專利名稱：金黃色葡萄球菌 DNA 疫苗pcDN A3.1(+)－Minigene及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種金黃色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene及其制備方法。
背景技術(shù)：
DNA疫苗的出現(xiàn)是疫苗發(fā)展史上的第三次革命。作為一種新型疫苗，DNA疫苗既能刺激抗體反應(yīng)又能刺激CTL反應(yīng)。它是利用基因重組技術(shù)直接將編碼某種抗原蛋白的外源基因(DNA)與質(zhì)粒重組后，直接導(dǎo)入動物細胞內(nèi)，并通過宿主細胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達到預(yù)防和治療疾病的目的。與傳統(tǒng)的滅活疫苗、亞單位疫苗和基因工程疫苗相比，DNA疫苗具有如下優(yōu)點①免疫保護力增強；②制備簡單，省時省力；③同種異株交叉保護；④應(yīng)用較安全；⑤產(chǎn)生持久免疫應(yīng)答；⑥貯存、運輸方便；⑦可用于防治腫瘤。2005年7月18日世界上首個DNA疫苗獲準(zhǔn)上市，是DNA疫苗科技的一個里程碑；我國廣州解放軍第458醫(yī)院研究的治療性乙肝DNA疫苗也獲得了國內(nèi)SFDA批準(zhǔn)，進入了2期臨床研究。這些都顯示了DNA疫苗廣闊的發(fā)展前景。
金黃色葡萄球菌(以下簡稱金葡菌)是人畜化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，但至今仍未有十分有效的疫苗能預(yù)防金葡菌的感染。因此，本發(fā)明采用新型的DNA疫苗技術(shù)，利用其能同時引起細胞和體液免疫的特性，以期能有效地保護機體抵御金黃色葡萄球菌的感染。
金葡菌疫苗一直是眾多學(xué)者研究的焦點，其候選抗原主要有金葡菌感染初期的黏附素，感染后期的毒素分泌調(diào)控因子以及金葡菌分泌的各種毒素。以下為本發(fā)明所選用候選抗原的介紹在眾多金葡菌感染實驗中發(fā)現(xiàn)，金葡菌的識別黏附基質(zhì)的細胞表面組分(MSCRAMM)纖連蛋白結(jié)合蛋白(FnBP)是一種重要的黏附素，而MSCRAMM與細胞外基質(zhì)的相互作用被認(rèn)為是細菌感染的先決條件。幾乎所有的金葡菌都擁有FnBP，有研究發(fā)現(xiàn)金葡菌的FnBP能促進菌體在乳腺中的定殖[1]，同時Wubshet等人報道，含金葡菌纖維素結(jié)合蛋白(FnBP)的血清對金黃色葡萄球菌型奶牛乳房炎有調(diào)理作用。
同時，研究發(fā)現(xiàn)AIP(auto-inducing peptides)和RAP(RNAIII activatingprotein)是在金葡菌感染后期中重要的信號肽。細菌在處于高密度時分泌這些分子，它們能下調(diào)黏附素的表達同時上調(diào)各種酶與毒素的表達。而其中RAP蛋白是通過TRAP蛋白的磷酸化而激活RNAIII轉(zhuǎn)錄。因此，TRAP蛋白磷酸化是金黃色葡萄球菌外毒素分泌起始和關(guān)鍵因素。高亞萍等[2]用重組的TRAP蛋白免疫家免得到多抗血清，純化后的抗體可以特異性識別不同菌株的TRAP蛋白，并抑制TRAP蛋白磷酸化，降低金葡菌外毒素的分泌。目前，已經(jīng)在不同菌株中發(fā)現(xiàn)多種TRAP蛋白，不同的TRAP蛋白之間的同源性都大于85％。
以上2種候選抗原均有相關(guān)研究報道顯示其蛋白疫苗能有效地刺激機體產(chǎn)生特異性的抗體，但目前尚無發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用這2個抗原作為疫苗的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種金黃色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene。
本發(fā)明的目的之二在于提供該DNA疫苗的制備方法，期望該DNA疫苗能起到調(diào)理和抑制金葡菌黏附細胞外基質(zhì)的作用的同時還能降低金黃色葡萄球菌外毒素的分泌，從而對機體起到免疫保護作用，抵御金葡菌的攻擊感染。
為達到上述目的，本發(fā)明利用真核表達載體pcDNA3.1(+)，創(chuàng)新性地融合了FnBP的抗原決定簇(D1和D3)以及TRAP的抗原決定簇(該融合基因命名為Minigene)的基因序列，構(gòu)建多階段、多價激發(fā)多種免疫反應(yīng)的多表位DNA疫苗。有報道顯示象這樣呈線性排列抗原肽是一種激活T細胞的有效方式[3，4]，由于疾病復(fù)發(fā)的主要原因是細胞內(nèi)感染的金葡菌，因此這樣設(shè)計是為了能增強其產(chǎn)生的細胞免疫，以達到徹底清除感染部位金葡菌的目的。
根據(jù)上述機理，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種金黃色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene，其特征在于該疫苗具有SEQ NO 5所示的堿基序列。
