嵌合抗原受體及其基因和重組表達(dá)載體、car20-nkt細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種嵌合抗原受體及其基因和重組表達(dá)載體、CAR20-NKT細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用，所述嵌合抗原受體為CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括串聯(lián)的大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽、CD20ScFv、CD8的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域。采用本發(fā)明的CAR20-NKT細(xì)胞治療進(jìn)展期CD20陽(yáng)性B細(xì)胞淋巴瘤時(shí)，能夠有效避免采用現(xiàn)有靶向CD20的藥物時(shí)引起的耐藥性，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有一定的特異殺傷活性，且對(duì)已經(jīng)過(guò)多次治療(如放療、化療及其他藥物對(duì)癥治療等)但均無(wú)明顯療效的進(jìn)展期CD20陽(yáng)性B細(xì)胞淋巴瘤患者有一定的治療效果。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
嵌合抗原受體及其基因和重組表達(dá)載體、CAR20-NKT細(xì)胞 及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤生物制品領(lǐng)域，具體地，設(shè)及過(guò)繼免疫治療中的一種嵌合抗原受 體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C及其基因和重組表達(dá)載體、工程化CD20祀向性的NKT細(xì)胞 (CAR20-NKT細(xì)胞）及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然殺傷細(xì)胞（MT)是一種特殊類(lèi)型的T淋己細(xì)胞亞群，具有T細(xì)胞和NK細(xì)胞細(xì) 胞兩重性質(zhì)。NKT細(xì)胞能表達(dá)T細(xì)胞的TCR與NK細(xì)胞的NKR-Pl兩種受體，在TCR和NKR介 導(dǎo)下，NKT細(xì)胞能夠產(chǎn)生大量的比-4及INF 丫，對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞殺傷作用。NKT細(xì)胞通 過(guò)自身表面的CD16與特異性抗體的Fc段結(jié)合，發(fā)揮抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用 (ADCC，antibody-dependent cell-mediated 巧totoxicity)。但在抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的 殺傷作用過(guò)程中，由于抗體能與祀細(xì)胞上的相應(yīng)抗原表位特異性結(jié)合，NKT細(xì)胞可殺傷任何 已與抗體結(jié)合的祀細(xì)胞，因此抗體與祀細(xì)胞上的抗原結(jié)合是特異性的，但NKT細(xì)胞對(duì)祀細(xì) 胞的殺傷作用是非特異性的。另外，通常情況下，輸注的NKT細(xì)胞在患者體內(nèi)半衰期為2周 左右，有效期短暫，需要反復(fù)多次輸注。而且，NKT細(xì)胞本身缺少特異性抗體，不足W在腫瘤 周?chē)蛘吡龀仓懈患?，制約了 NKT細(xì)胞對(duì)惡性腫瘤的祀向治療。再者，研究表明，NKT細(xì)胞 并不是對(duì)所有的腫瘤都有殺傷效果，且對(duì)部分腫瘤的殺傷作用比較弱，特異殺傷活性有待 提局。
[0003] CD20分子是一種B細(xì)胞分化抗原，僅表達(dá)于前B細(xì)胞和成熟B細(xì)胞表面，表達(dá)于 95% W上的B細(xì)胞性淋己瘤，而在造血干細(xì)胞、漿細(xì)胞和其他正常組織細(xì)胞中不表達(dá)。重要 的是，CD20分子在膜上比較暴露，容易接近，與單克隆抗體結(jié)合后無(wú)顯著內(nèi)化及脫落，也不 會(huì)因?yàn)榕c抗體的結(jié)合而發(fā)生抗原調(diào)變，故成為治療B細(xì)胞淋己瘤的理想祀點(diǎn)。
[0004] 目前，在治療進(jìn)展期CD20陽(yáng)性B細(xì)胞淋己瘤患者時(shí)，抗CD20的藥物治療已經(jīng)處于 臨床研究階段，但是，臨床結(jié)果表明，僅部分進(jìn)展期CD20陽(yáng)性B細(xì)胞淋己瘤患者采用抗CD20 的藥物（如CD20單克隆抗體）治療有效，并且患者最終會(huì)產(chǎn)生一定的耐藥性，從而影響藥 物的療效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中NKT細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷作用比較弱、特異殺 傷活性有待提高W及采用抗CD20的藥物治療進(jìn)展期CD20陽(yáng)性B細(xì)胞淋己瘤患者時(shí)引起的 耐藥性的缺陷，提供一種嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C及其基因和重組表達(dá) 載體、工程化CD20祀向性的NKT細(xì)胞（CAR20-NKT細(xì)胞）及其制備方法和應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的發(fā)明人在研究中意外發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明的嵌合抗原受體 CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細(xì)胞治療進(jìn)展期CD20陽(yáng)性B細(xì)胞淋己瘤時(shí)，對(duì)淋己 瘤細(xì)胞具有很好的特異殺傷活性，且對(duì)已經(jīng)過(guò)多次治療（如CD20單克隆抗體、放療、化療及 其他藥物對(duì)癥治療等）但均無(wú)明顯療效的進(jìn)展期CD20陽(yáng)性B細(xì)胞淋己瘤患者有一定的治 療效果。
[0007] 因此，為了實(shí)現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種嵌合抗原受體，所述嵌合 抗原受體為〔0205〇。￥-〔08-〔0137-〔03(，包括串聯(lián)的大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)膚、〔0205〇。￥、〔08 的較鏈區(qū)化inge區(qū)）和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3 C的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域。
[0008] 第二方面，本發(fā)明提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。
[0009] 第=方面，本發(fā)明提供了含有上述基因的重組表達(dá)載體。
[0010] 第四方面，本發(fā)明提供了一種工程化CD20祀向性的NKT細(xì)胞，所述NKT細(xì)胞是上 述嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細(xì)胞。
[0011] 第五方面，本發(fā)明提供了一種工程化CD20祀向性的NKT細(xì)胞的制備方法，所述方 法包括：包裝攜帶pWP化-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C的慢病毒，得到病毒濃縮液；利用得 到的病毒濃縮液感染NKT細(xì)胞，使NKT細(xì)胞表達(dá)嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C。
[0012] 第六方面，本發(fā)明提供了上述方法制備得到的工程化CD20祀向性的NKT細(xì)胞。 [001引第屯方面，本發(fā)明提供了上述工程化CD20祀向性的NKT細(xì)胞在制備用于治療腫瘤 的制劑中的應(yīng)用。
