專利名稱：殺死不想要的靶細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從一個(gè)細(xì)胞群體中有選擇性地清除靶細(xì)胞的方法，該方法通過將此細(xì)胞群體暴露于兩種或多種免疫毒素的組合中而得以實(shí)現(xiàn)。
所謂的自體干細(xì)胞移植物包括來自癌癥患者血液或骨髓的分離細(xì)胞，分離的細(xì)胞經(jīng)過預(yù)處理，再回輸進(jìn)病人的血液中，細(xì)胞是從該病人的血液中收獲的。很快或經(jīng)過一段較長(zhǎng)的時(shí)間之后，病人就包含有足夠數(shù)量的未成熟前體血液和免疫細(xì)胞以重建無功能性骨髓的功能。
用抗體凈化自體造血移植物在本領(lǐng)域中是已知的，此時(shí)移植物代表的是未篩選的骨髓樣品。這樣的凈化方法由Myklebust,A T.,Godal,A.,Juell,S.和Fodstad,φ.等發(fā)表，“從人骨髓細(xì)胞中清除乳腺癌細(xì)胞的兩種基于抗體的方法的比較”?！栋┌Y研究》(USA)1994,54/1(209-214),以及Myklebust,A.T.,Godal,A.,Pharo,A.,Jerll,S.和Fodstad,φ?！坝妹庖叨舅貜娜斯撬柚星宄〖?xì)胞肺癌細(xì)胞”，《癌癥研究》(USA)1993,53(16),3784-88。在兩篇文章中都用到免疫毒素，即抗體連接到一種毒素上。原則是在將細(xì)胞懸浮液重新注射給病人之前殺滅收獲的骨髓細(xì)胞中的惡變細(xì)胞。
近年來正是在改進(jìn)的方法中此原則事實(shí)上正好相反。人們?cè)噲D用所謂的干細(xì)胞移植充滿自信地從血液或骨髓中篩選一個(gè)正常的細(xì)胞亞群，當(dāng)此細(xì)胞重注入病人之后，它們能恢復(fù)正常骨髓的功能。這些“干細(xì)胞”由血細(xì)胞和免疫細(xì)胞的最不成熟的前體以及更進(jìn)一步分化細(xì)胞的混合物組成。收獲這些細(xì)胞可通過所謂的外周血的單采血液成分術(shù)(apharesis)來實(shí)現(xiàn)，此過程要一到幾天，或通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員知道的不同的技術(shù)從血或骨髓中免疫吸收/篩選CD34+細(xì)胞(未成熟先祖細(xì)胞)。
Stray,K.M.等，“用親和素、生物素、免疫吸收從骨髓或外周血中清除癌細(xì)胞”見P.G.Adrian,G.Samuel和A.w-w.Diana(編)，《骨髓凈化和處理方法進(jìn)展》97～103頁(yè)，Orlando:Willelis Inc.,1994，描述了從外因血中凈化骨髓細(xì)胞或單采血液成分術(shù)產(chǎn)物。此過程是為了清除病人體內(nèi)的淋巴瘤以及病人體內(nèi)的乳腺癌。此方法包括在純化B細(xì)胞或乳腺癌細(xì)胞之前用一個(gè)所謂的親和柱對(duì)CD34+細(xì)胞進(jìn)行富集。此處的凈化是間接進(jìn)行的，細(xì)胞懸液起初與結(jié)合乳腺癌細(xì)胞的初級(jí)抗體共孵育，細(xì)胞懸液經(jīng)過清洗，再一次和結(jié)合初級(jí)抗體的抗體共孵育。此鼠抗體是生物素標(biāo)記的，即連接到一個(gè)分子上，該分子與親和素結(jié)合力很強(qiáng)。當(dāng)此細(xì)胞懸液最終裝柱，柱中是結(jié)合了親和素的小珠，通過初級(jí)的生物素標(biāo)記抗體和二級(jí)的抗體親和素反應(yīng)造成的細(xì)胞間結(jié)合，則腫瘤細(xì)胞就將被捕獲。用此系統(tǒng)凈化的結(jié)果至多可以使惡變細(xì)胞下降3.2個(gè)對(duì)數(shù)值(3.2log)。此原理非常費(fèi)時(shí)而且麻煩，因?yàn)榧?xì)胞懸液在此柱之前必須經(jīng)過幾步處理，包括與抗體共孵育及兩次清洗。這樣，很難避免對(duì)干細(xì)胞的損害，柱子對(duì)干細(xì)胞也可能有非特異性的捕獲，導(dǎo)致對(duì)恢復(fù)正常的骨髓功能來說至關(guān)重要的細(xì)胞的不幸丟失。
Tyer,C.L.等，“用免疫磁學(xué)技術(shù)可以從外周血先祖細(xì)胞中有效清除乳腺癌細(xì)胞”。國(guó)際血液治療和移植工程學(xué)會(huì)第一次會(huì)議摘要，Orlando FL,1993，描述了一種免疫磁學(xué)方法類似于上述Myklebust等的發(fā)表物中所用的方法。然則此方法是用于外周血細(xì)胞。其原理也完全不同于應(yīng)用免疫毒素，模型試驗(yàn)中惡變細(xì)胞凈化效率在3.3到4.8個(gè)對(duì)數(shù)單位中間變動(dòng)。摘要中沒有提到此間接系統(tǒng)—用初級(jí)抗體孵育，接著洗滌，又與連接有結(jié)合初級(jí)抗體的抗體的小珠共孵育—的任何其他用途，但這是一個(gè)值得進(jìn)一步推敲的設(shè)想。此過程包含額外的可能是對(duì)正常細(xì)胞有害的處理，而且有時(shí)間要求。其效率有限而且摘要中未提及任何關(guān)于清除CD34+細(xì)胞種群的內(nèi)容，但在此方法中CD34+細(xì)胞種群將是一個(gè)主要問題，因?yàn)楹Y選CD34+細(xì)胞是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的。這樣，在多數(shù)情況下免疫磁學(xué)原理是用于CD34+細(xì)胞本身篩選，在本例中隨后有一或兩個(gè)免疫磁學(xué)步驟用于凈化之目的。因此，如果一個(gè)方法需要持續(xù)長(zhǎng)的過程，費(fèi)用又高，則會(huì)有相當(dāng)大的風(fēng)險(xiǎn)導(dǎo)致細(xì)胞破壞和細(xì)胞丟失。
對(duì)分離用于移植的干細(xì)胞而言，主要目標(biāo)之一是，將要用于再注入病人的細(xì)胞需按以下方法進(jìn)行選擇性分離，分離的途徑即是要保證移植物中不含有任何惡變細(xì)胞。現(xiàn)有技術(shù)最近表明這樣制備的干細(xì)胞在所控測(cè)的例數(shù)中相當(dāng)多的時(shí)候出人意外地包含有惡變細(xì)胞。迄今為止，選擇性地除去或殺死這些移植物中的惡變細(xì)胞，這樣的嘗試還非常有限。這要部分歸因于本領(lǐng)域的技術(shù)人員沒有看到其必要性，也因?yàn)槠谕F(xiàn)實(shí)中已知的方法不是特異性的，如此也就能夠殺滅或除去脆弱的干細(xì)胞。而且，病人提供骨髓或活化的外周血不是簡(jiǎn)單的和不受限制的，這樣一個(gè)凈化干細(xì)胞移植物的方法必須在很短的時(shí)間內(nèi)完成，而且不能復(fù)雜化，為的是避免對(duì)正常細(xì)胞can的丟失和破壞。這樣，如上所述，用干細(xì)胞移植物的原因由部分是移植物應(yīng)該完全沒有癌細(xì)胞，部分是骨髓功能的重建要比用未篩選骨髓進(jìn)行移植者快。結(jié)論是絕對(duì)有必要發(fā)明一種方法，它可以使易損壞的正常干細(xì)胞保持完整，且在實(shí)際中可以和干細(xì)胞分離程序聯(lián)合實(shí)施。
