每個(gè)用PHA處理的T細(xì)胞均已經(jīng)分裂(圖21A)。在培養(yǎng)7天后，用Chimigen3蛋白或TT負(fù)栽的DC導(dǎo)致顯著的T細(xì)月包增殖，^旦這在高DC濃度時(shí)最明顯。由于抗原負(fù)載，僅高DC濃度孔誘導(dǎo)顯著的CD8+T細(xì)胞增殖(圖21B)。然而，用抗原負(fù)載的4氐濃度DC足以^秀導(dǎo)CD4+T細(xì)胞增殖(圖21C)。特別地，在高DC濃度下，Chimigen3蛋白負(fù)載的DC誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖至可與TT負(fù)載的DC相比的7K平。T細(xì)胞增殖的另一個(gè)衡量標(biāo)準(zhǔn)(測(cè)量)是T細(xì)胞群中T母細(xì)胞的相對(duì)比例。T母細(xì)胞定義為那些具有較高FSC(前光散射，forwardlightscatter)和SSC(側(cè)光散射)的細(xì)胞，而且淋巴細(xì)胞門(mén)中的休止淋巴細(xì)胞定義為通過(guò)流式細(xì)胞儀所評(píng)估的。培養(yǎng)物中T母細(xì)胞的百分比示于圖22中。這些結(jié)果與如圖21A中示出的經(jīng)歷分裂的細(xì)胞百分比非常好地相關(guān)聯(lián)。因此，評(píng)估細(xì)胞群中T母細(xì)胞可作為CFSE分析的替代方案?？傮w來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明NS5AChimigen蛋白對(duì)于誘導(dǎo)初始T細(xì)胞應(yīng)答非常有效，如通過(guò)T細(xì)胞活化和增殖所測(cè)定的。通過(guò)DC的NS5AChimigenTM蛋白呈遞引起產(chǎn)生IFN-y和TNF-oc的CD8+和CD4+T細(xì)月包的生成通過(guò)三次刺激離體APA來(lái)評(píng)估針對(duì)NS5AChimigenTM疫苗的功能性免疫應(yīng)答。將4x1()4dC/孔(高濃度)或2x1()4dC/孔(低濃度)的未成熟dc用對(duì)照載體緩沖液、pbs、tt(陽(yáng)性對(duì)照)、或NS5AChimigenTM蛋白負(fù)載。隨后催熟DC并評(píng)估其表型。DC的成熟利用MHCI類(lèi)、MHCII類(lèi)、CD86、CD80和CD83的高水平表達(dá)而確i人(圖23)。將自體T細(xì)胞與成熟的抗原負(fù)載DC以20x104T細(xì)月包/孔4x1()4dC/孔或者4x104T細(xì)胞/孔2x1040(:/孔的比例一起孵育。刺激該T細(xì)力包三次，并在第三次刺激后6小時(shí)通過(guò)一全測(cè)Thl細(xì)月包因子IFN-y和TNF-oc的細(xì)胞內(nèi)水平來(lái)評(píng)估T細(xì)月包功能。此外，還評(píng)估了T母細(xì)胞的含量。圖24示出了高和低DC濃度下的T母細(xì)胞百分比。相比于5:1的比率，2:1的T細(xì)力包:DC的比率導(dǎo)致較〗氐的背景(纟爰沖液)T細(xì)月包增殖反應(yīng)。由于4吏用2:1的比率，在緩沖'液與抗原負(fù)載的T細(xì)月包增殖反應(yīng)之間存在4交顯著的差異。以5:1和2:1的T細(xì)月包:DC的比率來(lái)測(cè)定IFN-y應(yīng)答。ft據(jù)以該組每一個(gè)孔的應(yīng)答以及三個(gè)孔的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示(圖25)。T細(xì)胞IFN-y應(yīng)答的比較在5:1和2:1的T細(xì)胞:DC的比率之間顯示出顯著差異。在較高DC濃度的情況下，相比于對(duì)照緩沖液，并無(wú)Chimigen3誘導(dǎo)的IFN-y應(yīng)答的證據(jù)。然而，在較低DC濃度的情況下，與^f照l(shuí)l沖'液負(fù)載的DC—起i條養(yǎng)的T細(xì)月包才及少生成IFN-y，而與Chimigen3蛋白負(fù)載的DC—起培養(yǎng)的T細(xì)胞則有4交高百分比生成IFN-y。相比于2.5(ag/mL的NS5AChimigenTM蛋白，在已用由5pg/mLNS5AChimigenTM蛋白負(fù)載的DC刺激的T細(xì)胞中，存在較多產(chǎn)生IFN-y的細(xì)胞。還測(cè)定了CD8+和CD4+細(xì)胞群中表達(dá)IFN-y的T細(xì)月包百分比(圖26牙口27)。由于Chimigen3-DC的刺;敫，低DC濃度組表現(xiàn)出高百分比的表達(dá)IFN-y的CD8+T細(xì)胞。相比于TT負(fù)載的DC，對(duì)于用Chimigen3蛋白負(fù)載的DC刺激的T細(xì)胞，表達(dá)IFN-y的CD8+T細(xì)胞的百分比較高(圖26)。類(lèi)似地，相比于用對(duì)照緩沖液刺激，一旦用NS5AChimigenTM蛋白刺激，還存在高百分比表達(dá)IFN-y的CD4+T纟田月包(圖27)。相比于用TT負(fù)載的DC刺激，對(duì)于用Chimigen3蛋白負(fù)載的DC刺〗敫的T細(xì)J包表達(dá)IFN-K的CD4+T細(xì)胞的百分比是可比較的(圖27)。這些結(jié)果表明NS5AChimigenTM蛋白在CD8+和CD4+T細(xì)胞群兩者中誘導(dǎo)顯著的IFN-y應(yīng)答并暗示該分子在MHCI類(lèi)和II類(lèi)通3各兩者中均由所述DC力口工。圖28示出了用抗原負(fù)載的成熟DC刺激6小時(shí)而得到的產(chǎn)生TNF-a的T細(xì)胞百分比。這些結(jié)果類(lèi)似于IFN-y的結(jié)果。盡管由于通過(guò)高DC濃度(5:1的比率)的T細(xì)胞抗原刺激導(dǎo)致產(chǎn)生TNF-a的細(xì)胞百分比增加，但用低DC濃度(2:1的比率)刺激存在更大的差異。相比于2.5|ug/mL蛋白，當(dāng)用5|ig/mL的Chimigen3蛋白負(fù)載的DC刺i^敫時(shí)，4交高百分比的T細(xì)胞產(chǎn)生TNF-a。相比于TT,對(duì)于NS5AChimigenTM蛋白，TNF-a應(yīng)答較高。利用TT負(fù)載的DC的刺激導(dǎo)致表達(dá)TNF-a的CD4+T細(xì)胞的百分比高于CD8+T細(xì)胞(圖29)。然而，NS5AChimigenTM蛋白負(fù)載的DC在CD8+和CD4+T細(xì)胞群兩者中誘導(dǎo)類(lèi)似程度的TNF-a生成(圖29)。通過(guò)DC的NS5AChimigenTM抗原呈遞在第三次刺激后6小時(shí)導(dǎo)致表達(dá)grB和pfn+的CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的生成還通過(guò)離體抗原呈遞分析評(píng)估了T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性顆粒蛋白grB和pfn的能力。將未成熟DC用對(duì)照鄉(xiāng)爰沖液、TT(陽(yáng)性對(duì)照)或不同濃度的NS5AChimigenTM蛋白負(fù)載，并且一旦成熟即與自體T細(xì)胞一起孵育。grB表達(dá)可以以不同方式進(jìn)行4全測(cè)，包括酶分析和利用特異性抗體[Ewenetal.(2003)J.Immunol.Meth.276:89-101;Spaeny畫(huà)Dekkingetal(1998)J.Immunol.160:3610;Hamannetal.(1997)J.Exp.Med.186:1407]。