專利名稱：輔助生殖技術(shù)中的代謝組學測定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過分析液體培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物來測定與液體培養(yǎng)基交換代謝產(chǎn)物的細胞 的狀態(tài)，及其應用。
背景技術(shù)：
代謝組學
隨著人類基因組序列測定的完成，對于復雜的生物體系，很顯然，僅遺傳信息是不能提 供其生物化學和細胞功能的綜合特性的。因此，很多生物學研究的焦點正在轉(zhuǎn)向蛋白質(zhì)組學 和代謝組學，在廣義上，蛋白質(zhì)組學和代謝組學定義為對生理環(huán)境中的蛋白質(zhì)和小分子的系
統(tǒng)分析，其中，生理環(huán)境是指，例如生物樣品、細胞、組織，或生物體；小分子是指，例如 多肽、激素和神經(jīng)傳遞素(及其代謝產(chǎn)物)。由于蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物比基因更為數(shù)眾多、互異、 和脆弱，對其發(fā)現(xiàn)、鑒定、和定量的現(xiàn)有手段不能滿足研究和臨床的需要。
蛋白質(zhì)組學的一個重要方面是對發(fā)生了遺傳突變或表達水平改變的蛋白質(zhì)的鑒定。蛋白 質(zhì)和代謝產(chǎn)物的水平隨時間或在群體中的差別可以與疾病的狀況、藥物群、或代謝的改變相 關(guān)聯(lián)。已確定的分子種可以用作疾病或該疾病癥狀的生物學標志物(生物標志物)，由此可建 立新的診斷、預后和疾病治療的方法，或針對病人作更適合的修改。為了找到上述的生物學標志物，精確測得不同類型樣品之間有關(guān)蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物水平的差別是有幫助的，此過程 稱為差示表型分析。
體外受精(IVF)治療法
包括IVF的輔助生殖技術(shù)(ART)領(lǐng)域，無論是用于人或動物，現(xiàn)在都還是不甚精湛的科 學或技術(shù)。評估精子(精子細胞)、卵子(卵細胞)和胚胎的發(fā)育能力主要是在顯微鏡下通過 觀察其可見的外觀來完成的。在很多情況下，這些細胞的可見外觀與其發(fā)育能力并不是很好 地相關(guān)。有關(guān)這些細胞中發(fā)生了什么，沒有其它的信息可提供給ART專家來指導該過程。整 個程序是抱著一種期望來實行的選擇能發(fā)育的配子，然后這些能發(fā)育的配子會產(chǎn)生能發(fā)育 的胚胎，這些胚胎又會成功地植入到子宮內(nèi)，接著產(chǎn)生健康的后代。盡管通過提取一個細胞 對胚胎進行遺傳檢驗，有可能至少測得一些發(fā)育能力的因子，但這種"侵入式"的步驟會對 胚胎產(chǎn)生有害的影響。目前，沒有一種現(xiàn)有技術(shù)能使胚胎學家和其它ART專家去有效地評估 ART程序中這些細胞的發(fā)育能力。
IVF已被證明是最適用于不孕配偶的選擇，而且正逐漸被公認為優(yōu)于其它治療方案的"最 優(yōu)良"的程序。
IVF過程可分為6個主要的程序步驟1)用生育激素藥物刺激雌性生物以產(chǎn)生大量同期 的卵子群；2)收取卵子；3)收集并處理雄性配子，隨后是卵子的受精；4)在生長培養(yǎng)基中 培養(yǎng)所產(chǎn)生的受精卵/胚胎；5)胚胎的選擇；以及最后是6)胚胎的移植。 一般，不把包括 胚胎植入和妊娠的關(guān)鍵過程考慮作為IVF過程的一部分，因為它們不受程序本身的控制。在 當前的IVF實施中，主要根據(jù)主觀的形態(tài)學的標準和發(fā)育的模式(在胚胎的情況下)，設想選 擇用于程序中的卵子和胚胎是能發(fā)育的或是健康的；沒有生物學的量度標準可有助于這種非 常嚴格的選擇過程。未使用的胚胎通常將其深低溫保藏。
現(xiàn)在，ART服務業(yè)使其還可能為下述的患者提供治療的方案這些患者自覺不是不能生 育的，但他們希望推回或控制其生物鐘，以增強和/或保持他們的生殖功能(或生育力)(生 育力的保持)。另一方面，ART服務業(yè)應用于正常的、能生育的人群已產(chǎn)生了新的保持生育力 的治療范式。對于控制生育推遲的需要可以進一步得到理解，例如，如果一個患者正在進化學治療，在治療中，其生殖功能可能會受到干擾。
目前還沒有實用的生物學標準或分析方法使卵子、精子、或胚胎的選擇能夠保證IVF程 序的有效和安全。因此，在IVF程序的前端，由于缺乏可靠地評估卵子能力的分析方法學， 胚胎學家們采用了主觀的和非標準的胚胎發(fā)育標準和形態(tài)學作為胚胎質(zhì)量的標志，并由此推 斷起始的卵子質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
在兩門科學的學科匯合的基礎上，確立了一個新穎的技術(shù)平臺(l)活組織分光鏡檢査， 這是不同形式的分光鏡檢查分析在人類生物學方面的應用，它可用于確定、定量以及證實蛋 白組學和分子診斷的生物標志物；(2)代謝組學，它是對生物樣品中(在體液和在固體的組 織中)的多個小分子生物標志物之間的動態(tài)相互作用進行檢査和集合的一門科學，用以了解 復雜的生物過程和功能。代謝組學可以用于研究在組織和/或細胞型式中代謝量變曲線的改 變。
在此使用術(shù)語"基于活組織分光鏡檢査的代謝組學(BSM)"，以描述該技術(shù)平臺。這里使 用BSM平臺來分析樣品的蛋白質(zhì)組和分子生物標志物的組成，然后它又利用信息學將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn) 換為獨特的"代謝組的量變曲線"。每條量變曲線又轉(zhuǎn)變?yōu)楠毺氐?指印"或"識別特征"， 該"指印"或"識別特征"確定了目的樣品的代謝狀態(tài)，從而也就確定了樣品來源的患者的 狀態(tài)。"代謝組的量變曲線"可以用來系統(tǒng)地區(qū)分通常很微小的差別，該差別可區(qū)別正常的生 理狀態(tài)與疾病的開始或發(fā)展，或個體對藥物治療的反應。
因此，BSM可以廣泛地應用于人類和動物的健康中而對本發(fā)明的范圍沒有限制。這種BSM 技術(shù)平臺的廣泛應用包括但不限于(1)非侵入式的分子診斷和預后的評估，例如在老年癡 呆癥(AD)、胎-母健康監(jiān)測、體外受精方法學中的評估；以及(2)利用代謝組的量變曲線鑒 定有效和安全的替代標志物,用于制定發(fā)現(xiàn)和開發(fā)藥物的基于藥物診斷法的策略。上述這些應 用利用了在BSM技術(shù)中重點應用的基于生物標志物的代謝組量變曲線。
各種不同形式的活組織分光鏡檢查分析都表明對數(shù)種組織、器官和體液的非侵入式體內(nèi)監(jiān)測是有用的。固體的組織、單個細胞和生物體液的體外分析也采用這種方法來完成。
活組織分光鏡檢査有很多優(yōu)點，包括簡單、精確和專一性、使用容易、分析快速、低成 本的檢測設備、可同時測定單個樣品中的多種被分析物，以及通過即時檢驗或遠程分析進行 連續(xù)的實時監(jiān)測的優(yōu)點?，F(xiàn)在，利用BSM平臺，人們可以用小型的設備，對少至20ri的液體 樣品，在少于l分鐘的時間內(nèi)進行高速、復雜的代謝組分析。
代謝組學是日趨了解基因與蛋白的相互作用后的很有價值的延伸?，F(xiàn)在，醫(yī)學和I4學界 已認識到基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學只是體內(nèi)平衡的一小部分。基因組代表可能是什 么，蛋白質(zhì)組則明確表達了什么，代謝組表示細胞、組織、器官或個體有關(guān)健康和疾病方面 的實時功能狀態(tài)。表達的蛋白質(zhì)和修飾后蛋白質(zhì)的這些所有"下游后果"的累積影響表現(xiàn)在 一個反映細胞的功能狀態(tài)的小分子庫中。描繪這種分子庫(代謝組)的量變曲線提供了細胞 的健康、疾病、年齡以及藥物和在其周圍的賓主共棲生物的影響之間的關(guān)聯(lián)。因此，獲取這 種信息的能力促進了跨幾個學科的分子診斷、預后和藥物的發(fā)現(xiàn)的技術(shù)的進展。它為專業(yè)人 員提供了寶貴的在多種臨床環(huán)境中的決策能力。
