專利名稱：基于負(fù)載了天然殺傷t細(xì)胞的配體、和抗原的b細(xì)胞的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療傳染病和癌癥的基于B細(xì)胞的疫苗，所述 B細(xì)胞負(fù)載了天然殺傷T細(xì)胞的配體，和抗原，更準(zhǔn)確地，由負(fù)載了 oi-半乳糖基神經(jīng)酰胺和抗原的B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫治療和預(yù)防疫苗，所述cc-半乳糖基神經(jīng)酰胺是一種能夠刺激天然殺傷T細(xì)胞的糖脂。
背景技術(shù)：
通常，腫瘤抗原不能由抗原呈遞細(xì)胞有效地呈遞，即，不能有效地誘 導(dǎo)免疫應(yīng)答?？鼓[瘤疫苗是新型治療性疫苗，其特征在于活化腫瘤特異性 免疫系統(tǒng)(例如，向抗原呈遞細(xì)胞引入腫瘤抗原)，從而誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫 應(yīng)答，以破壞癌細(xì)胞。
在可利用的疫苗方法中，已知利用抗原呈遞細(xì)胞(APC)諸如樹突細(xì) 胞(DC)的細(xì)胞疫苗可靠地生成有效的T細(xì)胞免疫性(Rosenberg, S. A. 等，自然醫(yī)學(xué)(Nat.Med.) ,10,909-915,2004)。因?yàn)橐呀?jīng)表明特別是基于 DC的疫苗有效誘導(dǎo)Ag-特異性效應(yīng)器和記憶T細(xì)胞，所以在大量臨床試 驗(yàn)中認(rèn)為它們是抗腫瘤免疫療法(Rosenberg, S. A.等，自然醫(yī)學(xué)(Nat. Med.): 10, 909-915, 2004)。樹突細(xì)胞對(duì)免疫療法而言是理想的抗原-呈遞細(xì)胞 (APC)，因?yàn)樗鼈兡軌虿东@Ag并然后遷移到淋巴器官內(nèi)，在那里它們向 相關(guān)的T細(xì)胞呈遞所述Ag。更重要地，它們提供對(duì)T細(xì)胞的強(qiáng)烈共刺激 (Figdor, C. G等，自然醫(yī)學(xué)(Nat. Med.) , 10， 475-480， 2004;和Banchereau, J. 等，細(xì)胞(Cell) ，106,271-274,2001)。針對(duì)試驗(yàn)和臨床研究充分地確定了 DC-疫苗方法。然而，DC在血液和淋巴組織中相對(duì)稀少，且很難先體外 后體內(nèi)地從血液?jiǎn)魏思?xì)胞增多它們的數(shù)量，這兩點(diǎn)均體現(xiàn)處它們?cè)谝呙缰?的普遍應(yīng)用的主要缺點(diǎn)(Schultze， J.L.等，免疫學(xué)趨勢(shì)(Trends Immunol.), 25, 659-664, 2004)。B細(xì)胞為細(xì)胞疫苗提供了有吸引力的備選來源，原因在于它們?cè)诹馨?br> 組織和血液中豐富，并易于先體外后體內(nèi)地?cái)U(kuò)大(Schultze，J.L.等，免疫學(xué) 趨勢(shì)(Trends Immunol.) ， 25， 659-664， 2004; von Bergwelt-Baildon, M.S.等， 血液(Blood) ， 99, 3319-3325， 2002;和Schultze， J. L.等，臨床研究雜志(J. Cin. Invest.) ， 100， 2757-2757， 1997)，并且在腸胃外施用后返回到淋巴器官。
盡管這些優(yōu)勢(shì)，并沒有將B細(xì)胞考慮作為細(xì)胞疫苗的來源，原因在于 它們的免疫原性很低。事實(shí)上，累積的證據(jù)顯示可能是由于缺乏共刺激， 它們?cè)贑D4和CD8T細(xì)胞中直接誘導(dǎo)免疫耐受性(Bennett, S. R.等，試驗(yàn) 醫(yī)學(xué)雜志(J. Exp. Med.) , 188, 1977-1983, 1998;和Eynon, E. E.等，試驗(yàn)醫(yī) 學(xué)雜志(J,Exp.Med.) ， 175, 131-138， 1992)。然而，'活化的'B細(xì)胞能夠 使CD4和CD8T細(xì)胞致敏(von Bergwelt-Baildon, M. S.等，血液(Blood)， 99, 3319-3325, 2002; Schultze, J. L.等，臨床研究雜志(J. Clin. Invest) , 100, 2757-2765， 1997; Lapointe, R.等，癌癥研究(Cancer Res.) ,63,2836-2843, 2003;和Heit，A.等，免疫學(xué)雜志(J. Immunol.) ,172,1501-1507,2004)，這 提示，當(dāng)通過適當(dāng)?shù)拇碳の锛せ頑細(xì)胞時(shí)，其可以作用為能夠誘導(dǎo)Ag-特 異性T細(xì)胞免疫性的APC的作用。
充分確定地，總體上，zTSTKT細(xì)胞在多種免疫應(yīng)答和免疫病理學(xué)中扮 演至關(guān)重要的角色。盡管它們?cè)谛∈笾写砩儆?%的淋巴細(xì)胞，但是 WKT細(xì)胞控制針對(duì)自體-和外源-Ag的應(yīng)答，并決定是否誘導(dǎo)耐受性或免 疫性(Kronenberg, M.,免疫性年度綜述(Annu. Rev. Immunol.), 23， 877-900, 2005;禾口 Park, S. H. & Bendelac， A.，自然(Nature) ，406,788-792,2000)。 它們?cè)谀[瘤、糖尿病中和免疫-專用位點(diǎn)處起到免疫性抑制子的作用 (Sonoda， K. H.，等,試驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J. Exp. Med.) ，190,1215-1226,1999)。
相反，配體-介導(dǎo)的z"NKT細(xì)胞活化導(dǎo)致T、 B和NK細(xì)胞以及DC的 活化。注射aGalCer，即一種/NKT配體，通過調(diào)控NK和T細(xì)胞產(chǎn)生抗 腫瘤免疫性(Moodycliffe, A. M.,等，自然免疫性(Nat. Immunol.), 1, 521-525, 2000)。
a-半乳糖基神經(jīng)酰胺(ccGalCer)是一種從海洋海綿體中提取的糖脂， 它是天然殺傷T細(xì)胞的配體，并由在抗原呈遞細(xì)胞(APC)上的CDld呈遞，
5所述天然殺傷T細(xì)胞具有Val4+ T細(xì)胞受體(TCR) (K證ano等，科學(xué) (Science) ，278: 1626， 1997)。天然殺傷T細(xì)胞的活化導(dǎo)致IFN-y和IL-4 的大規(guī)模產(chǎn)生，由此能夠控制針對(duì)傳染病或癌癥的免疫應(yīng)答(Chen等，免 疫學(xué)雜志(J. Immunol.)) , 159: 2240， 1997; Wilson等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué) 報(bào)(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.) ，100:10913,2003)。
共施用了蛋白質(zhì)Ag和oiGalCer的小鼠發(fā)展了體液的和細(xì)胞-介導(dǎo)的免 疫性，其包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答(Hermans， I. F.,等，免疫學(xué)雜志(J. Immunol), 171, 5140-5147, 2003;和Stober， D.等，免疫學(xué)雜志(J. Immunol), 170,2540-2548,2003)。此外，近期的研究己經(jīng)證明了負(fù)載aGalCer的DC 比游離形式的aGalCer產(chǎn)生更長(zhǎng)期-持久的/NKT細(xì)胞應(yīng)答，這提示/NKT-配體的輔助作用(adjuvancity)能夠通過將其靶定到專門的APC上得到增 強(qiáng)。
本發(fā)明人證實(shí)了 zmT-配體在B細(xì)胞上的呈遞能夠?qū)⑺鼈儚哪褪茉?轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖咴?，由此產(chǎn)生針對(duì)展示在B細(xì)胞MHC分子上的Ag的強(qiáng)烈 免疫性。為了驗(yàn)證該證實(shí)，并由此完成本發(fā)明，本發(fā)明人進(jìn)一步證實(shí)了負(fù) 載aGalCer的、肽-脈沖的B細(xì)胞和負(fù)載aGalCer的、腺病毒-轉(zhuǎn)導(dǎo)的B細(xì) 胞在生成抗原特異性免疫性和抗-腫瘤活性中的功效。
內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是提供免疫治療/預(yù)防疫苗和抗腫瘤疫苗，所述疫苗能夠 誘導(dǎo)抗原-呈遞B細(xì)胞-介導(dǎo)的抗原-特異性免疫應(yīng)答。受到負(fù)載抗原的B 細(xì)胞的CDld分子上的aGalCer刺激的天然殺傷T細(xì)胞將耐受原性的B細(xì) 胞轉(zhuǎn)變免疫原性的抗原呈遞細(xì)胞。
技術(shù)方案
本發(fā)明提供由B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫治療/預(yù)防性疫苗和抗腫瘤疫苗，所 述B細(xì)胞負(fù)載了天然殺傷T細(xì)胞的配體，和抗原。
本發(fā)明還提供由B細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤疫苗，所述B細(xì)胞負(fù)載了天然殺 傷T細(xì)胞的配體并表達(dá)腫瘤抗原。本發(fā)明進(jìn)一步提供由負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞介導(dǎo)的天然殺傷T細(xì)胞激 活劑。
另外，本發(fā)明提供由表達(dá)腫瘤抗原的B細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)誘導(dǎo)物。
以下，詳述本發(fā)明
本發(fā)明提供由B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫治療/預(yù)防性疫苗和抗腫瘤疫苗，所 述B細(xì)胞負(fù)載了單獨(dú)的天然殺傷T細(xì)胞的配體，或還負(fù)載了抗原。
天然殺傷T細(xì)胞的配體包括下述源自鞘氨醇單胞菌屬亞種 (Sphingomonas spp.) 的 a-galacturonosylceramide 禾口 a-glucuronosylceramide (Mattner， J.等自然(Nature)434:525, 2005, Kinjo, Y. 等自然(Nature) 434:520,2005)，源自結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis) 的磷脂酰肌醇四甘露糖苷(Fischer,K.等PNAS 101:10685, 2004)，自體抗原 異球三己糖基神經(jīng)酰胺(Zhou,D.等科學(xué)(Science) 306:1786, 2004)和神經(jīng) 節(jié)苷脂GD3 (Wu， D. Y.等試驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J. Exp. Med.) 198:173,2003)， 磷脂酰膽堿(免疫學(xué)雜志(J. Immunol.) 175:977,2005)， (3-半乳糖基神經(jīng)酰 胺(卩GalCer，Ortaldo JR等，免疫學(xué)雜志(J. Immunol.) 172:943),利什曼 表面糖苷鍵脂磷酸聚糖和糖基肌醇磷脂(glycoinositol phospholipid)(試驗(yàn) 醫(yī)學(xué)雜志(J. Exp. Med.) 200:895, 2004)， aGalCer衍生物(3-異頭GalCer 和a-異頭GalCer(免疫學(xué)雜志(J. Immunol.) 173:3693,2004)， aGalCer變 體(美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(J.Am.Chem. Soc.) 126:13602, 2004)和細(xì)菌脂質(zhì)抗 原諸如源自皮諾卡氏菌(Nocardia falcinica)的葡萄糖單霉菌酸酯(Moody, D. B.等試驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J. Exp. Med.) 192:965,2000)。
由于己經(jīng)充分確定了負(fù)載aGalCer的DC激活z'NKT細(xì)胞(van der Vliet HJ,等，免疫學(xué)方法雜志(J Immunol Methods.) , l;247(l-2):61-72, 2001)， 本發(fā)明人檢查了負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞是否也同樣作用。
從小鼠中分離0(:和0019+ B細(xì)胞(