本發(fā)明的目標(biāo)因而是提供一種方法以凈化干細(xì)胞移植物，且不包含上述的缺點(diǎn)。
這些目標(biāo)在以所包括的權(quán)利要求為特征的本發(fā)明中都達(dá)到了。
本發(fā)明涉及從實(shí)體瘤病例收獲的干細(xì)胞群體的凈化，該方法中細(xì)胞群體暴露于兩種或多種連接到細(xì)菌毒素的抗體的組合物中。所用的抗體都指向靶細(xì)胞相關(guān)抗原。
下邊將用一個(gè)例子更詳細(xì)地描述本發(fā)明，即凈化從外周血中收獲的干細(xì)胞移植物，除去其中的乳腺癌細(xì)胞。
收獲細(xì)胞的已知技術(shù)包括從血或骨髓中免疫吸收/篩選外周血干細(xì)胞(PBSC)或CD-34+細(xì)胞。然而，尚未知無害和足夠有效的技術(shù)以清除這些細(xì)胞群中的腫瘤細(xì)胞。顯然甚至在這些未成熟細(xì)胞中也有惡變細(xì)胞，按照以前的知識(shí)這些惡變細(xì)胞不應(yīng)有CD34受體。重要的是，本發(fā)明如下的敘述將會(huì)令人驚奇地將癌細(xì)胞也清除掉而不對(duì)正常前體產(chǎn)生毒性。
在從外周血中收獲干細(xì)胞移植體之前，必須用本領(lǐng)域中已知的方法以化學(xué)治療或生長(zhǎng)素處理而從骨髓中活化干細(xì)胞。干細(xì)胞的收獲可以按照一種或多種方法進(jìn)行，根據(jù)需要什么種類的細(xì)胞而定。外周血干細(xì)胞用一種方法收集。其執(zhí)行可安排病人在接受高劑量的化療和全身放療之后給予G-CSF(10μg/kg/d)在第10天和11天耐受白細(xì)胞提取。血流率可用CS-300加血細(xì)胞分離器固定在例如70ml/min(BaxterHealthcare Corporation,Fenwal Division,Deerfield,IL,USA)。此過程中處理到一個(gè)二腔中心靜脈導(dǎo)管中的平均血容可以是10升左右，持續(xù)21/2小時(shí)?？梢允占?0ml PBSC，用磷酸鈉緩沖液(PBS)、1％人血清白蛋白(HSA)在一個(gè)Processor 2991管中洗滌以除去血小板。用在本發(fā)明中，細(xì)胞濃度(2～4×1010/單采血液成分)可調(diào)至1×108/ml以用免疫毒素進(jìn)行陰性篩選(凈化)。
如果需要CD-34+細(xì)胞，可用ISOLEX 50或ISOLEX 300(Baxter)進(jìn)行陽(yáng)性篩選來獲得。在此方法中，來自單采血液成分術(shù)或骨髓的產(chǎn)物，約4×1010～6×1010個(gè)細(xì)胞，可以混和在一起，與抗-CD34+-單克隆抗體9C5共孵育，條件是在溫和震蕩器上于4℃作用30min，抗體的量是0.5μg/1×106細(xì)胞。經(jīng)處理的細(xì)胞用含1％HSA的PBS在CobeProcessor上洗滌以除去未結(jié)合抗體。DYNAL珠M-450被加到CD34+部分，比例是0.5個(gè)小珠對(duì)1個(gè)有核細(xì)胞，4℃作用30分鐘。從非靶細(xì)胞磁力分離玫瑰花形聚集物，可用含1％HSA的PBS洗2～3次以除去未結(jié)合細(xì)胞。然后，為使CD34+細(xì)胞從Dynal小珠上釋放，可加進(jìn)例如ChymoCell-R(木瓜凝乳蛋白酶)達(dá)終濃度200 pKat/ml室溫作用15分鐘。這樣，CD34+細(xì)胞可通過用含5％檸檬酸鈉的PBS洗滌而收集。其他篩選干細(xì)胞/早期前體細(xì)胞的程序也是已知的。
多個(gè)抗體與乳腺癌細(xì)胞系及腫瘤物質(zhì)的結(jié)合曲線已經(jīng)其他作者調(diào)查出來，部分得到我們驗(yàn)證。那些和很大比率乳腺癌細(xì)胞相結(jié)合卻不和血及骨髓中重要的未成熟正常細(xì)胞結(jié)合的抗體，和假單胞外毒素A(PE)相連，其殺死培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞的能力。主要在集落產(chǎn)生分析中得到了檢驗(yàn)?；谀切┛贵w的結(jié)合曲線，本發(fā)明人生產(chǎn)了所有5種不同的免疫毒素1．MOC31-PE此結(jié)合物與所有乳腺癌細(xì)胞中一個(gè)很高百分比的部分相結(jié)合，在模型試驗(yàn)中非常有效，在實(shí)際作用濃度下對(duì)正常的造血先祖細(xì)胞只有邊緣毒性。
2．NrLu10-PE結(jié)合如上的抗原，也結(jié)合其他的表位。活性稍稍低于MOC31-PE。
3．BM7-PE結(jié)合主要發(fā)現(xiàn)于乳腺癌細(xì)胞中的粘蛋白抗原的蛋白部分。此抗原存在于很高百分比的乳腺癌細(xì)胞中，但不是全部都有。此免疫毒素對(duì)癌細(xì)胞顯示高特異性，但不像前兩個(gè)免疫毒素一樣有效。
4．BM2-PE結(jié)合BM7-PE相同抗原的含糖表位。此免疫毒素顯示與BM7-PE大抵相同的效應(yīng)，對(duì)正常細(xì)胞毒性很低。
5．MLuCl-PE結(jié)合一個(gè)完全不同的抗原，即Lewisy-抗原。此免疫毒素較前一個(gè)活性輕微降低，對(duì)正常細(xì)胞也顯示中等毒性。
根據(jù)1,2,5所說的免疫毒素在模型試驗(yàn)中已分別或聯(lián)合試用以清除規(guī)則骨髓樣品中的癌細(xì)胞(MyKlebust等，癌癥研究，1994)。正如前邊提到的，用干細(xì)胞移植物有一個(gè)很大的優(yōu)點(diǎn)就是只需要一個(gè)較短的時(shí)間間隔就可以重新獲得正常的骨髓功能(那更安全的程序)。然而，不管期望的是什么，這些移植物已被癌細(xì)胞所污染，有必要應(yīng)用能殺死移植物中所有癌細(xì)胞而又不嚴(yán)重影響正常細(xì)胞的免疫毒素。
尋找比MLuCl-PE對(duì)乳腺癌更特異的更適宜于乳腺癌清除的免疫毒素的工作開始了。
本研究中令人驚訝地發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用MOC31-PE和BM7-PE的效果超過單獨(dú)應(yīng)用這兩種免疫毒素的總和。如下面的表1所示。對(duì)抗體和細(xì)胞系兩者之間結(jié)合的進(jìn)一步研究顯示聯(lián)合使用導(dǎo)致了比單一抗體更強(qiáng)的結(jié)合。
MOC31結(jié)合大多數(shù)乳腺癌細(xì)胞，包括那些分化程度較低者。BM7識(shí)別相當(dāng)一部分乳腺癌細(xì)胞都表達(dá)的一種粘蛋白抗原，也包括表達(dá)于那些分化程度更高的細(xì)胞上者。MrLu 10和BM 2分別結(jié)合被MOC31和BM7識(shí)別的抗原，記住這一點(diǎn)就會(huì)明白它們不大可能在聯(lián)合使用MOC31和BM7免疫毒素時(shí)有所貢獻(xiàn)。MLuCl-PE在理論上的意義在于它結(jié)合的抗原不同于上邊所述的免疫毒素。然則，MLuCl-PE對(duì)正常細(xì)胞有毒，模型試驗(yàn)未顯示在聯(lián)合應(yīng)用中包括它有任何明顯的好處。