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)染色，分別利用抗grB和抗pfnmAb來(lái)4企測(cè)GrB和pfn表達(dá)。圖30示出了用抗原負(fù)載的成熟DC刺激三次后，表達(dá)grB和pfn的CD8+T細(xì)月包的百分比。相比于無(wú)抗原對(duì)照，NS5AChimigenTM蛋白負(fù)載的DC誘導(dǎo)CD8+T細(xì)月包中g(shù)rB和pfn表達(dá)增力口。這些結(jié)果表明NS5AChimigen蛋白誘導(dǎo)grB和pfn在CD8+T細(xì)胞中表達(dá)，且這暗示該蛋白在I類(lèi)通路中由DC加工，以有效的呈遞至T細(xì)月包，這引起其A人幼稚CD8+T細(xì)胞分化為細(xì)力包毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。通過(guò)成熟DC的NS5AChimigen抗原呈遞導(dǎo)致CD8+和CD4+T細(xì)胞的產(chǎn)生和持續(xù)活化在APA中，用抗原負(fù)載的DC刺激T細(xì)月包三次。第三次刺潮:后培養(yǎng)6天，收獲T細(xì)胞并通過(guò)FFC研究母細(xì)胞的百分比，其作為增殖和活化標(biāo)記物CD69表達(dá)的一個(gè)量度。此外，作為一種估計(jì)乂人培養(yǎng)物中回收的T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量的方法(means),還才艮據(jù)FSC和SSC流式細(xì)胞4義分析確定落在'淋巴細(xì)胞門(mén)(R1門(mén))內(nèi)的一皮圈定細(xì)胞的數(shù)量。相比于緩沖液對(duì)照，在從TT和ChimigenTM蛋白刺激的細(xì)胞中回收T細(xì)J包方面存在顯著差異(圖31)。相比于Chimigen3蛋白刺激的細(xì)胞，TT刺激的細(xì)胞獲得較高的T細(xì)胞回收率。然而，所述TT應(yīng)答是一種回憶應(yīng)答，因此預(yù)計(jì)與TT發(fā)生特異性反應(yīng)的初始T細(xì)胞群將高于特異于NS5A的初始幼稚T細(xì)胞群的該值。特別地，沖艮據(jù)對(duì)母細(xì)胞群的評(píng)估，實(shí)際上NS5AChimigen3蛋白培養(yǎng)物中的母細(xì)胞/增殖細(xì)胞的百分比高于所述TT培養(yǎng)物。在》爰沖液對(duì)照培養(yǎng)物中幾乎不存在母細(xì)胞/增殖細(xì)月包。如通過(guò)CD69表達(dá)而評(píng)估的，活化的CD8+和CD4+T細(xì)胞群的百分比示于圖32中。相比于緩沖液對(duì)照，用Chimigen3蛋白負(fù)載的DC刺激的T細(xì)胞中存在較高百分比的表達(dá)CD69的CD4+和CD8+T細(xì)月包兩者。這些結(jié)果表明用Chimigen3蛋白刺激引起顯著的T細(xì)胞活化和增殖，即在第三次刺激后6天(T細(xì)胞培養(yǎng)的第20天)依然很明顯。因此，該Chimigen3蛋白在CD8+和CD4+T細(xì)胞的活化和擴(kuò)增中是非常有效的。通過(guò)成熟DC的NS5AChimigenTM蛋白呈遞引起NS5A特異性CD8+T細(xì)力包的產(chǎn)生為了評(píng)估免疫應(yīng)答對(duì)NS5AChimigen蛋白的抗原特異性，對(duì)HLA-A2情形中特異于免疫顯性NS5A表位的T細(xì)胞百分比進(jìn)4亍定量。該百分比通過(guò)用軛合于PE的NS5A肽/HLA-A2五聚體標(biāo)i己T細(xì)胞而確定。在APA中，幼稚T細(xì)胞通過(guò)用不同濃度的NS5AChimigenTM蛋白負(fù)載的DC刺激三次，并與無(wú)^t原(-爰沖液)負(fù)載的各個(gè)對(duì)照DC進(jìn)行比較。第三次刺激后6天，收獲T細(xì)胞，并通過(guò)四聚體標(biāo)記和FFC牙企測(cè)NS5A特異性T細(xì)胞或EBV特異性丁細(xì)胞(對(duì)照)。陰性四聚體標(biāo)記(陰性對(duì)照)和EBV四聚體標(biāo)記(陽(yáng)性對(duì)照)的CD8+和CD4+T細(xì)胞的百分比示于圖33中。在CD8+T細(xì)胞群中，三個(gè)才企測(cè)孔之一是EBV四聚體標(biāo)記(陽(yáng)性四聚體)P日性。由于評(píng)估的T細(xì)胞來(lái)自緩沖液對(duì)照處理孑L，將預(yù)料到EBV四聚體標(biāo)記的T細(xì)胞的數(shù)目會(huì)相對(duì)低。APA后，標(biāo)記有NS5A五聚體的CD8+T細(xì)胞的百分比示于圖34中。用NS5AChimigenTM蛋白負(fù)載DC導(dǎo)致在兩個(gè)高DC濃度孔和三個(gè)4氐DC濃度3L中，具有該特異'性的CD8+T細(xì)胞的顯著擴(kuò)增比較明顯。因此，該NS5AChimigen3蛋白能夠i秀導(dǎo)生成對(duì)這種NS5A免疫顯性表位特異的T細(xì)力包，并且可能存在對(duì)其他NS5A表位具有特異性的T細(xì)月包。實(shí)施例3.NS3Chimigen3蛋白的結(jié)果NS3ChimigenTM蛋白已被提純并鑒定Sf9細(xì)胞中表達(dá)的NS3ChimigenTM蛋白通過(guò)Ni-NTA親和層析以及隨后的陰離子交換層坤斤而純化。純化的樣品利用10%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行分析，電泳后，將凝力交轉(zhuǎn)移至硝基纖維素用于蛋白質(zhì)印跡。該SDS-PAGE凝膠用頁(yè)藍(lán)染色，并用特異于NS3Chimigen蛋白不同組分的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。純化的蛋白顯示為約110KDa和120KDa的雙耳關(guān)體。兩種組分(species)均通過(guò)4元N末端(4元6xHis)、TBD(4元Fc)禾口NS3(多克隆#元NS3)的4元體進(jìn)行片企測(cè)，結(jié)果表明該純化的蛋白是完整的。利用Pro-QREmerald300糖蛋白凝膠以及BlotStain試劑盒，對(duì)純化的NS3ChimigenTM蛋白的糖基化進(jìn)行定量估計(jì)。將純化的蛋白在8%SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳后，利用制造商的方案對(duì)凝膠進(jìn)行染色并在紫外光照下掃描。由于純化的蛋白是雙聯(lián)體，推測(cè)分子量差異是由于糖基化的不同水平。NS3ChimigenTM蛋白結(jié)合于未成熟DC對(duì)NS3ChimigenTM蛋白結(jié)合于未成熟DC的能力加以檢測(cè)。在不同濃度NS3ChimigenTM蛋白存在或缺失的情況下，將該細(xì)胞在4。C下將育1小時(shí)。通過(guò)生物素化的抗小鼠IgGlmAb和SA-PE-Cy5#僉測(cè)結(jié)合的蛋白。結(jié)合該Chimigen3蛋白的細(xì)另包百分比(陽(yáng)性細(xì)胞%)以及結(jié)合蛋白的相對(duì)量(MFI)通過(guò)FFC來(lái)確定。在NS3ChimigenTM蛋白為4-55叱/mL的情況下，大多數(shù)DC結(jié)合均為陽(yáng)性，且結(jié)合蛋白的量存在劑量依賴(lài)性遞增(圖35和36)。相比于55pg/mL,22ng/mL時(shí)蛋白的結(jié)合并未表現(xiàn)出更大，表明與未成熟DC的結(jié)合是可飽和的。