圖1)。每個(gè)細(xì)胞用不同濃度的 aGalCer脈沖，再與NKT雜交瘤共培養(yǎng)。然后，測(cè)量了培養(yǎng)上清液中的IL-2 水平。作為結(jié)果，負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞(B/ aGalCer)和負(fù)載aGalCer的 DC (DC/ aGalCer)刺激NKT雜交瘤產(chǎn)生IL-2 (見圖30)。因此，證實(shí)了 B/aGalCer和DC/aGalCer能夠先體外后體內(nèi)地激活/NKT細(xì)胞。為了研究體內(nèi)施用的B/aGalCer和DC/aGalCer是否能夠激活免疫細(xì) 胞，本發(fā)明人將來自小鼠的B/aGalCer或DC/aGalCer靜脈內(nèi)注射到同種 小鼠中，并通過ELISPOT測(cè)量IL-4-和IFN-y-生成細(xì)胞的水平。具體地， 對(duì)野生型C57BL/6或Ja281-a小鼠靜脈內(nèi)注射了賦形劑賦形劑、aGalCer、 負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞或負(fù)載aGalCer的DC。 一周后，分離脾細(xì)胞，制 備單細(xì)胞，將其置于ELISPOT平板上。將賦形劑或aGalCer添加到該平 板上，隨后培養(yǎng)6小時(shí)用于進(jìn)行刺激。按照供應(yīng)商的說明(IL-4 ELISPOT 試劑盒，IFN-y ELISPOT試劑盒；R&D系統(tǒng)(R&D system))進(jìn)行ELISPOT 測(cè)定，從而測(cè)量分泌IL-4和IFN-y的細(xì)胞。
作為結(jié)果，注射B/aGalCer和DC/aGalCer都誘導(dǎo)大量IL-4和IFN-y-生成細(xì)胞(圖2)。然而，應(yīng)該注意，甚至在缺乏(xGalCer再刺激的條件下， 檢測(cè)出顯著量的該細(xì)胞因子-生成細(xì)胞。然而，本發(fā)明人認(rèn)為IL-4-和IFN-y-生成細(xì)胞的誘導(dǎo)依賴于/NKT細(xì)胞，因?yàn)樗话l(fā)生在缺乏/NKT群的 Ja 281-/-小鼠中(見圖2)。
本發(fā)明人將CFSE (羧基熒光素琥珀酰亞胺基酯)標(biāo)記的B/aGalCer 靜脈內(nèi)施用到首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠中，并且然后，在施藥后24或48小時(shí) 的時(shí)候，本發(fā)明人通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法分析了在CFSE+細(xì)胞上的共刺激分 子，從而確定如果注射后，在負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞中誘導(dǎo)了任何改變將 會(huì)怎么樣。作為結(jié)果，24小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)了高水平的CD86而非CD80的表達(dá) (圖3)。 CD40和MHCII也受到輕微的上調(diào)?？傊?，體內(nèi)施用B/aGalCer 在24或48小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)B細(xì)胞的活化。
其次，本發(fā)明人闡釋aGalCer和MHC I-限制的肽在B細(xì)胞上的共脈 沖是否能夠使肽-特異性CD8+T細(xì)胞致敏。為了該目的，本發(fā)明人首先適 當(dāng)?shù)貙FSE-標(biāo)記的OVA-特異性CD8+T細(xì)胞移植到小鼠中，然后施用賦 形劑-脈沖的B細(xì)胞(單獨(dú)的B細(xì)胞)、aGalCer-脈沖的B細(xì)胞(BAxGalCer)、 賦形劑+肽-脈沖的B細(xì)胞(B/pep)或aGalCer +肽-脈沖的B細(xì)胞 (B/otGalCer/pep)。然后，從脾和淋巴結(jié)獲得淋巴細(xì)胞，隨后在移植了B細(xì) 胞的小鼠中測(cè)量CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。作為結(jié)果，在接受單獨(dú)的B的小鼠中 幾乎沒有誘導(dǎo)OVA-特異性CD8+T細(xì)胞的分裂；然而，在BAxGalCer組中 注意到OVA-特異性CD8+T細(xì)胞的弱分裂，其可能具有Ag-非特異性起源。注射B/pep誘導(dǎo)了 OVA-特異性CD8+T細(xì)胞的大量分裂。且被給予 B/aGalCer/pep的小鼠顯示出增強(qiáng)的CD8+T細(xì)胞分裂，其中多于40%的由 此生成的細(xì)胞產(chǎn)生IL-2，且最令人驚訝地，多于卯％的由此生成的細(xì)胞以 比B/pep組高得多的水平產(chǎn)生IFN-Y (見圖4)。這些結(jié)果提示高得多的 CD8+ T細(xì)胞活化率能夠通過將aGalCer負(fù)載到B/pep上而實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明人研究了基于B細(xì)胞的疫苗方法是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞毒性免疫 性。具體地，本發(fā)明人用單獨(dú)的B、 B/aGalCer、 B/pep或B/aGalCer/pep 靜脈內(nèi)注射C57BL/6小鼠組，并且然后在體內(nèi)確定CTL活性。作為結(jié)果， 僅B/aGalCer/pep完全裂解肽-脈沖的耙標(biāo)(圖5)。且B/aGalCer/pep-處理 的組在針對(duì)所述肽的生產(chǎn)IFN- Y的CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量上，顯示出顯著的 增加(圖6，左圖)。當(dāng)用OVA-包被的同源脾細(xì)胞進(jìn)行后繼免疫作用以描 繪CTL反應(yīng)性時(shí)，被給予單獨(dú)的B或BAxGalCer的小鼠針對(duì)致敏正常應(yīng) 答，并產(chǎn)生大量的肽-特異性生產(chǎn)正仆￥的008+ T細(xì)胞(圖6，右圖)。 然而，當(dāng)用相關(guān)的肽在體外再刺激來自于B/pep免疫的小鼠脾細(xì)胞時(shí)，與 注射了單獨(dú)的B的小鼠的那些相比，生產(chǎn)IFN-Y的CD8+T細(xì)胞的數(shù)量減 少，這提示那些小鼠耐受所述肽。相反，用B/aGalCer/pep接種的小鼠獲 得了比接受了 B/aGalCer或單獨(dú)的B的組所獲得的多得多數(shù)量的肽-反應(yīng) 性CD8+T細(xì)胞，這提示這是記憶性應(yīng)答。
本發(fā)明人比較了基于B細(xì)胞的疫苗方法和DC疫苗方法在產(chǎn)生細(xì)胞毒 性上的功效。為了該目的，本發(fā)明人確定了在體內(nèi)獲得完全的靶細(xì)胞裂解 所需要的最少細(xì)胞數(shù)量。鑒于DC的表面積比B細(xì)胞的表面積大得多， B/aGalCer/pep在產(chǎn)生細(xì)胞毒性中與DC/aGalCer/pep —樣有效。同時(shí)， DC/pep-處理的組的體內(nèi)細(xì)胞毒性的模式與DC/aGalCer/pep-處理的組的非 常類似，這說明將aGalCer負(fù)載到DC上沒有進(jìn)一步增強(qiáng)DC/pep疫苗功 效。
本發(fā)明人接下來檢查了哪些類型的免疫細(xì)胞參與CTL應(yīng)答的產(chǎn)生。為 了該目的，在用B/aGalCer/pep接種小鼠之前4天或之后4天，本發(fā)明人 用消耗的Ab注射它們，并然后進(jìn)行體內(nèi)CTL測(cè)定。作為結(jié)果，不考慮消 耗的時(shí)間，CTL活性的產(chǎn)生不受CD4+消耗或NKl.l+細(xì)胞消耗的妨礙。在 另一方面，CD8消耗完全阻斷了靶細(xì)胞的殺傷(圖9)。
9可以爭(zhēng)論的是，肽-脈沖的B細(xì)胞不起APC的作用，而起肽儲(chǔ)存庫(kù)的 作用，宿主DC從其中取出肽，從而誘導(dǎo)CTL應(yīng)答。為了探究這種可能性， 本發(fā)明人使用了 bm-l小鼠。這些小鼠的細(xì)胞能夠?qū)VA肽負(fù)載到它們的 MHCI類分子上，但是由此生成的復(fù)合物由于在H-2K區(qū)域中的突變，不 被同族CD8+T細(xì)胞識(shí)別。來自該品系的B細(xì)胞正常表達(dá)CDld，并對(duì) aGalCer作出應(yīng)答從而刺激/NKT的活化，這說明B和z皿T之間的相互 作用是完好無(wú)損的。此外，當(dāng)利用來自野生型小鼠的B細(xì)胞制備 BAxGalCer/pep，并然后將其注射到野生型小鼠中時(shí)，產(chǎn)生了完整的體內(nèi) OVA-特異性細(xì)胞毒性。然而，當(dāng)將來源自bm-l小鼠B細(xì)胞的 B/aGalCer/pep注射到野生型小鼠中時(shí)，未能產(chǎn)生OVA-特異性細(xì)胞裂解活 性，這提示在受體小鼠中的DC或其他專門的APC不負(fù)責(zé)CTL的產(chǎn)生(圖 11)。
本發(fā)明接下來檢查了當(dāng)分別脈沖(xGalCer和肽并然后一起注射時(shí)，是 否可能產(chǎn)生CTL。作為結(jié)果，用'B/aGalCer加B/pep'接種的小鼠未能產(chǎn)生 體內(nèi)的細(xì)胞毒性(圖12)。該結(jié)果證明為了產(chǎn)生OVA-特異性細(xì)胞毒性， 肽和aGalCer必須在相同的B細(xì)胞上呈遞。
本發(fā)明人還研究了用B/aGalCer/pep接種是否產(chǎn)生抗-腫瘤免疫性。為 了測(cè)試預(yù)防性抗-腫瘤活性，在將OVA-轉(zhuǎn)染的黑素瘤皮下移植到小鼠組中 之前，用單獨(dú)的B、 B/aGalCer、 B/pep 、 B/aGalCer/pep 、 DC/pep或 DC/aGalCer/pep對(duì)它們接種一次。作為結(jié)果，盡管所有的小鼠最后都發(fā)育 了腫瘤，在用B/aGalCer接種的小鼠中觀察到了稍微延遲的腫瘤生長(zhǎng)模式。 相反，接受了 B/aGalCer/pep、 DC/pep或DC/aGalCer/pep的小鼠沒有發(fā)育 腫瘤(見圖13)。為了檢査這些小鼠是否建立了長(zhǎng)期的抗-腫瘤活性，本發(fā) 明人在第一次腫瘤接種后70天時(shí)，用相同的腫瘤細(xì)胞再次攻擊了存活的 無(wú)腫瘤小鼠。本發(fā)明人在那些小鼠中沒觀察到腫瘤生長(zhǎng)，這證明用 B/otGalCer/pep接種引起了針對(duì)所述腫瘤的記憶免疫性(見圖14)。
下一步，本發(fā)明檢查了用B/txGalCer/pep接種是否根除預(yù)先-存在的腫 瘤。作為結(jié)果，在用DC/pep、 DC/aGalCer/pep或B/aGalCer/pep接種的小 鼠中，完全抑制了腫瘤的生長(zhǎng)(見圖15和圖16)。
為了確定這種基于B細(xì)胞的疫苗方案是否能夠應(yīng)用到真正的腫瘤Ag中，本發(fā)明人選擇了 Her-2/^"模型。本發(fā)明人在被給予負(fù)載otGalCer的、 Her-2Mw 63.71-脈沖的B細(xì)胞的小鼠中體內(nèi)觀察到顯著水平的Her-2/^w-特 異性細(xì)胞毒性(見圖17)。為了檢查在該模型中的治療性抗腫瘤活性，本 發(fā)明人在用負(fù)載aGalCer的、Her-2/"e" 63_71-脈沖的B細(xì)胞接種小鼠前，向 它們注射表達(dá)Her-2/"w的腫瘤細(xì)胞。腫瘤接種后，用BAxGalCer或B/pep 接種的那些小鼠的存活率比用單獨(dú)的B接種的那些稍好(見圖18)。相反， 用B/ccGalCer/pep接種的全部小鼠在該試驗(yàn)過程中始終存活。在實(shí)體瘤模 型中，用基于B細(xì)胞的疫苗或基于DC的疫苗接種移植了腫瘤的小鼠。作 為結(jié)果，用負(fù)載aGalCer的、Her-2/"ew 63.71-脈沖的B細(xì)胞接種的小鼠中腫 瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制與用DC疫苗接種的小鼠中的差不多(見圖19)。
因此，證明了本發(fā)明的基于B細(xì)胞的疫苗在產(chǎn)生預(yù)防性和治療性抗腫 瘤免疫性中與基于DC的疫苗一樣有效。
本發(fā)明還提供由B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫治療/預(yù)防性疫苗和抗腫瘤疫苗， 所述B細(xì)胞負(fù)載了天然殺傷T細(xì)胞的配體并表達(dá)抗原。
與肽-脈沖的細(xì)胞疫苗不同，由病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)從而表達(dá)完整抗原的細(xì)胞 疫苗能夠在不受關(guān)于主要組織相容性復(fù)合體單元型的限制下，應(yīng)用于每個(gè) 人，并能夠同時(shí)誘導(dǎo)不同的表位4寺異性免疫應(yīng)答，特別是體液免疫應(yīng)答和 細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。用腺病毒(AdHM)轉(zhuǎn)導(dǎo)B細(xì)胞，所述腺病毒具有 編碼Her-2/"w，即腫瘤-相關(guān)抗原的細(xì)胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域的基因。作為結(jié) 果，B細(xì)胞的ccGalCer呈遞不受用AdHM的轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響(見圖21)。免疫 作用后一周，在用B細(xì)胞和B/aGalCer免疫的小鼠中，沒有觀察到靶細(xì)胞 的裂解。相反，在用B/AdHM和B/AdHM/aGalCer免疫的小鼠中觀察到有 效的細(xì)胞毒性T細(xì)胞免疫應(yīng)答(見圖22和圖24)。