上述的金黃色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene的編碼蛋白，其特征在于具有SEQ NO 6所示的氨基酸序列。
上述的金黃色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene的制備方法，其特征在于該方法具有以下步驟a.Minigene的人工合成根據(jù)，F(xiàn)nBP的配體結(jié)合基序(D121-34；D320-33)和TRAP蛋白C末端的12個氨基酸的基因序列，設(shè)計重組融合基因的序列如下CAAGGTGGCAATATCGTAGATATCGATTTTGATAGTGTACCTCAATTCGGTGGACACAATAGTGTTGACTTTGAAGAAGATACAAGTTATTTTGAAAGATATCTATACCCAATAAAAGAA；再根據(jù)上段基因設(shè)計上下游引物上游引物5’-CAAGGTGGCAATATCGTAGATATCGATTTTGATAGTGTACCTCAATTCGGTGGACACAATAGTGTTGACT-3’下游引物5’-TTCTTTTATTGGGTATAGATATCTTTCAAAATAACTTGTATCTTCTTCAAAGTCAACACTATTGTGTCCA-3’上述引物互為模板進行PCR擴增，得到120bp的Minigene片段，回收純化擴增產(chǎn)物；b.重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Minigene的構(gòu)建根據(jù)Minigene末端20個核苷酸序列設(shè)計上下游引物上游引物5’-TAAGCTAGCACCATGGGTCAAGGTGGCAATATCGTAGA-3’下游引物5’-GCCGGTACCTTATCATTCTTTTATTGGGTATAGAT-3’以步驟a所得Minigene片段用Nhe I和Kpn I雙酶切后插入質(zhì)粒pcDNA3.1(+)的Nhe I/Kpn I之間，構(gòu)成重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Minigene。
上述的金黃色葡萄球菌DNA疫苗在制備預(yù)防金黃色葡萄球菌感染引起的各種疾病疫苗中的應(yīng)用pcDNA3.1(+)表達載體是Invitrogen公司開發(fā)的較為成熟的真核表達載體，被廣泛地應(yīng)用于基因治療和核酸疫苗的研究中。目前核酸疫苗的載體多采用的人巨細胞病毒(hCMV)的啟動子，可使外源基因得到較好的表達，pcDNA3.1(+)正是采用了CMV啟動子。同時pcDNA3.1(+)質(zhì)粒含有氨芐青霉素抗性基因以用作篩選標(biāo)記。Raz小組已證實這一抗性基因中含有2個可顯著增強基因免疫效果的六寡核苷酸序列5’-AACGTT-3’。此序列含CpG結(jié)構(gòu)，稱為免疫激活DNA序列(immuno-stimulatory DNA sequence，ISS)，該序列可作用于多種免疫活性細胞，誘導(dǎo)細胞因子IFN-7、TNF、IL-6、IL-12、IL-18產(chǎn)生，增強DNA疫苗誘導(dǎo)的Th1型免疫應(yīng)答。
DNA疫苗作為新型的第三代疫苗，與傳統(tǒng)的滅活疫苗、亞單位疫苗和基因工程疫苗相比，DNA疫苗具有如下優(yōu)點①免疫保護力增強；②制備簡單，省時省力；③同種異株交叉保護；④應(yīng)用較安全；⑤產(chǎn)生持久免疫應(yīng)答；⑥貯存、運輸方便；⑦可用于防治腫瘤。具有廣闊的發(fā)展前景。


圖1為重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Minigene的構(gòu)建流程2為pcDNA3.1(+)-Minigene免疫小鼠血清中抗Minigene抗體的動態(tài)變化。
圖3為pcDNA3.1(+)-Minigene免疫小鼠的淋巴細胞體外受融合蛋白Trx-Minigene和Con A刺激后的增殖反應(yīng)。
具體實施例方式
實施例一金黃色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene及其制備方法1.Minigene的人工合成根據(jù)，F(xiàn)nBP的配體結(jié)合基序(D121-34；D320-33)和TRAP蛋白C末端的12個氨基酸的基因序列，設(shè)計重組融合基因的序列如下CAAGGTGGCAATATCGTAGATATCGATTTTGATAGTGTACCTCAATTCGGTGGACACAATAGTGTTGACTTTGAAGAAGATACAAGTTATTTTGAAAGATATCTATACCCAATAAAAGAA根據(jù)上段基因設(shè)計上下游引物進行人工合成上游引物5’-CAAGGTGGCAATATCGTAGATATCGATTTTGATAGTGTACCTCAATTCGGTGGACACAATAGTGTTGACT-3’下游引物5’-TTCTTTTATTGGGTATAGATATCTTTCAAAATAACTTGTATCTTCTTCAAAGTCAACACTATTGTGTCCA-3’互為模板進行PCR擴增，得到120bp的Minigene基因?；厥占兓瘮U增產(chǎn)物.