生殖健康的范圍包括正常生殖功能以及生殖力衰退和不孕。對于在生殖健康領(lǐng)域中，更 具體的是在輔助生殖技術(shù)(ART)中，生物標志物的代謝組量變曲線尚未進行探索。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，
生物標志物量變曲線可以可靠地用于鑒定能發(fā)育的、生物學上合格的卵子、精子、和胚胎， 以提高體外受精程序(IVF)的治療成功率(懷孕)，同時，通過允許審慎地預選出少一些， 但只要是能發(fā)育的胚胎用于移植，可以降低一胎多生的風險。
因此，通過用光學法測定體液和IVF實驗室程序中所用的配子或胚胎的培養(yǎng)基，提供一 種測定樣品的代謝組量變曲線的方法，用于確定，例如卵子、精子或胚胎的發(fā)育能力，從而 可確定進一步在體外受精程序和相關(guān)方法中的成功可能性，這對于該技術(shù)是很重大的貢獻。
非常希望提供下述的一種方法，該方法通過分析液體培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物來測定與液體 培養(yǎng)基交換代謝產(chǎn)物的細胞的狀態(tài)。所述的細胞可以是在合適的培養(yǎng)基中生長的細胞，例如 胚胎或干細胞。該細胞可以是子宮壁的細胞，所說的液體培養(yǎng)基可以是子宮內(nèi)膜的液體。
本發(fā)明提供一種方法，該方法通過分析液體培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物來確定與液體培養(yǎng)基交換代謝產(chǎn)物的細胞的狀態(tài)。
本發(fā)明還提供一種測定樣品的代謝組量變曲線的體系和方法，通過用光學法測定體液和 IVF實驗室程序中所用的配子或胚胎的培養(yǎng)基，來確定，例如，在體外受精程序和相關(guān)方法 中的成功可能性。
本發(fā)明另外還提供的是關(guān)聯(lián)液體中代謝產(chǎn)物的波譜的方法和儀器，例如包括熒光的單波 長光譜、多波長的光吸收光譜、拉曼散射光譜、或磁共振譜；所說的液體例如是體液、配子 或胚胎的培養(yǎng)基，其中這些波譜顯示至少一種細胞的狀態(tài)，包括胚胎中的配子和多個細胞。
在一些實施方案中，提供了一種輔助生殖技術(shù)(ART)的方法。這種方法包括在體外使 至少一個胚胎在培養(yǎng)基中生長；在該胚胎生長的期間，不時地分析檢驗所述的至少一個胚胎
的培養(yǎng)基，以確定該胚胎的狀態(tài)，并利用該胚胎的狀態(tài)來確定下述時機中的至少一種 將胚胎移植到子宮的時機；
使胚胎經(jīng)過短時期的貯藏，以供此后移植到子宮內(nèi)的時機； 使胚胎經(jīng)過深低溫冷藏，以供此后移植到子宮內(nèi)的時機； 調(diào)整培養(yǎng)基，使胚胎繼續(xù)生長；以及
將胚胎移植到替換的培養(yǎng)基中，使該胚胎繼續(xù)生長的時機。
在一些實施方案中，上述的方法還包括通過分別分析檢驗卵泡液、精液槳和子宮內(nèi)液， 確定卵子、精子和子宮的發(fā)育能力，當卵子、精子和子宮的發(fā)育能力表明胚胎移植的植入或 懷孕成功的或然率高時，即可將單個的胚胎移植。
胚胎可以通過用精子使至少一個卵子在體外受精而得到。 在一些實施方案中，在胚胎生長的過程，對培養(yǎng)基的調(diào)整反復進確測定。 在常規(guī)的IVF中，沒有可靠的有關(guān)胚胎發(fā)育能力的信息，致使有時移植會延誤，因為生 存至第3、 4或5天的胚胎預期是更能發(fā)育的。但是，人們還是希望將已知是(或表明有較大 的可能性是)能發(fā)育的胚胎盡早移植。隨著胚胎發(fā)育至成熟期的某一點，如第2天，該胚胎 的發(fā)育能力的狀態(tài)會提高，但是，胚胎在體外成熟時，對于某些胚胎，其發(fā)育能力可能不會 明顯地提高更多。因此，在一些實施方案中，胚胎移植的時機確定在最早的時刻，在該時刻胚胎達到植入成功高或然率的起點。
本發(fā)明可以不受限制地應用于哺乳類動物，例如人類、牛科動物、馬科動物、貓^f動物、 犬科動物、羊科動物和鯨類。
當一些卵子受精，并有若干胚胎長成時，至少可以利用所確定的狀態(tài)選擇供移植的胚胎。
分析檢驗可以包括獲得培養(yǎng)基的波譜。在一些實施方案中，對波譜進行校正，確定一些 胚胎的培養(yǎng)基的波譜記錄與使用這些胚胎懷孕成功的記錄之間實際的相互關(guān)系，然后在此波 譜上運用該相互關(guān)系來確定胚胎的狀態(tài)。在一些實施方案中，該波譜是一種光譜。所說的波 譜可以含有與培養(yǎng)基的氧化壓力組分有關(guān)的信息。
當胚胎被深低溫冷藏時，可以定期地獲得該深低溫冷藏的培養(yǎng)基的光譜，由該深低溫冷 藏的培養(yǎng)基的光譜可確定胚胎的狀態(tài)，用于在深低溫冷藏期間對深低溫冷藏的胚胎進行監(jiān)測。
在一些實施方案中，提供了一種輔助生殖技術(shù)(ART)的方法。
這種方法包括在卵子的卵泡液中提取多個卵子，分析檢驗每個卵子的卵泡液，以確定該 卵子的狀態(tài)，并依據(jù)狀態(tài)選擇深低溫冷藏或受精。卵泡液的分析檢驗基本上與培養(yǎng)基的相同。
在一些實施方案中，提供了一種方法，該方法可產(chǎn)生生殖健康程序在患者中獲得成功結(jié) 果的或然率數(shù)據(jù)。該方法包括，使用所選擇的分析模式，獲得至少一種與液體培養(yǎng)基交換代
謝產(chǎn)物的細胞在液體培養(yǎng)基中的至少一種代謝產(chǎn)物的波譜，該細胞選自卵子、精子、和胚胎； 然后，利用所獲得的波譜，以及針對患者群體已建立的生殖健康程序的成功結(jié)果與用所選擇 的分析模式得到的液體培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物的波譜之間的相互關(guān)系，產(chǎn)生所說的至少一種細 胞的成功或然率數(shù)據(jù)。這些液體培養(yǎng)基的分析檢驗基本上是相同的。
上述的分析模式可以是單波長或多波長的光吸收、拉曼散射或光學熒光。該光譜可以在 短波長的近紅外線范圍內(nèi)。所選擇的分析模式也可以是醒R。
生殖健康程序可以涉及先兆子癇、IAI或羊膜內(nèi)炎、早產(chǎn)、反復流產(chǎn)、胚胎植入、性別 決定、環(huán)境污染/傳染、異位妊娠、正常妊娠、子宮內(nèi)膜異位癥。
在其他的實施方案中，本發(fā)明提供了一種輔助生殖技術(shù)(ART)的方法。該方法包括提供 含有一個或多個精子的精子漿液樣品，分析檢驗該精子漿液以確定該精子的狀態(tài)，然后依據(jù)該狀態(tài)選擇該精子進行深低溫冷藏或受精。
在其他的實施方案中，本發(fā)明提供了一種輔助生殖技術(shù)(ART)的方法。該方法包括分析 檢驗患者的子宮內(nèi)膜液，以確定該子宮對植入胚胎的發(fā)育能力，并依據(jù)該發(fā)育能力確定植入 胚胎的時機。例如，如果該發(fā)育能力較弱，則重復進行檢驗，在發(fā)育能力較強的時候確定為 植入的時機。例如，至少可對患者提供飲食、休息/運動、和醫(yī)療介入的其中之一種干預，以 增強其發(fā)育能力。
子宮內(nèi)膜液可用光學法在原位測定，然后該分析檢驗可獲得一份光譜。
在一些實施方案中，提供了一種確定與液體培養(yǎng)基交換代謝產(chǎn)物的細胞的狀態(tài)的方法。 該方法包括，使用所選擇的分析模式，獲得至少一種細胞在液體培養(yǎng)基中的至少一種代謝產(chǎn) 物的光譜，并利用所獲得的光譜，以及針對細胞群體所建立的至少一種細胞的狀態(tài)與用所選 擇的分析模式得到的液體培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物的光譜之間的相互關(guān)系，產(chǎn)生所說的至少一種 細胞的成功或然率數(shù)據(jù)。
在一些實施方案中，分析的模式是光學光譜法，例如，光的拉曼散射、光吸收或光 學熒光。在一些實施方案中，所說的光譜提供了有關(guān)液體培養(yǎng)基的氧化壓的信息。
在其他的實施方案中，提供了在培養(yǎng)基中使一個或多個細胞維持或生長的方法。該方法 包括，根據(jù)由選擇的分析模式得到的培養(yǎng)基的光譜所確定的細胞狀態(tài)，對該培養(yǎng)基進行調(diào)整。