盡管差別不顯著，由負(fù)載aGalCer的、轉(zhuǎn)導(dǎo)腺病毒的B細(xì)胞 (B/AdHMAxGalCer)介導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答比由用腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的B 細(xì)胞(B/AdHM)介導(dǎo)的那些持續(xù)更高且更久。這些結(jié)果顯示負(fù)載在B細(xì) 胞上的aGalCer，與肽脈沖不同，不影響細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)。然 而，當(dāng)將負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞疫苗施用到小鼠時(shí)，刺激了 NKT細(xì)胞， 并由此最終體內(nèi)激活NK細(xì)胞，這與施用了用腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的B細(xì)胞疫苗的 小鼠不同(見圖25)。
ii為了測(cè)量基于B細(xì)胞的疫苗方案在產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答中的 效率，本發(fā)明人通過用未達(dá)最佳標(biāo)準(zhǔn)的劑量接種小鼠，研究了耙細(xì)胞的裂 解，所述未達(dá)最佳標(biāo)準(zhǔn)的劑量不足以誘導(dǎo)完全的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng) 答。作為結(jié)果，由腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)從而表達(dá)抗原的B細(xì)胞能夠有效地誘導(dǎo)抗原
特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，即使與肽-脈沖的B細(xì)胞疫苗相比，其 需要大量的B細(xì)胞。由于大約占總數(shù)20%的由腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的B細(xì)胞實(shí)際 表達(dá)Her-2/"w，所以被迫在作用上低估用腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的B細(xì)胞的功效。 在移植少量B細(xì)胞的情形中，由負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞誘導(dǎo)的NKT細(xì)胞 的活化有助于由轉(zhuǎn)導(dǎo)了腺病毒的B細(xì)胞誘導(dǎo)的靶細(xì)胞裂解。
感染B細(xì)胞從而表達(dá)腫瘤抗原的病毒能夠由腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、痘 苗病毒、痘病毒和新培斯病毒所示范，但并不總限于此。除使用病毒載體 之外，下列方法能夠用于轉(zhuǎn)移編碼抗原的基因；l)使DNA與脂質(zhì)體結(jié)合， 從而保護(hù)該DNA免于被酶分解或被吸收到內(nèi)體中；2)使DNA與分子綴 合物或合成的配體結(jié)合，從而增加轉(zhuǎn)染功效(例如(ex):脫唾液酸糖蛋 白、運(yùn)鐵蛋白和聚合的IgA); 3)利用PTD (蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域)構(gòu)建新型 DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，從而增加編碼抗原的基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率(例如(ex):Mph-l); 和4)將肽或蛋白質(zhì)引入到B細(xì)胞中，從而呈遞抗原。
本發(fā)明進(jìn)一步提供由負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞介導(dǎo)的天然殺傷T細(xì)胞活 化劑。
如上文所解釋地，本發(fā)明的負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞，與負(fù)載aGalCer 的樹突細(xì)胞一樣，在體外刺激天然殺傷T細(xì)胞雜交瘤，由此誘導(dǎo)IL-2的 分泌(見圖30)，并有效地活化/NKT細(xì)胞，所述/NKT細(xì)胞能夠在體內(nèi) 誘導(dǎo)不同免疫細(xì)胞的活化(見圖2)。因此，本發(fā)明的負(fù)載aGalCer的B 細(xì)胞能夠用作天然殺傷T細(xì)胞的活化劑，這正如負(fù)載cxGalCer的樹突細(xì)胞 也能夠一樣。
本發(fā)明還提供了由表達(dá)腫瘤抗原的B細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性應(yīng)答誘導(dǎo)劑。
與用肽脈沖以誘導(dǎo)細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的B細(xì)胞疫苗不同，轉(zhuǎn)導(dǎo)了 腺病毒的B細(xì)胞疫苗能夠同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。 為了證實(shí)用AdHM轉(zhuǎn)導(dǎo)的B細(xì)胞是否能夠誘導(dǎo)Her-2/"ew特異性抗體，分別用B/AdHM和B/AdHM/aGalCer免疫小鼠，并然后測(cè)量了血清中的抗 -Her-2/wew抗體滴度。作為結(jié)果，在用B/AdHM和B/AdHM/aGalCer免疫 的兩個(gè)組中，抗-Her-2/"w抗體滴度長(zhǎng)期維持在高水平(見圖27)。與用 單獨(dú)的B細(xì)胞(B)禾n B/aGalCer免疫的組不同，在用B/AdHM和 B/AdHM/aGalCer免疫的兩個(gè)組中均產(chǎn)生了體液免疫應(yīng)答(見圖28)。
在用基于B細(xì)胞的疫苗免疫后一周時(shí)，本發(fā)明人進(jìn)行了表達(dá)Her-2/ww 的鼠科腫瘤細(xì)胞(TAUF)的靜脈內(nèi)注射，隨后研究了存活率。作為結(jié)果， 施用了負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞(B/aGalCer)或轉(zhuǎn)導(dǎo)了 AdHM的B細(xì)胞 (B/AdHM)的小鼠比施用了單獨(dú)的B細(xì)胞的那些存活得更久。此外，施用 了這樣的B細(xì)胞的小鼠的抗腫瘤作用比用B/AdHM免疫的小鼠的那些更 顯著，所述這樣的B細(xì)胞用表達(dá)Her-2/加"的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，并負(fù)載了 aGalCer (見圖29)。因此，證實(shí)了負(fù)載(xGalCer的和轉(zhuǎn)導(dǎo)了腺病毒的B細(xì)胞疫苗 能夠有效地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，從而預(yù)防腫瘤。
為了證實(shí)所述B細(xì)胞疫苗的治療作用，在向小鼠尾靜脈靜脈內(nèi)注射 TAUF而建立肺癌之后，分別用B、B/aGalCer、B/AdHM和B/AdHM/aGalCer 免疫BALB/c小鼠。作為結(jié)果，在用單獨(dú)的B細(xì)胞處理的小鼠組中觀察到 最短的存活時(shí)間，且用BAxGalCer疫苗處理的組的結(jié)果類似得短。同時(shí)， 與用B或B/aGalCer處理的組相比，在用B/AdHM疫苗處理的小鼠組中存 活時(shí)間或多或少地得到了延長(zhǎng)，但是腫瘤的形成沒有得到完全抑制。然而， 與所有其他組相比，用B/AdHM/aGalCer處理的組中的存活時(shí)間長(zhǎng)得多， 且因此B/AdHM/aGalCer組的抗腫瘤作用優(yōu)于任何其他免疫的組(見圖 29)。
除天然殺傷T細(xì)胞配體和B細(xì)胞外，本發(fā)明的疫苗能夠另外包括一種 或多種具有與它們相同或相似作用的有效成分。除以上提及的有效成分 外，所述疫苗還能夠包括一種或多種用于施藥的藥用載體。能夠通過混合 多于一種成分來選擇或制備所述藥用載體，所述成分是選自由下列各項(xiàng)組 成的組中的一項(xiàng)鹽水、滅菌水、林格溶液、緩沖鹽、葡萄糖溶液、麥芽 糖葡萄糖溶液、甘油和乙醇?？梢蕴砑悠渌钠胀ㄌ砑觿T如抗氧化劑、 緩沖溶液、制菌劑等。為了制備可注射的溶液，諸如水性溶液、混懸液和 乳狀液，可以另外添加稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合劑和潤(rùn)滑劑?？梢砸詫?duì)于每種疾病合適的形式或根據(jù)成分，通過遵循雷明頓制藥科學(xué)
(Remington's Pharmaceutical Science)(最新的版本)，馬克出版公司 (Mack Publishing Company), EastonPA中所述的方法進(jìn)一步制備本發(fā)明 的疫苗。
本發(fā)明的疫苗能夠通過腸胃外施用，并且所述腸胃外施用包括皮下注 射、靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射和胸內(nèi)注射。為了將疫苗制備為用于腸胃外施 藥的制劑，將負(fù)載了天然殺傷T細(xì)胞配體的B細(xì)胞、負(fù)載了天然殺傷T 細(xì)胞配體和肽的B細(xì)胞、或用表達(dá)腫瘤抗原的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的B細(xì)胞與穩(wěn)定劑 或緩沖劑混合，從而生成溶液或混懸液，然后將其配制成安瓿或小瓶(參 見關(guān)于生產(chǎn)用于樹突細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的病毒載體的標(biāo)準(zhǔn))。
所述疫苗能夠以有效劑量施用，以在患者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。例如，能 夠一天一次或幾次地，以劑量lxl()S lxl(^個(gè)細(xì)胞/kg，和更優(yōu)選地，lxl04 個(gè)細(xì)胞/kg lxl()8個(gè)細(xì)胞/kg，向患者施用該疫苗。為了制備負(fù)載了 ctGalCer 的B細(xì)胞疫苗，必須以每lxl(^ lx107個(gè)B細(xì)胞/ml中1~2 pg/ml的濃度， 向培養(yǎng)基中補(bǔ)充aGalCer。為了制備aGalCer和肽共脈沖的B細(xì)胞疫苗， 培養(yǎng)基必須以每lx106 lx107 B細(xì)胞/ml中1~2嗎/ml的濃度補(bǔ)充aGalCer 和以每lx106 lxl07B細(xì)胞/ml中1~10 Kg/ml的濃度補(bǔ)充肽。
aGalCer似乎在嚙齒動(dòng)物和猿中不誘導(dǎo)毒性(Nakata等，癌癥研究 (Cancer Res.) , 58: 1202-1207, 1998)。當(dāng)將2200昭/kg的aGalCer施用于 小鼠時(shí)，尚沒有報(bào)告副作用(Giaccone等，臨床癌癥研究(Clin. Cancer Res.)， 8:3702,2002)。由臨床試驗(yàn)，按照aGalCer的全身施用，己經(jīng)報(bào)告了輕微 的頭痛作為副作用(Mie Nieda等，血液(Blood) ， 103: 383-389， 2004， Giaccone等，臨床癌癥研究(Clin. Cancer Res.) ，8:3702,2002)，這能夠通 過施用對(duì)乙酰氨基酚得到預(yù)防。如果可能，存在很少的機(jī)會(huì)來顯示輕微的 全身性副作用(Giaccone等，臨床癌癥研究(Clin. Cancer Res.) ， 8: 3702， 2002)。在本發(fā)明中，通過劑量增加研究，aGalCer不引起劑量-限制性毒性 (50-4800 jig/m2)，并且顯示出耐受性，這說明aGalCer是非常安全的物質(zhì)。
本文中的肽包括病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲和腫瘤來源的抗原肽，并 且通過病毒載體介導(dǎo)向B細(xì)胞中引入的抗原包括病毒、細(xì)菌、真菌、寄生 蟲和腫瘤-來源的抗原。"抗原"意指在侵入宿主時(shí)，通過被免疫系統(tǒng)識(shí)別而能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng) 答的任一物質(zhì)(例如(ex)，蛋白質(zhì)、肽、腫瘤細(xì)胞、糖蛋白、糖脂、活 病毒、殺死的病毒、DNA等)。所述抗原可以以純化的或非-純化的形式制