觀察到的高結(jié)合MFI表明NS3ChimigenTM蛋白與未成熟DC的結(jié)合非常有歲文且處于高水平。4。C下的結(jié)合是可々包和的，表明該過(guò)程是受體介導(dǎo)的。該結(jié)合也非常迅速，因?yàn)榻Y(jié)合的蛋白在4°C下孵育5分鐘后即可檢測(cè)到，其中結(jié)合MFI約為將育60min后觀察到的值的一半(數(shù)據(jù)未示出)。NS3ChimigenTM蛋白結(jié)合于未成熟DC上的特異性受體由于存在Fc片段，推測(cè)NS3Chimigen蛋白通過(guò)其TBD區(qū)而結(jié)合于未成熟DC上的CD32(FcyRII)。此外，由于其甘露糖糖基化，推測(cè)NS3ChimigenTM蛋白結(jié)合于C型凝集素受體如CD206(MMR)。為了確定所述蛋白的結(jié)合特異性，在阻斷性抗CD32和/或抗CD206mAb存在的情況下，將未成熟DC與NS3Chimigen蛋白一起孵育。將未成熟DC與緩沖液對(duì)照或5pg/mL的同種型對(duì)照mAb、抗CD32mAb、抗CD206mAb或者抗CD32mAb和抗CD206mAb兩者在4。C下一起孵育1小時(shí)，隨后與NS3ChimigenTM蛋白在4。C下一起孵育1小時(shí)。結(jié)合的NS3Chimigen蛋白用生物素化的抗6xHismAb隨后是SA-PE-Cy5進(jìn)行斗全測(cè)。相比于緩沖液對(duì)照，同種型對(duì)照mAb(鼠IgGl和IgG2b)并未抑制結(jié)合。然而，相比于1￡沖液對(duì)照，抗CD32和抗CD206分別抑制結(jié)合約70%和60%(圖36)。加入兩種阻斷性mAb則進(jìn)一步抑制NS3ChimigenTM蛋白結(jié)合，產(chǎn)生90%抑制(圖36)。因此，這些凄欠據(jù)表明CD32和CD206兩者在NS3ChimigenTM蛋白結(jié)合于未成熟DC過(guò)程中的作用。通過(guò)共聚焦顯微鏡使NS3ChimigenTM蛋白的結(jié)合可視化。將未成熟DC與NS3ChimigenTM蛋白在4。C下一起孵育。相比于僅用緩沖液對(duì)照，該細(xì)胞表面上的強(qiáng)烈標(biāo)記表明ChimigenTM蛋白結(jié)合于細(xì)胞表面，可能結(jié)合于受體。為了研究?jī)?nèi)化作用，將未成熟DC與NS3ChimigenTM蛋白在37。C下一起孵育1小時(shí)。所述細(xì)胞幾乎未表現(xiàn)出任何表面標(biāo)記(質(zhì)膜4侖廓)，^旦反而表現(xiàn)為點(diǎn)狀標(biāo)記才莫式，常位于核附近，表明Chimigen蛋白4皮內(nèi)。通過(guò)DC的NS3ChimigenTM蛋白呈遞導(dǎo)致CD8+和CD4+T細(xì)胞兩者活化和增殖對(duì)NS3ChimigenTM蛋白的功能性免疫應(yīng)答通過(guò)離體抗原呈遞分析(APA)力口以評(píng)估。該分析可用來(lái)在用抗原負(fù)載的DC刺激T細(xì)胞后測(cè)定功能性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的多個(gè)參數(shù)。該分析包括首先通過(guò)加入IL-4和GM-CSF從PBMC起源的單核細(xì)胞生成未成熟DC。隨后將該未成熟DC與疫苗候選物、載體緩沖液(陰性對(duì)照)或TT(陽(yáng)性對(duì)照)一起賻育。隨后用細(xì)月包因子處理DC以促進(jìn)成熟、洗滌并與自體幼稚T細(xì)胞一起孵育。為了測(cè)定細(xì)胞因子的生成、細(xì)胞毒性顆粒組分的存在、以及NS3特異性T細(xì)力包的生成，再刺激所述T細(xì)胞兩次，以允許ChimigenTM蛋白特異性T細(xì)胞的擴(kuò)增。然而，預(yù)計(jì)單次刺激也能啟動(dòng)從幼稚T細(xì)胞群的擴(kuò)增?；罨ㄟ^(guò)測(cè)定早期T細(xì)胞活化標(biāo)記物CD69而評(píng)估，而增殖則通過(guò)追蹤C(jī)FSE標(biāo)記的T細(xì)胞熒光而測(cè)定。與抗原負(fù)載的DC—起培養(yǎng)4天和7天后，評(píng)估CD69表達(dá)和CFSE熒光兩者。免疫應(yīng)答的重要參數(shù)。因此，設(shè)計(jì)APA使得評(píng)估6種不同的T細(xì)胞:DC濃度。釆用兩組DC濃度，高濃度為5x1()4DC/孔，而低濃度為1x10"DC/孔。培養(yǎng)48小時(shí)后，將未成熟DC與緩沖液(陰性對(duì)照)、NS3ChimigenTM蛋白(3C,5嗎/mL)、TT(陽(yáng)性對(duì)照)、或PBS—起孵育。隨后將該DC培養(yǎng)8小時(shí)，并通過(guò)加入polyIC、IL-1、IL-6、TNF-cc、IFN-a和IFN國(guó)y而催熟。過(guò)夜(16小時(shí))培養(yǎng)后，洗滌來(lái)自PBS對(duì)照組的DC并^r測(cè)多種成熟DC標(biāo)記物的表達(dá)。高濃度和^f氐濃度DC均表達(dá)高水平HLA-ABC(MHCI類(lèi))、HLA-DR(MHCII類(lèi))、CD86、CD80和CD83。通過(guò)陰性選擇步驟來(lái)分離自體T細(xì)胞，并利用CFSE標(biāo)記用于確定纟田月包分裂。向96孑14反中100(al/孑L的DC中，力口入100jil/孑L的T細(xì)胞，每孔濃度為20xl04、5xl()4或2xi04。對(duì)于高DC濃度孔(5x104DC/孔)，每孑L中T纟田胞/DC的比例組合為20xlo4:5x104(4:1)，5x104:5x104(1:1)，以及2x104:5x104(04:i)。對(duì)于<氐DC濃度孑L(5x1()4DC/孔)，每孔中T細(xì)月包/DC的比例組合為20xi04:Ix104(20:l)，5x104:1x104(5:1〉，以及2xi04:x104(2:1)。在無(wú)任何外源性細(xì)胞因子的情況下，將T細(xì)胞加入到DC中。作為對(duì)照，培養(yǎng)第3天時(shí)，將PHA(1jag/mL)加入到T細(xì)胞中，其中該T細(xì)月包S皮加載到PBS處理的DC組上。i咅養(yǎng)4天后，收獲一半細(xì)胞^咅養(yǎng)物(100(il)，用于活化和增歹直分沖斤。將100|il的新鮮AIMV㊣/2.5。/。匹配的血清加入到剩余的一半細(xì)月包i咅養(yǎng)物中，并對(duì)細(xì)月包再i咅養(yǎng)3天。以5x104T細(xì)月包/孑L:5x104DC/孔的比率(1:1)培養(yǎng)4天和7天后，T細(xì)胞上CD69的表達(dá)示于圖37中。無(wú)i侖T細(xì)胞:DC的比率如何，大多數(shù)PHA處理的細(xì)i)包均表達(dá)CD69。與高DC濃度一起培養(yǎng)的T細(xì)胞中沖企測(cè)到了CD69;但與低DC濃度一起培養(yǎng)的T細(xì)胞中幾乎未檢測(cè)到CD69(凄t據(jù)未示出)。相比于緩沖液對(duì)照，抗原刺激的T細(xì)胞表達(dá)較高水平的CD69。第4天時(shí)，NS3ChimigenTM蛋白負(fù)載的DC誘導(dǎo)的表達(dá)CD69的CD8+T細(xì)胞百分比高于CD4+T細(xì)胞。培養(yǎng)4天后，經(jīng)過(guò)至少一次分裂的細(xì)胞(CFSE1。)百分比示于圖38中。結(jié)果表明用PHA處理24小時(shí)的T細(xì)月包專(zhuān)交早開(kāi)始分裂。用TT負(fù)載的DC處理的CD8+和CD4+T細(xì)胞在培養(yǎng)4天后出現(xiàn)可檢測(cè)性增殖，但這僅在高DC濃度時(shí)比較明顯(凄t據(jù)未示出)。