在本發(fā)明的一些實施方案中，提供了一種儀器，用來對體外在培養(yǎng)基中生長的一個或多 個細胞的培養(yǎng)進行控制。這種儀器包括光譜獲得裝置，用來獲得培養(yǎng)基的光譜；將光譜數(shù) 據(jù)與細胞的狀態(tài)關(guān)聯(lián)的相關(guān)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫；確定狀態(tài)的信息處理系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用相關(guān)數(shù)據(jù) 和光譜產(chǎn)生表示細胞狀態(tài)的數(shù)據(jù)；培養(yǎng)基控制器，它可產(chǎn)生控制信號，以實現(xiàn)在培養(yǎng)基中對 表示細胞狀態(tài)的數(shù)據(jù)應答的調(diào)整。上述的控制器可以是全自動的，用來改變培養(yǎng)基參數(shù)的閥 門或開關(guān)也是全自動的，或者它能夠向技術(shù)員報告，讓技術(shù)員去操作所需要的調(diào)整。在一些 實施方案中，所說的光譜包含培養(yǎng)基中至少一種組分的有關(guān)氧化壓力的信息。
作為實施例，上述對培養(yǎng)基的調(diào)整可以是對環(huán)境溫度、或氣體組分，如溶解氧方面的調(diào) 整。同樣，例如，該調(diào)整也可以是在培養(yǎng)基中加入某種物質(zhì)去改變PH，或加入蛋白。在其他場合，合適的調(diào)整是替換培養(yǎng)基。
上述的儀器能夠利用所說的狀態(tài)作為反饋信息而進行操作來使培養(yǎng)基改變。通過一次調(diào) 整使狀態(tài)產(chǎn)生可測量的變化所需的時間通常就確定了反饋環(huán)的循環(huán)時間。當然，當調(diào)整立刻 影響培養(yǎng)基的光譜時，可緊隨調(diào)整再獲得光譜，那么，調(diào)整后立即測得的以及在隨后的某一 時間測得的狀態(tài)的改變，便可用來評估該調(diào)整是否有利于細胞的維持或生長。
為了本發(fā)明的目的，下面的術(shù)語定義如下
術(shù)語"體液"是指全血、血漿、血清、尿液、唾液、淚液、羊膜液、腦脊髓液(CSF)、 乳液、陰道液、子宮液、精液。
術(shù)語"培養(yǎng)基"是指營養(yǎng)物和鹽溶液的任何一種混合物，它可用來維持在實驗室中體外 培養(yǎng)的活細胞，包括配子和胚胎。對于某些分析模式，例如光學光譜法，分析的培養(yǎng)基可以 是冰凍的形式而不會影響其獲得有用的光譜的能力。
術(shù)語"患者"是指調(diào)查、觀察、監(jiān)測或研究的對象，無論是人或動物。
術(shù)語"非侵入的"是指透皮的或經(jīng)皮的光譜學分析，該分析是在原位，或是在患者的體 內(nèi)操作，是最低限度的侵入，例如通過取出小量體積的體液。
術(shù)語"與氧化壓力有關(guān)的疾病"是指引起氧化壓力或由氧化壓力引起或依賴于氧化壓力 的疾病。
術(shù)語"氧化壓力組分"是指對體液培養(yǎng)基或其它的研究樣品中的某種生物化學組分的親 氧化劑/抗氧化劑平衡的干擾，對前者有利時，可能會導致對組織的損害。同樣，"氧化壓力 組分"是指對體液培養(yǎng)基或其它的研究樣品中的多種生物化學組分的親氧化劑/抗氧化劑平衡 的干擾，對前者有利時，可能會導致對組織的損害。
術(shù)語"氧化還原的識別標志"是指來自多波長光吸收光譜學分析或NMR光譜學分析的氧 化壓力成分或0S生物學副產(chǎn)物的集合體。
術(shù)語"抗體"是指實質(zhì)上由一種免疫球蛋白基因或多種免疫球蛋白基因或其片段編碼的 多肽。己認可的免疫球蛋白基因包括k、 X、 a、 Y、 S、 e和u恒定區(qū)域內(nèi)的基因以及 許多免疫球蛋白可變區(qū)域的基因。輕鏈歸為k或A類。重鏈歸為Y、 y、 a、 S或e類，這反過來又確定了免疫球蛋白的分類，分別為lgG、 lgM、 lgA、 lgD和lgE。
術(shù)語"生物標志物"或"靶標志物"是指與特定的程序或醫(yī)學癥狀或所研究的疾病，如
體外受精或老年癡呆癥有關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)、酶、肽、小分子、氧化壓力化合物、或其它生 物化合物的量變曲線。與特定的生物標志物的構(gòu)成有關(guān)的數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)換為新的"代謝組量變曲 線"或"指印"。每條量變曲線通常是采用專有的信息學進行分析，該信息學可將上述數(shù)據(jù)與 臨床癥狀或結(jié)果相關(guān)聯(lián)。代謝組的量變曲線可以用來系統(tǒng)地辨認出通常很微小的差別，該差 別是正常的生理狀態(tài)與疾病開始或發(fā)展狀態(tài)間的，或個體對治療藥物的反應之間的差別。這 種技術(shù)可以應用到跨幾個科學的學科和應用的領(lǐng)域。
術(shù)語"胚胎質(zhì)量"定義為在隨后的程序中使用的合格胚胎的質(zhì)量表示，并反映出胚胎用 于涉及胚胎的選擇和移植的程序中的發(fā)育能力，這些程序例如是體外受精、以及植入以達到 懷孕的目的、短期貯藏、長期貯藏，包括深低溫冷藏。短期貯藏定義為從約3天至約5年的 貯藏。長期貯藏定義為長于5年至無限期的貯藏。
術(shù)語"卵子質(zhì)量"定義為在隨后的程序中使用的合格卵子的質(zhì)量表示，并反映出卵子用 于涉及卵子的選擇和移植的程序中的發(fā)育能力，這些程序例如是體外受精、以及植入以達到 懷孕的目的、短期貯藏、長期貯藏，包括深低溫冷藏。短期貯藏定義為約3天至約5年的貯 藏。長期貯藏定義為長于5年至無限期的貯藏。
術(shù)語"精子質(zhì)量"定義為在隨后的程序中使用的合格精子的質(zhì)量表示，并反映出精子用 于涉及精子的選擇和移植的程序中的發(fā)育能力力，這些程序例如是體外受精、以及植入以達 到懷孕的目的、短期貯藏、長期貯藏，包括深低溫冷藏。短期貯藏定義為從約3天至約5年 的貯藏。長期貯藏定義為長于5年至無限期的貯藏。
術(shù)語"HLA-G"是指人體白細胞抗原G，并包括可溶的和不可溶的兩種形式，除非另有說 明。該術(shù)語在相應的上下文中是指抗原或基因座。
術(shù)語"整連蛋白、泛蛋白、選凝素、生長因子、抑制素和其它激素、其它酶、小分子和 肽"是有代表性的生物標志物，這些生物標志物具有其不同的公認的科學含義。
術(shù)語"免疫分析"是一種分析方法或方法論，它利用抗體來與被分析物特異結(jié)合。免疫分析的特征是利用至少一種抗體的特異結(jié)合性質(zhì)來分離、靶向或定量被分析物。
術(shù)語"分離的"、"純化的"、或"生物純的"是指實質(zhì)上或基本上不含在天然狀態(tài)下通常 與其伴隨存在的組分的材料。
術(shù)語"標記物"在由以下方法可檢測的合成物中使用光譜法、光化學法、生物化學法、 免疫化學法、或化學法。例如，有用的標記物包括熒光染料、電子致密試劑、量熱劑、酶， 例如ELISA中常用的酶、生物素、地高辛、或已有抗血清或單克隆抗體因而可檢測的半抗原 和蛋白質(zhì)。
此處涉及的所有參考文獻特此引入作為參考。


由以下的詳述并結(jié)合附圖，本發(fā)明更多的特征和優(yōu)點將會更顯而易見，其中-
圖1是光學氧化壓力測定裝置的示意圖，包括一個光徑為lcm長的5(￥1樣品池，由寬帶 的鴇鹵素燈通過第一條光纖供光， 一臺短波長近紅外分光光度計(SWNIR)通過第二條光纖連 接在樣品池的另一端，用于檢測600nm-1100nm范圍的CW強度，還有一臺與該分光光度計連 接的計算機，用于光譜的記錄和分析。
圖2表明不同種類的各種分子種在600nm-1000nm波長范圍的吸收水平。
圖3表明20個IVF胚胎培養(yǎng)基樣品的拉曼光譜。
圖4表明帶有標準偏差的拉曼光譜。
圖5表明能發(fā)育的樣品的光譜。
圖6表明交叉驗證。
圖7是發(fā)育中胚胎的代謝組學識別特征，用帶有紫外光檢測的毛細管電泳獲得，該檢測 可確定培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物和代謝產(chǎn)物的級分。