在下邊的例子中，敘述的是凈化外周干細(xì)胞移植物(單采血液成分術(shù)之產(chǎn)物)。另外，發(fā)明者用MOC31-PE和BM7-PE組合物進(jìn)行了數(shù)個(gè)試驗(yàn)，在試驗(yàn)中于免疫磁學(xué)法陽(yáng)性篩選CD34+細(xì)胞之前將癌細(xì)胞加到收獲的外周干細(xì)胞中。一個(gè)這樣試驗(yàn)的結(jié)果示于表2。用兩種不同細(xì)胞系，顯示出僅僅用陽(yáng)性篩選CD34+(沒有其他任何形式的清除)則從初始收獲的細(xì)胞群中除去高達(dá)3.8個(gè)Log的癌細(xì)胞。在其他試驗(yàn)中CD34篩選的“凈化”效率變化于2～3log，這些在文獻(xiàn)中亦有提及。當(dāng)免疫毒素處理用于已經(jīng)經(jīng)過了陽(yáng)性篩選的CD34細(xì)胞群體時(shí)，則對(duì)兩個(gè)細(xì)胞系的整體凈化效率都超過4.7log(表2)。此處超過4.7log意味著所有可檢測(cè)到的癌細(xì)胞皆已除去。在其他試驗(yàn)中我們經(jīng)分離分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)1小時(shí)免疫毒素處理的CD34+群體/中可減少成熟腫瘤細(xì)胞和正常的先祖細(xì)胞。在這些試驗(yàn)中我們觀察到，腫瘤細(xì)胞被殺死或在處理之后很快死去，而未凈化的對(duì)照群體中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生集落，和/或以細(xì)胞粘附型培養(yǎng)物的形式繁殖。正常干細(xì)胞不受此處理的影響，所以在三個(gè)不同的檢測(cè)系統(tǒng)中正常先祖細(xì)胞的存活僅僅發(fā)生無關(guān)緊要的降低。表3顯示了一個(gè)類似試驗(yàn)，CD34+細(xì)胞與免疫毒素37℃共孵育2小時(shí)，顯示出干細(xì)胞基本上可經(jīng)免疫毒素處理而存活。
表1包含PE免疫毒素殺滅PM1乳腺癌細(xì)胞的效果
表2 單獨(dú)及與抗-乳腺癌MOC31和BM7免疫毒素聯(lián)合使用的趨向性免疫磁珠篩選的凈化效果，在模型試驗(yàn)中用1％的PM1和T-47D乳腺癌細(xì)胞與外周血干細(xì)胞混合。
表3IT對(duì)從活化外周血中篩選的CD34+細(xì)胞的集落存活的效應(yīng)。約×105CD34+細(xì)胞與免疫毒素于37℃共孵育2小時(shí)，在CFU-GM和CFU-GEMM(5×103/盤)培養(yǎng)物中選種，而后如舉例的“材料與方法”中所述進(jìn)行分析
a．從所觀察到的集落數(shù)目計(jì)算得到，把平皿接種的效率考慮在內(nèi)，放入這種處理所殺死的細(xì)胞數(shù)目。b．獨(dú)立試驗(yàn)結(jié)果的均數(shù)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次。c．MOC31-PE和BM7-PE免疫毒素的作用濃度均為1μg/ml。
很奇怪的是，用兩種抗體殺死惡變細(xì)胞都沒有對(duì)從外周血和骨髓中收獲的正常干細(xì)胞造成任何損壞，依據(jù)本發(fā)明，這兩種抗體針對(duì)的是上皮細(xì)胞表達(dá)的抗原，每種抗體都和假單胞外毒素A細(xì)菌外毒素相聯(lián)合。本領(lǐng)域的人知道細(xì)胞可以被細(xì)菌外毒素殺死，而且將毒素連接到針對(duì)靶細(xì)胞表達(dá)表位的抗體則殺滅效應(yīng)會(huì)增強(qiáng)。然而，還知道的是如果未成熟細(xì)胞暴露于一種或幾種免疫毒素則極有可能的是這種處理將殺滅該細(xì)胞群體中的正常干細(xì)胞。更進(jìn)一步，這些正常干細(xì)胞對(duì)伴隨機(jī)械損傷和溫度改變的體內(nèi)處理敏感。本發(fā)明中的細(xì)胞群體，例如從外周血中收獲的一干細(xì)胞移植物，暴露于兩種抗體的組合物，兩種抗體均結(jié)合于PE。由于其中的一種免疫毒素的活性非常強(qiáng)，很奇怪顯示的結(jié)果是用結(jié)合到一種細(xì)菌毒素的兩種抗體的組合物其凈化效果看起來好像比單獨(dú)使用兩種免疫毒素的效應(yīng)的總和還要強(qiáng)。此協(xié)作效應(yīng)顯示于表4，本發(fā)明用連接到假單胞外毒素A的抗體BM7和MOC31殺滅PM1人乳腺癌細(xì)胞揭示出這一點(diǎn)。所指的免疫毒素都是針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體，都連接到細(xì)菌毒素假單胞外毒素A。其中一個(gè)抗體識(shí)別被GA733-2基因編碼的上皮抗原，該抗原表達(dá)于大多數(shù)癌細(xì)胞，因此可用于包含癌的所有病例(例如乳腺癌，直腸癌，前列腺癌，卵巢癌，腫瘤和胰腺癌)。另一個(gè)抗體針對(duì)粘蛋白，一種類型的癌與另一類型的癌其粘液蛋白有輕微區(qū)別。一般情況下其抗原可被描述成基因MUC-1,MUC-2和MUC-3編碼的蛋白。上邊提及的單克隆抗體的例子是MOC31和BM7。
抗體和毒素的連接可用已知的不同方法進(jìn)行。
篩選組合物中偶聯(lián)細(xì)菌外毒素的兩或多種抗體是按下述方法進(jìn)行的。即抗體結(jié)合針對(duì)的是大多數(shù)靶細(xì)胞表達(dá)的表位，而正常細(xì)胞不表達(dá)這些表位?，F(xiàn)有技術(shù)的問題是惡變細(xì)胞和正常血細(xì)胞均在細(xì)胞表面表達(dá)公共抗原。本發(fā)明包含的例子中用到兩種單克隆抗體MOC31和BM7。這些抗體的形成都是針對(duì)外周血中發(fā)現(xiàn)的惡變的上皮細(xì)胞的。其抗原(整個(gè)蛋白)是由基因GA733-2編碼的。然而，此抗原有數(shù)個(gè)表位，重要的是指向表達(dá)最豐富最充分的表位。
BM7抗體是針對(duì)MUC1基因表達(dá)抗原的一個(gè)表位的抗體之一。有數(shù)個(gè)基因編碼類似的抗原，例如(MUC2,MUC3)。
細(xì)菌毒素假單胞菌外毒素A對(duì)正常干細(xì)胞和惡變細(xì)胞有相對(duì)中等的毒性效應(yīng)。然而，當(dāng)該毒素連接到針對(duì)表達(dá)于靶細(xì)胞的抗原的抗體時(shí)則對(duì)這些細(xì)胞的毒性效應(yīng)是很顯著的。表5顯示的是本發(fā)明中免疫毒素的混合物，即使孵育時(shí)間短至60分鐘，也可殺死T-47D細(xì)胞，MCF7細(xì)胞和PM1細(xì)胞，比現(xiàn)有技術(shù)中的其他方法的效率高得多。這樣這兩種免疫毒素的聯(lián)合使用就給出了如人們所期望的同時(shí)又令人驚奇的結(jié)果，由于其選擇效率，簡(jiǎn)單性以及對(duì)正常先祖細(xì)胞僅有邊緣毒性。
或許有人指出已知有由假單胞外毒素A連接到三種不同抗體而組成數(shù)種免疫毒素的應(yīng)用，見MyKlebust等1993和1994。其中一種抗體(MOC31)和本發(fā)明的用法相類似，目的是凈化未篩選的骨髓細(xì)胞。然而，所用的其他抗體似乎不是最理想的，在其他抗體中因?yàn)橛幸环N是指向與MOC31相同的抗原，而且另一種(MLuCl)與正常細(xì)胞交叉反應(yīng)，因而連接到這種抗體的免疫毒素很容易對(duì)最不成熟的干細(xì)胞產(chǎn)生毒性。本發(fā)明凈化干細(xì)胞制備物過程中我們制備了另一種單克隆抗體，它增強(qiáng)MOC31的效應(yīng)，而且觀察到這兩種抗體的組合物用作免疫毒素給出了極為令人驚奇的結(jié)果。