第4天時(shí)，在疫苗候選物處理組中幾乎檢測(cè)不到T細(xì)胞增殖。因此，第4天時(shí)，幼稚T細(xì)胞通過(guò)NS3Chimigen蛋白負(fù)載的DC活化(如通過(guò)CD69表達(dá)而證明的)，但這些T細(xì)胞尚未分裂。培養(yǎng)7天后，收獲細(xì)胞用于活化和增殖分析。培養(yǎng)7天后，T細(xì)胞上CD69的表達(dá)示于圖37中。對(duì)于Chimigen3蛋白刺激的T細(xì)胞，在與高DC濃度一起培養(yǎng)的T細(xì)胞中，以高于5%的水平檢測(cè)到CD69,但在與低DC濃度一起培養(yǎng)的T細(xì)胞中，則幾乎沖全測(cè)不到cd69(數(shù)據(jù)未示出)。因此，低dc濃度(1x1()4dC/孔)不足以用于抗原特異性T細(xì)胞的活化。第7天時(shí)，回憶TT應(yīng)答的CD69表達(dá)有所降低。第7天時(shí)，與d4T細(xì)胞相反，NS3ChimigenTM蛋白負(fù)載的DC誘導(dǎo)的表達(dá)CD69的CD4+T細(xì)胞百分比高于CD8+T纟田月包。相比于回憶抗原TT，第7天時(shí)CD8+和CD4+T細(xì)胞中表達(dá)CD69的百分比等于或大于表達(dá)Chimigen3蛋白的百分比。因此，Chimigen3蛋白首先活化幼稚CD8+T細(xì)胞，隨后活化CD4+T細(xì)胞。培養(yǎng)7天后，經(jīng)過(guò)至少一次分裂的細(xì)胞(CFSE'。)的百分比示于圖38中。用Chimigen3蛋白或TT負(fù)載的DC引起顯著的CD8+和CD4+T細(xì)胞增殖，并且這在高DC濃度時(shí)最明顯(結(jié)果未示出)。通過(guò)DC的NS3ChimigenTM蛋白呈遞導(dǎo)致產(chǎn)生IFN-y和TNF腳a的CD8+和CD4+T細(xì)月包的生成通過(guò)三次刺激離體APA,評(píng)估針對(duì)NS3ChimigenTM蛋白的功能性免疫應(yīng)答。將4x1()4DC/孔(高濃度)或2x1()4dC/孔(低濃度)的未成熟DC用對(duì)照載體緩沖液、PBS、TT(陽(yáng)性對(duì)照)、或NS3ChimigenTM蛋白負(fù)載。隨后催熟DC并評(píng)估其表型。如杲其表達(dá)高7jc平的MHCI類(lèi)、MHCII類(lèi)、CD86、CD80和CD83,則該DC可^H介為成熟。^l奪自體T細(xì)月包與成熟的4元原負(fù)載的DC以20x104T細(xì)胞/孔4x1()4DC/孔或者4x104T細(xì)月包/孔2x1()4dC/孔的比例一起孵育。刺激該T細(xì)胞三次，并在第三次刺激后6小時(shí)通過(guò);險(xiǎn)測(cè)Thl細(xì)胞因子IFN-y和TNF-oc的細(xì)胞內(nèi)水平來(lái)評(píng)估T細(xì)胞功能。此外，還評(píng)估了T母細(xì)胞的程度。T細(xì)胞群中T母細(xì)胞的百分比測(cè)量可用作T細(xì)胞增殖程度的量度。T母細(xì)胞定義為那些具有較高FSC和SSC散射的細(xì)胞，而且淋巴細(xì)胞門(mén)中的Y水止淋巴細(xì)胞定義為通過(guò)流式細(xì)胞^f義所評(píng)估的。培養(yǎng)14天后，培養(yǎng)物中T母細(xì)胞的百分比示于圖39中。NS3ChimigenTM蛋白在談導(dǎo)T細(xì)胞增殖(母細(xì)胞產(chǎn)生)方面非常有效，其中相比于5:1的比率，2:1的T細(xì)胞:DC比率導(dǎo)致較低的背景(緩沖液)T細(xì)月包增殖反應(yīng)。因此，在T細(xì)胞:DC比率為2:1時(shí)，相比于緩沖液，NS3ChimigenTM蛋白刺激的T細(xì)胞增殖存在顯著差異。以5:1和2:1的T細(xì)月包:DC比率來(lái)測(cè)定IFN-y應(yīng)答。數(shù)據(jù)以該組每一個(gè)孔的應(yīng)答以及三個(gè)孔的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示(圖40)。T細(xì)胞IFN-y應(yīng)答的比4交在5:1和2:1的T細(xì)月包:DC比率之間顯示出顯著差異。在較高DC濃度的情況下，相比于對(duì)照緩沖液，幾乎不存在疫苗候選物誘導(dǎo)的IFN-y應(yīng)答的證據(jù)。然而，在較低DC濃度的情況下，與對(duì)照緩沖液負(fù)載的DC—起培養(yǎng)的T細(xì)胞極少生成IFN-丫，而與疫苗4矣選物負(fù)載的DC—起培養(yǎng)的T細(xì)月包則有4交高百分比生成IFN-y。相比于5Tg/mL的NS3Chimigen蛋白，在已用由2.5昭/mLNS3Chimigen蛋白負(fù)載的DC刺激的T細(xì)胞中，產(chǎn)生IFN-y的細(xì)胞并未減少。對(duì)CD8+和CD4+細(xì)胞群中表達(dá)IFN-y的T細(xì)胞百分比進(jìn)行了定量，并示于圖41中。相比于TT負(fù)載的DC，在用2.5嗎/mL疫苗候選物負(fù)載的DC剌激的T細(xì)胞中，表達(dá)IFN-y的CD8+T細(xì)胞百分比是可比較的。同樣，相比于用對(duì)照緩沖液刺激，一旦用NS3Chimigen蛋白刺;敫，還出SL高百分比表達(dá)IFN-y的CD4+T細(xì)月包。相比于用TT負(fù)載的DC刺激，用疫苗4美選物負(fù)載的DC刺激的T細(xì)胞中表達(dá)IFN-y的CD4+T細(xì)月包的百分比是可比較的。這些結(jié)果表明NS3Chimigen蛋白在CD8+和CD4+T細(xì)胞群兩者中誘導(dǎo)顯著的IFN-y應(yīng)答并暗示該分子在MHCI類(lèi)和II類(lèi)通if各中均由DC力口工。圖42示出了用抗原負(fù)載的成熟DC刺激6小時(shí)而得到的產(chǎn)生TNF-ct的T細(xì)月包百分比。這些結(jié)果類(lèi)似于IFN-y的結(jié)果。相比于TT，NS3ChimigenTM蛋白的TNF-ot應(yīng)答大約相同或較高。利用TT或NS3Chimigen蛋白負(fù)載的DC的刺激導(dǎo)致表達(dá)TNF-ct的CD4+T細(xì)月包的百分比高于CD8+T細(xì)月包。通過(guò)DC的NS3ChimigenTM蛋白呈遞導(dǎo)致表達(dá)grB和pfn的CD8+T細(xì)胞的生成還通過(guò)離體APA評(píng)估T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性顆粒蛋白grB和pfn的能力。將未成熟DC用對(duì)照緩沖液、TT(陽(yáng)性對(duì)照)或不同濃度的NS3ChimigenTM蛋白負(fù)載，并且一旦成熟即與自體T細(xì)胞一起孵育。通過(guò)細(xì)月包內(nèi)染色，分別利用3元grB和4元pfnmAb沖企測(cè)GrB和pfn表達(dá)。圖43示出了用抗原負(fù)載的成熟DC刺激三次后，表達(dá)grB和pfn的CD8+T細(xì)胞百分比。相比于緩沖液對(duì)照處理的DC,NS3ChimigenTM蛋白負(fù)載的DC誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞中g(shù)rB和pfn表達(dá)增加。這些結(jié)果表明NS3ChimigenTM疫苗誘導(dǎo)grB和pfn在CD8+T細(xì)胞中表達(dá)。該發(fā)現(xiàn)表明該疫苗候選物在MHCI類(lèi)通路中由DC加工，用于有效的呈遞至T細(xì)胞，以引起其從幼稚CD8+T細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。