注意，所有附圖中，相同的特征用相同的參照數(shù)字確認。
具體實施例方式
本發(fā)明提供一種用于關(guān)聯(lián)波譜的方法和儀器，所說的波譜例如是培養(yǎng)基或體液的多波長 光吸收、拉曼散射光譜、或磁共振譜，其中的體液例如是，取自與氧化壓力有關(guān)疾病患者的 體液。
氧化壓力測定現(xiàn)在尚未作為診斷或預見病癥開始的一種方法而在臨床中使用。本發(fā)明提 供了一種能迅速測定氧化壓力的適用于臨床環(huán)境的方法。
為了更好地研究癥狀的時間過程，從而能夠千預和改正氧化壓力的水平，從這觀點來看， 以前還沒有縱向地(全過程)對氧化壓力進行過測定。本發(fā)明提供了一種儀器，該儀器能夠 非侵入地以適合用于任何患者的方式快速測定氧化壓力。
作為實施例，本發(fā)明提供了一種利用光學分析方法來測定體液中一種或多種氧化壓力組 分的一種手段。按照本發(fā)明，所分析的體液可以是全血、血漿、血清、尿液、唾液、淚液和 腦脊髓液(CSF)、羊膜液、乳液、陰道液或子宮液中的任意一種或其混合物。另一方面，本 發(fā)明提供了一種測定培養(yǎng)基中一種或多種氧化壓力組分的方法，以確定卵子的質(zhì)量、胚胎的 質(zhì)量、精子的質(zhì)量等。光學分析可用光譜中不同范圍的波長來完成，例如NIR、 S麗IR和THz 范圍。除了吸收光譜以外，拉曼光譜、熒光光譜也可以用作分析。
本發(fā)明還提供一種方法和儀器，用來測定與氧化壓力有關(guān)的癥狀在患者或樣品中存在的 或然率數(shù)據(jù)。針對患者群或樣品群，建立與氧化壓力有關(guān)的疾病和用選擇的分析模式獲得的 體液的波譜之間的相互關(guān)系。對于要測定其或然率數(shù)據(jù)的患者，用選擇的分析模式獲得體液 的波譜。利用所獲得的譜和已建立的相互關(guān)系，產(chǎn)生該患者的或然率數(shù)據(jù)。
本發(fā)明還提供了測定胚胎質(zhì)量的方法，以便其在隨后的程序中使用，該質(zhì)量包括精子的 發(fā)育能力。這些方法包括通過對胚胎發(fā)育能力的生物標志物的代謝組量變曲線的評估，利 用體外受精和胚胎移植(IVF/ET)以及輸卵管胚胎移植(TET)技術(shù)將胚胎移植到子宮。
BSM技術(shù)平臺可以應用于許多不同的診斷、預后和監(jiān)測顯示中，包括體外受精程序(IVF)。 研究表明，BSM可以容易地以非侵入的方式實施，并且具有高度的靈敏度和專一性。小型的 設備可很容易適用于商業(yè)單位的大規(guī)模生產(chǎn)。大多數(shù)針對代謝組學的方法都依賴下述的技術(shù)作為其核心技術(shù)例如質(zhì)譜術(shù)、NMR、 HPLC、 電泳和很多基于蛋白組學的分析檢驗方法，包括微矩陣和免疫分析等。雖然這些技術(shù)對于一 些應用，例如在研究、服務或臨床參考實驗室中的應用，都是有用的方法，但是這些方法是 費錢和復雜的。相反，BSM是用小型、方便使用和便攜的現(xiàn)場使用設備來實施的，該設備甚 至可用于篩選的目的。
有關(guān)化學和生物樣品中組分的相對定量的信息可以由光譜通過使光譜標準化，產(chǎn)生峰的 強度值而得到，該強度值精確地反映了相應的化學物質(zhì)的濃度。由固有組分的峰強度計算出 標準化的因子，這些固有組分的濃度在一系列樣品中是保持恒定的。 一種組分在不同樣品中 的相對濃度可以由標準化的峰強度判斷。與常規(guī)的方法不同，它不需要內(nèi)標準和添加試劑。 在蛋白質(zhì)組學和代謝組學的研究中，該方法對差示表型分析尤為有用，在該分析中，確認了 其濃度在不同樣品中變化的分子。這些被確認的分子種可以用作疾病或?qū)χ委煈鸬纳飿?志物。
自由基是在其外層軌道含有不配對電子的原子或分子。它們的電子形態(tài)使得這些化學物 質(zhì)與膜脂、蛋白、核酸和其他細胞基質(zhì)具有高的反應活性。自由基可以來自環(huán)境的來源，或 可以在組織內(nèi)再產(chǎn)生。
過氧化物陰離子(02—)、過氧化氫(HA)、單純氧、次氯酸(H0C1)、過亞硝酸鹽(ONOO-)、 羥基自由基(0H*)是內(nèi)源產(chǎn)生的反應性氧類物質(zhì)(ROS)的例子。過渡金屬，例如亞鐵離子 (Fe2+)或亞銅的銅(Cu1+)，在細胞的氧化還原化學中，通過將仏02還原為高細胞毒性的OH* 自由基(芬頓催化)而起重要的作用。在哺乳類動物的組織中，進化保守的抗氧化酶(例如 過氧化物岐化酶、過氧化氫酶、甘肽過氧化物酶以及各種氧化還原酶)與許多非酶的低分子 量的抗氧化劑化合物(例如GSH、硫氧還蛋白、抗壞血酸、生育酚、尿酸、退黑激素、膽紅 素)協(xié)同起作用，以維持氧化還原反應在體內(nèi)的平衡。通過將過渡金屬維持在相對低的氧化 還原狀態(tài)，金屬結(jié)合蛋白，例如鐵蛋白、運鐵蛋白、乳鐵蛋白、金屬硫蛋白、血漿銅藍蛋白， 基本上成為組織和體液中的抗氧化劑蛋白。
氧化壓力(0s)被定義為"在親氧化劑/抗氧化劑平衡中的干擾，對前者有利時，導致可能的[組織]損傷"。這種平衡可以與體液中的一種或多種生物化學組分有關(guān)。氧化壓力被牽 連為細胞機能障礙和死亡的重要常見途徑，而且可能是很多人類內(nèi)科疾病的治療目標，這些 疾病包括癌癥、糖尿病、阻塞性肺疾患、炎性的腸道疾病、心臟缺血、腎小球腎炎、斑疹變 性以及各種神經(jīng)變性的疾患。
由此，目前已知道采用色譜技術(shù)和質(zhì)譜儀來測定血漿和腦瘠液(CSF)中的氧化壓力。這 種分析技術(shù)很費時，而且要獲得相當大量的體液來取得氧化壓力的測定結(jié)果。
本發(fā)明所用的生物標志物包括炎癥標志物、氧化壓力標志物、和細胞損傷標志物，或它 們的結(jié)合。炎癥標志物包括但不限于細胞因子、或其它促進白細胞或炎癥細胞的吸引力的 炎癥介質(zhì)。炎癥標志物可以，但不是必須由炎癥細胞釋放。癥標志物包括但不限于8-異前 列烷(8-isoprostane)、髓過氧化物酶、IL-6和C-活性蛋白。氧化壓力標志物顯示出由氧化 劑或自由基引起的細胞損傷。氧化壓力標志物包括到達其各自的目標，例如脂、蛋白或DNA 的自由基和氧化劑，以及由自由基和氧化劑引起的損傷的間接標志物。氧化壓力標志物包括 但不限于游離鐵、8-異前列烷、髓過氧化物酶、谷甘胱肽過氧化物酶、脂質(zhì)氫過氧化物酶、 雙酪氨酸、和8-羥基喹啉。細胞損傷標志物包括生物分子(例如酶)，其中該生物分子的釋 放與壞死或損傷的細胞有關(guān)。細胞損傷標志物包括但不限于:肌酸激酶和乳酸脫氫酶。 一些 生物標志物可以歸類于一種以上的標志物類型。例如，8-異前列烷可歸為炎癥標志物和氧化 壓力標志物兩類。
本發(fā)明提供了一種處理波譜數(shù)據(jù)的方法，其中的波譜包含有峰強度的峰。由多個化學樣 品，例如含有代謝產(chǎn)物、蛋白或肽的生物樣品，獲得了一組波譜。該波譜可以是由下述方法 得到的質(zhì)譜例如，電子噴射離子化(EST)、基質(zhì)促進的激光解吸離子化(MALDI),或電子 撞擊離子化(EI)。每個波譜的峰強度通過標準化因子換算，產(chǎn)生與對應組分的濃度成比例的 峰強度。根據(jù)換算的峰強度，可以估計特定樣品中組分的相對濃度。標準化因子根據(jù)化學樣 品中的組分計算得出，該組分的濃度在其各個化學樣品中的濃度基本上是不變的。在一個實 施方案中，這些組分未預先確定，而且是化學樣品中的固有組分，在另一個實施方案中，標 準化因子由所說的一組波譜中的兩個(例如第一和第二個)波譜的峰強度之間的比率計算而得，而且是非參量性的測定，例如是中值。 包括體外受精的輔助生殖技術(shù)(ART)
本發(fā)明的方法可用于確定體外受精的成功時機。目前，在體外受精(IVF)實驗室中，對 前胚胎的選擇只能根據(jù)其在受精后的前48-72小時期間的形態(tài)和體外的卵裂速率來進行。這 些標準是有用的，但是，作為發(fā)育潛力的指標，這些標準不總是好的。在大多數(shù)情況下，根 據(jù)這些相對粗糙的指標選擇3或4個胚胎，然后移植到子宮腔中。如果在生物化學、遺傳、 發(fā)育參數(shù)的基礎上，另外提供更嚴格的前胚胎選擇的標準，則有可能移植一個或兩個成活可 能性最大的健康胚胎，而不會使患者處于因反復發(fā)生的胚胎植入的失敗、自然流產(chǎn)、多次IVF 試驗或多次妊娠的風險所引起的心理創(chuàng)傷之中。因此，為了成功的植入，醫(yī)學上需要一種更 有預見性的檢驗標準。