[0014] 在治療進(jìn)展期CD20陽(yáng)性B細(xì)胞淋己瘤患者時(shí)，本發(fā)明的嵌合抗原受體 CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細(xì)胞，即工程化CD20祀向性的NKT細(xì)胞能夠特異性 結(jié)合CD20抗原，明顯的延長(zhǎng)免疫細(xì)胞在患者體內(nèi)的存活時(shí)間，增強(qiáng)免疫細(xì)胞祀向識(shí)別癌細(xì) 胞表面CD20抗原的能力，加強(qiáng)對(duì)CD20陽(yáng)性祀細(xì)胞的特異殺傷活性，而且確實(shí)能夠有效避免 采用現(xiàn)有抗CD20的藥物治療時(shí)引起的耐藥性，對(duì)已經(jīng)過(guò)多次治療（如放療、化療及其他藥 物對(duì)癥治療等）但均無(wú)明顯療效的進(jìn)展期CD20陽(yáng)性B細(xì)胞淋己瘤患者有一定的治療效果。 本發(fā)明的工程化CD20祀向性的NKT細(xì)胞為治療CD20陽(yáng)性的腫瘤提供了一種新的選擇，具 有良好的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景。
[0015] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予W詳細(xì)說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為流式細(xì)胞術(shù)對(duì)分離培養(yǎng)的NKT細(xì)胞表型分析的結(jié)果。
[0017] 圖2為本發(fā)明的慢病毒表達(dá)載體pWP化-CD8-CD137-CD3 C的限制性內(nèi)切酶MluI/ NdeI雙酶切片段的電泳鑒定圖。
[0018] 圖3為本發(fā)明的慢病毒表達(dá)載體pWP)(L-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C的限制性內(nèi) 切酶BamHI/Ndel雙酶切片段的電泳鑒定圖。
[0019] 圖4為本發(fā)明的慢病毒表達(dá)載體pWP)(L-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C的結(jié)構(gòu)示意 圖，其中，逆時(shí)針序列為正向基因片度，順時(shí)針為反向基因片段。
[0020] 圖5為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)含有嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C的病毒濃 縮液對(duì)NKT細(xì)胞的感染效率。
[0021] 圖6為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細(xì) 胞（CAR20-NKT細(xì)胞）表型鑒定的結(jié)果。
[0022] 圖7為本發(fā)明的CAR20-NKT細(xì)胞對(duì)CD20陽(yáng)性的B細(xì)胞淋己瘤細(xì)胞的殺傷作用的 細(xì)胞毒性分析圖。
[0023] 圖8為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CAR20-NKT細(xì)胞回輸至9例進(jìn)展期CD20陽(yáng)性的B細(xì)胞淋 己瘤患者中，CAR20-NKT細(xì)胞在患者外周血中的持續(xù)存在時(shí)間曲線圖。
[0024] 圖9為本發(fā)明的CAR20-NKT細(xì)胞對(duì)進(jìn)展期CD20陽(yáng)性的B細(xì)胞淋己瘤患者治療前 與治療后3個(gè)月陽(yáng)T-CT的對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] W下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實(shí)施方式僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0026] 本發(fā)明提供了 一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體為 CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C，包括串聯(lián)的大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)膚、CD20單鏈抗體CD20ScFv、 CD8的較鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3 C的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域。
[0027] 優(yōu)選情況下，嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C由大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)膚、 CD20ScFv、CD8的較鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3 C的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域串 聯(lián)構(gòu)成。進(jìn)一步優(yōu)選地，嵌合抗原受體具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列，更進(jìn)一步優(yōu) 選地，嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0028] 本發(fā)明提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。優(yōu)選情況下，所述基因具有如SEQ ID NO. 2所示的核巧酸序列，進(jìn)一步優(yōu)選地，編碼上述嵌合抗原受體的基因的核巧酸序列如 沈QID NO. 2所示。
[0029] 本發(fā)明提供了含有上述基因的重組表達(dá)載體。優(yōu)選情況下，重組表達(dá)載體為慢病 毒表達(dá)載體。對(duì)于慢病毒表達(dá)載體沒(méi)有特別的限定，只要能夠與輔助載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞 如293T包裝細(xì)胞，獲得病毒濃縮液及嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3C修飾的 NKT細(xì)胞即可，優(yōu)選情況下，慢病毒表達(dá)載體為pWP化-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C。
[0030] 對(duì)于慢病毒表達(dá)載體pWP化-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C的制備方法沒(méi)有特 別的限定，可W為本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的各種方法，優(yōu)選情況下，慢病毒表達(dá)載體 pWP)(L-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3C 的制備方法包括 W下步驟：
[003。 （1)從NKT細(xì)胞CDNA中分別擴(kuò)增CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞 內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3 C的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，并克隆至載體pWP化-GFP中，構(gòu)建得到 pWP化-CD8-CD137-CD3C ;