2.構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Minigene根據(jù)Minigene末端20個核苷酸序列設(shè)計上下游引物，加入酶切位點上游引物5’-TAAGCTAGCACCATGGGTCAAGGTGGCAATATCGTAGA-3’下游引物5’-GCCGGTACCTTATCATTCTTTTATTGGGTATAGAT-3’以先前合成得到的Minigene為模板，PCR擴增之后就得到了120bp左右的Minigene基因。回收純化擴增產(chǎn)物。
Minigene片段用Nhe I和Kpn I雙酶切后插入質(zhì)粒pcDNA3.1(+)的Nhe I/KpnI之間，構(gòu)成重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Minigene。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選出抗Ampicillin的陽性克隆。重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Minigene用Nhe I和Kpn I雙酶切，得到120bp和5.4kb兩個片段，與預(yù)期結(jié)果相符。DNA序列測定表明，Minigene基因的序列正確。
實施例二DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene的免疫效果的評估1質(zhì)粒DNA的大量制備(1)每250ml培養(yǎng)物用150ml用冰預(yù)冷的STE重懸后，4℃，8000rpm離心6min，棄上清，菌體存-20于℃；(2)取一定量的菌體用300ml溶液I重懸，OD為10左右；(3)加入600ml新配置的溶液II，溫和顛倒4-6次混勻，室溫放置5-10min；(4)加入300ml用冰預(yù)冷的的溶液III，溫和顛倒4-6次混勻，冰上放置10min；4℃，10000rpm離心30min，棄沉淀，上清用紗布過濾；(5)加入0.6倍體積異丙醇，室溫放置10min；室溫(25℃)12000g離心15min；小心棄上清，倒置于紙巾上，去除殘余上清；(6)室溫70％乙醇刷洗管底及管壁，棄乙醇，用1ml槍小心吸去殘余乙醇；將離心管倒置在紙巾上，室溫干燥10-15min(不要過長)；
(7)30mlTE溶解，冰浴至0℃；(8)加入30ml5mol/LLiCl，混勻，4℃12000g離心10min；(9)棄沉淀，上清加等體積異丙醇，混勻，室溫(25℃)12000g離心10min；(10)重復(fù)步驟6；(11)將離心管倒置在紙巾上，室溫干燥數(shù)分鐘，不要過長，保持核酸沉淀濕潤；(12)2ml含20μg/mlRNase的TE(pH8.0)溶解沉淀，移至1.5ml離心管中；(13)室溫放置30min；(14)用等量酚∶氯仿抽提一次，如發(fā)現(xiàn)蛋白過多，可以多抽提幾次然后再用氯仿抽提一次；(15)加0.1倍體積3mol/L乙酸鈉(pH5.2)及兩倍體積乙醇(注意次序)沉淀DNA；(16)質(zhì)粒DNA沉淀用1ml滅菌水溶解，再加入0.5mlPEG-MgCl2溶液；(17)室溫沉淀15min，再室溫最大轉(zhuǎn)速離心20min；(18)沉淀用0.5ml用70％乙醇重懸，除去痕量PEG，室溫最大轉(zhuǎn)速離心10min；(19)重復(fù)步驟18，室溫晾干20min；(20)最后以少量無菌PBS(pH7.2)溶解DNA。
以紫外分光光度計測DNA溶液的OD260/OD280比值，比值接近1.9認(rèn)為達到純度，以O(shè)D260＝0.1時的DNA含量為50μg/ml來計算DNA的濃度，將質(zhì)粒DNA濃度調(diào)整為1mg/ml，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 2免疫程序與標(biāo)本采集將大量抽提純化得到的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Minigene，采用肌肉注射分別在第0，2，4周免疫SPF級BALB/c小鼠，每次每只小鼠免疫100μg質(zhì)粒。同時從第一次免疫起，每隔2周，用毛細血管從小鼠內(nèi)眥靜脈內(nèi)取血0.5ml，室溫靜置30分鐘后，10000rpm離心20分鐘，小心吸取上清(血清)凍存?zhèn)錅y。第3次免疫后2周，小鼠用70％酒精消毒后固定，剪開腹部皮膚、腹膜，無菌取脾臟制備細胞懸液。