生殖健康(IVF)
目前，商業(yè)上還沒有診斷的檢驗方法去評估卵子、精子或胚胎的能力?，F(xiàn)在，胚胎的選 擇是在任意的形態(tài)、速率的尺度的基礎上進行的。著床前胚胎遺傳學診斷(PGD)是一種檢驗 有限數(shù)量的遺傳疾病，但不能用于預見胚胎的能力的程序，PGD是有高度侵入性的標準化的 程序，它僅在美國的很少幾個專業(yè)化的實驗室中使用。再者，該程序很費錢、費時，而且很 有爭議。這種技術(shù)在生殖健康和產(chǎn)科醫(yī)學方面的其它應用包括對下述方面的評估先兆子癇、 IAI或羊膜內(nèi)炎、早產(chǎn)、反復流產(chǎn)、胚胎植入、性別決定、環(huán)境污染、傳染、異位妊娠、正 常妊娠、子宮內(nèi)膜異位癥等。
卵子
直至最近，人們還是假定卵子一般是"正常"或合格的。它們不被看成可能是在IVF中 造成障礙的來源，除非在觀察到形態(tài)發(fā)生嚴重變異，或如果該卵細胞是不成熟的(主要用大 小度量)明顯情況下。在上述的情況下，有缺陷的卵細胞會被丟棄，并繼續(xù)被丟棄。然而， 增長的科學証據(jù)正在改變這種見解，正如幾份新的報告(最近，2005年的ASRM年會)已證 明的，在年輕的女性(21-31歲)中，所有卵子的50%至高達75%是不正常的(非整倍體的)， 而且，該數(shù)字隨著年齡而顯著地上升。 一般來說，由于對人類卵子缺乏在任何水平，如基因組學、蛋白質(zhì)組學或代謝組學水平上的調(diào)査研究，因此，就沒有令人滿意的用于卵子選擇的 程序。
基因組學檢驗
一些基因組學檢驗技術(shù)只是最近(不到2年)才使其適用于嚐試評估卵子的能力中(例 如，比較基因組雜交)。這些技術(shù)尚處在其發(fā)展的初期，還未標準化或被承認，而且離開成為 IVF試驗室中實用的、有普通席位的程序還相差很遠。目前，這些程序是很費錢、費力的， 而且對卵子的侵入性程度很高，因為需要做卵細胞的切片。這種切片的作用，即使有，也是 未知的。
新近，著床前胚胎遺傳學診斷(PGD)已通過評估胚胎中非整倍體的發(fā)生率，間接地用于 卵子質(zhì)量的研究，其中所說的胚胎如沒有非整倍體的發(fā)生，則是在健康、形態(tài)方面合格的胚 胎。在這些研究中，甚至取自年輕女性的卵子都發(fā)現(xiàn)其染色體異常的發(fā)生率都很高；根據(jù)推 斷，該非正常的胚胎來源于非正常的卵子。令人信服地，用CGH或PGD程序在卵子中檢測得 到的非整倍體發(fā)生率是很相似的，約為50%。
胚胎
從歷史的事實看，為了監(jiān)測和預見IVF的成功，胚胎作為干預的目標更為引人注目。IVF 的"圣杯(holygrail)"是為了了解哪些胚胎是能發(fā)育的、合格的胚胎以及哪些不是。其前 題是有一種程序一貫地只鑒定并選擇出高質(zhì)量的胚胎，即具有引起妊娠的最大可能性的胚 胎，這種胚胎可以常規(guī)地進行選擇來用于移植。其本身又可期望提高妊娠率而降低一胎多生 的幾率，因為如果預知這些胚胎是能發(fā)育的，就只需移植較少的胚胎。
形態(tài)的評估
現(xiàn)今，在IVF實驗室中，基于+卜+4分級系統(tǒng)的胚胎形態(tài)的評估是確定胚胎發(fā)育能力的 主要方法。胚胎通常用"分級胚胎記分(GES)"進行評價。GES系統(tǒng)在受精后的前72小時期 間進行評價。對每個胚胎，按最大為100分進行記分。GES分大于70的胚胎有最大的可能發(fā) 育成為能發(fā)育的胚泡，該胚泡在胚胎移植(ET)后，接著植入子宮內(nèi)層(或內(nèi)膜)中并產(chǎn)生能 發(fā)育的妊娠。這樣，GES建立了一套完整的標準，為ET在有關(guān)選擇胚胎方面向患者提出建議。對于培養(yǎng)過程中的胚胎發(fā)育模式(例如，卵裂速率、裂殖、包涵體、內(nèi)細胞群等)也進 行了評價，但是，就這些量度的使用而言，胚胎學家之間甚至很少一致。由于缺乏國家的或 國際的標準所帶來的明顯困難，形態(tài)的評估遭受到麻煩。內(nèi)部和外部的觀測者與生俱來的易 變傾向與分級系統(tǒng)的主觀性，以及缺乏任何有關(guān)的生物學的量度結(jié)合起來，阻止了該方法的 發(fā)展。此外，該分級系統(tǒng)的基本科學缺陷是因下述的原則而引起的形態(tài)分析不能被認可為 是生物學功能的測定。這種方法的局限性在最近的ASRM年會上再次受到熱烈的關(guān)注。然而， 由于還沒有產(chǎn)生替代的方法，胚胎學家們?nèi)员仨氁蕾囉谶@種分級系統(tǒng)。
通過分析生長的細胞和胚胎的代謝組學的光譜量變曲線，可評估對營養(yǎng)物、補給品、PH 和代謝產(chǎn)物的調(diào)整。這樣可以連續(xù)監(jiān)測細胞和胚胎的生長，并使其最佳化。例如，對確定的 氧化壓力水平可以進行測定，或通過補充化學物質(zhì)，如氧化劑來抵消。更具體地說，根據(jù)對 培養(yǎng)基的監(jiān)測，較弱的胚胎可以補充更多的氧，或改良其生長培養(yǎng)基，以提高該胚胎的發(fā)育 能力，例如更改培養(yǎng)基的pH、除去代謝產(chǎn)物、在培養(yǎng)基中補充營養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明的對培養(yǎng) 基的監(jiān)測，在第3天的培養(yǎng)基中生長的弱胚胎可以轉(zhuǎn)移到第5天的培養(yǎng)基中生長。
子宮的評估
子宮對胚胎植入的發(fā)育能力可以與子宮內(nèi)膜液，即子宮壁的內(nèi)層液體的分析光譜組分相關(guān)。
該方法論可應用于測定子宮頸粘液和子宮內(nèi)層內(nèi)膜的代謝組量變曲線，以確定該內(nèi)膜對 胚胎植入的生物接受能力。雖然不同子宮的內(nèi)膜內(nèi)層可以用采用光纖的不同光譜法非侵入式 地進行檢査，該方法將光纖通過子宮頸直接插入子宮，但是，作為一種生物液體，子宮頸粘 液可以通過不同的光譜法進行分析，以確定表明有接受能力的內(nèi)膜特征的代謝組學量變曲線。 子宮內(nèi)膜的代謝組測定將會導致胚胎植入成功率的提高，因而妊娠率也提高。
著床前遺傳學診斷和基因組學檢驗
胚胎的基因組學檢驗(即，CGR)受到與上面提及的卵子同樣的限制，而且到目前為止， 胚胎的CGR還未受到科學界可信任的關(guān)心。然而，目前ART領(lǐng)域卻得益于著床前遺傳學診斷 的程序，該程序可用于對發(fā)育中的胚胎篩査其有限的幾種特殊的遺傳病和非整倍體，非整倍體使23對可能受到影響的染色體中的9對受到影響。PGD是一種費力的程序，它與另一種稱 為熒光原位雜交(FISH)的程序聯(lián)合使用。遺憾的是，PGD/FISH為IVF程序鑒定卵子和胚胎 的總體發(fā)育能力時，缺乏靈敏性和專一性。雖然PGD在檢測能影響胚胎的發(fā)育能力的非整倍 體中是有用的，但這不能證明在總體評估胚胎的發(fā)育能力中有用。PGD被認為是有爭議的程序，因為它需要做早期胚胎的單細胞切片檢査，而且該過程本 身所固有的對健康風險也是未知的。盡管切片是在IVF實驗室中完成，但該切片必須送到另 一遠處的遺傳實驗室去做染色體分析。PGD也被FDA和ASRM看成是一種試驗程序，而且，由 于從試驗所得的遺傳信息性質(zhì)的原因，已對其提出了生物倫理道德的問題。作為IVF的常規(guī)、 主流的試驗，PGD的費用也是過高的。直至最近，該領(lǐng)域被PGD的占領(lǐng)，很有可能阻止了科 學家們繼續(xù)從事其它基因組的方法學或蛋白質(zhì)組學和代謝組學的研究。與本發(fā)明的代謝組量變曲線相比，PGD是很費錢和對胚胎有侵入性的程序，因此未知風 險的程度很高；對遺傳疾病的試驗有限制；而且費時。此外，除了非整倍體的基因組學評估 之外，尚未證明PGD是測定胚胎的發(fā)育能力的有用方法。因為它是一種復雜和費錢的程序， 它不可能成為常規(guī)的胚胎評估中的主流方案。由于許多科學的、社會政治的理由，PGD仍被 考慮為一種試驗程序。因此，代謝組量變曲線作為卵子和精子總體能力檢驗的引進，在技術(shù) 上是很大的進步。胚胎生物標志物至少己對一種胚胎發(fā)育能力的分子生物標志物已經(jīng)稍嚴格地進行了檢査，即一種稱為可 溶的人白細胞抗原(sHLAG)的分子。