[0032] 似合成編碼大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)膚和CD20ScFv的核巧酸序列， 并克隆至pWP化-CD8-CD137-CD3C中，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后得到序列正確的 pWP化-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C。
[0033] 步驟（1)中，對(duì)于從NKT細(xì)胞CDNA中分別擴(kuò)增CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的 胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3 C的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域的方法沒(méi)有特別的限定，可W為本領(lǐng)域常用的 各種方法，例如可W為RT-PCR法。其中，NKT細(xì)胞可W通過(guò)分離人靜脈血中的單個(gè)核細(xì)胞， 然后進(jìn)行培養(yǎng)獲得。
[0034] 具體地，得到pWP化-CD8-CD137-CD3 C的方法可W包括：提取NKT細(xì)胞的總RNA， 逆轉(zhuǎn)錄獲得NKT細(xì)胞cDNA，W得到的NKT細(xì)胞CDNA為模板，利用引物Pl (SEQID NO. 11)和 P2(SEQID NO. 12)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得CD8基因的hinge區(qū)和跨膜區(qū)（SEQID NO. 3);利用引 物P3(SEQID NO. 13)和P4(SEQID NO. 14)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得CD137基因的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域 (SEQID NO. 4);利用引物 P5(SEQID NO. 15)和 P6(SEQID NO. 16)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增獲得 CD3 C 基 因的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域（SEQID NO. 5)，將獲得的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行雙酶切，然后與Mlul/Ndel 雙酶切后的慢病毒表達(dá)載體pWP化-GFP連接。
[0035] 步驟（2)中，對(duì)于合成編碼大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)膚和CD20ScFv的核巧酸序列的方法 沒(méi)有特別的限定，可W為本領(lǐng)域常用的各種方法，例如可W通過(guò)全基因合成技術(shù)合成。
[0036] 具體地，得到序列正確的pWP)(L-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C的方法可 W包括：通過(guò)全基因合成技術(shù)合成編碼大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)膚和CD20ScFv融合基 因的核巧酸序列（SEQID NO. 8)，克隆至載體pGSI中，得到pGSI-CD20ScFv ;然后 將pGSI-CD20ScFv進(jìn)行BamHI/MluI雙酶切，與用BamHI/MluI雙酶切后的步驟 (1)得到的重組質(zhì)粒pWP化-CD8-CD137-CD3 C連接，經(jīng)測(cè)序鑒定，得到序列正確的 pWP化-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C。其中，大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)膚的核巧酸序列如沈QID NO. 6所示，CD20ScFv核巧酸序列如沈QID NO. 7所示。
[0037] 本發(fā)明還提供了一種工程化CD20祀向性的NKT細(xì)胞，所述NKT細(xì)胞是由上述嵌合 抗原受體 CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C 修飾的 NKT 細(xì)胞（即 CAR20-NKT 細(xì)胞）。
[0038] 本發(fā)明還提供了一種工程化CD20祀向性的NKT細(xì)胞的制備方法，該方法包括：包 裝攜帶pWP化-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C的慢病毒，得到病毒濃縮液；利用得到的病毒濃 縮液感染NKT細(xì)胞，使NKT細(xì)胞表達(dá)嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C。
[0039] 對(duì)于包裝攜帶pWP)(L-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C的慢病毒的方法沒(méi)有特 別的限定，可W為本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的各種方法，優(yōu)選情況下，將慢病毒表達(dá)載體 pWP化-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C 與輔助質(zhì)粒（如 PSPAX2、pMD2. G)共轉(zhuǎn)染 293T 包裝細(xì) 胞，轉(zhuǎn)染48-7化時(shí)收集病毒上清，離屯、、過(guò)濾，在濾液中添加5 XPEGeooo-NaCl進(jìn)行混勻，離 屯、后棄上清，沉淀用0-4°C預(yù)冷的無(wú)菌PBS溶解，獲得病毒濃縮液。
[0040] 本發(fā)明的方法中，還包括通過(guò)如下方法制備N(xiāo)KT細(xì)胞：
[0041] (1)在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行第一階 段培養(yǎng)；
[0042] (2)在白介素-2存在下，將所述第一階段培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行第二階段培養(yǎng)。
[0043] 優(yōu)選情況下，所述第一階段培養(yǎng)的實(shí)施方式包括：將單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)于第一 NKT 細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng)液含有NKT細(xì)胞培養(yǎng)基、CD3單克隆抗體、白介 素-2和白介素-15 ;進(jìn)一步優(yōu)選地，第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述CD3單克隆抗體的濃度為 30-70ng/mU和/或所述白介素-2的濃度為300-700U/mU和/或所述白介素-15的濃度為 3〇-70ng/mL。
[0044] 優(yōu)選情況下，所述第二階段培養(yǎng)的實(shí)施方式包括：將所述第一階段培養(yǎng)的細(xì)胞培 養(yǎng)于第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中含有NKT細(xì)胞培養(yǎng)基和白介素-2 ; 進(jìn)一步優(yōu)選地，第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL。
[0045] 對(duì)于MT細(xì)胞培養(yǎng)基沒(méi)有特別的限定，可W為本領(lǐng)域常用的各種用于培養(yǎng)MT細(xì) 胞的培養(yǎng)基，例如可W為GT-T551培養(yǎng)基。
[0046] 在制備N(xiāo)KT細(xì)胞時(shí)，對(duì)于第一階段培養(yǎng)和第二階段培養(yǎng)的條件沒(méi)有特別的限定， 可W為本領(lǐng)域常用的各種條件，例如可W在30-37°C、飽和濕度為3-6%的C〇2培養(yǎng)箱中進(jìn) 行培養(yǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可W對(duì)培養(yǎng)的時(shí)間進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)整，此為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知， 在此不再寶述。