備，但是純化的形式是優(yōu)選的。本發(fā)明的抗原包括病原體蛋白、重組蛋白、
肽、多糖、糖蛋白、脂多糖和DNA分子(多核苷酸)、腫瘤細(xì)胞、活病毒 和殺死的病毒。
可以將下面的抗原列表中存在的抗原提供為用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的工 具，而替代本發(fā)明實(shí)施例的腫瘤-相關(guān)抗原，但是不總限于此。所述列表包 括流感病毒抗原(血凝素和神經(jīng)氨酸酶抗原)、百日咳博德特氏菌
(Bordetellapertussis)抗原(百日咳毒素、絲狀血凝素和pertactin)、人乳 頭狀瘤病毒(HPV)抗原(糖蛋白)、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)抗 原(血清組A, B, C， Y和W-135的莢膜多糖)、破傷風(fēng)類毒素、白喉抗原
(白喉類毒素)、肺炎球菌抗原(3型肺炎鏈球菌(Streptococcuspnemoniae) 莢膜多糖)、結(jié)核抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原(GP-120、 GP-160、 p18、 Tat、 Gag、 Pol和Env)、霍亂抗原(霍亂毒素B亞基)、葡萄球菌抗 原(葡萄球菌腸毒素B)、志賀氏菌屬(shigella)抗原(志賀氏菌屬多糖)、 皰疹性口炎病毒抗原(皰疹性口炎病毒糖蛋白)、巨細(xì)胞病毒(CMV)抗原、 肝炎抗原(甲型肝炎(HAV),乙型肝炎(HBV),丙型肝炎(HCV)， 丁型肝炎 (HDV)和庚型肝炎(HGV)抗原)(核心抗原和表面抗原)、呼吸道合胞病毒 (RSV)抗原、單純皰疹抗原或它們的組合物(例如(ex),白喉、百日咳和 破傷風(fēng)、DPT)、疏螺旋體屬物種(Borrelia sp.)抗原(例如(ex)， OspA, OspB 和OspC抗原)、白色念珠菌(Candida albicans)抗原(例如(ex) ， MP65) 和瘧原蟲抗原(例如(ex) ，CS蛋白)。
腫瘤抗原是通過野生型基因的體突變產(chǎn)生的。癌癥抗原包括歸因于腫 瘤細(xì)胞遺傳不穩(wěn)定性的腫瘤-特異性抗原，和腫瘤-相關(guān)抗原，內(nèi)源自體抗 原，其較多地在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，并臨時(shí)地在腫瘤發(fā)育階段表達(dá)或限制性 地表達(dá)于特異性組織中。腫瘤特異性抗原例如HPVE6/E7，其為癌癥病毒 來源的抗原，且腫瘤-相關(guān)抗原例如gp100、酪氨酸酶，TRP-1 (酪氨酸酶-相關(guān)蛋白-l)、 TRP-2 (酪氨酸酶-相關(guān)蛋白-2)、 MAGE、 MUC-1、 CEA (癌 胚抗原)、p53、a-甲胎蛋白和Her-2/"ew等(Rosenberg SA.，自然(Nature)，17;411(6835):380-4, 2001)。
附圖簡(jiǎn)述
參考附圖，更好地理解本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的應(yīng)用，在附圖中
圖1-圖3是舉例說明zmT細(xì)胞和負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞之間相互活 化作用的圖。
圖1是一組圖，其舉例說明在消耗CDllc+細(xì)胞后，從脾純化B細(xì)胞， 并隨后通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)量CD19、 CDllc和CDld的表達(dá)。
圖2是一組屈，其舉例說明用單獨(dú)的賦形劑，用自由形式的otGalCer， 或用負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞(B/aGalCer)或DC (DC/aGalCer)靜脈內(nèi)注射 C57BL/6野生型或J281一小鼠，然后獲得來自受體小鼠的脾細(xì)胞，并通過 ELISPOT測(cè)定分析生產(chǎn)IL-4-和IFN-y的細(xì)胞。
圖3是一組圖，其舉例說明用CFSE染色負(fù)載賦形劑的或負(fù)載ocGalCer 的B細(xì)胞，并將其注射到C57BL/6小鼠中。分析了來自脾細(xì)胞的CFSE+ 細(xì)胞。
圖4-圖6是顯示用aGalCer和肽(0￥八257.264)共脈沖的B細(xì)胞活化肽特 異性CD8+T細(xì)胞的圖。
圖4是一組圖，其舉例說明將CFSE標(biāo)記的OVA257.264特異性CD8+ T 細(xì)胞(OT-I T細(xì)胞)移植到C57BL/6小鼠中，所述小鼠已經(jīng)分別施用了 B/賦形劑、B/aGalCer、 B/pep或B/aGalCer/p印。然后，通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù) 法研究OT-l T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌。
圖5是一組圖，其舉例說明用指定形式的B細(xì)胞(單獨(dú)的B、BAxGalCer, B/pep或B/ctGalCer/pep)接種C57BL/6小鼠。 一、三或五周后，通過注射 CFSE-標(biāo)記的同源靶標(biāo)進(jìn)行體內(nèi)CTL測(cè)定。
CFSES:肽-脈沖的靶標(biāo)，
CFSEffi:肽-未脈沖的對(duì)照
圖6是一組圖，其舉例說明在施用基于B細(xì)胞的疫苗后7天時(shí)(左圖)
或在另外用負(fù)載OVA257.264的同源脾細(xì)胞進(jìn)行另外的CTL致敏后7天時(shí)(右
圖)，計(jì)算生產(chǎn)IFN-y的CD8+ T細(xì)胞對(duì)OVA257_264體外再刺激的應(yīng)答。
圖7和圖8是比較基于B細(xì)胞和基于DC的細(xì)胞疫苗之間細(xì)胞毒性T
16淋巴細(xì)胞生成效率的圖。
圖7是一組圖，其舉例說明連續(xù)稀釋OVA257.264肽脈沖的
B/aGalCer/pep禾B DC/aGalCer/pep，然后將它們施用于小鼠中，并且然后
測(cè)量針對(duì)的OVA^.264體內(nèi)細(xì)胞毒性。
圖8是一組圖，其舉例說明通過與圖7中所述相同的方式施用 OVA257-264脈沖的B/賦形劑/p印和DC/賦形劑/pep，并然后測(cè)量針對(duì)的
OVA257.264體內(nèi)細(xì)胞毒性。
圖9和圖10是顯示參與由基于B細(xì)胞的疫苗誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答的免疫 細(xì)胞類型的圖。
圖9是一組圖，其舉例說明將用aGalCer和0￥八257.264共脈沖的B細(xì) 胞注射到小鼠中。受體小鼠接受消耗免疫細(xì)胞的mAb，然后檢測(cè)針對(duì)
OVA257.264的體內(nèi)細(xì)胞毒性。
圖10是一組圖，其舉例說明將用aGalCer和OVA257.264肽共脈沖的B 細(xì)胞注射到野生型、Ja281一或MHCirZ'類小鼠中，并隨后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的51Cr 釋放測(cè)定，從而研究針對(duì)OVA257.264的體外細(xì)胞毒性。
圖11和圖12是顯示用aGalCer和OVA257-264肽共脈沖的B細(xì)胞對(duì) CD8+ T細(xì)胞起到直接的抗原呈遞細(xì)胞作用的圖。
圖ll是一組圖，其舉例說明在被注射到野生型小鼠中前，用aGalCer 和OVA257.264共脈沖來自野生型小鼠或bm-l小鼠的B細(xì)胞，然后測(cè)量針 對(duì)的OVA257.264的體內(nèi)細(xì)胞毒性。
圖12是一組圖，其舉例說明用aGalCer和OVA257.264共脈沖的B細(xì)胞 或用'OVA257.264脈沖的B細(xì)胞和用aGalCer脈沖的B細(xì)胞的組合物，接 種C57BL/6小鼠，然后測(cè)量針對(duì)的OVA257_264的體內(nèi)細(xì)胞毒性。
圖13-圖16是舉例說明基于B細(xì)胞的疫苗能夠提供針對(duì)OVA-轉(zhuǎn)染的 B16黑素瘤的預(yù)防性和治療性抗腫瘤免疫性的圖。
圖13是舉例說明用指定的細(xì)胞疫苗(單獨(dú)的B、 B/aGalCer、 B/pep、 B/aGalCer/pep、 DC/pep或DC/aGalCer/pep)接種C57BL/6小鼠的圖。7 天后，將MO-5腫瘤細(xì)胞皮下注射到小鼠中，并然后測(cè)量腫瘤的質(zhì)量。圖14是舉例說明在圖13中所示的無(wú)腫瘤小鼠中受到再刺激的腫瘤細(xì)
胞生長(zhǎng)得到抑制的圖。第一次腫瘤接種后7天時(shí)，用MO-5細(xì)胞(2xl()S)皮
下再刺激無(wú)腫瘤小鼠，并測(cè)量腫瘤的質(zhì)量。
圖15和圖16是舉例說明用指定的細(xì)胞疫苗(單獨(dú)的B、 B/aGalCer, B/pep, B/aGalCer/pep, DC/pep或DC/aGalCer/pep)接種C57BL/6小鼠的圖。 l天或9天后，將MO-5腫瘤細(xì)胞皮下注射到小鼠中，并然后測(cè)量腫瘤的 質(zhì)量，
*，與"單獨(dú)的B"對(duì)照組(圖13，圖15和圖16)或與年齡-匹配的 首次實(shí)驗(yàn)小鼠(圖14)的比較，p<0.05。
圖17-圖19是舉例說明基于B細(xì)胞的疫苗引發(fā)針對(duì)表達(dá)Her-2/ eM的 腫瘤的治療性抗腫瘤免疫性的圖。
圖17是一組圖，其舉例說明在如所示與aGalCer或賦形劑加上 Her-2/^M63."(hP63)共培養(yǎng)后，用B細(xì)胞或DC接種BALB/c小鼠，并然后 進(jìn)行體內(nèi)CTL測(cè)定。
圖18和圖19是這樣的圖，其舉例說明通過與上述相同的方式，用 CT26-Her2/"w靜脈內(nèi)(圖18)或皮下(圖19)剌激BALB/c小鼠，隨后 用B細(xì)胞或DC免疫所述小鼠，并測(cè)量這些小鼠的存活率(圖18)或腫瘤 生長(zhǎng)(圖19)。
圖20和圖21是這樣的圖，其舉例說明檢測(cè)利用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)具有完 整抗原的B細(xì)胞的方法是否能夠應(yīng)用到B細(xì)胞疫苗中的試驗(yàn)。
圖20是一組圖，其舉例說明用這樣的腺病毒(AdHM)感染B細(xì)胞， 并然后測(cè)量B細(xì)胞表面上的Her-2/"ew表達(dá)，所述腺病毒表達(dá)Her-2/"ew， 即腫瘤-相關(guān)抗原的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域。
圖21是這樣的圖，其舉例說明轉(zhuǎn)導(dǎo)AdHM的和負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞 能夠活化DN32.D3細(xì)胞。具體地，分別與單獨(dú)的B細(xì)胞、 負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)AdHM的B細(xì)胞，和轉(zhuǎn)導(dǎo)AdHM的并 負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞一起培養(yǎng)DN32.D3細(xì)胞，并然后通過ELISA測(cè)量 每份上清液中的IL-2水平。
圖22-圖24是舉例說明用腫瘤-相關(guān)抗原Her-2/"w轉(zhuǎn)導(dǎo)的B細(xì)胞有效 誘導(dǎo)細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答的圖。圖22是這樣的圖，其舉例說明分別用從BALB/c小鼠脾細(xì)胞中分離并 然后用腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的B細(xì)胞(B/AdHM)、另外負(fù)載了 aGalCer的B細(xì)胞 (B/AdHMAxGalCer)、單獨(dú)的B細(xì)胞和負(fù)載了 aGalCer的B細(xì)胞(B/aGalCer) 免疫小鼠。向每只小鼠移植了負(fù)載有細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位的靶細(xì)胞，從而 研究體內(nèi)抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。
圖23是比較每個(gè)用B/AdHM和B/AdHM/aGalCer免疫的小鼠組中的 細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答持續(xù)時(shí)間的圖，
圖24是這樣的圖，其比較了在用細(xì)胞毒性T細(xì)胞肽體外刺激每只小 鼠之前和之后，由CD8+T細(xì)胞分泌的IFN-y水平，所述小鼠是用 B/AdHM和B/AdHM/aGalCer免疫的，
首次用于實(shí)驗(yàn)的沒用疫苗處理過的小鼠組