這種蛋白是通過免疫分析法測定的，因此比較麻煩，周 期長(數(shù)小時)，而且運轉(zhuǎn)起來費錢。由于體積的限制(培養(yǎng)基樣品的體積)，該測定不能按 重復測兩份樣品的方式進行，所以計算的精確度會有所降低。其它的蛋白組生物標志物(如 整連蛋白e、遍在蛋白、HCG、其他)近來也被提出用于胚胎；但是，這些標記物尚未被廣 泛地研究，而且，它們作為胚胎發(fā)育能力的標志，其作用，如果有，還需要進一步研究。實現(xiàn)單個胚胎的移植樹立信心，以單個胚胎移植過程作為一種手段，減少一胎多生而又不降低妊娠率，是IVF從事者的目標，同樣也是ASRM和保險提供者的目標。遺憾的是，迄今已證明這是個難以達到 的目標。人們預期到了代謝組量變曲線的可利用性，它可給予該從事者在IVF的臨床實踐中 選擇多個胚胎移植或單個胚胎移植的機會。因此可以領(lǐng)會到代謝組學檢驗的益處，它包括 (i)提高治療的效果(即妊娠率)同時降低一胎多生(三胞胎或更多)的幾率；(ii)降低對母 親和后代的醫(yī)療風險；(iii)減少對多個早產(chǎn)嬰兒提供醫(yī)療健康看護的費用；(iv)對IVF的較 寬的保險覆蓋范圍；(v)給予尋求不育治療的患者更強的信心。人們也預期到代謝組量變曲線 為ART業(yè)界實現(xiàn)的其它益處的開發(fā)，包括l)冷凍的供體卵細胞庫，它僅為未來的接受者提 供預選的，能發(fā)育的卵細胞，以及2)"卵子營救"，該過程是收集合格的但多余的卵細胞， 用于深低溫冷藏，隨后在將來的下一輪IVF中受精。 sHLAG生物標記物測定sHLAG單個生物標記物的測定目前正在IVF程序中使用。所用的試劑盒另外還包含實施 本發(fā)明方法的說明書。 干細胞通過分析培養(yǎng)基，本發(fā)明同樣可以應用于測定培養(yǎng)基中一個或多個干細胞的發(fā)育能力。按照本發(fā)明，為了使干細胞分化為e細胞或分化的細胞類型的分化達到最大化，必須對干細胞的生長培養(yǎng)基進行評估，以測定這些干細胞的氧化壓力。利用干細胞生長培養(yǎng)基，例如蛋 白或其他代謝產(chǎn)物的監(jiān)測光譜，可以對分化因子進行鑒定。參照以下的實施例，將會更容易理解本發(fā)明，給出的實施例是用來說明該發(fā)明而不是限 制其范圍的。實施例l由短波長遠紅外(SWNIR)光譜分析測定血漿中的OS取樣方法分析前，將樣品融化l小時以達到室溫，然后離心30分鐘。為了清潔和預處理樣品池， 該樣品池先用200W的0. 1M NaOH淋洗，然后用3X200W的純水淋洗。短波長遠紅外(SWNIR)光譜分析記錄第三次淋洗水的SWNIR光譜用作對照。隨即，將75W樣品注入樣品池，并用圖l所 示的儀器記錄樣品的光譜。由所制備的樣品按下述的方案獲得短波長近紅外光譜。該測定是使用美國全像攝影近紅 外分光光度計完成的。該分光光度計配備了一個雙路徑的入口，這樣，參照可以與樣品同時 測量。所得的光譜覆蓋了 580-1100nm的范圍。該檢測儀器完成測定的時間是100微秒。所有 的樣品都測定50次，將結(jié)果平均以減少光譜的噪音。用印pendorff移液管將樣品送入內(nèi)徑 為10mm的樣品池中。大約使用的樣品。得到光譜數(shù)據(jù)后，樣品池先用200W的0. 1MNaOH， 然后用3倍體積的200W純水清洗。在每次的樣品測定后，另外獲取第三次淋洗水的參照光 譜。這樣可以監(jiān)測樣品池的污染或光學系統(tǒng)組合的變化。每個樣品的光譜都以連續(xù)流動的水 樣品為參照，用于后面的程序。 IVF取樣卵子在卵子收集的期間， 一旦確認了卵子，并將其移至支持培養(yǎng)基中之后，即從培養(yǎng) 皿中回收一份約含通常要丟棄的卵泡液。胚胎在IVF培養(yǎng)過程(叢受精至分裂為囊泡)的每個階段的結(jié)束，收集通常要丟棄的 用過的培養(yǎng)基，用BSM進行分析。單個胚胎培養(yǎng)是該程序中制備胚胎的最好方法，但不是必 須要使用的方法。另一方面，PGD丟棄的培養(yǎng)基、輔助孵化技術(shù)和其他有關(guān)的ART程序也都 可以按類似的方式分析。樣品可以直接用BSM分析，或冰凍保藏后，在將來進行分析。卵子 和胚胎的選擇是根據(jù)在各自樣品中的生物標志物的獨特代謝量變曲線來確定的。 液體樣品可以經(jīng)冰凍后直接使用，以得到光譜，或以后經(jīng)融化后再獲得光譜。分析方法學 事先選擇波長S麗IR光譜包含各種的分子種的吸收。為了選出血漿中主要的分子種類，如圖2所示， 確認了與血紅素(700nm)、 CH(830nm)、 R0H(940nm)、 H20 (960nm)、 0H(980nm)和NH(1020nm) 組分有聯(lián)系的波長范圍(15nm寬)。然后將這六個范圍組合在一起的吸收用于下面描述的回歸模型中。Haar小波變換Haar變換(HT)是最古老也是最簡單的小波變換。與傅立葉變換相似，Haar變換將數(shù)據(jù)(例 如近紅外光譜)映射到一個給定的基組。與傅立葉變換不同的是，傅立葉變換使用正弦函數(shù)和 余弦函數(shù)作為基組，而HT使用Haar小波作為基組。在本研究中，離散的小波變換(DWT)是 從連續(xù)的小波變換或者小波包變換中挑選出來的，用以使計算的簡單程度和速度最大化。對 定義在0 < ;c < 1范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)，對于DWT的Haar小波類由以下公式給出1 ifOsx<l0其余范圍(1)1 ifOsx<% -1 if^sx<l0其余范圍(2)屮n,k, (x)=屮(2"x — k), 0 s k s 2n — 1(3)實現(xiàn)Haar變換包含將光譜分解為0，平，和甲 ，4,的加權(quán)和數(shù)，其中的權(quán)重為"小波 系數(shù)"。為了獲得父小波^的系數(shù)，對整個數(shù)據(jù)窗口上的信號求積分。母小波甲的權(quán)重由第一 半數(shù)據(jù)點積分后減去第二半數(shù)據(jù)點的總和得到。子小波是母小波的縮小和平移的形式。符號 甲w,表示標度，k表示平移。由此，為了找到子小波的系數(shù)，即使是數(shù)據(jù)中再小的區(qū)域都進 行求和，直到數(shù)據(jù)的最小單位尺寸。因此，子小波更像是高通量濾波器，而父小波的功能類 似于低通量濾波器?？偟膩碚f，所獲得的小波系數(shù)的數(shù)目與原始數(shù)據(jù)組中點的數(shù)目相同。根據(jù)以上描述，顯而易見，Haar小波是簡單的結(jié)構(gòu)，因為它們只有三個不同的取值+1， -l或0，而且很可能通過引入父小波的縮小和平移的形式來將它們進一步簡化，父小波的縮 小和平移的形式稱為標度函數(shù)或"son"小波<formula>formula see original document page 26</formula>母小波也可以重寫為因此，使用2z-1個僅由1和0組成的小波，可以在具有z個點的光譜上實現(xiàn)"son"小 波的Haar變換。該小波變換的基組為非直角的，因為高代的"son"小波是低代"son"小波 的子集。然而，"son"小波具有單向性的優(yōu)勢，亦即，它們只能取正。因此，與子小波不同 的是son小波在數(shù)據(jù)處理中并不會固有地執(zhí)行一階導數(shù)。Haar變換特別適合于光譜分析。所獲得的小波系數(shù)包含頻率和波長信息(這里"頻率" 并不是通常意義上的所指，而是指小波是否描述為小標度或大標度的特征)。由于波長信息的 保持力，比起傅立葉變換的結(jié)果，Haar小波變換的結(jié)果更容易理解光譜的含義。而且，有可 能不僅研究分離波長的重要性，而且研究不同尺寸光譜特征。這一特性的通常應用于通過 刪除高頻率小波系數(shù)來使數(shù)據(jù)平滑?；蛘撸跀?shù)據(jù)集塊中很大的傾向，例如傾斜的基線，可 以通過除去低頻率小波的方法來修正。Haar變換的另一個重要特征是將大量的信息壓縮成很小數(shù)目的變量的能力。子小波在 數(shù)據(jù)壓縮中是有效的，并且這一特性在現(xiàn)有的研究中巳經(jīng)被用以尋找最精簡的模型來評價樣 本的特性。比較起來，由于son Haar變換是部分多余的，因此son Haar變換在數(shù)據(jù)壓縮中 做得并不是很好，但它可使相鄰的波長的完全去耦。