[0047] 本發(fā)明制備得到的NKT細(xì)胞中，CD3+細(xì)胞平均比率〉90%，CD3 +CD8+細(xì)胞占總CD3 + 細(xì)胞的平均比率〉7〇%仰3+〔056+細(xì)胞占總〔03+細(xì)胞的平均比率〉15%。
[004引對(duì)于感染NKT細(xì)胞的方法沒(méi)有特別限定，可W為本領(lǐng)域常用的各種方法，優(yōu)選情 況下，該方法包括：
[0049] (1)在病毒濃縮液、魚(yú)精蛋白和白介素-2存在下，將NKT細(xì)胞進(jìn)行第一階段感染培 養(yǎng)；
[0050] (2)在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將所述第一階段感染培養(yǎng) 的細(xì)胞進(jìn)行第二階段感染培養(yǎng)。
[0051] 優(yōu)選地，所述第一階段感染培養(yǎng)的實(shí)施方式包括：將NKT細(xì)胞培養(yǎng)于第S NKT細(xì) 胞培養(yǎng)液中，所述第S NKT細(xì)胞培養(yǎng)液含有NKT細(xì)胞培養(yǎng)基、病毒濃縮液、魚(yú)精蛋白和白介 素-2 ;進(jìn)一步優(yōu)選地，第S NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL。
[0052] 優(yōu)選地，所述第二階段感染培養(yǎng)的實(shí)施方式包括：將所述第一階段感染培養(yǎng)的細(xì) 胞培養(yǎng)于所述第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中。第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng)液的具體組成可參見(jiàn)前述相應(yīng)內(nèi) 容，在此不再寶述。
[0053] 在感染NKT細(xì)胞時(shí)，對(duì)于第一階段感染培養(yǎng)和第二階段感染培養(yǎng)的條件沒(méi)有特別 的限定，可W為本領(lǐng)域常用的各種條件，例如可W在30-37°C、飽和濕度為3-6%的C〇2培養(yǎng) 箱中進(jìn)行培養(yǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可W對(duì)培養(yǎng)的時(shí)間進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)整，此為本領(lǐng)域技術(shù)人員 所公知，在此不再寶述。
[0054] 具體地，感染NKT細(xì)胞的方法包括：取IX IO7-SX IO7個(gè)NKT細(xì)胞，棄掉舊的培養(yǎng) 液，加入2-4血新鮮GT-l'SSl培養(yǎng)液，再加入200-400 y L病毒濃縮液、2-4 y L 1 X 10 Smg/ 血魚(yú)精蛋白和終濃度為300-70011/血的比-2，置于30-37°(：、飽和濕度為3-6%的〇)2培養(yǎng) 箱中感染12-1化后，棄培養(yǎng)液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)至未包被的培養(yǎng)瓶中，加入20-50mL的GT-T551培 養(yǎng)基，再加入終濃度為300-700U/mL的IL-2、終濃度為30-7化g/ml的CD3單克隆抗體和終 濃度為30-7化g/mL的白細(xì)胞介素15,于30-37°C、飽和濕度為3-6%的C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12-1她，獲得嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細(xì)胞。
[00巧]進(jìn)一步優(yōu)選地，感染NKT細(xì)胞的方法還包括：
[0056] (3)先在白介素-2存在下，將所述第二階段感染培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)，待細(xì) 胞的密度為80-90%時(shí)，再在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將細(xì)胞進(jìn)行 擴(kuò)增培養(yǎng)。
[0057] 優(yōu)選情況下，所述體外誘導(dǎo)的實(shí)施方式包括：將所述第二階段感染培養(yǎng)的細(xì)胞培 養(yǎng)于所述第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述擴(kuò)增培養(yǎng)的實(shí)施方式包括：將細(xì)胞培養(yǎng)于所述第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中。第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng)液和第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液的具體組成可參見(jiàn)前述相 應(yīng)內(nèi)容，在此不再寶述。
[0058] 具體地，感染NKT細(xì)胞的方法還包括：將第二階段感染培養(yǎng)后獲得的慢病毒感染 的NKT細(xì)胞用IL-2的終濃度為300-700U/mL的GT-T551培養(yǎng)液進(jìn)行體外誘導(dǎo)，待細(xì)胞的密 度為80-90%時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)袋中，隔1.5-2.5天加入比-2的終濃度為300-70011/ mL、CD3單克隆抗體的終濃度為30-7化g/ml、白細(xì)胞介素-15的終濃度為30-7化g/mL的 新鮮GT-T551培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)并將細(xì)胞擴(kuò)增至總量為1 X 109-2X IO9個(gè)細(xì)胞。經(jīng)過(guò) 本發(fā)明的慢病毒對(duì)祀向CD20抗原的嵌合抗原受體進(jìn)行MT細(xì)胞感染，其感染效率高達(dá) 30 % -60 %，而獲得的CAR20-NKT細(xì)胞，其CD3+CD56+細(xì)胞占總CD3 +細(xì)胞的比率在15 % -40 % 范圍之內(nèi)。
[0059] 嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細(xì)胞表達(dá)的嵌合抗原受體 的蛋白氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。其中，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，嵌合抗原受 體前體蛋白由大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)膚、CD20ScFv、CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信 號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3 C的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成，蛋白質(zhì)翻譯后在細(xì)胞內(nèi)粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)切除 信號(hào)膚后成為成熟嵌合抗原受體蛋白，分泌輸出后并定位于NKT細(xì)胞的細(xì)胞膜上。該嵌合 抗原受體的蛋白氨基酸序列對(duì)應(yīng)的基因編碼序列如SEQID NO. 2所示。該嵌合抗原受體W 基因CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及CD137和CD3 C的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成的結(jié)構(gòu)為信號(hào) 傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列如SEQID NO. 9所示，對(duì)應(yīng)的基因編碼序列如SEQID NO. 10所示。