圖25和圖26是這樣的圖，其舉例說明轉(zhuǎn)導(dǎo)了腺病毒的B細(xì)胞疫苗 (B/AdHMAxGalCer)能夠有效地活化天然殺傷細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。
圖25是顯示天然殺傷細(xì)胞活化的圖。
圖26是顯示依賴于細(xì)胞疫苗劑量的靶細(xì)胞裂解的圖，對(duì)其進(jìn)行研究， 從而比較誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的效率。
圖27和圖28是舉例說明用轉(zhuǎn)導(dǎo)了 AdHM的B細(xì)胞疫苗 (B/AdHM和B/AdHM/aGalCer)能夠誘導(dǎo)Her-2/"w特異性抗體的圖，
圖27是這樣的圖，其舉例說明分別用B/AdHM和B/AdHM/aGalCer 免疫BALB/c小鼠，并然后測(cè)量抗-Her-2/"w抗體的滴度，從而研究血清 中抗-Her-2/"w抗體與在其表面上表達(dá)Her-2/"e"的鼠科腫瘤細(xì)胞(TAUF) 的結(jié)合。
圖28是顯示各組的體液免疫應(yīng)答的圖。
圖29是一組圖，其顯示轉(zhuǎn)導(dǎo)了腺病毒的B細(xì)胞疫苗的抗腫瘤活性。 具體地，通過用TAUF接種，在小鼠中誘導(dǎo)肺癌，隨后用所述B細(xì)胞疫苗 進(jìn)行免疫。
圖30是一組圖，其舉例說明通過由負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞誘導(dǎo)的天 然殺傷T細(xì)胞的活化根據(jù)aGalCer的濃度分泌IL-2 ，和通過由負(fù)載otGalCer的B細(xì)胞或DC誘導(dǎo)的天然殺傷T細(xì)胞的活化根據(jù)細(xì)胞濃度 分泌IL-2， IL-2是關(guān)于天然殺傷T細(xì)胞活化的指標(biāo)。
圖31-圖35是這樣的圖，其舉例說明通過施用能夠體內(nèi)消耗CD4+、 CD8+或NK1.1細(xì)胞的抗體能夠消除特異性免疫細(xì)胞。
圖36是顯示由基于B細(xì)胞的疫苗誘導(dǎo)的針對(duì)胸腺瘤(EG-7)的抗腫 瘤免疫活性的圖。
*，p<0.001 :統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，與僅用B細(xì)胞處理的組相比。
發(fā)明方式
本發(fā)明的實(shí)施的和目前優(yōu)選的實(shí)施方案如下述實(shí)施例所示進(jìn)行舉例 說明。
然而，應(yīng)該理解，考慮到本內(nèi)容，本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員可以在本 發(fā)明的精神和范圍內(nèi)進(jìn)行修改和改進(jìn)。
實(shí)施例1:負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞和/NKT細(xì)胞的雙向活化 <1-1>比較由B細(xì)胞誘導(dǎo)的和由DC誘導(dǎo)的/NKT細(xì)胞的活化
由于已經(jīng)充分確定了負(fù)載aGalCer的DC活化z'NKT細(xì)胞(Kim, S.，等, 合成(Synthesis) ,847,2004)，本發(fā)明人研究了負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞是 否具有與負(fù)載aGalCer的DC相似的作用。
使用了處于6-10周齡的雌性C57BL/6和BALB/c小鼠。從杰克遜 (Jackson)實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買了 OT-I和C57BL/6b"11 (bml)小鼠，而J281—小鼠 和MHC irM、鼠分別是由Chung博士(首爾國(guó)立大學(xué)(Seoul National University),韓國(guó))(Kim JH等，美國(guó)病理學(xué)雜志(Am J Pathol.), 167(5):1231-41， 2005)和Park博士 (韓國(guó)大學(xué)(Korea University),韓國(guó)) (Park, S. H.，等，試驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J. Exp. Med.) 193:893, 2001)提供的。所有 小鼠在韓國(guó)首爾國(guó)立大學(xué)的制藥研究動(dòng)物中心(Animal Center for Pharmaceutical Research)中保存在無(wú)特異性病原體的條件下。從雜交瘤即 GK1.5 (抗-CD4: ATCC編號(hào)TIB-207)、 2.43 (抗-CD8; ATCC編號(hào) TIB-210)和PK136 (抗-NKl.l; ATCC編號(hào)HB-191)獲得抗體，并進(jìn)行腹膜 內(nèi)(i.p.)注射(150pg/小鼠)，以在體內(nèi)消耗各自的淋巴細(xì)胞子集。具體地，為了從每只小鼠中分離B細(xì)胞，從小鼠中摘除脾，隨后進(jìn)行
勻漿。在通過抗-CDllc微珠(Miltenyibiotec)從脾中消耗CD1 lc+細(xì)胞后， 本發(fā)明人利用抗-B220微珠(Miltenyibiotec)分離了純B細(xì)胞。這些細(xì)胞 中>99%是CD19-陽(yáng)性的(見圖1)。
為了從脾中分離樹突細(xì)胞，將從小鼠中取得的脾置于7ml培養(yǎng)基中， 該培養(yǎng)基中含有膠原酶D(lmg/ml，羅氏(Roche))和DNasel(50(ig/ml，西 格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich))，隨后在37'C反應(yīng)30分鐘。向該培養(yǎng)基中 加入EDTA (最終濃度是10mM，pH7.2)，隨后再進(jìn)一步反應(yīng)5分鐘。通 過15.5% Accudenz密度梯度(精確化學(xué)和科學(xué)(Accurate Chemical & Scientific))，將樹突細(xì)胞與脾細(xì)胞分離。
將純化的細(xì)胞(B細(xì)胞或DC)在C02培養(yǎng)箱中，與aGalCer (l嗎/ml)或 賦形劑(0.5%聚山梨酸酯)一起共培養(yǎng)14小時(shí)。然后，將該細(xì)胞與 天然殺傷T細(xì)胞雜交瘤，即DN32.D3 —起共培養(yǎng)(Claire Forestier等，免 疫學(xué)雜志(The Journal of Immunology) ，171:4096,2003);然后通過夾心 ELISA測(cè)量IL-2，其作為NKT活化的指示劑。
作為結(jié)果，負(fù)載aGalCer的DC (DC/aGalCer)刺激DN32.D3產(chǎn)生IL-2。 類似地，負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞(B/aGalCer)有效地刺激DN32.D3細(xì)胞產(chǎn) 生IL-2，當(dāng)處于與雜交瘤較高的比例時(shí)，等同于DC組的IL-2生成率，但 是當(dāng)處于較低的比例時(shí)，達(dá)不到DC組的IL-2生成率(見圖30)。
<1-2>活化天然殺傷T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答
為了研究體內(nèi)施用的B/aGalCer和DC/aGalCer是否可以活化免疫細(xì) 胞，本發(fā)明人將來自C57BL/6小鼠的B/aGalCer或DC/aGalCer靜脈內(nèi)注 射到同種小鼠中，并通過ELISPOT測(cè)量生產(chǎn)IL-4和IFNy的細(xì)胞的水平。 具體地，用賦形劑、(xGalCer、負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞或負(fù)載aGalCer的DC 靜脈內(nèi)注射野生型C57BL/6或Ja28W-小鼠。 一周后，分離脾，從而制備 單細(xì)胞，將所述單細(xì)胞置于ELISPOT平板上。將賦形劑或aGalCer添加 到該平板上，隨后培養(yǎng)6小時(shí)以進(jìn)行刺激。按照供應(yīng)商的說明(IL-4 ELISPOT試劑盒，IFN-y ELISPOT試劑盒；R&D系統(tǒng)(R&D system))進(jìn)行 ELISPOT,從而測(cè)量分泌IL-4和IFN-y的細(xì)胞。作為結(jié)果，注射B/aGalCer和DC/aGalCer均誘導(dǎo)大量生產(chǎn) IL-4和IFN-y的細(xì)胞(圖2)。然而，應(yīng)該注意，即使在缺乏aGalCer再刺 激的條件下，檢測(cè)到顯著數(shù)量的這些生產(chǎn)細(xì)胞因子的細(xì)胞。不過，本發(fā)明 人認(rèn)為生產(chǎn)IL-4和IFN-Y的細(xì)胞的誘導(dǎo)不依賴于z'NKT細(xì)胞，因?yàn)樗话l(fā) 生在缺乏zNKT群的J281-A小鼠中(見圖2)。
<1-3>由天然殺傷T細(xì)胞活化引起的B細(xì)胞的活化
為了確定如果注射后在B細(xì)胞中誘導(dǎo)了任何變化將會(huì)怎么樣，本發(fā)明 人靜脈內(nèi)施用CFSE (羧基熒光素琥珀酰亞胺基酯)標(biāo)記的B/aGalCer，并 然后分析CFSE+細(xì)胞上的共刺激分子。具體地，從C57BL/6小鼠的脾和淋 巴結(jié)獲得淋巴細(xì)胞，并且利用抗-CDllc微珠(Miltenyibiotec)消除CDllc十 細(xì)胞。利用抗-B220微珠(Miltenyibiotec)分離B細(xì)胞。用10 一 CFSE 標(biāo)記分離的B細(xì)胞，將其注射到同種小鼠的尾靜脈中。為了用CFSE標(biāo)記， 以適當(dāng)?shù)臐舛?，在RPMI培養(yǎng)基中稀釋CFSE (分子探針(Molecular Probe))，隨后在37。C反應(yīng)15分鐘進(jìn)行標(biāo)記。用RPMI培養(yǎng)基清洗該細(xì) 胞三次，以消除殘留的CFSE。標(biāo)記后24和48小時(shí)，通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù) 法研究了從該小鼠的脾和淋巴結(jié)分離的CFSE+細(xì)胞中的共刺激分子。
作為結(jié)果，在24小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)了高水平的CD86而非CD80的表達(dá)。 CD40和MHCII也受到輕微的上調(diào)(圖3)。即使注射后48小時(shí)，仍沒有 觀察到CD80的上調(diào)，并且所有其他結(jié)果很大程度上保持與24小時(shí)的水 平一致。換句話說，在24小時(shí)內(nèi)，由B/aGalCer活化的天然殺傷T細(xì)胞 激活了B細(xì)胞。
考慮實(shí)施例<1-1> 、 <1-2>和<1-3〉的結(jié)果，證實(shí)了 DC/aGalCer和B/aGalCer均能夠在體外和體內(nèi)地完全活化/NKT細(xì)胞，且 該活化作用在體內(nèi)是雙向的(因?yàn)閦NKT和B細(xì)胞均被活化了)。
實(shí)施例2:肽-脈沖的B/aGalCer促進(jìn)肽-特異性CD8+ T細(xì)胞的活化
本發(fā)明人檢查了 aGalCer和MHC I-限制的肽在B細(xì)胞上的共脈沖是 否能夠使肽-特異性CD8+T細(xì)胞致敏。為了該目的，本發(fā)明人首先適當(dāng)?shù)?將CFSE-標(biāo)記的OVA-特異性CD8+T細(xì)胞(OT-I)移植到C57BL/6小鼠中，然后施用賦形劑-脈沖的B細(xì)胞(單獨(dú)的B) ， B/(xGalCer，賦形劑 和OVA257-264肽-脈沖的B細(xì)胞(B/pep)，或ctGalCer和OVA257-264 肽-脈沖的B細(xì)胞(B/aGalCer/pep)。 48小時(shí)后，從脾獲得單細(xì)胞，并然后 觀察到OT-I細(xì)胞的增殖。同時(shí)，將分泌IL-2和IFN-y的OT-I細(xì)胞與1 fiM 0￥八257.264肽和1 ^L/mL GolgiPlug —起培養(yǎng)4小時(shí)，并且然后利用 Cytoperm/Cytofix試劑盒(BD Pharmingen)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。
作為結(jié)果，在接受單獨(dú)的B的小鼠中幾乎不誘導(dǎo)OVA-特異性CD8+T 細(xì)胞(OT-I細(xì)胞)的分裂；然而，在B/aGalCer組中，注意到OVA-特異 性CD8T細(xì)胞的弱分裂，其以Ag-非特異性方式進(jìn)行(圖7, 1.2±0,5%相 對(duì)5.4 ±1.8%)。注射B/pep誘導(dǎo)了OT-I大量分裂，但是體外再刺激后， 非常少量的這些細(xì)胞產(chǎn)生IL-2(<4%)，且相對(duì)少量的細(xì)胞產(chǎn)生IFN-y (38%)。 相反，被給予了B/aGalCer/pep的小鼠顯示出增強(qiáng)的OT-I分裂，其中多于 40%的由此生成的細(xì)胞產(chǎn)生IL-2，并最令人驚訝地，多于90%產(chǎn)生比B/pep 組高得多的水平的IFN-y (圖4)。