由于所發(fā)現(xiàn)的免疫毒素有高度特異的活性，看來有可能對(duì)罹患不同類型癌癥的病人給予該混和物以進(jìn)行體內(nèi)治療。如果腫瘤是局限性的則有可能靜脈注射或輸入其中一種或其混和物，例如當(dāng)顯示疾病已擴(kuò)散至骨髓時(shí)。進(jìn)一步還有可能對(duì)疾病進(jìn)一步擴(kuò)散、已有腹部液體(腹水)或胸膜滲出物的病人單獨(dú)或聯(lián)合注射免疫毒素。第三種可能性是治療腫瘤已擴(kuò)散到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病人。在這種情況下免疫毒素可直接注射進(jìn)腫瘤組織，注射進(jìn)腦脊液或給腦供血的動(dòng)脈。
除了MOC31-PE已經(jīng)被用于小細(xì)胞肺癌的薄腦膜腫瘤模型以外，尚未見這些免疫毒素用于體內(nèi)的情況。BM7-PE在文獻(xiàn)中根本沒有述及。
體內(nèi)應(yīng)用免疫毒素的一個(gè)重要問題是，它們的半壽期一般都很短，即腫瘤內(nèi)的濃度還沒有達(dá)到足夠高時(shí)免疫毒素就被破壞和清除出血液。在US PS 5322678中，Morgan等已申請(qǐng)了一個(gè)專利，即對(duì)免疫毒素的抗體部分進(jìn)行修飾，以減少體內(nèi)半壽期短的問題。本發(fā)明提出了對(duì)毒素部分進(jìn)行類似修飾，此程序是前所未知、前所未行的。
實(shí)施例1從外周血干細(xì)胞收獲物中用免疫毒素有效清除乳腺癌細(xì)胞。介紹以自體造血干細(xì)胞輔助的高劑量化學(xué)放射治療用于治療各種惡性腫瘤患者的使用頻率在上升(1,2)。此方法不成功的病例，最普遍的原因是疾病的復(fù)發(fā)，而非毒力，感染和增強(qiáng)移植作用的缺乏(3)。重要的是，有過硬的證據(jù)說明在接受高劑量治療的病人，重注入含有集落生成的腫瘤細(xì)胞的自體移植物會(huì)對(duì)舊病復(fù)發(fā)起促進(jìn)作用，且影響預(yù)后(4)。自體移植細(xì)胞的基因標(biāo)記研究已顯示，存留在回輸骨髓(BM)中的腫瘤細(xì)胞對(duì)疾病的復(fù)發(fā)有一定促進(jìn)作用(5)。此結(jié)論被下述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，即在濾泡淋巴瘤的病人有效的BM凈化提高了病愈存活(6)。
應(yīng)用靈敏的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)在組織學(xué)上正常的骨髓自體移植物中能觀察到腫瘤細(xì)胞污染，這種情況在經(jīng)高劑量處理的乳腺癌病人中的發(fā)生范圍是37％～62％(7)。用造血生長(zhǎng)因子和化學(xué)治療預(yù)處理，之后用單采血液成分術(shù)收集外周血干細(xì)胞(PBSC)自體移植物，此方法的應(yīng)用范圍在擴(kuò)大，由于相信這些產(chǎn)物污染腫瘤細(xì)胞的可能性低。然而，近來發(fā)現(xiàn)，雖然比之BM收集物PBSC自體移植物中腫瘤細(xì)胞包含率的廣泛性較低，而在乳腺癌病人的活化PBSC收集物中仍然經(jīng)常發(fā)現(xiàn)惡變細(xì)胞(4,7)。另外，近來的發(fā)現(xiàn)顯示，不論病人以前有或沒有在骨髓中發(fā)現(xiàn)可檢測(cè)到的腫瘤細(xì)胞，化療和/或生長(zhǎng)因子都將會(huì)活化腫瘤細(xì)胞進(jìn)入外周血(7,8)，結(jié)果是進(jìn)一步增加PBSC移植物中腫瘤細(xì)胞污染的危險(xiǎn)性。
為了避免重輸入惡變細(xì)胞，有必要體外清除PBSC自體移植物中的乳腺癌細(xì)胞。此處我們報(bào)告一個(gè)實(shí)用、快速的凈化方法，顯示在一個(gè)60分鐘的孵育過程中，ITs直接加入血液?jiǎn)纬煞痔崛∥镏袑⑦x擇性地殺死超過5log的腫瘤細(xì)胞。
材料和方法細(xì)胞系。PM1乳腺癌細(xì)胞系由我們實(shí)驗(yàn)室建立，它是從一個(gè)病情惡化的病人的腹水建成的。MCF7和T-47D細(xì)胞系來自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockwille,MD)(分別為ATCC HTB 22和ATCC HTB133)。細(xì)胞培養(yǎng)的條件是37℃,5％CO2室氣，RPMT 1640培養(yǎng)基(RPMI)含10％熱滅活胎牛血清(FCS)和抗生素(100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素)培養(yǎng)基和補(bǔ)充物購(gòu)自GIBCO(Paisley,UK)。
人骨髓和外周血先祖細(xì)胞。BM細(xì)胞來自健康的志愿捐獻(xiàn)者。BM單核細(xì)胞(MNC)部分獲自Lymphoprep試劑盒(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)，試驗(yàn)應(yīng)用之前用磷酸緩沖液(PBS)洗滌兩次。PBSCs來自非-何杰金淋巴瘤病人。為了活化PBSCs，病人經(jīng)化療加造血生長(zhǎng)因子(G-CSF,Neupogen,Amgen/Hoffman-La Roche,Basel,Switzerland)預(yù)處理?；熤?1到12天。當(dāng)外周血中CD34+細(xì)胞的數(shù)目高的時(shí)候，就用CS-3000 Plus血細(xì)胞分離器收集干細(xì)胞(Baxter,Healthcare,Corp.,Fenwal Division,Deerfield,IL)。
毒素，抗體，及免疫毒素的構(gòu)建?？?MUC1(9)抗體BM7(IgGl)由S.Kaul(Frauenklinik，海登堡大學(xué)，德國(guó))贈(zèng)送，抗-EGP2(10)抗體MOC-31(IgG2a)由L.de Leij(University of Groningen，荷蘭)和MCA Development(Groningen)善意提供。PE來自瑞士血清與疫苗研究所(伯爾尼，瑞士)。每一種抗體都通過一個(gè)硫醚鍵連接到PE，此鍵的形成如前所述(11)用磺基-琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸鹽(Sulfo-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate(Pierce,Rockford,IL)。
免疫毒素治療。IT治療對(duì)集落生成乳腺癌細(xì)胞存活的效應(yīng)測(cè)定是將含F(xiàn)CS的RPMI中處在指數(shù)生長(zhǎng)期的2×106腫瘤細(xì)胞與指示濃度的ITs共孵育，于37℃輕微振蕩(100rpm，于環(huán)形孵化器上(Gallenkamp,Leicestershire,UK))不同長(zhǎng)度的一段時(shí)間，視每次試驗(yàn)而定。用于集落形成分析篩檢之前以含1％FCS的PBS洗滌兩次細(xì)胞。