通過(guò)成熟DC的NS3ChimigenTM蛋白呈遞導(dǎo)致CD8+和CD4+T細(xì)胞的產(chǎn)生和持續(xù)活化在APA中，用4元原負(fù)載的DC刺;敫T細(xì)月包三次。第三次刺;敫后培養(yǎng)6天，收獲T細(xì)胞并通過(guò)流式細(xì)胞儀研究母細(xì)胞的百分比，其作為增殖和活化標(biāo)記物CD69表達(dá)的量度。此外，作為一種估計(jì)從培養(yǎng)物中回收的T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量的方法，還才艮據(jù)FSC和SSCFFC分析確定落在淋巴細(xì)胞門(mén)(Rl門(mén))內(nèi)的被圈定細(xì)胞的數(shù)量。如通過(guò)CD69表達(dá)而評(píng)估的，活化的CD8+和CD4+T細(xì)胞的百分比示于圖44中。相比于緩沖液對(duì)照，在用Chimigen3蛋白負(fù)載DC刺;敫的T細(xì)月包中，表達(dá)CD69的CD4+和CD8+T細(xì)月包的百分比均有所增加。相比于緩沖液對(duì)照，在從TT和ChimigenTM蛋白刺激的細(xì)胞中回收T細(xì)月包方面存在顯著差異(圖45)。相比疫苗候選物刺激的細(xì)胞，TT刺激的細(xì)胞獲得較高的T細(xì)胞回收率。然而，TT應(yīng)答是一種回憶應(yīng)答，因此預(yù)計(jì)與TT發(fā)生特異性反應(yīng)的初始T細(xì)胞群將高于特異于NS3的初始幼稚T細(xì)胞群的該值。特別地，根據(jù)對(duì)培養(yǎng)物中存在的T母細(xì)胞的評(píng)估，含有NS3Chimigen3蛋白的培養(yǎng)物中的母細(xì)胞/增殖細(xì)胞的百分比高于所述TT培養(yǎng)物。在緩沖液對(duì)照的培養(yǎng)物中，幾乎不存在母細(xì)胞/增殖細(xì)月包。因此，用Chimigen3蛋白刺激引起顯著的T細(xì)胞活化和增殖，即在第三次刺激后6天(T細(xì)胞培養(yǎng)的第20天)依然很明顯。因此，NS3Chimigen，蛋白在CD8+和CD4+T細(xì)月包兩者的活化和擴(kuò)增中非常有步文。通過(guò)成熟DC的NS3ChimigenTM蛋白呈遞引起NS3特異性CD8+T細(xì)"包的產(chǎn)生為了評(píng)估免疫應(yīng)答對(duì)NS3Chimigen蛋白的特異性，對(duì)HLA-A2情形中特異于兩種免疫顯性NS3表位的T纟田月包百分比進(jìn)行定量。該百分比通過(guò)用軛合于PE的NS3肽/HLA-A2五聚體標(biāo)記T細(xì)胞而確定。在APA中，幼稚T細(xì)胞通過(guò)用不同濃度NS3ChimigenTM蛋白負(fù)載的DC刺激三次，并與無(wú)抗原(緩沖液)負(fù)載的各個(gè)對(duì)照DC進(jìn)行比較。第三次刺激后6天，收獲T細(xì)胞，NS3特異性T細(xì)月包或EBV特異性T細(xì)月包(對(duì)照)通過(guò)四聚體標(biāo)i己來(lái)4企測(cè)并利用流式細(xì)胞儀分析。CD8+T細(xì)胞群中，所迷緩沖液對(duì)照組的三個(gè)孔中有一個(gè)是EBV四聚體標(biāo)記(陽(yáng)性四聚體)陽(yáng)性，且不存在對(duì)陰性四聚體標(biāo)記為陽(yáng)性的孔(數(shù)據(jù)未示出)。由于被評(píng)估的T細(xì)胞來(lái)自緩沖液對(duì)照處理孔，預(yù)計(jì)EBV四聚體標(biāo)記的T細(xì)胞數(shù)量將相對(duì)較^f氐。APA后，標(biāo)記有NS3五聚體的CD8+T細(xì)胞的百分比示于圖46中。用NS3ChimigenTM蛋白負(fù)載DC導(dǎo)致生成對(duì)NS3表位具有特異性的T細(xì)胞。在6個(gè)^f氐DC濃度孔中，其中4個(gè)孔內(nèi)具有該特異性的CD8+T細(xì)胞的顯著擴(kuò)增比較明顯。因此，該NS3ChimigenTM蛋白能夠誘導(dǎo)生成對(duì)NS3免疫顯性表位特異的T細(xì)胞，且可能存在對(duì)其他NS3表位具有特異性的T細(xì)胞。實(shí)施例4.NS3-NS4B-NS5A多抗原Chimigen3蛋白的結(jié)果HCVNS3-NS4B-NS5AChimigenTM蛋白的表達(dá)SDS-PAGE后，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析HCV多抗原Chimigen蛋白在Sf9細(xì)月包內(nèi)表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程。通過(guò)考慮HCV多抗原Chimigen蛋白表達(dá)和降解兩方面因素，確定蛋白表達(dá)的最佳條件為注射后MOI1.5達(dá)36個(gè)小時(shí)。從Sf9細(xì)胞沉淀的清亮裂解物中純化HCVNS3-NS4B-NS5AChimigen蛋白Ni-NTA親和層析作為純化的第一步，將HCVNS3-NS4B-NS5AChimigenTM蛋白捕獲于Ni-NTASuperflow3柱上。結(jié)合于Ni-NTASuperflow34i上的蛋白通過(guò)SDS-PAGE并利用蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行分析。該蛋白質(zhì)印跡表現(xiàn)出該ChimigenTM蛋白的優(yōu)勢(shì)條帶(顯性條帶)，然而硝基纖維素膜銀染色則示出另外的非免疫反應(yīng)性蛋白條帶。121HiTRapO-XL離子交換層析通過(guò)Ni-NTASuperflow4主捕獲的蛋白進(jìn)一步通過(guò)HiTrapQ-XLlmL柱層析加以分離。將蛋白在無(wú)逆流餾分中洗脫，且所述餾分在0.4至0.5MNaCl之間的鹽濃度下進(jìn)行洗脫。與無(wú)逆流餾分中的蛋白相比，結(jié)合于柱上的HCVNS3-NS4B-NS5A多抗原ChimigenTM蛋白含有較少污染物。通過(guò)銀染色，觀察到至少6條非免疫反應(yīng)性蛋白條帶。Superdex200層析裂解物中的蛋白通過(guò)Superdex200柱分餾。該HCVNS3-NS4B-NS5A多抗原ChimigenTM蛋白在第一個(gè)峰內(nèi)洗脫。對(duì)該餾分進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡和銀染色。該蛋白顯示為銀染色上的一條優(yōu)勢(shì)條帶；然而，還可見(jiàn)多個(gè)污染物條帶。蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果表明純化過(guò)程中蛋白聚集。Pherwl-650CToyopearl上的疏水作用層析將含有所述HCVNS3-NS4B-NS5A多抗原Chimigen蛋白的細(xì)胞裂解物力口才羊于Phenyl-650CToyopearl⑧上并在未吸收和吸收的餾分兩者中洗脫。對(duì)該餾分進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡和4艮染色。在兩種餾分中，在蛋白質(zhì)印跡和硝基纖維素膜的4艮染色上，HCV多抗原Chimigen蛋白可視為一條優(yōu)勢(shì)條帶。實(shí)施例5.HCV核心Chimigen3蛋白的結(jié)果HCV核心ChimigenTM蛋白已被提純并鑒定HCV核心Chimigen3蛋白通過(guò)在變性條件下的Ni鰲合層析(Ni-NTAsuperflow)以及隨后的陰離子交換層析(CM瓊脂糖)進(jìn)行純化。