這些結(jié)果提示高得多的CD8+ T細(xì)胞活化率能夠通過將otGalCer負(fù)載 于B/pep上而獲得。
實(shí)施例3:由BAxGalCer/pep引起的長(zhǎng)期持久的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答和免 疫耐受性的克服
<3-1>由B/aGalCer/pep誘導(dǎo)的長(zhǎng)期持久的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答
本發(fā)明人研究了基于B細(xì)胞的疫苗方法是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞毒性免疫 性。為了該目的，本發(fā)明人向C57BL/6小鼠組靜脈內(nèi)注射了單獨(dú)的B、 B/ctGalCer、 B/pep或B/aGalCer/pep，并且然后確定體內(nèi)CTL活性。另夕卜， 本發(fā)明人研究了由基于B細(xì)胞的疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答是否能夠 持續(xù)。具體地，分別用單獨(dú)的B、 B/aGalCer、 B/pep和B/aGalCer/pep免 疫C57BL/6小鼠。在免疫作用的第一、第三和第五周，進(jìn)行了體內(nèi)CTL 測(cè)定。同源淋巴細(xì)胞在被用20 (CFSE ,或2 (CFSECFSE進(jìn)行
標(biāo)記前，負(fù)載了 OVA257-264肽或保持不接觸的。將相等數(shù)量的這兩種群體
混合，并將其靜脈內(nèi)注射到小鼠中。第二天，獲得單細(xì)胞，并且通過流式
23細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)量CFSE胃和CFSE氣較小數(shù)量的CFSE "意味著較高的細(xì)胞 毒性免疫應(yīng)答。
作為結(jié)果，只有B/aGalCer/pep完全裂解肽-脈沖的靶標(biāo)，并且其甚至 在單次注射后5周還維持全部的細(xì)胞毒性。同時(shí)，小鼠中B/pep和 B/aGalCer均不誘導(dǎo)任何肽-特異性CTL應(yīng)答。只有B/aGalCer/pep-處理的 組在針對(duì)OVA257.264的生產(chǎn)IFN-y的CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量上，顯示出顯著的 增加(圖6，左圖)。
<3-2>證實(shí)由B/aGalCer/pep引起的免疫耐受性的克服
通常，單獨(dú)施用抗原誘導(dǎo)免疫耐受性。因此，本發(fā)明人研究了當(dāng)在B 細(xì)胞上負(fù)載aGalCer和肽時(shí)，抗原誘導(dǎo)的免疫耐受性是否能夠得到克服。 具體地，通過與實(shí)施例<3-1>所述的相同的方式免疫C57BL/6小鼠。1周 后，獲得脾細(xì)胞，隨后用OVA-包被的同源脾細(xì)胞刺激1周。通過細(xì)胞內(nèi) 細(xì)胞因子染色，測(cè)量在受刺激的脾細(xì)胞中的分泌IFN-丫的CD8+T細(xì)胞。
作為結(jié)果，被給予單獨(dú)的B或B/aGalCer的小鼠針對(duì)致敏正常應(yīng)答， 并產(chǎn)生大量的肽-特異性生產(chǎn)IFN-y的CD8+T細(xì)胞(圖6，右圖)。然而， 被給予B/pep的小鼠在生產(chǎn)IFN-y的CD8+T細(xì)胞數(shù)量上沒有顯示出增多， 這提示這些小鼠耐受所述肽。
相反，用B/cxGalCer/pep接種的小鼠獲得了比被給予單獨(dú)的B或 BAxGalCer的組所獲得的多得多的肽-反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞數(shù)量。同時(shí)，沒 有將任何抗原施用于用單獨(dú)的B或BAxGalCer接種的小鼠，因此，在所述 小鼠中沒有誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答，并且用OVA-包被的脾細(xì)胞的體外 刺激是引起免疫應(yīng)答的首次且唯一的刺激。然而，用B/aGalCer/pep接種 的小鼠已經(jīng)施用了抗原，因此用OVA-包被的脾細(xì)胞進(jìn)行體外刺激是記憶 性應(yīng)答?？傊?，B/aGalCer/pep克服免疫耐受性，這顯示出免疫原性和強(qiáng)記 憶性應(yīng)答。
實(shí)施例4:基于B細(xì)胞的疫苗是與基于DC的疫苗一樣有效的CTL產(chǎn)生劑 本發(fā)明人比較了基于B細(xì)胞的疫苗與DC-疫苗在產(chǎn)生細(xì)胞毒性上的功效。為了該目的，本發(fā)明人確定了在體內(nèi)獲得完全的靶標(biāo)裂解所需要的最
小細(xì)胞數(shù)量。具體地，將B細(xì)胞或DC用aGalCer或賦形劑一起共培養(yǎng)16-18 小時(shí)，并且然后用1 ng/ml OVA257.264脈沖1小時(shí)。將連續(xù)稀釋的細(xì)胞靜脈 內(nèi)注射到同種小鼠中，并進(jìn)行體內(nèi)CTL測(cè)定。如在上述實(shí)施例中所解釋 的那樣，將肽-脈沖的靶標(biāo)標(biāo)記為CFSE氣并將沒有用肽脈沖的對(duì)照細(xì)胞 標(biāo)記為CFSE ffi。將相等數(shù)量的這兩種群體混合，并將其靜脈內(nèi)注射到小 鼠中。不久后，通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢查小鼠脾細(xì)胞，以計(jì)算CFSE CFSE 8的比例，從而測(cè)量抗原特異性靶細(xì)胞裂解。
作為結(jié)果，用DC/aGalCer/pep注射的小鼠顯示出與16,000個(gè)細(xì)胞一 樣少的完全靶細(xì)胞裂解。引起興趣的是，用80,000個(gè)B/aGalCer/pep細(xì)胞 的單次接種足以引起完全的肽-特異性細(xì)胞裂解，而用16,000個(gè)細(xì)胞的接 種產(chǎn)生中度細(xì)胞毒性(圖7)。然而，假設(shè)DC的表面積比B細(xì)胞的表面 積大得多，則能夠認(rèn)為在產(chǎn)生細(xì)胞毒性上，BAxGalCer/pep與 DC/aGalCer/pep—樣有效。DC/pep有效地產(chǎn)生了 OVA-特異性細(xì)胞毒性， 而B/pep-處理，無(wú)論所檢査的細(xì)胞的數(shù)量，不產(chǎn)生該毒性(圖8)。值得 注意地，DC/pep-處理的組的體內(nèi)細(xì)胞毒性模式非常類似于 DC/aGalCer/pep-處理的組的，這說明了向DC上負(fù)載aGalCer不增強(qiáng) DC/pep的免疫功效。
實(shí)施例5:由B/aGalCer/pep產(chǎn)生CTL的要求
本發(fā)明人檢查了哪種類型的免疫細(xì)胞參與了 CTL應(yīng)答的產(chǎn)生。為了該 目的，本發(fā)明人用消耗的Ab(抗-CD4消耗Ab: GK1.5，抗-CD8消耗抗體 2.43,抗-NKl.l消耗抗體PK136)注射小鼠。4天前或4天后，用 BAxGalCer/pep對(duì)它們進(jìn)行接種，并然后進(jìn)行體內(nèi)CTL測(cè)定。
作為結(jié)果，消耗的時(shí)間沒有影響，因?yàn)镃TL活性的產(chǎn)生不受以下任一 種情形的妨礙CD4+或NKl.l+細(xì)胞的消耗(圖9)。相反，CD8的消耗 完全阻斷靶細(xì)胞的殺死。與這些結(jié)果相一致，MHCI廣小鼠(缺乏CD4+T 細(xì)胞)發(fā)育正常的CTL應(yīng)答，而Ja281一小鼠(缺乏WKT細(xì)胞)未能做 到這些(圖10)。實(shí)施例6:由B細(xì)胞引起的抗原-呈遞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)
可以爭(zhēng)論地，肽-脈沖的B細(xì)胞不起APC而起肽儲(chǔ)存器的功能，宿主
DC從所述儲(chǔ)存器中取得肽，從而誘導(dǎo)CTL應(yīng)答。為了研究這種可能性， 本發(fā)明人使用bm-l小鼠(Norbury， C. C.等，科學(xué)(Science) 304, 1318-1321, 2004)。這些小鼠的細(xì)胞能夠?qū)VA肽負(fù)載到它們的MHC I上，但是， 由于H-2K區(qū)域中的突變，由此產(chǎn)生的復(fù)合物不被同族CD8+T細(xì)胞識(shí)別。 來自該品系的B細(xì)胞正常表達(dá)CDld，并應(yīng)答aGalCer而刺激/NKT活化， 這說明B和/NKT之間的相互作用是完整無(wú)損的。
此外，當(dāng)利用來自野生型小鼠的B細(xì)胞制備B/aGalCer/pep，并然后 將其注射到野生型小鼠中時(shí)，產(chǎn)生了完全的體內(nèi)OVA-特異性細(xì)胞毒性。 然而，當(dāng)將源自bm-l小鼠B細(xì)胞的B/aGalCer/pep注射到野生型小鼠中 時(shí)，未能產(chǎn)生OVA-特異性細(xì)胞裂解活性，這提示受體小鼠中的DC或其 他專門的的APC不是造成CTL產(chǎn)生的原因(圖ll)。
本發(fā)明人研究了當(dāng)aGalCer和肽分別脈沖并然后一起注射時(shí)，是否可 能產(chǎn)生CTL。為了該目的，用'B/aGalCer加B/pep，或單獨(dú)的B/aGalCer/pep 靜脈內(nèi)注射C57BL/6小鼠，并進(jìn)行體內(nèi)CTL測(cè)定。
作為結(jié)果，用'B/aGalCer加B/pep，接種的小鼠未能產(chǎn)生體內(nèi)細(xì)胞毒性 (圖12)。該結(jié)果證明為了產(chǎn)生細(xì)胞毒性，肽和aGalCer必須在相同的B 細(xì)胞上呈遞。
實(shí)施例7: B/aGalCer/pep的抗腫瘤作用 <7-1>利用OVA模型的體內(nèi)檢驗(yàn)
本發(fā)明人檢査了接種B/aGalCer/pep是否能夠產(chǎn)生抗腫瘤免疫性。為 了檢驗(yàn)預(yù)防性抗腫瘤活性，在將OVA-轉(zhuǎn)染的B16黑素瘤(MO-5) (Kenneth Rock博士，馬薩諸塞大學(xué)(University of Massachusetts) : Falo, L. D.,等，自 然醫(yī)學(xué)(Nat. Med.) 1: 649， 1995)皮下移植到小鼠組中之前，用單獨(dú)的B、 B/aGalCer、 B/pep、 B/aGalCer/pep、 DC/pep或DC/aGalCer/pep對(duì)它們接 種一次。作為結(jié)果，在用B/aGalCer接種的小鼠中觀察到了稍微延遲的腫 瘤生長(zhǎng)模式，盡管所有的小鼠最后都發(fā)展了腫瘤(見圖13)。相反，接受 了 B/aGalCer/pep、 DC/pep或DC/aGalCer/pep的小鼠沒有發(fā)展腫瘤。
26為了檢査這些小鼠是否引起長(zhǎng)期持久的抗腫瘤活性，本發(fā)明人在第一 次腫瘤接種后70天時(shí)，用M0-5腫瘤再次剌激了存活的瘤小鼠。作為結(jié)
果，本發(fā)明人在那些小鼠中沒觀察到腫瘤生長(zhǎng)(見圖14)，這證明用 B/aGalCer/pep接種引起了針對(duì)所述腫瘤的記憶免疫性。當(dāng)本發(fā)明人利用不 同來源的腫瘤，即轉(zhuǎn)染OVA的胸腺瘤(EG=7)，進(jìn)行類似的試驗(yàn)時(shí)，獲得 的非常相似并一致的結(jié)果(圖36)。
本發(fā)明人研究了接種B/aGalCer/pep是否能夠根除預(yù)先存在的腫瘤。 為了該目的，本發(fā)明人構(gòu)建了兩種治療模型當(dāng)腫瘤變得可觸摸到時(shí)，皮 下移植后(i) l天或(ii) 9天，對(duì)小鼠進(jìn)行接種。
在所述1天的模型中，接種DC/pep或DC/aGalCer/pep幾乎完全地抑 制了腫瘤生長(zhǎng)。有趣地是，在接種了 B/aGalCer/pep的小鼠中，也完全減 少了腫瘤的生長(zhǎng)(圖5)。在所述9天的模型中，由于B16黑素瘤非常具 有侵略性的性質(zhì)，這些接種中無(wú)一完全地破壞生長(zhǎng)中的腫瘤。然而，在接 種了 B/aGalCer/pep的小鼠中，腫瘤的生長(zhǎng)不如"單獨(dú)的B"小鼠組中的 明顯，并且類似于DC/pep-或DC/aGalCer/pep-接種的組中觀察到的(圖 16)。
<7-2>利用Her-2/朋w模型的體內(nèi)檢驗(yàn)
為了研究基于B細(xì)胞的疫苗是否能夠應(yīng)用于真正的腫瘤Ag中，通過 與上述實(shí)施例<7-1>中所述的相同方式，利用TAUF(PenichetML等，實(shí)驗(yàn) 室動(dòng)物科學(xué)(Lab AnimSci.) ,49: 179-88, 1999)，即表達(dá)Her-2/"e"的腫瘤 細(xì)胞系，進(jìn)行試驗(yàn)。該腫瘤Ag得到了充分的表征，并且其CTL表位是已 知的。此外，本發(fā)明人在被給予 了 負(fù)載aGalCer的Her-2/"e^,脈沖的B細(xì)胞的小鼠中，觀察到顯著水平的 Her-2/"ew-特異性體內(nèi)細(xì)胞毒性(圖17)。