在一些試驗(yàn)中，10％的腫瘤細(xì)胞與BM單核細(xì)胞或PBSCs混合，與ITs共孵育，而后洗滌，并對(duì)腫瘤細(xì)胞或造血先祖集落形成細(xì)胞的存活進(jìn)行效應(yīng)評(píng)估。
腫瘤和造血先祖細(xì)胞的集落分析。用于腫瘤細(xì)胞的集落生成軟瓊脂分析以前已有敘述(12)。三份重復(fù)培養(yǎng)物在37℃,5％CO2,5％O2,90％N2中孵育14天，超過50個(gè)細(xì)胞的集落將在一座Zeiss立體顯微鏡下計(jì)數(shù)。
經(jīng)處理和未經(jīng)處理的正常先祖細(xì)胞的集落形成能力是經(jīng)CFU-GEMM分析評(píng)估的(13)，此分析中每ml 5×104PBSCs分別培養(yǎng)于IMDM培養(yǎng)基(GIBCO)中標(biāo)準(zhǔn)的甲基纖維素培養(yǎng)物內(nèi)(HCC-4433Methocult,Terry Fox Labs,Vancouver,BC)。19天孵育之后，BFU-E和CFU-GM集落在倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)。每個(gè)分析都用三份平行培養(yǎng)物進(jìn)行，在1ml 35mm的小碟中，于37℃，在5％CO2,100％濕度的空氣中。
結(jié)果人乳腺癌細(xì)胞在軟瓊脂中的生長(zhǎng)。在數(shù)個(gè)試驗(yàn)中，觀察到種下的腫瘤細(xì)胞數(shù)和形成的腫瘤集落數(shù)目之間存在一個(gè)線性關(guān)系。PM1細(xì)胞系的克隆效率的范圍是20％到30％(未顯示)。在T-47D和MCF7細(xì)胞系的試驗(yàn)中，與PEs的線性關(guān)系以前報(bào)道的(14)分別是27％和22％，試驗(yàn)證實(shí)了這一點(diǎn)。這些資料被用來計(jì)算通過這種處理獲得的乳腺癌細(xì)胞衰竭的效率。
單獨(dú)和混和使用免疫毒素殺滅乳腺癌細(xì)胞的功效。在模型試驗(yàn)中每種工廠都使用了三種不同的濃度。如表4所示，在兩個(gè)較低濃度BM7結(jié)合物僅有邊緣效應(yīng)，而在1.0μg/ml時(shí)殺滅細(xì)胞達(dá)到2.5log，看到近3log細(xì)胞被殺死，在最高濃度(1μg/ml)功效最低達(dá)5logs，在本分析中估計(jì)可能是最高效應(yīng)(14)。兩種ITs的混合物，每種都用所指的濃度，在濃度為0.1μg/ml時(shí)所有的癌細(xì)胞都已被殺死(表4)。結(jié)果顯示這兩種ITs的混合物可以非常有效地殺滅乳腺癌細(xì)胞，資料還提示聯(lián)合使用兩種結(jié)合物可獲得加和效果。用其他兩種乳腺癌細(xì)胞系檢測(cè)ITs的功效也獲得了類似的結(jié)果(未顯示)。由于靶細(xì)胞上抗原表達(dá)有預(yù)期的異質(zhì)性，將IT聯(lián)合物用于將會(huì)進(jìn)一步發(fā)展起來的適合于臨床應(yīng)用的方法，這看來是符合邏輯的。
表4包含假單胞菌外毒素A的免疫毒素在殺滅PM1人乳腺癌細(xì)胞中的功效。PM1細(xì)胞和免疫毒素共孵育，37℃2h，在軟瓊脂，集落形成的估計(jì)如“材料和方法”中所述。
a.從觀察到的集落數(shù)計(jì)算得到，考慮到涂板效率，最終由處理所殺滅的細(xì)胞數(shù)目的對(duì)數(shù)確定下來。b.結(jié)果的均數(shù)來自獨(dú)立的軟瓊脂試驗(yàn)，每試驗(yàn)重復(fù)三次。c.各免疫毒素均用指定濃度。
孵育時(shí)間的影響。在上述試驗(yàn)中，與ITs的孵育時(shí)間用的是120min。在臨床情況下，為了實(shí)用的原因，用甚至更短的孵育時(shí)間將會(huì)有好處。為了研究是不是暴露于ITs的時(shí)間可以縮短而不影響殺死特定的腫瘤細(xì)胞，兩種結(jié)合物的混和物，每種所用的濃度均為1μg/ml，與三種乳腺癌細(xì)胞系孵育不同的時(shí)間以檢測(cè)之。在所有這幾種情況下，與ITs作用120分鐘者導(dǎo)致了所有腫瘤細(xì)胞的根除。重要的是，當(dāng)孵育時(shí)間減少到90min甚至60min時(shí)，該處理同樣有效(表5)，而且資料顯示在所用的IT濃度下最短的孵育時(shí)間足以殺死腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中出現(xiàn)的所有的集落形成腫瘤細(xì)胞。
表5孵育時(shí)間對(duì)MOC-31和BM7免疫毒素混和物殺滅乳腺癌細(xì)胞功效的影響單獨(dú)的腫瘤細(xì)胞(2×106/ml)或與外周血前體細(xì)胞混合(比例1∶10)(總數(shù)1×107細(xì)胞/ml)與ITs于37℃共孵育指定的時(shí)間長(zhǎng)度，用軟瓊脂篩選，作分析如表4。
a.每種IT的應(yīng)用濃度1μg/ml。b.結(jié)果來自用T-47D和PM1細(xì)胞進(jìn)行的兩個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)，及用MCF7細(xì)胞進(jìn)行的一個(gè)試驗(yàn)。
為了檢測(cè)在高數(shù)目的正常造血細(xì)胞存在時(shí)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的毒性是否會(huì)改變，進(jìn)行了這樣的試驗(yàn)，即將腫瘤細(xì)胞按1∶10的比例混合于用血液?jiǎn)纬煞痔崛》ㄊ斋@的PBPCs中。如表5所示，在正常細(xì)胞存在的情況下僅孵育60min之后ITs還是已經(jīng)殺死了超過5logs的PM1腫瘤細(xì)胞。由于對(duì)所有三種細(xì)胞系結(jié)果都一樣，資料表明該IT程序在臨床情況下應(yīng)用可能有效。
孵育條件和細(xì)胞濃度的影響。為了檢驗(yàn)在類似于臨床應(yīng)用的條件下IT程序的功效，試驗(yàn)中PM1腫瘤細(xì)胞將以1∶10的比例與PBPCs混合，其中在與ITs共孵育之前直接取自血液?jiǎn)纬煞痔崛“械奈聪礈旒?xì)胞用含ACD的生理鹽水(貯存液包，R2220,Baxter Healthcare Corp.,Fenwal Division)重懸。其結(jié)果與初始試驗(yàn)中的相比較，后者的細(xì)胞經(jīng)洗滌，是用含10％FCS的RPMI重懸的。發(fā)現(xiàn)(表6)兩種情況下用ITS處理60min均殺死所有PM1細(xì)胞，表明臨床應(yīng)用中ITs可以直接注射進(jìn)血液?jiǎn)纬煞痔崛“?，該條件下的低pH不會(huì)影響ITs的細(xì)胞毒性。