純化的蛋白在12。/。SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行分析，主要條帶為融合蛋白(約55KDa)，在28kDa觀察到的次要條帶很可能是降解產(chǎn)物。在12%SDS-PAGE凝膠上分離后，將純化的蛋白電轉(zhuǎn)至硝基纖維素膜上。蛋白質(zhì)印跡通過(guò)抗6xHis-HRP輒合抗體、抗Fc特異性HRP扼合的抗體以及抗HCV核心抗體并以抗Fab特異性HRP扼合的抗體作為第二抗體而實(shí)施。結(jié)合的抗體通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。所述抗體與印跡的結(jié)合表明純化的HCV核心TBD具有完整的N末端、核心和TBD部分。此夕卜，所有3種抗體均才全測(cè)到4交j氐分子量條帶，表明其為來(lái)自全長(zhǎng)HCV核心ChimigenTM分子的蛋白，且可能是降解的結(jié)果。HCV核心ChimigenTM蛋白結(jié)合于未成熟DC對(duì)HCV核心ChimigenTM疫苗結(jié)合于未成熟DC的能力加以檢測(cè)。在不同濃度HCV核心ChimigenTM蛋白存在或缺失的情況下，將該細(xì)胞在4。C下孵育1小時(shí)，并通過(guò)FFC或通過(guò)共聚焦顯孩i鏡才企測(cè)結(jié)合。對(duì)于FFC分析，通過(guò)生物素化的抗小鼠IgGlmAb和SA-PE-Cy5才企測(cè)結(jié)合的HCV核心ChimigenTM蛋白。結(jié)合HCV核心ChimigenTM蛋白的細(xì)胞百分比(陽(yáng)性細(xì)胞％)以及結(jié)合的蛋白的相對(duì)量(MFI)通過(guò)FFC確定。在HCV核心ChimigenTM蛋白為5-40昭/mL的情況下，所述細(xì)胞幾乎100%結(jié)合均為陽(yáng)性，且結(jié)合的HCV核心ChimigenTM蛋白的量存在劑量依賴(lài)性遞增(圖47)。觀察到的高結(jié)合MFI表明HCV核心Chimigen蛋白與未成熟DC的結(jié)合非常有效且處于高水平。還4吏用共聚焦顯樣"竟研究了HCV核心Chimigen蛋白的結(jié)合。所述結(jié)合通過(guò)FITC軛合的羊抗鼠IgG進(jìn)4于^r測(cè)。藍(lán)色焚光染料DAPI用來(lái)成像核。共聚焦圖像和相應(yīng)的光圖像表明所述蛋白在4。C下脈沖1小時(shí)后結(jié)合于未成熟DC膜。HCV核心ChimigenTM蛋白結(jié)合于未成熟DC上的特異性受體由于存在Fc片段，推測(cè)所述HCV核心Chimigen蛋白通過(guò)其TBD區(qū)能結(jié)合于未成熟DC上的CD32(FcyRH)。此外，由于其甘露糖糖基化，推測(cè)HCV核心ChimigenTM蛋白還結(jié)合于C型凝集素受體如CD206(MMR)。為了確定HCV核心Chimigen蛋白的結(jié)合特異性，在對(duì)CD32或CD206特異性的阻斷mAb存在的情況下，將未成熟DC與HCV核心ChimigenTM蛋白一起孵育。所述結(jié)合還在竟?fàn)幮耘潴w、用于Fey受體的鼠IgGFc片段以及用于C型凝集素受體的甘露糖化BSA(mBSA)存在的情況下進(jìn)行4全測(cè)。將未成熟DC與PBS(緩沖液對(duì)照)、鼠IgGFc片段(500|ig/mL)、CD32mAb(200pg/mL)、甘露糖化BSA(500jug/mL)、或抗CD206(200昭/mL)在4。C下一起孵育1小時(shí)，隨后與HCV核心Chimigen蛋白(30叱/mL)在4°C下一起孵育1小時(shí)。結(jié)合的蛋白用生物素化的抗小鼠IgG1mAb或生物素化的抗HCV核心mAb隨后是SA-PE-Cy5進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)合的HCV核心Chimigen蛋白的相對(duì)量(MFI)通過(guò)FFC而確定。來(lái)自所述結(jié)合和抑制研究的結(jié)果表明HCV核心Chimigen蛋白結(jié)合于Fey受體如CD32和C型凝集素受體如CD206(圖48)。通過(guò)DC的HCV核心Chimigen蛋白呈遞導(dǎo)致CD8+和CD4+t細(xì)胞中的細(xì)月包內(nèi)IFN-y水平升高對(duì)HCV核心ChimigenTM蛋白的功能性免疫應(yīng)答通過(guò)離體抗原呈遞分析加以評(píng)估。將未成熟DC用PBS(緩沖液對(duì)照)、破傷風(fēng)類(lèi)毒素(陽(yáng)性對(duì)照)、或不同濃度的HCV核心Chimigen蛋白負(fù)載。一旦DC成熟，將其與自體T細(xì)胞一起孵育。T細(xì)胞功能通過(guò)牙全測(cè)Thl細(xì)胞因子IFN-y的細(xì)月包內(nèi)水平而評(píng)估。還通過(guò)FFC確定該細(xì)胞的CD3和CD8表型。圖49A和B分別示出了用抗原負(fù)載的成熟DC第三次刺;敫后12小時(shí)表達(dá)IFN-y的CD8+和CD4+T細(xì)j包的百分比。石皮傷風(fēng)類(lèi)毒素^皮用作有效抗原呈遞的陽(yáng)性對(duì)照。相比于無(wú)抗原對(duì)照，HCV核心Chimigen蛋白負(fù)載的DC誘導(dǎo)IFN-y在CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加。用HCV核心ChimigenTM蛋白負(fù)載的DC刺激后，CD4+T細(xì)月包群中也存在IFN-y表達(dá)的增加。這些結(jié)果表明HCV核心Chimigen蛋白誘導(dǎo)IFN-y在CD8+和CD4+T細(xì)胞群中的應(yīng)答，并暗示在MHCI類(lèi)和MHCII類(lèi)通路中該分子均由DC力口工。通過(guò)成熟DC的HCV核心Chimigen蛋白呈遞引起HCV核心凈爭(zhēng)異'l"生CD8+T細(xì)力包的產(chǎn)生為了評(píng)估免疫應(yīng)答對(duì)HCV核心的特異性，對(duì)HLA-B7情形中特異于免疫顯性HCV核心表位的T細(xì)胞百分比進(jìn)行定量。這是通過(guò)用輒合于PE的HCV核心肽/HLA-B7四聚體標(biāo)記T細(xì)月包而實(shí)現(xiàn)的。此外，將T細(xì)月包用CD4和CD8特異性mAb標(biāo)記。HCV核心幼稚T細(xì)胞通過(guò)用由不同濃度HCV核心Chimigen蛋白負(fù)載的DC刺激三次，并與無(wú)抗原、石皮傷風(fēng)類(lèi)毒素或TBD負(fù)載的各個(gè)對(duì)照DC進(jìn)行比較。第三次刺激后5天，收獲T細(xì)胞，并通過(guò)二維FFC檢測(cè)HCV核心特異性T細(xì)胞。圖50中，所述二維FFC點(diǎn)圖表明與用HCV核心ChimigenTM蛋白負(fù)載的DC—起孵育的T細(xì)胞表現(xiàn)出在核心四聚體陽(yáng)性T細(xì)胞中^又有少量增加。美國(guó)臨時(shí)申i青第60/726,701號(hào)所:坡露的內(nèi)容(包括全部附錄)均結(jié)合于此作為參考。在上述說(shuō)明書(shū)中提及的所有出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)以及專(zhuān)利以引用方式結(jié)合于此作為參考。對(duì)于本領(lǐng)域的4支術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)的各種更改和變化都是顯而易見(jiàn)的。