因此這一基組在特征選擇上能夠有更大 的自由。此外用son小波建立的模型更易于說明。因為《^只有兩種不連續(xù)的取值， 一個波長 區(qū)域要么被最優(yōu)化算法選取，要么不被選取?；谒x擇的son小波，很可能構(gòu)建起一個簡 單化的使用峽縫或過濾器進行樣品分析的儀器。子小波Haar變換和son小波Haar變換均用Matlab (Mathworks公司，MA， Natick)中 所寫的程序來進行計算。對于子小波Haar變換，基于Mallat的金字塔算法的快速Haar變換 程序，通過執(zhí)行一系列的遞歸和與遞歸差來決定小波系數(shù)。對于son小波Haar變換，使用 簡單的和。由于算法需要輸入的數(shù)據(jù)長度為2的乘方，為了達到最接近的2n，實驗的光譜使用最后的數(shù)據(jù)值來填補。小波系數(shù)被確定，并由寬的小波至更密的小波依次排列(^，甲，A,o'…，l乂或0，《o...，《k)。 遺傳算法用于評估目的級別的最精簡變量(方法1的波長或方法2的小波)子集，由反向最小二 乘(ILS)回歸法確定。當包含很少的波長時，如方法l，對所有可能的結(jié)合均進行模擬。當 許多小波都包含在分級系統(tǒng)中時，(即方法2)，使用遺傳算法(GA)最優(yōu)化來決定小波的最 佳選擇。使用諸如交配、交叉和突變的原理對許多模型進行了評價。對于每種變量的結(jié)合， 樣本級別根據(jù)如下公式評估-7="。 + c !Xj + or2X2 +----h anXn ( 6 )其中，Y為因變量(神經(jīng)學上的分級，艮P， O代表正常，1代表AD)， X,， X2，……，Xn 是自變量(即，給定波長或小波系數(shù)的強度)，"。，",，……，A是系數(shù)，由一組校正的X's 確定。遺傳算法最優(yōu)化的完整描述先前已在別處給出，因此，這里只給出該方法的概要。使用遺傳算法的方法尋找包含1至15個變量的擬合最好(最佳)的模型。通過用二進制 對選定的變量編碼，并按照詞典編纂的方式將它們堆成單個個體(如模型)的群體。對于2a 變量的預處理光譜，二進制編碼使用n位。群體數(shù)量設置為IOOO，使用每個個體與一組校正 值按照公式6建立一個模型。相應的選擇校正標準誤差(SEC)的計算基于測試組。根據(jù)其 SEC確認擬合最好的兩個個體，并且不進行突變地保留到下一代。余下的新群體通過以1的 交叉幾率和0.02的突變率使個體間隨機交配來進行擬合。隨著該群體突破2000代之后，該 算法逐漸趨近一個穩(wěn)定的解。對1至15個變量組成的模型進行了同樣的研究，它們的SEC用于獲得預報殘差平方和 (PRESS)的圖。令h代表帶有最小PRESS值的模型中小波的數(shù)目。最精簡的模型就是具有 最少小波數(shù)目的模型，這樣，該模型的PRESS值不會很明顯地大于具有h個小波(f-測試， 99%的置信水平)的模型的PRESS值。評估的級值不是0就是1。然而，上述的回歸確定為連續(xù)的實數(shù)值。級別間的間隔用大 于0.5的值，如1級，和小于0.5的值，如O級來確定。對于每個模型，確定其靈敏度和特異性，并作為模型選擇的標準。正如對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，是顯而易見的，我們知道，本發(fā)明能夠在光譜中不同范圍 的波長下工作得很好，例如在NIR、 S麗IR和THz范圍。除了吸收光譜之外，拉曼光譜和熒光 光譜也可以類似地進行分析。同樣對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的是，在核磁共振情況 下，分析技術(shù)會被修改，用以確認氧化壓力組分和/或與疾病或癥狀相關(guān)。我們還知道，除了提供一個或多個氧化壓力的值之外，本發(fā)明可以用于將光譜與疾病或 癥狀相關(guān)。在后面的這種情況下，本發(fā)明提供一個處理器，該處理器可以產(chǎn)生一個值，該值 代表多個氧化壓力組分的值的加權(quán)平均，這樣，該加權(quán)平均就提供了表明該病人氧化壓力程 度的值。實施例2實施例1的示范方法可以用于IVF程序和胎-母健康監(jiān)領(lǐng)!l。該方法也可以應用于獲得卵子、 精子和胚胎，以及卵子、精子和胚胎的深低溫冷藏。這些方法也被考慮用于體外受精程序中。實施例3利用鑒定培養(yǎng)基中營養(yǎng)物和代謝產(chǎn)物級分的分析分離技術(shù)，也可以得到氧化壓力組分的 代謝組識別特征。圖7給出的是利用帶有紫外光監(jiān)測的毛細管電泳進行分離的實施例。與胚 胎發(fā)育有關(guān)的組分已被鑒定出來，而且與胚胎的發(fā)育能力有正的和負的相關(guān)。具體是， 一種 在900秒的營養(yǎng)物級分與胚胎的發(fā)育能力負相關(guān)，而兩種代謝產(chǎn)物的級分(1000-1100秒) 與胚胎的發(fā)育能力正相關(guān)。結(jié)合上述兩組組分的信息，可以將能導致妊娠的胚胎和不能導致 妊娠的胚胎分開，其靈敏度為80%，特異性為100%。利用相同的方法論建立的分離技術(shù)，例 如，其它電動分離技術(shù)、液相和氣相色譜分析法也可以用來分離這些從發(fā)育的細胞至發(fā)育能 力評估的代謝組識別特征。對于本發(fā)明，雖然己經(jīng)結(jié)合了其具體的實施方案進行了描述，但應該認識到，該發(fā)明是可以作進一步修改的，而且，本專利申請意欲覆蓋本發(fā)明的任何變更體、用途或改編本，一般來說，這些變更體、用途或改編本遵循本發(fā)明的原則，又包含偏離本發(fā)明所公開的內(nèi)容， 例如在本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)公知的或常規(guī)的操作規(guī)程，和可以適用于上文所述的基本特征 的內(nèi)容，以及下面所附的權(quán)利要求范圍內(nèi)的內(nèi)容。參考書目Sies和H.在1991年發(fā)表于紐約Elsevier的"Oxidative Stress, Oxidants and Antioxidants."《氧化壓力、氧化劑和抗氧化劑》第507頁；Hailiwell， B.和J.M.C.Gutteridge在1999年發(fā)表于"Oxford University Press Inc." 《牛津大學出版公司》第三期的"Free Radicals in Biology and Medicine."《生物學和醫(yī)學中 的自由基》第736頁；Albuszies， G.和U.B.Bruckner在2003年發(fā)表于"Intensive Care Med."《強化治療》29巻第10 期的"Antioxidant therapy in sepsis."《膿毒病的抗氧化劑治療》1632頁至1636頁；Abu-Zidan， RM.， L.D. 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權(quán)利要求
1.一種輔助生殖技術(shù)(ART)方法，該方法包括在體外使至少一個胚胎在培養(yǎng)基中生長；在所說的胚胎生長期間，不時地分析檢驗所說的至少一個胚胎的培養(yǎng)基，以確定該胚胎的狀態(tài)；利用所說的胚胎的狀態(tài)確定下述的時機中的至少之一將胚胎移植到子宮中的時機；將胚胎短期貯藏以供此后移植到子宮中的時機；將胚胎深低溫冷藏以供此后移植到子宮中的時機；調(diào)整所說的培養(yǎng)基，以便使所說的胚胎繼續(xù)生長的時機；以及將胚胎移植到替換的培養(yǎng)基中，以便使所說的胚胎繼續(xù)生長的時機。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所說的胚胎是通過用精子使至少一個卵子在體外受精而獲得的。
3. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所說的利用所說的胚胎的狀態(tài)包括反復地確定對所說的培養(yǎng)基的調(diào)整。
4. 權(quán)利要求l所述的方法，其中所說的狀態(tài)是胚胎對植入的發(fā)育能力，所說的胚胎移植的時機確定在最早的時刻，在該時刻，胚胎達到其植入成功高或然率的起點。