表6 孵育條件對(duì)免疫毒素MOC-31和BM7混和物殺滅PM1乳腺癌細(xì)胞與外周血前體細(xì)胞混合(比例為1∶10)物的功效的影響，外周血先祖細(xì)胞以血細(xì)胞單成分提取術(shù)分離。從血液?jiǎn)纬煞痔崛“玫降募?xì)胞被置于3試管中，每管含1×108個(gè)細(xì)胞。在兩個(gè)試管中，細(xì)胞(體積500～700μl)以含20％ACD和1％人白蛋白的PBS稀釋到終體積1ml。其中一只試管用作對(duì)照，用作IT孵育(A組)。第三只試管中的細(xì)胞經(jīng)洗滌，用含10％FCS的RPMI重懸至1ml(B組)。在處理組中，細(xì)胞與每種含量為1μg/ml的IT在37℃孵育1h，洗滌，以軟瓊脂分析法篩檢，如表1進(jìn)行計(jì)算。未處理的對(duì)照培養(yǎng)物的平皿接種效率為20％～30％。<
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在單采血液成分包中細(xì)胞總數(shù)將會(huì)非常高，可以想象到在這樣高的細(xì)胞濃度下，相對(duì)于模型研究條件下該程序的功效可能會(huì)下降。然而，在檢測(cè)此可能性的試驗(yàn)中，當(dāng)總體細(xì)胞濃度從每毫升1×107上升到5×107，而后又上升到1×108，均未觀察到功效上的差異(表6)。
ITs對(duì)正常造血先祖細(xì)胞的毒性。ITs對(duì)CFU-GM和BFU-E存活的影響在如上所述的孵育條件下進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)(表7)有核PBPCs與IT混合物的孵育甚至達(dá)120min也不降低前體細(xì)胞的存活，不論是在經(jīng)洗滌后用含10％FCS的RPMI重懸細(xì)胞的情況下測(cè)定，還是用未洗滌的細(xì)胞重懸于含ACD的生理鹽水中。
由于在臨床情況下經(jīng)處理的細(xì)胞在回輸給病人之前要經(jīng)過冷凍和解凍，這些過程對(duì)先祖細(xì)胞的影響也經(jīng)過了研究。發(fā)現(xiàn)冷凍和解凍僅僅輕微減少CFU-GM和BFU-E的數(shù)目(表7)。值得注意的是，IT處理本身并不一定減少前體細(xì)胞的存活，而且細(xì)胞集落平均數(shù)的輕微降低也在細(xì)胞經(jīng)低pH條件處理的組中見到。資料顯示，在60min的孵育中腫瘤細(xì)胞被有效根除的ITs濃度僅對(duì)經(jīng)過了兩次這種處理的正常集落形成細(xì)胞的存活產(chǎn)生無足輕重的影響。
表7 免疫毒素MOC-31和BM7的混合物對(duì)新鮮的人PBPCs中CFU-GM和BFU-E的毒性，新鮮的人PBPCs是經(jīng)G-CSF活化后收集的。孵育條件和冷凍程序的影響。
對(duì)照和處理組同表6。有核PBPCs與每種濃度1μg/ml的ITs于37℃共孵育2h，后用“材料和方法”中所述的分析篩選出來(5×104細(xì)胞/碟)。
a．均數(shù)±SD的結(jié)果來自兩次獨(dú)立試驗(yàn)中的三次重復(fù)培養(yǎng)。
討論循環(huán)造血干細(xì)胞的自體移植由于其與BM移植相比的優(yōu)越性，最近已引起了相當(dāng)大的興趣(15,16)。于骨髓功能的快速重建之外，PBSCs的應(yīng)用還被猜測(cè)可以除去回輸污染了腫瘤細(xì)胞的移植物的風(fēng)險(xiǎn)。然而，也已顯示腫瘤細(xì)胞污染的問題是減少了但并未消滅(4)。還應(yīng)指出的是高劑量的化療包括應(yīng)用集落刺激因子可能會(huì)使外周血細(xì)胞中的腫瘤細(xì)胞復(fù)原(7,8)。因此，一種凈化單采血液成分術(shù)產(chǎn)物的快捷、實(shí)用的程序是人們高度期盼的。
已有數(shù)種從BM中除去乳腺癌細(xì)胞的方法報(bào)道，包括化學(xué)-免疫分離，免疫磁珠程序，以及免疫毒素的運(yùn)用(14,17,18,19)。相比之下，僅有極少的凈化PBSC制備物的研究被提及(20,21)，但一種用核糖體失活蛋白制備的ITs(22,23)已用于殺滅增添到制備自BM的CD-34+細(xì)胞收集物中的淋巴腫瘤細(xì)胞(24)。在后一個(gè)研究中，在以CD34篩選程序獲得的3log非直接純化作用之外，還獲得了2logs的凈化功效。本研究的目標(biāo)是發(fā)展一種安全的IT程序以從PBSCs中清除乳腺癌細(xì)胞。模型試驗(yàn)中獲得的結(jié)果顯示，與兩種均為1μg/ml的結(jié)合物共孵育60min，每種結(jié)合物均包含抗腫瘤抗體和PE，將有效殺死混合到PBSCs的所有腫瘤細(xì)胞，且對(duì)正常前體細(xì)胞沒有毒性。重要的是，該方法容許ITs直接加到血液?jiǎn)纬煞痔崛⌒g(shù)的產(chǎn)物中，孵育之后細(xì)胞經(jīng)洗滌，離心，可以冷凍。特別是因?yàn)槠浜?jiǎn)單性和功效，該方法用于如下用途將是有吸引力的，即聯(lián)合應(yīng)用高劑量化療配合PBSCs的移植處理乳腺癌病人的篩選組時(shí)。我們的程序的高選擇性功效或許可以表述成下述因素第一，被MOC31抗體識(shí)別的抗原已知表達(dá)于幾乎所有經(jīng)檢測(cè)的乳腺癌標(biāo)本的大部分細(xì)胞(10)。而BM7抗體，識(shí)別MUC-1基因表達(dá)的核心蛋白，也結(jié)合于很大一部分乳腺癌細(xì)胞(25)。這兩種單抗一起，好像在相當(dāng)?shù)某潭壬细采w了在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)的抗原表達(dá)的異質(zhì)性。第二，我們以前已證實(shí)，構(gòu)建ITs時(shí)，用與所用抗體般配的一種毒素是重要的(11)。我們已發(fā)現(xiàn)PE結(jié)合物包含若干單抗，包括此處應(yīng)用的那些，是非常有效的(14)。而且，伴PE的ITs通常比等分子濃度的游離PE毒性更強(qiáng)(11,18)，表明了這些ITs的特異性。
凈化過程必須是有效和安全的，該方法也必須是實(shí)用的，可應(yīng)用于臨床水平。ITs可直接加至單采血液成分包中，在此優(yōu)點(diǎn)之外，我們的方法包括僅用60min孵育時(shí)間即可殺死所有的集落生成腫瘤細(xì)胞。而且，此處理對(duì)正常的造血先祖細(xì)胞沒有毒性，且在BM凈化試驗(yàn)中甚至高得多的IT濃度也可以很好地耐受(14)。我們也顯示經(jīng)ITs處理的PBSCs的冷凍和解凍不引起額外的毒性，值得一提的是IT過程不包含非特異性的細(xì)胞丟失，而在其他方法中則可能要經(jīng)歷細(xì)胞丟失，包括用免疫小珠或免疫吸附的方法除去腫瘤細(xì)胞。
我們以前計(jì)算過，洗滌之后存留在經(jīng)IT處理BM中的結(jié)合物的數(shù)量是加入的整體數(shù)量的0.75％左右(26)。在臨床情況下，對(duì)PBSCs的處理，包含大約2×1010個(gè)單核細(xì)胞，推薦濃度是2μg IT/ml(1×108細(xì)胞)，則結(jié)果可期望在經(jīng)產(chǎn)物中有至多3μg的IT。這表示比理論計(jì)算中游離毒素的最大耐受劑量要低100～150倍(26)。這樣，回輸經(jīng)凈化的PBSCs將不會(huì)出現(xiàn)任何系統(tǒng)性的毒性。