3 ELISA檢測免疫小鼠血清抗Minigene抗體結(jié)果免疫pcDNA3.1(+)-Minigene質(zhì)粒的小鼠抗Minigene抗體產(chǎn)生趨勢見圖2和表3-1(免疫血清的抗Minigene抗體的平均滴度均為1∶100)，在第6周后，免疫小鼠血清中出現(xiàn)了抗Minigene抗體，并呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，在第10周達到頂點(抗體效價為3200)，此時抗體略有下降；同時與注射空質(zhì)粒的小鼠在同一時期的抗體水平比較有顯著性差異(P＜0.05)，參見表1。該結(jié)果表明構(gòu)建的pcDNA3.1(+)-Minigene質(zhì)粒在體內(nèi)表達了相應(yīng)的蛋白，該蛋白具有刺激機體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答的免疫原性表1pcDNA3.1(+)-Minigene免疫小鼠血清中抗Minigene抗體的動態(tài)變化(*表示與空質(zhì)粒組在統(tǒng)計學(xué)上有明顯差異性)

4免疫小鼠的淋巴細胞增殖實驗結(jié)果將細胞懸液以200ul/孔加入96孔細胞培養(yǎng)板中。實驗組其中一孔中加入1μgCon A，一孔中什么都不加，其余每孔加入10μg相對應(yīng)的融合蛋白，調(diào)零孔只加培養(yǎng)基不加淋巴細胞。于37℃50ml/L CO2孵箱中培養(yǎng)68h。
取上述培養(yǎng)的細胞，每孔加入20ul MTT(5g/L溶于PBS，pH7.2)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，以1000r/min離心10min。吸棄上清，每孔加/入200g/L DMSO150ul，振蕩10min，測定OD570值，結(jié)果用刺激指數(shù)(stimulationindex，SI)表示。SI＝A實驗組/A對照組。結(jié)果顯示，pcDNA3.1(+)-Minigene質(zhì)粒免疫小鼠可誘導(dǎo)較明顯的特異性淋巴細胞增殖(圖3)，SI值分別為1.682±0.2542，與空載質(zhì)粒免疫小鼠相比有顯著性差異(P＜0.05)。
5金黃色葡萄球菌攻毒實驗結(jié)果選用前期實驗中免疫14周的小鼠，使用蛋白疫苗加強免疫7天后，通過腹腔注射5×108CFU的進行金葡菌攻毒實驗，攻毒實驗結(jié)果參見表2表2黃色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene攻毒實驗結(jié)果

由上表可見該劑量的致死率約為37.5％，實驗組的存活率與對照組有顯著性差異(P＜0.01)，同時對照組中的小鼠都不同程度地出現(xiàn)安靜少動，蜷縮，精神萎糜，毛發(fā)疏松，而實驗組的小鼠均一切正常。
本發(fā)明構(gòu)建的DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene，通過免疫小鼠實驗顯示，該DNA疫苗能刺激小鼠機體產(chǎn)生明顯和持久的特異性淋巴細胞增殖反應(yīng)以及一定水平的體液免疫，與相應(yīng)的pcDNA3.1接種的陰性對照組比較，差異具有顯著性(P＜0.05)。同時從攻毒實驗的結(jié)果來看，pcDNA3.1(+)-Minigene質(zhì)粒能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了抗金葡菌感染的抗體，對免疫小鼠起到了免疫保護的作用。
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序列表<110>上海大學(xué)<120>金黃色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene及其制備方法<140>
<141>
<160>6<210>1<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>
<223>
<400>1CAA GGT GGC AAT ATC GTA GAT ATC GAT TTT GAT AGT GTA CCT CAA TTC GGT GGACAC AAT AGT GTT GAC T<210>2<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>
<223>
<400>2TTC TTT TAT TGG GTA TAG ATA TCT TTC AAA ATA ACT TGT ATC TTC TTC AAA GTCAAC ACT ATT GTG TCC A
<210>3<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>
<223>
<400>3TAA GCT AGC ACC ATG GGT CAA GGT GGC AAT ATC GTA GA<210>4<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>