[0060] 本發(fā)明還提供了上述方法制備得到的工程化CD20祀向性的NKT細(xì)胞。
[0061] 本發(fā)明還提供了工程化CD20祀向性的NKT細(xì)胞在制備用于治療腫瘤的制劑中的 應(yīng)用。優(yōu)選情況下，腫瘤是CD20陽(yáng)性的惡性腫瘤，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述腫瘤為進(jìn)展期CD20 陽(yáng)性的B細(xì)胞淋己瘤。
[0062] 本發(fā)明的應(yīng)用中，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，進(jìn)展期CD20陽(yáng)性的B細(xì)胞淋己 瘤是指淋己瘤病灶進(jìn)行性增大的B細(xì)胞淋己瘤，癥狀表現(xiàn)為：全身淋己結(jié)及結(jié)外病灶受累 等，優(yōu)選為非霍奇金淋己瘤。
[0063] 本發(fā)明的應(yīng)用中，對(duì)于用于治療CD20陽(yáng)性的腫瘤的制劑的組成沒(méi)有特別的限 定，只要含有本發(fā)明所述CAR20-NKT細(xì)胞或是由CAR20-NKT細(xì)胞制備而成即可，制劑的具體 組成和制備方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，在此不再寶述。
[0064] 實(shí)施例
[0065] W下的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不因此限制本發(fā)明。
[0066] W下實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所 用的實(shí)驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到，其中：
[0067] NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551購(gòu)自TaKaRa公司。
[0068] 淋己細(xì)胞分離液購(gòu)自T抓公司。
[0069] CD3單克隆抗體、重組纖維連接蛋白（retronectin)均購(gòu)自TaKaRa公司。
[0070] 重組人蛋白干擾素-丫、重組人白介素2、重組人白介素15均購(gòu)自protech公司。
[007U 總RNA提取試劑盒RNAiso Reagent、高保真DNA聚合酶（PHmeSTA民K HS DNA Polymerase)、T4DNA 連接酶購(gòu)自 TaKaRa 公司。
[0072] Reve;rtAid?First Strand cDNA Synthesis Kit 購(gòu)自 F'ermentas 公司。
[0073] Bgl II、EcoRI、MluI、BamHI、NdeI、EcoR V購(gòu)自 Fermentas 公司。
[0074] 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自天 根生化科技有限公司。
[00巧]pWP化-GFP、PSPAX2、pMD2. G 均購(gòu)自 Addgene 公司。
[0076] pGSI購(gòu)自北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。
[0077] Transl-Tl Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公 司。
[0078] Lipofectamine?2000 Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自 Invitrogen 公司。
[0079] 293T包裝細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC。
[0080] 陽(yáng)Geooo-NaCl中陽(yáng)G6000終濃度為25. 5質(zhì)量％，化Cl終濃度為1. 2M，陽(yáng)G6000 和化Cl均購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司。
[0081] 胎牛血清購(gòu)自德國(guó)PAA公司。
[008引 CD20陽(yáng)性的B細(xì)胞淋己瘤細(xì)胞系Raji購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。
[0083] 5-簇基巧光素班巧酷亞胺醋購(gòu)自上海譜振生物科技有限公司。
[0084] 膜聯(lián)蛋白V-R陽(yáng)試劑盒購(gòu)自美國(guó)抓公司。
[0085] 所有引物均由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。
[0086] 實(shí)施例1NKT細(xì)胞的制備
[0087] (1)取人靜脈血于含肝素的真空管中。采用淋己細(xì)胞分離液，通過(guò)密度梯度離屯、方 法分離獲得單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs)。
[0088] 似PBMCs洗；次后，采用含有0. 6體積％的人自體血清的NKT細(xì)胞培養(yǎng)基 GT-巧51調(diào)整細(xì)胞終濃度為2 X IO6個(gè)細(xì)胞/mL ;將細(xì)胞接種于預(yù)先經(jīng)過(guò)終濃度為10 y g/mL 的retronectin包被的75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。然后在培養(yǎng)基里加入終濃度為500U/mL的重 組人白介素 2、50ng/ml CD3單克隆抗體和50ng/mL的重組人白介素 -15,在37°C、飽和濕度 為5 %的C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0089] (3)培養(yǎng)第4天，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至未包被的培養(yǎng)瓶中，每2天按照細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)量加入 NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551，控制細(xì)胞濃度為1 X IO8個(gè)細(xì)胞/mU并加入終濃度為500U/ml的 重組人白介素2 ;培養(yǎng)至第12天，得到NKT細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)對(duì)NKT細(xì)胞表型進(jìn)行分析。結(jié) 果見(jiàn)圖 1，其中 CD3+:95. 04% ;CD3+CD8+:90. 99% ;CD3+CD56+:24. 12% ;CD8+CD56+:24. 63%。
[0090] 實(shí)施例2慢病毒表達(dá)載體pWP)(L-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C的構(gòu)建
[0091] (1) NKT 細(xì)胞 cDNA 的制備
[0092] 離屯、沉淀實(shí)施例1培養(yǎng)得到的NKT細(xì)胞，用總RNA提取試劑盒RNAiso Reagent提 取細(xì)胞的總RNA，-80°C保存?zhèn)溆?。提取的總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevedAid?First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄得MT細(xì)胞cDNA，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0093] (2)慢病毒質(zhì)粒pWP化-CD8-CD137-CD3 C的制備
[0094] 會(huì)成了引物!皮方Il r甘出了書(shū)Il純*完。電化拍芯成昔古祐電而白切位點(diǎn)）.