雖然結(jié)合特定的優(yōu)選具體實(shí)施方式描述了本發(fā)明，^f旦是應(yīng)該明了，本發(fā)明的保護(hù)范圍不應(yīng)當(dāng)不'除當(dāng)?shù)鼐窒抻谶@些特定的具體實(shí)施方式。實(shí)際上，所述用于實(shí)施本發(fā)明的方式的各種更改，對(duì)于本領(lǐng)i或的才支術(shù)人員來(lái)i兌是顯而易見(jiàn)的，而這些都在本發(fā)明的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種用于引起免疫應(yīng)答的嵌合抗原，所述嵌合抗原包括免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中，所述免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域包括丙型肝炎(HCV)抗原，而所述靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體片段。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合抗原，其中，所述抗體片段是異源抗體片段。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的嵌合抗原，其中，所述嵌合抗原引起體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答、或體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答兩者。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原，其中，所述嵌合抗原引起Thl免疫應(yīng)答、Th2免疫應(yīng)答、或Thl免疫應(yīng)答和Th2免疫應(yīng)答兩者。5.才艮據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原，其中，所述免疫應(yīng)答是體內(nèi)免疫應(yīng)答。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原，其中，所述免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)i或包4臺(tái)一個(gè)以上的蛋白。7.才艮據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原，其中，所述免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域包括一種或多種蛋白的一個(gè)或多個(gè)免疫原部分，所述蛋白選自由HCV核心(1-191)蛋白、HCV核心(1-177)蛋白、HCVp7蛋白、HCVEl蛋白、HCVE2蛋白、HCVE1畫(huà)E2蛋白、HCVNS3蛋白、HCVNS4B蛋白、以及HCVNS5A蛋白纟且成的纟且。8.才艮據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原，其中，所述耙結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合于抗原呈遞細(xì)胞(APC)。9.才艮據(jù)權(quán)利要求2-8中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原，其中，所述抗體片段是Fc片段。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原，進(jìn)一步包括6xHis標(biāo)簽、蛋白酶切割位點(diǎn)、以及用于連接所述免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)J或和所述草巴結(jié)合結(jié)構(gòu)i或的連接子中的一種或多種。11.才艮據(jù)權(quán)利要求10所述的嵌合抗原，其中，所述連接子選自由亮氨酸拉鏈、結(jié)合于抗生物素蛋白的生物素、以及共價(jià)肽4定組成的組。12.才艮據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原，其中，所述嵌合抗原#皮#唐基化。13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原，其中，所述嵌合抗原被甘露糖糖基化。14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原，其中，所述抗體片段包括免疫J求蛋白重鏈片段。15.根據(jù)權(quán)利要求14所迷的嵌合抗原，其中，所述免疫球蛋白重鏈片段包括鉸鏈區(qū)。16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的嵌合抗原，其中，所述免疫球蛋白重鏈片段包括一個(gè)抗體片4爻的全部或部分，所述抗體片段選自由CH1、鉸鏈區(qū)、Ch2結(jié)枸域、以及Ch3結(jié)構(gòu)域組成的組。17.—種將抗原遞送至抗原呈遞細(xì)胞的方法，所述方法包括將才艮據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原給予所述抗原呈遞細(xì)胞。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述抗原呈遞細(xì)胞是樹(shù)突細(xì)月包。19.一種活4b抗原呈遞細(xì)力包的方法，所述方法包括使所述纟元原呈遞細(xì)胞與根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原接觸。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述接觸發(fā)生在體外。21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述接觸發(fā)生在體內(nèi)。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述接觸發(fā)生在人體內(nèi)。23.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的方法，其中，所述方法包括將包括根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合抗原的組合物給予受治療者，并且其中所述抗原呈遞細(xì)月包存在于受治療者體內(nèi)。24.根據(jù)權(quán)利要求20-23中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述接觸引起體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答、或體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答兩者。25.沖艮據(jù)一又利要求24所述的方法，其中，所述細(xì)胞免疫應(yīng)答是Thl應(yīng)答、Th2應(yīng)答、以及CTL應(yīng)答中的一種或多種。26.才艮據(jù)片又利要求23-25中4壬一項(xiàng)所述的方法，其中，所述受治療者患有或可能患有免疫-可治療的疾病。27.才艮據(jù)4又利要求26所述的方法，其中，所述免疫-可治療的疾病是急性感染。