克服高劑量治療配合自體造血前體細(xì)胞移植物的不是可能更多地依靠系統(tǒng)性處理的功效而非凈化移植物的效率(1)。不過，清除可能存在于自體移植物中的腫瘤細(xì)胞是符合邏輯的，來自研究其他腫瘤類型的最近證據(jù)表明了凈化之重要性(16)。在乳腺癌中，我們建議用一種簡(jiǎn)單，安全和有效的步驟，正如此處所述的這種。實(shí)施例2由于乳腺癌細(xì)胞對(duì)免疫毒素可以顯示不同的敏感性，例如BM7和MOC31的凈化活性對(duì)來自不同病人的乳腺癌細(xì)胞可能不同，以前用PM1乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行的同樣的試驗(yàn)(例1)用另一個(gè)細(xì)胞系MA11進(jìn)行了重復(fù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與PM1細(xì)胞相比對(duì)MA11細(xì)胞而容免疫毒素處理的效果同樣好或者甚至更好(表4)。結(jié)果證實(shí)了免疫毒素凈化處理的高度特異性的活性。
在單獨(dú)的試驗(yàn)中研究了免疫毒素細(xì)胞殺滅活性的動(dòng)力學(xué)，該試驗(yàn)中PM乳腺癌細(xì)胞加入到外周血前體細(xì)胞中(比例1∶100)。孵育兩小時(shí)之后，混合的細(xì)胞懸浮液被冷凍，隨后在細(xì)胞選種之前被解凍，乳腺癌細(xì)胞和正常前體細(xì)胞的生活力通過平行試驗(yàn)估算出來。發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞很快發(fā)生中毒，且在大約72小時(shí)之內(nèi)所有腫瘤細(xì)胞都死了。通過對(duì)比，在免疫毒素處理和未處理細(xì)胞培養(yǎng)中，未發(fā)現(xiàn)在同樣的時(shí)間長(zhǎng)度內(nèi)正常血液前體的生活力出現(xiàn)差異。實(shí)施例3-4
擴(kuò)散到骨或骨髓，到胸膜腔和腹腔，到大腦和脊髓組織，到尿生殖道的癌細(xì)胞，可以被免疫毒素選擇性地殺死，方法是將免疫毒素注入腫瘤、注入上述體液，或者有系統(tǒng)地，例如導(dǎo)向諸如血液，骨及骨髓等組織的轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞。實(shí)施例3MA-11人乳腺癌細(xì)胞被注射進(jìn)免疫缺陷大鼠的左心室。未治療的對(duì)照動(dòng)物發(fā)展了骨髓壓迫癥狀，在細(xì)胞注射后34～37天必須被殺死。經(jīng)靜脈注射單一劑量的MOC31-PE(20μg/鼠)治療的動(dòng)物出現(xiàn)了延長(zhǎng)的無癥狀存活，其中一些動(dòng)物存活超過50天。
同一個(gè)模型的另一個(gè)試驗(yàn)證實(shí)了此結(jié)果，在此例中一些動(dòng)物在整個(gè)觀察時(shí)間的110天中均存活。在這些試驗(yàn)中，一組大鼠經(jīng)由結(jié)合于PE的針對(duì)EGF-受體的425.3抗體組成的免疫毒素治療。此組中所有動(dòng)物均存活。
此模型的第三個(gè)試驗(yàn)中，對(duì)照大鼠顯示索壓迫癥狀，必須在細(xì)胞注射之后的40～60天被殺死。此試驗(yàn)中包括三個(gè)治療組，其一用20μg425.3-PE；一組接受兩種免疫毒，每種均用10mg。兩種免疫毒素單獨(dú)應(yīng)用都得到無疾病存活期的有效的延長(zhǎng)，MOC31-PE和425.3-PE分別使存活時(shí)間延長(zhǎng)6％和8％。在組合使用試驗(yàn)中，所有動(dòng)物無疾病存活。
此模型的第四個(gè)試驗(yàn)中，MOC31-PE的效果將與順鉑及阿霉素相對(duì)比。此試驗(yàn)中所有MOC31-PE治療的動(dòng)物存活超過70天，而阿霉素僅顯示邊緣效果，而順鉑處理大鼠不比生理鹽水處理的對(duì)照動(dòng)物活得長(zhǎng)。這些資料令人信服地證明，所用的免疫毒素在殺死乳腺癌轉(zhuǎn)移方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于臨床最常應(yīng)用的兩種藥物，阿霉素和順鉑。實(shí)施例4人乳腺癌細(xì)胞系MT-1被用于兩種不同的試驗(yàn)中。在第一個(gè)試驗(yàn)中，細(xì)胞被注入左心室，由于骨髓壓迫癥狀，對(duì)照動(dòng)物在平均19天時(shí)間以后就必須殺死。細(xì)胞注射一天以后靜脈給予425.3-PE處理的動(dòng)物全部存活。在另一個(gè)試驗(yàn)中，MT-1腫瘤細(xì)胞被直接注射進(jìn)鼠脛骨之骨髓腔。所有未治療的動(dòng)物由于脛骨瘤的生長(zhǎng)都必須在20天之后獻(xiàn)出生命，然而在細(xì)胞注射一天之后靜脈給予20mg 425.3-PE治療的大鼠所有均存活100天以上。
此外，在MT-1腫瘤細(xì)胞直接注射進(jìn)大鼠脛骨骨髓腔的模型中，于第1天或第7天給予BM7-PE，其效果與425.3-PE的作了對(duì)比，后者所用動(dòng)物組的處理時(shí)間與BM7-PE在同一天。而且，在第7天和第14天靜脈給予阿霉素(鹽酸阿霉素)的效果也進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)兩種免疫毒素均治愈了80％的鼠，不論其給藥是在第1天或第7天。當(dāng)每種免疫毒素以一半濃度聯(lián)合使用時(shí)所有動(dòng)物均活存。對(duì)比之下，阿霉素的效率明顯要低，90天之后僅剩下35％的動(dòng)物活存。而對(duì)照動(dòng)物在注射細(xì)胞20天之后就不得不獻(xiàn)身，同前邊的試驗(yàn)一樣。該資料證實(shí)了如前所示的425.3-PE的效果，重要的是，BM7-PE被發(fā)現(xiàn)與425.3-PE同樣有效。兩種試劑在功效方面明顯超過阿霉素，后者是治療乳腺癌最常用的臨床藥物之一。而且，這兩種免疫毒素的聯(lián)合使用治愈了所有患病的動(dòng)物。
實(shí)施例5在兩套試驗(yàn)中檢測(cè)了重組生產(chǎn)的針對(duì)erbB2-基因產(chǎn)物的與重組生成的PE的變異體相連的免疫毒素的功效。在例4所述的模型中，重組免疫毒素的最高濃度有效地延長(zhǎng)了動(dòng)物的生存期限，35％的鼠活存。在一個(gè)模型中MT-1乳腺癌細(xì)胞被靜脈注入免疫缺陷大鼠，重組免疫毒素的治療也經(jīng)靜脈給予(于第1,2和3天)，結(jié)果導(dǎo)致動(dòng)物生存期限的有效延長(zhǎng)。此效應(yīng)是劑量依賴性的，該免疫毒素的兩種不同劑量使動(dòng)物的生存期限增加，從10,6天(生理鹽水處理的對(duì)照)到23,4天以及32,8天。在最高劑量，20％的鼠存活。由于即便是最高的免疫毒素劑量也未觀察到毒性，故指望最適宜劑量的效應(yīng)甚至?xí)谩?br> 參考文獻(xiàn)1. Peters,W.P.,Ross,M.,Vredenburgh,J.J.,Meisenberg,B.,Marks,L.B.,Winer,E.,Kurtzberg,J.,Bast,R.C.J.,Jones,R.,Shpall,E.,Wu,K.,Rosner,G.,Gilbert,C.,Mathias,B.,Coniglio,D.,Petros,W.,Henderson,I.C.,Norton,L.,Weiss,R.B.,Budman,D.,and Hurd,D.對(duì)高危險(xiǎn)性早期乳腺癌的高劑量化療和自體骨髓用于標(biāo)準(zhǔn)劑量佐藥治療之后起鞏固作用。臨床腫瘤學(xué)雜志，11:1132-1143,1993。