5. 權(quán)利要求l-4所述的方法，其中所說的子宮是哺乳動物的子宮，所說的哺乳動物選自人類、?？苿游?、馬科動物、貓科動物、犬科動物、羊科動物和鯨類。
6. 權(quán)利要求2所述的方法，該方法還包括通過分別分析檢驗卵泡液、精液漿和子宮內(nèi)層液，確定所說的卵子、精子和子宮的發(fā)育能力，當該卵子、精子和子宮的發(fā)育能力表明胚胎移植的植入或懷孕成功的或然率高時，即將其中所說的單個胚胎移植。
7. 權(quán)利要求2所述的方法，其中一些所說的卵子受精并長成若干所說的胚胎，其中可以利用至少所說的狀態(tài)選擇所說的胚胎進行移植。
8. 權(quán)利要求6所述的方法，其中一些所說的卵子受精并長成若干所說的胚胎，其中可以利用至少部分所說的狀態(tài)選擇所說的胚胎進行移植。
9. 權(quán)利要求l所述的方法，其中所說的分析檢驗包括獲得培養(yǎng)基的波譜。
10. 權(quán)利要求9所述的方法，該方法還包括通過下述的方式，校正所說的波譜確定若干胚胎培養(yǎng)基的記錄波譜與使用所說的若干胚胎的妊娠成功記錄之間的有效相互關(guān)系；其中所說的狀態(tài)是通過用所說的相互關(guān)系在所說的波譜上進行運算而確定的。
11. 權(quán)利要求10所述的方法，其中所說的波譜是一種光譜。
12. 權(quán)利要求11所述的方法，其中所說的光譜包含所說培養(yǎng)基中與氧化壓力有關(guān)的組分的信息。
13. 權(quán)利要求ll所述的方法，其中的胚胎是深低溫冷藏的，該方法還包括定期地獲得該深低溫冷藏的培養(yǎng)基的光譜，并由該深低溫冷藏的培養(yǎng)基的光譜確定所說胚胎的狀態(tài)，以便在深低溫冷藏期間對該深低溫冷藏的胚胎進行監(jiān)測。
14. 權(quán)利要求10所述的方法，其中一些所說的卵子受精并長成若干所說的胚胎，其中至少可以利用所說的狀態(tài)選擇所說的胚胎進行移植。
15. —種輔助生殖技術(shù)(ART)的方法，包括在卵子本身的卵泡液中提取多個卵子；分析檢驗每個所說卵子的卵泡液，以確定該卵子的狀態(tài)；利用所說的狀態(tài)選擇卵子進行深低溫冷藏或受精。
16. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所說的分析檢驗包括獲得卵泡液的波譜。
17. 權(quán)利要求16所述的方法，該方法還包括通過下述的方式，對所說的波譜進行校正確定一些卵子的卵泡液的記錄光譜與使用所說的一些卵子的受精和/或妊娠成功記錄之間的有效相互關(guān)系；其中所說的狀態(tài)是通過用所說的相互關(guān)系在所說的波譜上進行運算而確定的。
18. 權(quán)利要求17所述的方法，其中所說的波譜是一種光譜。
19. 一種可產(chǎn)生生殖健康程序在患者中獲得成功結(jié)果的或然率的數(shù)據(jù)，該方法包括使用所選擇的分模形式，獲得至少一種與液體培養(yǎng)基交換代謝產(chǎn)物的細胞的至少一種在該液體培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物的波譜，該細胞選自卵子、精子、和胚胎；利用所獲得的波譜，以及在患者群體中所建立的生殖健康程序的成功結(jié)果與用所選擇的分析模式得到的液體培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物的波譜之間的相互關(guān)系，產(chǎn)生針對所說的至少一種細胞的或然率數(shù)據(jù)。
20. 權(quán)利要求19所述的方法，其中所說的分析模式是多波長光吸收。權(quán)利要求19所述的方法，其中所說的分析模式是光的拉曼散射和光學熒光中的一種。權(quán)利要求20所述的方法，其中所說的光譜是短波長近紅外光譜。權(quán)利要求21所述的方法，其中所說的光譜是近紅外光譜。權(quán)利要求19所述的方法，其中所說的選擇的分析模式是醒R。權(quán)利要求19-24之任意一項所述的方法，其中所說的至少一種細胞是卵子。
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26.權(quán)利要求19-24之任意一項所述的方法,
27. 權(quán)利要求19-24之任意一項所述的方法,
28. 權(quán)利要求19-24之任意一項所述的方法:
29. 權(quán)利要求19-24之任意一項所述的方法:癥。
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34.權(quán)利要求19-24之任意一項所述的方法，權(quán)利要求19-24之任意一項所述的方法，權(quán)利要求19-24之任意一項所述的方法，權(quán)利要求19-24之任意一項所述的方法，權(quán)利要求19-24之任意一項所述的方法，
35. 權(quán)利要求19-24之任意一項所述的方法，
36. 權(quán)利要求19-24之任意一項所述的方法，其中所說的至少一種細胞是胚胎。其中所說的生殖健康程序是體外受精。其中所說的生殖健康程序涉及先兆子癇。其中所說的生殖健康程序涉及IAI或羊膜內(nèi)炎其中所說的生殖健康程序涉及早產(chǎn)/分娩。其中所說的生殖健康程序涉及反復流產(chǎn)。其中所說的生殖健康程序涉及胚胎植入。其中所說的生殖健康程序涉及性別確定。其中所說的生殖健康程序涉及環(huán)境污染/傳染。其中所說的生殖健康程序涉及異位妊娠。其中所說的生殖健康程序涉及正常妊娠。
37.權(quán)利要求19-24之任意一項所述的方法，其中所說的生殖健康程序涉及子宮內(nèi)膜異位癥。
38. —種輔助生殖技術(shù)(ART)的方法，該方法包括提供含有一個或多個精子的精子漿液樣品，分析檢驗該精子漿液，以確定該精子的狀態(tài);以及利用該狀態(tài)對選擇所說的精子進行深低溫冷藏或受精。
39. 權(quán)利要求38所述的方法，其中所說的分析檢驗包括獲得該漿液的波譜。
40. 權(quán)利要求39所述的方法，該方法還包括通過下述的方式，校正所說的波譜-確定一些精子的精液的記錄光譜與使用所說的一些精子的受精和/或妊娠成功記錄之間的有效相互關(guān)系；其中所說的狀態(tài)是通過用所說的相互關(guān)系在所說的波譜上進行運算而確定的。
41. 權(quán)利要求40所述的方法，其中所說的波譜是一種光譜。
42. —種輔助生殖技術(shù)(ART)的方法，該方法包括分析檢驗患者子宮的內(nèi)膜液，以確定該子宮對胚胎植入的發(fā)育能力；以及利用所說的發(fā)育能力確定植入的時機。
43. 權(quán)利要求42所述的方法，其中，如果該發(fā)育能力弱，則重復進行檢驗，在發(fā)育能力較強的時候確定為植入的時機。
44. 權(quán)利要求43所述的方法，其中，至少可對患者提供飲食、休息/運動、和醫(yī)療介入的其中之一種干預，以增強該發(fā)育能力。
45. 權(quán)利要求44所述的方法，其中所說的內(nèi)膜液用光學法在原位測定，所說的分析檢驗包括波譜的獲得。
46. 權(quán)利要求45所述的方法，該方法還包括通過下述的方式，校正所說的波譜確定一些患者體液的記錄光譜與所說的一些患者的妊娠成功記錄之間的有效相互關(guān)系；其中所說的狀態(tài)是通過用所說的相互關(guān)系在所說的波譜上進行運算而確定的。
47. 權(quán)利要求l-46所述的方法，其中所說的培養(yǎng)基是冰凍的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種確定包括體外受精的生殖健康程序中的理想時機及其結(jié)果的方法。該方法包括，針對患者群體，建立所說程序的成功結(jié)果與用選擇的分析模式所得的體液的光譜之間的相互關(guān)系；針對某個患者，用所說的分析模式獲得該患者體液的光譜。
文檔編號A61B17/435GK101600396SQ200680050781
公開日2009年12月9日 申請日期2006年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月9日
發(fā)明者戴維·休·伯恩 申請人:麥吉爾大學