[0095]
[0096]
[0097]
[0098]
[0099]
[0100]
[0101]
[0102]
[0103]
[0104]
[0105]
[0106]
[0107] W步驟（I)中MT細(xì)胞cDNA為模板，用引物Pl和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)28化P 的CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)，核巧酸序列如SEQID NO. 3所示，兩端分別含有MluI和Bgl II 酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基；用引物P3和P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)146bp的CD137胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu) 域，核巧酸序列如SEQID NO. 4所示，兩端分別含有Bgl II和EcoRI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基；用 引物P5和P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)359bp的CD3 C的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，核巧酸序列如SEQID NO. 5所示，兩端分別含有EcoRI和NdeI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。各步PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系相 同，W擴(kuò)增CD137胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域?yàn)槔?，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件參照班6沒(méi)了冷裝? 服DNA Polymerase的說(shuō)明書(shū)，反應(yīng)體系巧OyL)如下：
[010引 雙蒸水：32. SliL
[0109] 5 X 反應(yīng) buffer : IOy L
[0110] dNTP 混合物（每種 2. 5mM) :4 y L [01川 P3 (IOmM)=Iy L
[0…]P4 (IOmM)=Iy L
[0113] NKT 細(xì)胞 cDNA (200ng/ul) : 1 y L
[0114] PnmeSTA民'1、HS DNA Polymerase :0. 5 Ji L
[0115] 將上述PCR產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn) 行DNA片段回收。得到片段后分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒 回收備用。
[0116] 慢病毒表達(dá)載體pWP化-GFP用Mlul/Ndel雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠進(jìn) 行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收大的載體片段，然后與之前回收的CD8、CD137、 CD3 C片段通過(guò)T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Transl-Tl Phage Resistant化學(xué)感受 態(tài)細(xì)胞，37°C培養(yǎng)1化后挑取單克隆，37°C，250巧m培養(yǎng)1化后用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì) 粒。提取的質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶MluI和NdeI雙酶切鑒定，鑒定電泳圖見(jiàn)圖2,其中，Ml : DNA分子量標(biāo)記D15000 ;1泳道：質(zhì)粒pWP化-CD8-CD137-CD3 C的未酶切片段；2泳道：質(zhì)粒 pWP化-CD8-CD137-CD3C的酶切片段（75化P) ;M2 :DNA分子量標(biāo)記D2000。將鑒定正確的質(zhì) 粒送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司對(duì)插入的融合基因片段進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果正確的 重組質(zhì)粒命名為pWP化-CD8-CD137-CD3C，其中，CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)的核巧酸序列如 SEQID NO. 3所示，CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域的核巧酸序列如SEQID NO. 4所示，CD3 C的胞 內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域的核巧酸序列如SEQID NO. 5所示。
[0117] (3)慢病毒質(zhì)粒 pWP)(L-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C 的制備
[0118] 全基因合成編碼大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)膚和CD20ScFv融合基因的核巧酸序列，序列 如SEQID NO. 8所示，由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，其5'端含有BamHI、kozak序 列，3'端含有MluI酶切位點(diǎn)，將前述融合基因克隆在質(zhì)粒pGSI中，命名為pGSI-CD20ScFv。 質(zhì)粒經(jīng)BamHI/MluI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收 試劑盒回收目的片段備用。
[0119] pWP)(L-CD8-CD137-CD3 C質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI/MluI酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1 % 瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收載體片段備用。然后與回收的含 有大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)膚和CD20 ScFv的DNA片段通過(guò)T4DNA連接酶進(jìn)行連接，具體方法見(jiàn) 說(shuō)明書(shū)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化化ansl-Tl Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，37°C培養(yǎng)1化后 挑取單克隆，37°C，250巧m培養(yǎng)1化后，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒經(jīng)限制 性內(nèi)切酶BamHI/Ndel雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖3所示，其中，其中，Ml :DNA分子量標(biāo)記 D15000 ;1 泳道：質(zhì)粒 pWP)(L-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C 未酶切片段（1119化P) ;2 泳道： 質(zhì)粒 pWP化-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3C 的酶切片段（1300bp) ;M2:DNA 分子量標(biāo)記 D2000。 將鑒定正確的質(zhì)粒送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司對(duì)插入的融合基因片段進(jìn)行測(cè)序。將 測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為pWP)(L-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖4 所示，其中包括大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)膚（核巧酸序列如SEQID NO. 6所示）、抗CD20單鏈抗體 (核巧酸序列如SEQID NO. 7所示）、CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和 CD3 C的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，其中，該嵌合抗原受體W基因CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及CD137 和CD3 C的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成的結(jié)構(gòu)為信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列如SEQID NO. 9所示，對(duì)應(yīng)的基因編碼序列如SEQID NO. 10所示。