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權(quán)利要求
1．殺滅一個(gè)細(xì)胞群體中不想要的靶細(xì)胞的方法，其中該細(xì)胞群體包括從外周血收集的有核細(xì)胞，或從上述有核細(xì)胞中篩選的CD-34+細(xì)胞，或從骨髓抽吸物收獲的CD-34+細(xì)胞，或來自骨髓或包含多功能干細(xì)胞的血液的其他未成熟/早期先祖細(xì)胞，或由正?；|(zhì)細(xì)胞支持的惡變細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞群體被暴露于一或多種免疫毒素，其中的每一種免疫毒素是由抗體和細(xì)胞毒素偶聯(lián)物，抗體片段和毒素，或重組生產(chǎn)的抗體，毒素，免疫毒素或其片段組成的。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，該細(xì)胞群體暴露于兩種或多種免疫毒素。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，該細(xì)胞群體暴露于一種免疫毒素，例如MOC31-PE或BM7-PE。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，該細(xì)胞群體是從外周血中收獲。
5．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，其干細(xì)胞/早期先祖細(xì)胞是從骨髓中收獲的。
6．根據(jù)權(quán)利要求1-2的方法，其特征在于，其細(xì)胞群體是與2-3種物質(zhì)混和物共孵育，優(yōu)選地是2種指向靶細(xì)胞相關(guān)抗原的特異性抗體或其片段，每種抗體偶聯(lián)于相同或不同的細(xì)胞毒素。
7．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于，應(yīng)用了針對(duì)上皮細(xì)胞抗原的抗體。
8．根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于，應(yīng)用了針對(duì)主要表達(dá)于上皮細(xì)胞的表位的抗體。
9．根據(jù)上述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，在所用的抗體中至少有一種是針對(duì)基因GA733-2表達(dá)的抗原EGP2上的表位，而且至少有一種是針對(duì)基因MUC1,MUC2或MUC3，或其組表達(dá)的抗原上的表位。
10．根據(jù)上述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，所用的抗體是MOC31和一個(gè)針對(duì)由基因MUC1,MUC2,MUC3或其組合編碼的抗原的抗體。
11．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于，所用的抗體是MOC31和BM7，或其片段。
12．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于，所用的抗體是MOC31和BM2或12H12，或其片段。
13．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于，所用的抗體是MOC31和595A6，或其片段。
14．根據(jù)上述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，免疫毒素所用的毒素部分是天然的或重組假單胞菌外毒素A，或其片段。
15．根據(jù)上述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，所用的毒素是天然的或重組的相思豆毒素，蓖麻蛋白，gelonin，黑桿菌素或美洲商陸抗病素蛋白，皂草素，ebulin或其片段。
16．根據(jù)上述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，該細(xì)胞群體是從外周血收獲的有核細(xì)胞，靶細(xì)胞是上皮起源的惡變細(xì)胞。
17．根據(jù)上述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，該細(xì)胞群體包含作為一個(gè)基本部分的CD-34+細(xì)胞，或用其他表面標(biāo)記例如P-糖蛋白篩選的類似的早期先祖細(xì)胞。
18．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其特征在于，其靶細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，例如乳腺癌細(xì)胞，直腸癌細(xì)胞，前列腺癌細(xì)胞，卵巢癌細(xì)胞，胰腺癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞。
19．根據(jù)權(quán)利要求2,3的方法，其特征在于，該細(xì)胞群體是在體內(nèi)暴露于特異性免疫毒素。
20．根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其特征在于，免疫毒素直接注入腫瘤或胸腔和腹腔。
21．根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其特征在于，免疫毒素是全身給藥，尤其是在惡變細(xì)胞擴(kuò)散到的如骨和骨髓這樣的組織。
22．根據(jù)權(quán)利要求1中的方法殺死細(xì)胞的免疫毒素，其特征在于，它包含一或多種針對(duì)呈現(xiàn)于惡變細(xì)胞表面的抗原的免疫毒素。
23．根據(jù)權(quán)利要求22的免疫毒素，其特征在于，抗體選自MOC31和BM7,595,BM2,12H12或它們的組合，毒素是假單胞菌外毒素A。
24．應(yīng)用根據(jù)權(quán)利要求22的混和物生產(chǎn)癌癥治療劑。
25．執(zhí)行根據(jù)權(quán)利要求1的方法的試劑盒，其特征在于，它包括藥學(xué)上可接受的制劑中的一或多種免疫毒素制品。
全文摘要
描述了一種方法,從一個(gè)細(xì)胞群體中殺死不想要的靶細(xì)胞,該群體包括:從外周血中獲取的有核細(xì)胞,或CD－3文檔編號(hào)A61K39/00GK1218411SQ97194599
公開日1999年6月2日 申請(qǐng)日期1997年3月12日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月13日
發(fā)明者奧伊斯坦·福德斯塔德, G·克瓦爾黑姆, S·朱爾, 王孟瑜, O·恩格布雷藤 申請(qǐng)人:奧伊斯坦·福德斯塔德