<223>
<400>4GCC GGT ACC TTA TCA TTC TTT TAT TGG GTA TAG AT<210>5<211>120<212>DNA<213>人工合成<220>
<222>
<223>
<400>5CAAGGTGGCAATATCGTAGATATCGATTTTGATAGTGTACCTCAATTCGGTGGACACAATAGTGTTGAC
TTTGAAGAAGATACAAGTTATTTTGAAAGATATCTATACCCAATAAAAGAA120<210>6<211>40<212>PRT<213>金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)<220>
<222>
<223>
<400>6QGGNIVDIDFDSVPQFGGHNSVDFEEDTSYFERYLYPIKE 40
權(quán)利要求
1.一種金黃色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene，其特征在于該疫苗具有SEQ NO 5所示的堿基序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene的編碼蛋白，其特征在于該疫苗具有SEQ NO 6所示的氨基酸序列。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene的制備方法，其特征在于該方法具有以下步驟a.Minigene的人工合成根據(jù)，F(xiàn)nBP的配體結(jié)合基序(D121-34；D320-33)和TRAP蛋白C末端的12個氨基酸的基因序列，設(shè)計重組融合基因的序列如下CAAGGTGGCAATATCGTAGATATCGATTTTGATAGTGTACCTCAATTCGGTGGACACAATAGTGTTGACTTTGAAGAAGATACAAGTTATTTTGAAAGATATCTATACCCAATAAAAGAA；再根據(jù)上段基因設(shè)計上下游引物上游引物5’-CAAGGTGGCAATATCGTAGATATCGATTTTGATAGTGTACCTCAATTCGGTGGACACAATAGTGTTGACT-3’下游引物5’-TTCTTTTATTGGGTATAGATATCTTTCAAAATAACTTGTATCTTCTTCAAAGTCAACACTATTGTGTCCA-3’上述引物互為模板進行PCR擴增，得到120bp的Minigene片段，回收純化擴增產(chǎn)物；b.重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Minigene的構(gòu)建根據(jù)Minigene末端20個核苷酸序列設(shè)計上下游引物上游引物5’-TAAGCTAGCACCATGGGTCAAGGTGGCAATATCGTAGA-3’下游引物5’-GCCGGTACCTTATCATTCTTTTATTGGGTATAGAT-3’以步驟a所得Minigene片段作為模板進行PCR，擴增得到的片段用Nhe I和Kpn I雙酶切后插入質(zhì)粒pcDNA3.1(+)的Nhe I/Kpn I之間，構(gòu)成重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Minigene。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌DNA疫苗在制備預(yù)防金黃色葡萄球菌感染引起的各種疾病疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種金黃色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)－Minigene及其制備方法。本發(fā)明構(gòu)建的DNA疫苗pcDNA3.1(+)－Minigene，通過免疫小鼠實驗顯示，該DNA疫苗能刺激小鼠機體產(chǎn)生明顯和持久的特異性淋巴細胞增殖反應(yīng)以及一定水平的體液免疫，與相應(yīng)的pcDNA3.1接種的陰性對照組比較，差異具有顯著性(P＜0.05)。同時從攻毒實驗的結(jié)果來看，pcDNA3.1(+)－Minigene質(zhì)粒能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了抗金葡菌感染的抗體，對免疫小鼠起到了免疫保護的作用。
文檔編號A61P31/04GK101066463SQ20071004116
公開日2007年11月7日 申請日期2007年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月24日
發(fā)明者陳宇光, 倪繼祖, 沈彥萍 申請人:上海大學(xué)