為了檢查該模型中的抗腫瘤活性，本發(fā)明人在用Her-2/^z^,脈沖的 負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞接種BALB/c小鼠前，向它們靜脈內(nèi)或皮下注射表 達(dá)Her-2/"ew的腫瘤細(xì)胞(TAUF )。靜脈內(nèi)腫瘤接種后，用 B/aGalCer或B/pep接種的那些小鼠的存活率比用單獨(dú)的B接種的那些略 好(圖18)。相反，用B/aGalCer/pep接種的所有小鼠在該試驗(yàn)中始終存活。這些存活的小鼠還耐受TAUF的再刺激。在皮下腫瘤生長(zhǎng)模型中，觀 察到類似的結(jié)果(圖19)。
總而言之，證明了基于B細(xì)胞的疫苗方案，在產(chǎn)生預(yù)防性和治療性抗 腫瘤免疫性上，與基于DC的疫苗一樣有效。
實(shí)施例8:利用表達(dá)抗原的病毒載體引入完整的抗原
肽-脈沖的細(xì)胞疫苗通常是不能使用的，因?yàn)殡牡膽?yīng)用受限于主要組織
相容性復(fù)合體(MHC)的單元型，并僅能夠呈遞單一表位。另一方面，病 毒介導(dǎo)的完整抗原能夠在不受MHC單元型的限制下被廣泛使用，并能夠 誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，這說明其能夠誘導(dǎo)不同的表位 特異性免疫應(yīng)答?；诖耍景l(fā)明人研究了通過病毒載體用完整抗原轉(zhuǎn)導(dǎo) 的B細(xì)胞是否能夠有效地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。首先，本發(fā)明人制備了遞送基因 的腺病毒(AdHM)，并將其注射到小鼠模型中，所述基因編碼腫瘤-相關(guān) 抗原Her-2/"ew (HM)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域。
具體地，從BALB/c小鼠的脾細(xì)胞中分離B細(xì)胞，并且與100 MOI 的引入HM的腺病毒(AdHM, Viromed)—起在無(wú)血清條件下，37。C培養(yǎng) 90分鐘，用于進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。然后，向其中增補(bǔ)血清，隨后分別進(jìn)一步培養(yǎng)8 小時(shí)，24小時(shí)和48小時(shí)。用PE標(biāo)記的抗-Her-2/nw抗體(BD生物科學(xué)(BD biosciences) #340552)染色細(xì)胞，從而進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)。測(cè)量在細(xì)胞表 面上表達(dá)的Her-2/ww的水平(研究了關(guān)于B細(xì)胞的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和總 B細(xì)胞中PE+細(xì)胞的百分比)。
B細(xì)胞與腺病毒一起培養(yǎng)8小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)后，證實(shí)了轉(zhuǎn)導(dǎo) 效率在每種培養(yǎng)條件下大于20% (圖20)。具體地，當(dāng)B細(xì)胞與AdHM 一起共培養(yǎng)大于8小時(shí)后，B細(xì)胞完全轉(zhuǎn)導(dǎo)了 AdHM，并且因此，Her-2/"eM 在B細(xì)胞表面上表達(dá)。Her-2/wew在B細(xì)胞表面上的表達(dá)不受與aGalCer 一起培養(yǎng)的影響。另外，B細(xì)胞呈遞aGalCer的能力也不受影響(圖21)。 如上文中所解釋地，以上結(jié)果表示當(dāng)通過B細(xì)胞上的CDld分子向 DN32.D3細(xì)胞呈遞aGalCer時(shí)，活化的DN32.D3細(xì)胞分泌IL-2。因此， 測(cè)量在培養(yǎng)物上清液中的IL-2的水平能夠證實(shí)B細(xì)胞是否能夠呈遞aGalCer，并且，在本發(fā)明中，證實(shí)了培養(yǎng)物上清液中的IL-2分泌，這支 持B細(xì)胞能夠呈遞aGalCer。
實(shí)施例9:由轉(zhuǎn)導(dǎo)腺病毒的B細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答
從BALB/c小鼠的脾細(xì)胞中分離B細(xì)胞，在37。C培養(yǎng)箱中，無(wú)血清條 件下，用100 M.O.I腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)所述B細(xì)胞60分鐘，所述腺病毒表達(dá) Her-2/"w細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域。然后，向其中增補(bǔ)血清，隨后進(jìn)一 步培養(yǎng)24小時(shí)，以制備B/AdHM細(xì)胞。將轉(zhuǎn)導(dǎo)了 AdHM的B細(xì)胞在增補(bǔ) 了 1~2 pg/ml aGalCer的含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)23小時(shí)，這導(dǎo)致了 負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞(B/AdHM/aGalCer)。用RPMI清洗制備的B細(xì)胞 多于3次，從而消除殘留的腺病毒和(xGalCer。
本發(fā)明人向小鼠靜脈內(nèi)施用所述B細(xì)胞疫苗，以研究用所述AdHM 轉(zhuǎn)導(dǎo)的B細(xì)胞是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答。將施用了單獨(dú)的B細(xì)胞 (B)和負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞(B/aGalCer)的小鼠用作陰性對(duì)照。測(cè)量了 由轉(zhuǎn)導(dǎo)了 AdHM的B細(xì)胞(B/AdHM)以及aGalCer禾Q AdHM共 脈沖的B細(xì)胞(B/AdHM/aGalCer)誘導(dǎo)的Her-2/股w特異性細(xì)胞毒性T細(xì) 胞應(yīng)答。免疫作用后，注射負(fù)載了細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位肽(Her-2/^^.", Anygene)的耙細(xì)胞，隨后研究體內(nèi)CTL活性。
作為結(jié)果，免疫作用后1周后，在用單獨(dú)的B和B/aGalCer免疫的組 中沒有觀察到靶細(xì)胞的裂解，而在用B/AdHM和B/AdHM/aGalCer免疫的 小鼠組中觀察到細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答(圖22)。轉(zhuǎn)導(dǎo)了腺病毒的B細(xì)胞 活化能夠在無(wú)需天然殺傷T細(xì)胞的幫助下，有效地誘導(dǎo)體內(nèi)細(xì)胞毒性T細(xì) 胞應(yīng)答，這說明能夠?qū)⑺鼈冇米骺乖蔬f細(xì)胞。由 B/AdHM和B/AdHM/aGalCer誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答逐漸減少，但是 從免疫作用開始直到7周時(shí)，應(yīng)答持續(xù)在顯著水平(圖23)。免疫作用后 l周，測(cè)量了 CD8+ T細(xì)胞中的IFN-y分泌，以及細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。 作為結(jié)果，與僅用B細(xì)胞處理的組中的相比，用 B/AdHM和B/AdHM/aGalCer處理的小鼠組中活化的CD8+T細(xì)胞的數(shù)量 增多了，且更特殊地，用B/AdHM/aGalCer處理的組中的CD8+T細(xì)胞的 數(shù)量比用B/AdHM處理的組中的略高(圖24)。實(shí)施例10:由負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞引起的天然殺傷細(xì)胞的活化和轉(zhuǎn)導(dǎo)了 腺病毒的B細(xì)胞疫苗的疫苗作用的改進(jìn) <10-1>由負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞活化天然殺傷細(xì)胞
基于那些分泌的IFN-Y，計(jì)算活化的天然殺傷細(xì)胞。具體而言，從小 鼠脾細(xì)胞中分離B細(xì)胞，并然后在含有1 ng/ml GolgiPlug的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 5小時(shí)。用IFN-y:APC、 CD3:PE和CD49b:FITC抗體(全部Biolegend) 對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行染色。天然殺傷細(xì)胞由表達(dá)CD49b，即天然殺傷細(xì)胞標(biāo)記， 而非CD3的那些組成。
在用腺病毒和aGalCer共脈沖的B細(xì)胞(B/AdHMAxGalCer)處理的組 中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答比用轉(zhuǎn)導(dǎo)了腺病毒的B細(xì)胞(B/AdHM)處理的組 中的更高并持續(xù)得更久，但是差別是不顯著的。這些結(jié)果表示與 基于肽-脈沖的B細(xì)胞的疫苗不同，aGalCer的負(fù)載不增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞 應(yīng)答。但是，與基于轉(zhuǎn)導(dǎo)了腺病毒的B細(xì)胞的疫苗不同，施用基于 負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞的疫苗在體內(nèi)刺激天然殺傷T細(xì)胞，并由此活化天 然殺傷細(xì)胞(圖25)。通過活化天然殺傷細(xì)胞和由此誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì) 胞應(yīng)答，能夠預(yù)期抗腫瘤作用。
<10-2>改進(jìn)基于共負(fù)載aGalCer和腺病毒的B細(xì)胞的疫苗的疫苗作用
為了研究所述B細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的效率，本發(fā)明人 以未達(dá)最佳標(biāo)準(zhǔn)的劑量施用所述細(xì)胞疫苗，并且然后測(cè)量靶細(xì)胞的裂解， 所述未達(dá)最佳標(biāo)準(zhǔn)的劑量不足以誘導(dǎo)完全的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。陽(yáng)性對(duì) 照組用負(fù)載aGalCer和細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位肽的B細(xì)胞(BAxGalCer/pep)處 理。用各種B細(xì)胞疫苗免疫后1周，在分別用B/AdHM和B/AdHM/aGalCer 處理的組之間比較誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的效率(圖26)。在施用了 B/aGalCer/pep的組中，認(rèn)為大多數(shù)B細(xì)胞呈遞抗原，但是僅有占總數(shù)20% 的用腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的B細(xì)胞能夠作用為抗原呈遞細(xì)胞。因此，判定用腺病毒 轉(zhuǎn)導(dǎo)而引入完整抗原的B細(xì)胞疫苗能夠有效地誘導(dǎo)抗原-特異性細(xì)胞毒性 T細(xì)胞應(yīng)答，即使劑量高于肽-脈沖的B細(xì)胞疫苗的劑量。此外，當(dāng)施用
30少量B細(xì)胞(達(dá)不到有效劑量)時(shí)，其也能夠在由負(fù)載的aGalCer活化的 天然殺傷T細(xì)胞的幫助下誘導(dǎo)靶細(xì)胞裂解。
實(shí)施例11:轉(zhuǎn)導(dǎo)了腺病毒的B細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)抗原-特異性抗體應(yīng)答
基于轉(zhuǎn)導(dǎo)了腺病毒的B細(xì)胞的疫苗具有同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞 -介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的優(yōu)勢(shì)，這與肽-脈沖的B細(xì)胞疫苗僅誘導(dǎo)細(xì)胞-介導(dǎo)的免 疫應(yīng)答不同。為了證實(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)了 AdHM的B細(xì)胞疫苗是否能夠誘導(dǎo)Her-2/weM 特異性抗體，分別用B/AdHM和B/AdHM/aGalCer免疫BALB/c小鼠。為 了測(cè)量血清中抗-Her-2Mew抗體的滴度，通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法研究了抗體 與TAUF細(xì)胞，即在其表面上表達(dá)Her-2/"w的鼠科腫瘤細(xì)胞的結(jié)合。