28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中，所述免疫-可治療的疾病是慢性感染。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述慢性感染是慢性丙型肝炎病毒感染。30.根據(jù)權(quán)利要求26-29中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述免疫-可治療的疾病是丙型肝炎病毒感染，并且所述免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域包括一種或多種蛋白的一個(gè)或多個(gè)免疫原部分，所述蛋白選自由HCV核心(1-191)蛋白、HCV核心(1-177)蛋白、HCVEl蛋白、HCVE2蛋白、HCVEl-E2蛋白、HCVP7蛋白、HCVNS3蛋白、HCVNS4B蛋白、以及HCVNS5A蛋白組成的組。31.根據(jù)權(quán)利要求23-30中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述受治療者經(jīng)接種以4氏抗病毒感染。32.根據(jù)權(quán)利要求23-31中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述受治療者被預(yù)防性接種以抵抗病毒感染。33.才艮據(jù)權(quán)利要求31或32所述的方法，其中，所述受治療者^(guò)皮治療性接種以抵抗現(xiàn)存病毒感染。34.—種生成嵌合抗原的方法，包4舌(a)提供微生物或細(xì)胞，所述微生物或細(xì)胞包括編碼嵌合抗原的多核苷酸；以及(b)在所述嵌合抗原被表達(dá)的條件下，培養(yǎng)所述微生物或纟田月包。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述微生物或細(xì)胞是真核孩i生物或細(xì)月包。36.才艮據(jù)沖又利要求34或35所述的方法，其中，所述細(xì)月包是酵母細(xì)月包、才直物細(xì)月包或昆蟲(chóng)細(xì)月包。37.根據(jù)權(quán)利要求34-36中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述嵌合抗原-故翻譯后々務(wù)飾以包招4唐基4匕。38.根據(jù)權(quán)利要求34-37中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述嵌合抗原被翁3譯后修飾以包括甘露糖糖基化。39.—種編碼嵌合抗原的多核苷酸，所述多核香酸包括編碼免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域的第一多核普酸部分和編碼耙結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第二多核苷酸部分，其中，所述靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體片辜殳。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的多核苷酸，其中，所述抗體片段是異源抗體片l殳。41.才艮據(jù)4又利要求39-40中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其中，所述多核苦酸包括選自由在SEQIDNO:39以及41-51中列出的核普酸序列組成的組中的核普酸序列。42.根據(jù)權(quán)利要求39-41中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其中，所述多核普酸編碼嵌合抗原，所述嵌合抗原與選自由在SEQIDNO:40以及52-62中列出的氨基酸序列組成的組中的完整的氨基酸序列至少90°/"目同。43.才艮據(jù)4又利要求39-42中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸在嚴(yán)才各的條件下選l奪性地與具有選自由在SEQIDNO:39以及41-51中列出的核苷酸序列組成的組中的核苷酸序列的多核苷酸雜交。44.一種載體，包括根據(jù)權(quán)利要求39-43中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的載體，其中，所述多核苷酸可操作性地連接于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(TRE)。46.—種樣t生物或細(xì)胞，包括根據(jù)權(quán)利要求39-43中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。47.—種制品，包括根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原以及用于將所述嵌合抗原給予需要其的受治療者的說(shuō)明書(shū)。48.—種藥物組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原以及藥用貞武形劑。49.一種生成嵌合抗原的方法，包括(a)提供纟斂生物或細(xì)胞，所述纟效生物或細(xì)力包包括編碼耙結(jié)合結(jié)構(gòu)域-連接子分子的多核苷酸，其中，所述靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域-連接子分子包括結(jié)合于連接子分子的靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域。(b)在表達(dá)所述靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域-連接子分子的條件下，培養(yǎng)所述樣t生物或細(xì)力包；以及(c)在允許使所述連接子與所述免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域結(jié)合的條件下，接觸，所述結(jié)合得到嵌合抗原全文摘要本發(fā)明披露了嵌合抗原，其包括丙型肝炎病毒(HCV)抗原以及用于引起抗所述抗原的免疫應(yīng)答的免疫球蛋白的Fc片段。通過(guò)將免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域(來(lái)自HCV核心、包膜或非結(jié)構(gòu)蛋白片段的HCV抗原)和靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Fc片段)呈遞給宿主免疫系統(tǒng)，來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答。通過(guò)靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域，抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)化并加工該嵌合抗原用于抗原呈遞，從而引起體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答兩者。文檔編號(hào)A61K47/48GK101300355SQ200680037974公開(kāi)日2008年11月5日申請(qǐng)日期2006年10月13日優(yōu)先權(quán)日2005年10月13日發(fā)明者安托萬(wàn)·努杰姆,布魯斯·莫蒂卡,拉詹·喬治,洛恩·蒂勒爾,達(dá)坎·旺,馬友倫申請(qǐng)人:威瑞克斯醫(yī)藥公司