[0120] 實(shí)施例3嵌合抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細(xì)胞的制備
[0121] (1)慢病毒的包裝和濃縮
[0122] 用分光光度計(jì)分別測(cè)定慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pWP)(L-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C和 輔助質(zhì)粒PSPAX2、PMD2.G的濃度，S種質(zhì)粒W 4:2:1的質(zhì)量比用Lipofectamine?2000 Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞。分別在轉(zhuǎn)染4她、7化時(shí)收集病毒 上清于50血EP管中，4°C，2000g離屯、lOmin，轉(zhuǎn)移兩次得到的上清至新EP管中，用4. 5 y m 濾器過(guò)濾病毒上清；過(guò)濾的病毒上清與5X陽(yáng)Geooo-NaCl按照4:1的體積比混勻，4°C靜置 2h，然后4°C，1000 Og離屯、20min，棄上清，沉淀用1血的4°C預(yù)冷的無(wú)菌PBS溶解，即得嵌合 抗原受體的病毒濃縮液，按每管100 y L進(jìn)行分裝，-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0123] 按照上述方法，利用慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pWP化-GFP和輔助質(zhì)粒PSPAX2、pMD2. G共轉(zhuǎn) 染293T包裝細(xì)胞，收集病毒上清，濃縮，獲得表達(dá)GFP綠色巧光蛋白的慢病毒濃縮液。
[0124] (2)慢病毒感染NKT細(xì)胞及感染后細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)
[01巧]取實(shí)施例1的在75cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的IX 10 7個(gè)NKT細(xì)胞，棄掉舊的培養(yǎng)液，加入 2血新鮮NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551、200 y L步驟（1)得到的病毒濃縮液、2 y L 1 X 10 6mg/mL 魚(yú)精蛋白，終濃度為500U/mL的重組人白介素2,置于37°C、飽和濕度為5 %的C〇2培養(yǎng)箱中 感染12小時(shí)后，棄培養(yǎng)液。同時(shí)用表達(dá)GFP綠色巧光蛋白的慢病毒濃縮液對(duì)NKT細(xì)胞進(jìn)行 同步感染（得到的NKT細(xì)胞稱(chēng)為CART-GFP細(xì)胞），用于計(jì)算該病毒的感染效率。將感染后 的細(xì)胞轉(zhuǎn)至未經(jīng)CD3和retronectin包被的75cm2培養(yǎng)瓶中，加入20血的NKT細(xì)胞培養(yǎng)基 GT-T551，再加入終濃度為500U/mL的重組人白介素2、終濃度為50ng/ml的CD3單克隆抗體 和終濃度為50ng/mL的重組人白介素15,于37°C、飽和濕度為5%的C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1她， 得到的NKT細(xì)胞稱(chēng)為CAR20-NKT細(xì)胞。用相同的方法制備CAR20-T細(xì)胞燈細(xì)胞的制備方法 參貝胥文南犬：Yajin邑 Zhan邑，et al. Autologous CIK Cell Immunotherapy in Patients with Renal Cell Carcinoma after Radical Nephrectomy. Clinical Study, 2013 中 2. 4 部分 CIK細(xì)胞的制備方法）。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)該病毒的感染效率，結(jié)果如圖5所示，CAR20-NKT 細(xì)胞的感染效率為54. 13%。
[0126] (3)體外誘導(dǎo)擴(kuò)增CAR20-NKT細(xì)胞群
[0127] 將上述培養(yǎng)后的NKT細(xì)胞用重組人白介素2的終濃度為500U/mL的NKT細(xì)胞培 養(yǎng)基GT-T551進(jìn)行體外誘導(dǎo)，待細(xì)胞的密度為85%時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)袋中，隔2天加 入重組人白介素2的終濃度為500U/mL、CD3單克隆抗體的終濃度為50ng/ml、重組人白介 素15的終濃度為50ng/mL的新鮮NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，待細(xì)胞擴(kuò)增到總 量為1. 5X109個(gè)細(xì)胞左右后，采用流式細(xì)胞儀對(duì)感染的細(xì)胞群體進(jìn)行鑒定，細(xì)胞表型一般 達(dá)到CD3陽(yáng)性細(xì)胞比例> 90% ;CD3CD8雙陽(yáng)性細(xì)胞比例〉70% ;CD3CD56雙陽(yáng)性細(xì)胞比例 〉15%，結(jié)果見(jiàn)圖 6，CD3+:96. 9%;CD3 +CD4+:39. 37%;CD3 +CD8+:72. 85%;CD3 +CD56+:16. 22%; CD8+CD56+:6. 62%。
[0128] 實(shí)施例4 CAR20-NKT細(xì)胞對(duì)CD20陽(yáng)性的B細(xì)胞淋己瘤細(xì)胞殺傷作用的細(xì)胞毒性 分析
[0129] 分別取實(shí)施例3中制備的CAR20-NKT細(xì)胞、CAR20-T細(xì)胞和實(shí)施例1中培養(yǎng)的NKT 細(xì)胞接種于96孔板，用5-簇基巧光素班巧酷亞胺醋（WS巧進(jìn)行染色，與CD20陽(yáng)性的B細(xì) 胞淋己瘤細(xì)胞Raji細(xì)胞W效祀比（殺傷細(xì)胞：祀細(xì)胞）5:1，10:1，20:1，40:1的比率進(jìn)行共 培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)24小時(shí)的共培養(yǎng)后，將細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白V-R陽(yáng)試劑盒染色，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組分別 為未加入免疫細(xì)胞殺傷處理的Raji細(xì)胞，并將細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白V-R陽(yáng)試劑盒染色。流式細(xì) 胞術(shù)對(duì)細(xì)胞調(diào)亡進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞調(diào)亡的量根據(jù)下面的公式計(jì)算：調(diào)亡率=(對(duì)照-樣品）/ 對(duì)照X100%，對(duì)照為未加免疫細(xì)胞殺傷處理的細(xì)胞存活數(shù)目；樣品為加入相對(duì)應(yīng)的效祀 比（殺傷細(xì)胞：祀細(xì)胞）的免疫細(xì)胞殺傷處理的細(xì)胞存活數(shù)目，見(jiàn)圖7。由圖7可知，嵌合 抗原受體CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細(xì)胞對(duì)CD20陽(yáng)性的B細(xì)胞淋己瘤細(xì)胞具 有特異殺傷活性，且CAR20-NKT細(xì)胞的特異殺傷活性明顯優(yōu)于CAR20-T細(xì)胞和NKT細(xì)胞。
[0130] 實(shí)施例5 CAR20-NKT細(xì)胞對(duì)進(jìn)展期CD20陽(yáng)性B細(xì)胞淋己瘤患者的治療效果
[013U 取 5 X IO8個(gè) CD20ScFv-CD8-CD137-CD3 C 修飾的 NKT 細(xì)胞（即 CAR CD20-NKT 細(xì) 胞），經(jīng)過(guò)100mL生理鹽水稀釋后，連續(xù)=天靜脈回輸?shù)竭M(jìn)展期CD20陽(yáng)性的惡性B細(xì)胞淋 己瘤患者（在利用本發(fā)明的CAR20-NKT細(xì)胞進(jìn)行祀向免疫治療前，已經(jīng)過(guò)多次治療（如放 療、化療及其他藥物對(duì)癥治療等），但均無(wú)明顯療效）體內(nèi)，回輸后對(duì)患者的治療狀況進(jìn)行 評(píng)估。
[0132] 圖8為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CAR20-NKT細(xì)胞回輸至9例進(jìn)展期CD20陽(yáng)性的B細(xì)胞淋 己瘤患者中，CAR20-NKT細(xì)胞在患者外周血中的持續(xù)存在時(shí)間曲線圖。圖8結(jié)果顯示，9例 患者經(jīng)過(guò)CAR20-NKT細(xì)胞祀向免疫治療后，CAR20-NKT細(xì)胞在患者的外周血中均呈現(xiàn)高水 平的拷貝數(shù)，并在1個(gè)月內(nèi)持續(xù)存在（轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)在100/ y g曲NA W上），甚至能夠在長(zhǎng) 達(dá)270天的時(shí)間內(nèi)持續(xù)存在，說(shuō)明CAR20-NKT細(xì)胞能夠在進(jìn)展期CD20陽(yáng)性的B細(xì)胞淋己瘤 患者體內(nèi)大量的增殖來(lái)發(fā)揮殺傷活性。