為了測(cè)量抗體應(yīng)答，通過眼部采血，在從免疫作用起第l、第3、第5 和第7周制備血液樣品。將小鼠血液樣品靜置于室溫下2小時(shí)，隨后在 8,000離心10分鐘，從而分離血清。為了測(cè)量血清中抗-Her-2/"ew抗體的 滴度，從1:50開始，每次兩倍地連續(xù)稀釋該血清(用含有1%FBS，0.09% 疊氮化物的PBS)，隨后與TAUF，即表達(dá)Her-2Mw的腫瘤細(xì)胞一起在4°C 培養(yǎng)60分鐘。用緩沖液清洗與小鼠血清一起培養(yǎng)過的TAUF細(xì)胞，隨后 通過利用FITC-標(biāo)記的山羊抗-小鼠IgG抗體作為第二抗體，對(duì)與TAUF細(xì) 胞結(jié)合的小鼠抗體進(jìn)行染色。然后，通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器(FACSCaliber， BD 生物科學(xué)(BD Biosciences))測(cè)量與TAUF結(jié)合的小鼠抗體的量，并且通 過標(biāo)準(zhǔn)化首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠血清和將增高了大于1.8倍的平均熒光強(qiáng)度 認(rèn)作陽(yáng)性應(yīng)答，來計(jì)算抗體的滴度。
作為結(jié)果，與誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的結(jié)果一致，在用 B/AdHM和B/AdHM/aGalCer免疫的組中的抗-Her-2/"ew抗體的滴度維持 高水平(圖27)，并且在以上兩組中也誘導(dǎo)了體液免疫應(yīng)答，這與用B 細(xì)胞和B/aGalCer處理的組中不同(圖28)。
實(shí)施例12:由用基于負(fù)載ctGalCer的轉(zhuǎn)導(dǎo)了腺病毒的B細(xì)胞的疫苗的免疫 引起的對(duì)癌癥的預(yù)防和治療作用將2 x 105個(gè)TAUF細(xì)胞注射到BALB/c小鼠，即Her-2/"ew腫瘤模型 的尾靜脈中，從而誘導(dǎo)腫瘤。然后，用B細(xì)胞疫苗免疫攜帶腫瘤的小鼠， 隨后研究存活率。
本發(fā)明人檢查了轉(zhuǎn)導(dǎo)了腺病毒的B細(xì)胞疫苗是否能夠一起誘導(dǎo)細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，并由此具有抗腫瘤活性。將TAUF細(xì)胞 靜脈內(nèi)注射到小鼠中，從而誘導(dǎo)肺癌，在其中測(cè)量所述B細(xì)胞疫苗的預(yù)防 和治療作用。為了免疫作用，以濃度2 x 10S施用B細(xì)胞疫苗，并且7天 后，將2xl()S個(gè)腫瘤細(xì)胞靜脈內(nèi)注射到小鼠中，隨后研究存活率。與僅用 B細(xì)胞(B)處理的組相比，用負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞(BAxGalCer)和轉(zhuǎn)導(dǎo) 了腺病毒的B細(xì)胞(B/AdHM)處理的組中的存活期得到了延長(zhǎng)，其中所 述轉(zhuǎn)導(dǎo)了腺病毒的B細(xì)胞表達(dá)腫瘤抗原。當(dāng)用負(fù)載(xGalCer的轉(zhuǎn)導(dǎo)了 腺病毒的B細(xì)胞疫苗(B/AdHM/aGalCer)免疫小鼠時(shí)，小鼠在試驗(yàn)中始終存 活，其中所述B細(xì)胞表達(dá)腫瘤抗原。這些結(jié)果顯示B/AdHM/aGalCer疫苗 具有比B/aGalCer或B/AdHM疫苗更好的抗腫瘤作用(圖29，上圖)。 并且，判定由所述B細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答能夠有效的防止腫瘤生長(zhǎng)。
其次，為了證實(shí)所述B細(xì)胞疫苗的治療作用，將51104個(gè)腫瘤細(xì)胞 (TAUF)注射到尾靜脈中，從而誘導(dǎo)肺癌。3天后，用分別1 x 1()S個(gè)B 細(xì)胞、B/aGalCer、 B/AdHM和B/AdHMAxGalCer免疫該小鼠組。在僅用B 細(xì)胞處理的組中觀察到最短的存活時(shí)間，且B/ccGalCer組的存活時(shí)間與之 相似。同時(shí)，與僅用B細(xì)胞和B/aGalCer處理的組中的那些相比，用 B/AdHM疫苗免疫的組的存活時(shí)間得到稍微的延長(zhǎng)。相反，用 B/AdHMAxGalCer免疫的組中的存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)，這與預(yù)防模型的結(jié)果 一致，這說明了 B/AdHMAxGalCer疫苗具有比B細(xì)胞、 B/aGalCer或B/AdHM疫苗更好的抗腫瘤作用(圖29，下圖)。
配制實(shí)施例制備可注射的溶液
制備本發(fā)明抗腫瘤疫苗的可注射溶液如下。
將1 - 2嗎/ml (xGalCer， 5 x 106個(gè)細(xì)胞/ml的B細(xì)胞，1-2 (ig/ml肽， 1 g 5'-氯-3,2'-二羥基査耳酮或5'-氯-2,3'-二羥基查耳酮?dú)渎然铮?.6 gNaCl和O.l g抗壞血酸溶解到蒸餾水中，由此產(chǎn)生100ml用于注射的溶液。 將該溶液倒入瓶中，所述瓶在12(TC滅菌30分鐘。
工業(yè)適用性
如前文所解釋，本發(fā)明的B細(xì)胞不僅將細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答誘導(dǎo) 到與常規(guī)DC疫苗誘導(dǎo)的相似的水平，并且具有對(duì)實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤的 預(yù)防和治療作用，其中所述B細(xì)胞負(fù)載了天然殺傷T細(xì)胞配體，具體地是 (xGalCer，和抗原。用編碼腫瘤抗原的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的B細(xì)胞能夠誘導(dǎo)抗原 特異性免疫應(yīng)答，以致由B細(xì)胞介導(dǎo)的疫苗能夠用作腫瘤的預(yù)防劑和治療 劑。另外，本發(fā)明的疫苗甚至能夠在沒有CD4+T細(xì)胞的幫助下，誘導(dǎo)免 疫應(yīng)答。因此，能夠?qū)⑵溆行У厥┯糜诟腥綡IV的患者中，所述患者具有 由于缺乏CD4+T細(xì)胞引起的免疫缺陷。
本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員應(yīng)該理解，在前述描述中公開的觀念和具體的 實(shí)施方案可以容易地用作改進(jìn)或設(shè)計(jì)實(shí)施本發(fā)明的相同目的的其它實(shí)施 方案的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員還應(yīng)該理解，這樣的等價(jià)實(shí)施方案沒 有背離在后附的權(quán)利要求中提出的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1. 一種免疫治療和預(yù)防性疫苗，其由負(fù)載天然殺傷T細(xì)胞的配體的B細(xì)胞、配體和抗原共-脈沖的B細(xì)胞或表達(dá)負(fù)載配體的抗原的B細(xì)胞介導(dǎo)。
2. 按照權(quán)利要求1的免疫治療和預(yù)防性疫苗，其中所述天然殺傷T 細(xì)胞的配體是選自由下列各項(xiàng)組成的組中的 一 項(xiàng) a-galacturonosylceramide、 a-glucuronosylceramide、磷月旨酰肌醇四甘露糖苷、 異球三己糖基神經(jīng)酰胺、神經(jīng)節(jié)苷脂GD3、磷脂酰膽堿、卩-半乳糖基神經(jīng) 酰胺、脂磷酸聚糖、糖基肌醇磷脂(glycoinositol phospholipid )、 aGalCer 衍生物(3-異頭半乳糖基神經(jīng)酰胺和a-異頭半乳糖基神經(jīng)酰胺、細(xì)菌脂質(zhì)抗 原和aGalCer變體。
3. 按照權(quán)利要求1的免疫治療和預(yù)防性疫苗，其中所述抗原源自病原 體或腫瘤抗原，所述病原體包括致病細(xì)菌、病毒和寄生蟲。
4. 按照權(quán)利要求3的免疫治療和預(yù)防性疫苗，其中所述病原性細(xì)菌來源的抗原是選自由下列各項(xiàng)組成的組中的一項(xiàng)百日咳博德特氏菌 (Bordetellapertussis)抗原(百日咳毒素、絲狀血凝素和pertactin)、破傷 風(fēng)類毒素、白喉抗原(白喉類毒素)、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)抗 原(血清組A,B,C,Y和W-135的莢膜多糖)、肺炎球菌屬抗原(3型肺炎 鏈球菌(Streptococcuspnemoniae)莢膜多糖)、結(jié)核抗原、霍亂抗原(霍亂毒 素B亞基)、葡萄球菌抗原(葡萄球菌腸毒素B)、志賀氏菌屬(shigella) 抗原(志賀氏菌屬多糖)、疏螺旋體屬物種(Borreliasp.)抗原、白色念珠 菌(Candidaalbicans)抗原和癥原蟲(Plasmodium)抗原。
5. 按照權(quán)利要求3的免疫治療和預(yù)防性疫苗，其中所述病毒來源的抗 原是選自由下列各項(xiàng)組成的組中的一項(xiàng)流感病毒抗原(血凝素和神經(jīng)氨 酸酶抗原)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原(糖蛋白)、皰疹性口炎病毒抗 原(皰疹性口炎病毒糖蛋白)、巨細(xì)胞病毒(CMV)抗原、肝炎病毒抗原(甲型 肝炎(HAV),乙型肝炎(HBV),丙型肝炎(HCV), 丁型肝炎(HDV)和庚型肝 炎(HGV)抗原)(核心抗原和表面抗原)、呼吸道合胞病毒(RSV)抗原、單純 皰疹病毒(HSV)抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原(GP-120、 GP-160、 p18、 Tat、 Gag、 Pol和Env)和它們的組合。
6. 按照權(quán)利要求3的免疫治療和預(yù)防性疫苗，其中所述腫瘤抗原是選自由下列各項(xiàng)組成的組中的一項(xiàng)HPVE6/E7、 gp100、酪氨酸酶、TRP-1 (酪氨酸酶-相關(guān)蛋白-l)、 TRP-2(酪氨酸酶-相關(guān)蛋白-2)、 MAGE、 MUC-1、 CEA(癌胚抗原)、p53， oc-甲胎蛋白和Her-2/朋w。
7. 按照權(quán)利要求1的免疫治療和預(yù)防性疫苗，其中所述抗原特征性地 以肽、脂多糖、多糖、糖蛋白或多核苷酸的形式存在。
8. 按照權(quán)利要求1的免疫治療和預(yù)防性疫苗，其中所述抗原是通過用 重組病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)而表達(dá)的。
9. 按照權(quán)利要求8的免疫治療和預(yù)防性疫苗，其中所述重組病毒是選 自由下列各項(xiàng)組成的組中的一項(xiàng)腺病毒、腺伴隨病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、痘 苗病毒、痘病毒和新培斯病毒，從而引入編碼抗原的基因。
10. 天然殺傷T細(xì)胞活化劑，其是由負(fù)載aGalCer的B細(xì)胞介導(dǎo)的。
11. 細(xì)胞毒性反應(yīng)誘導(dǎo)劑，其是由負(fù)載otGalCer的表達(dá)腫瘤抗原的B 細(xì)胞介導(dǎo)的。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療疾病的基于B細(xì)胞的疫苗，所述B細(xì)胞負(fù)載了天然殺傷T細(xì)胞的配體，和抗原，更準(zhǔn)確地，由負(fù)載了α-半乳糖基神經(jīng)酰胺的B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫治療和預(yù)防性疫苗，所述α-半乳糖基神經(jīng)酰胺是一種能夠刺激天然殺傷T細(xì)胞的糖脂。本發(fā)明的疫苗組合物能夠有效地用作抗腫瘤免疫治療劑。其中的B細(xì)胞，不僅誘導(dǎo)與常規(guī)地基于樹突細(xì)胞的疫苗所誘導(dǎo)的相似水平的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，并且還具有對(duì)實(shí)體瘤和遷移腫瘤的預(yù)防和治療作用，所述B細(xì)胞與樹突細(xì)胞相比，是容易獲得的。
文檔編號(hào)A61P37/00GK101426523SQ200680054355
公開日2009年5月6日 申請(qǐng)日期2006年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月27日
發(fā)明者姜昌律, 鄭淵碩, 金娟政, 金炳皙, 高圣悅, 高賢政 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人首爾大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力財(cái)團(tuán)