[0133] 圖9為本發(fā)明的CAR20-NKT細(xì)胞對(duì)第4例進(jìn)展期CD20陽(yáng)性的B細(xì)胞淋己瘤患者 治療前與治療后3個(gè)月PET-CT的對(duì)比圖。圖9結(jié)果顯示，腫大淋己結(jié)消失（具體見(jiàn)箭頭所 示）。說(shuō)明CAR20-NKT細(xì)胞能夠?qū)M(jìn)展期CD20陽(yáng)性的B細(xì)胞淋己瘤患者發(fā)揮有效的治療效 果。
[0134] W上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中 的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可W對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，運(yùn) 些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0135] 另外需要說(shuō)明的是，在上述【具體實(shí)施方式】中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛 盾的情況下，可W通過(guò)任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可 能的組合方式不再另行說(shuō)明。
[0136] 此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可W進(jìn)行任意組合，只要其不違背本 發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開(kāi)的內(nèi)容。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗原受體為⑶20ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ， 包括串聯(lián)的大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽、⑶20ScFv、⑶8的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、⑶137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié) 構(gòu)域和CD3G的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域；優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體具有如SEQ ID NO. 1所示的氨 基酸序列，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 編碼權(quán)利要求1所述的嵌合抗原受體的基因，優(yōu)選地，所述基因具有如SEQ ID NO. 2 所示的核苷酸序列，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。3. 含有權(quán)利要求2所述的基因的重組表達(dá)載體，優(yōu)選地，所述重組表達(dá)載體為慢病毒 表達(dá)載體，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述慢病毒表達(dá)載體為PWPXL-⑶20ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ。4. 一種工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞，其特征在于，所述NKT細(xì)胞是由權(quán)利要求1所 述的嵌合抗原受體修飾的NKT細(xì)胞。5. -種工程化⑶20靶向性的NKT細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括： 包裝攜帶PWPXL-⑶20ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ的慢病毒，得到病毒濃縮液；利用得到的 病毒濃縮液感染NKT細(xì)胞，使NKT細(xì)胞表達(dá)嵌合抗原受體⑶20ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述方法還包括通過(guò)如下方法制備N(xiāo)KT細(xì)胞： (1) 在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行第一階段 培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述第一階段培養(yǎng)的實(shí)施方式包括：將單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)于第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng) 液中，所述第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng)液含有NKT細(xì)胞培養(yǎng)基、CD3單克隆抗體、白介素-2和白介 素-15 ;進(jìn)一步優(yōu)選地，第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述⑶3單克隆抗體的濃度為30-70ng/mL， 和/或所述白介素-2的濃度為300-700U/mL，和/或所述白介素-15的濃度為30-70ng/ mL ； (2) 在白介素-2存在下，將所述第一階段培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行第二階段培養(yǎng)；優(yōu)選地，所 述第二階段培養(yǎng)的實(shí)施方式包括：將所述第一階段培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)于第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液 中，所述第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中含有NKT細(xì)胞培養(yǎng)基和白介素-2 ;進(jìn)一步優(yōu)選地，第二NKT 細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述感染NKT細(xì)胞的方法包括： (1) 在病毒濃縮液、魚(yú)精蛋白和白介素-2存在下，將NKT細(xì)胞進(jìn)行第一階段感染培養(yǎng)； 優(yōu)選地，所述第一階段感染培養(yǎng)的實(shí)施方式包括：將NKT細(xì)胞培養(yǎng)于第三NKT細(xì)胞培養(yǎng)液 中，所述第三NKT細(xì)胞培養(yǎng)液含有NKT細(xì)胞培養(yǎng)基、病毒濃縮液、魚(yú)精蛋白和白介素-2 ;進(jìn) 一步優(yōu)選地，第三NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL ; (2) 在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將所述第一階段感染培養(yǎng)的細(xì) 胞進(jìn)行第二階段感染培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述第二階段感染培養(yǎng)的實(shí)施方式包括：將所述第一 階段感染培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)于所述第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述感染NKT細(xì)胞的方法還包括： (3) 先在白介素-2存在下，將所述第二階段感染培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)，待細(xì)胞的 密度為80-90%時(shí)，再在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增 培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述體外誘導(dǎo)的實(shí)施方式包括：將所述第二階段感染培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)于所 述第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述擴(kuò)增培養(yǎng)的實(shí)施方式包括：將細(xì)胞培養(yǎng)于所述第一 NKT細(xì)胞 培養(yǎng)液中。9. 權(quán)利要求5-8中任意一項(xiàng)所述方法制備得到的工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞。10.權(quán)利要求4或9所述的工程化CD20靶向性的NKT細(xì)胞在制備用于治療腫瘤的制 劑中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述腫瘤是CD20陽(yáng)性的惡性腫瘤，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述腫瘤為進(jìn)展期 ⑶20陽(yáng)性B細(xì)胞淋巴瘤。
【文檔編號(hào)】A61K39/00GK105924530SQ201510671924
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2015年10月13日
【發(fā)明人】伍志強(qiáng), 韓為東, 王曉慧, 王瑤, 郭業(yè)磊, 代漢仁, 張文英
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院