專利名稱：季胺鹽改性的殼聚糖親核no供體的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種季胺鹽改性的殼聚糖親核NO供體的合成方法。
背景技術(shù)：
作為包含有生物信息的天然高分子材料，殼聚糖及其衍生物兼具生物相容性和生物可降解性，可被生物內(nèi)的溶菌酶分解，應(yīng)用于相關(guān)的醫(yī)藥領(lǐng)域時(shí)其安全性較其它合成材料更為可靠。殼聚糖作為生物醫(yī)用材料的潛力來源于陽離子特征和在溶液中的高電荷密度。殼聚糖的衍生化反應(yīng)為增強(qiáng)材料的生物活性和改善機(jī)械性能提供了新的途徑。殼聚糖分子中的羥基和氨基容易進(jìn)行化學(xué)修飾，繼而可制成各種類型的膜、凝膠、聚電解質(zhì)等材料。通過在殼聚糖側(cè)鏈引入功能基團(tuán)，破壞結(jié)晶區(qū)結(jié)構(gòu)，增加非結(jié)晶區(qū)部分，不但可以改變其溶解性，而且可以改變物化性質(zhì)。例如N-烷基化殼聚糖降低了溶解性并且可以在烷基鏈大于5個碳的時(shí)候形成膠束團(tuán)簇，而硫酸化反應(yīng)則賦予殼聚糖陰離子特性和水溶性，同時(shí)獲得抗凝血性；經(jīng)糖基化修飾而成殼聚糖的衍生物易溶于水，表現(xiàn)出高吸濕性和保濕性，對酶降解的敏感性也隨著衍生物的取代度的增加而降低。
殼聚糖及其衍生物可以通過影響上皮細(xì)胞的通道來提高細(xì)胞的通透性，對某些可以使活性物質(zhì)降解的酶具有抑制作用。又由于其生物粘附性強(qiáng)，可以增強(qiáng)親水化合物在生物體內(nèi)的穿透作用，提高跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力，因此可作為生物活性物質(zhì)的促進(jìn)吸收因子。殼聚糖的季銨鹽是一種兩性高分子，一般情況下取代度在25％以上季銨鹽化殼聚糖可溶于水。殼聚糖的季銨鹽也可以分兩個類型一類是利用殼聚糖的氨基反應(yīng)制得，具體方法是用過量鹵代烷和殼聚糖反應(yīng)得到鹵化殼聚糖季銨鹽，由于碘代烷的反應(yīng)活性較高，是常用的鹵代化試劑。另一類是用含有環(huán)氧烷烴的季銨鹽和殼聚糖反應(yīng)，得到含有羥基的殼聚糖季銨鹽。許晨等人用環(huán)氧丙基三甲基氯化銨和殼聚糖反應(yīng)，合成了羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖，它的水溶性隨取代度的增加而增大，完全水溶性產(chǎn)物的10％溶液，可以與乙醇、乙二醇、甘油任意比混合而不發(fā)生沉淀。含有[N(O)NO]-官能團(tuán)的化合物是近幾年發(fā)展起來的一種最重要的NO供體藥物。它既可以在生理?xiàng)l件下自發(fā)的釋放NO分子；經(jīng)O2取代后又可以在靶器官和靶細(xì)胞中被特定酶脫離，具有靶向性的功能；它還具有良好的可調(diào)控性；另外它可以制備成各種形態(tài)，根據(jù)需要應(yīng)用于不同的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。大量的體外試驗(yàn)已經(jīng)證明了它可以有效的預(yù)防成型術(shù)后再狹窄，提高醫(yī)療裝置的抗血栓性能，減輕肺部高壓和血管痙攣等用途。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Smith等人于2002年在美國專利USP6451337，名稱“Chitosan-based nitric oxide donor compositions”(“基于殼聚糖的一氧化氮供體合成物”)，提出了將改性殼聚糖作為親核NO載體，合成出系列殼聚糖-NO加成物。但是對既能提高殼聚糖改性產(chǎn)物同NO的均相反應(yīng)，又可不經(jīng)過O2取代就可達(dá)到靶向效果的殼聚糖-NO加成物的效果不佳。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種季胺鹽改性的殼聚糖親核NO供體的合成方法。通過對殼聚糖進(jìn)行季胺化改性，產(chǎn)生NH親核位點(diǎn)，同NO反應(yīng)后，得到一系列以殼聚糖為載體的含有[N(O)NO]-官能團(tuán)的新型的NO供體。解決了此類親核NO供體不能直接靶向和不能均相反應(yīng)的問題。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明具體步驟包括如下(1)取殼聚糖作為反應(yīng)物，對殼聚糖上的NH2基團(tuán)進(jìn)行季胺化改性處理，得到季胺鹽改性殼聚糖分子；(2)季胺鹽改性殼聚糖分子同NO氣體分子在甲醇鈉的甲醇溶液中進(jìn)行高壓反應(yīng)，產(chǎn)生[N(O)NO]-基團(tuán)；將合成產(chǎn)物用甲醇乙醚分別清洗多次，分離提純，重結(jié)晶，室溫真空干燥，儲存于-20℃的干燥器內(nèi)。
所述的對殼聚糖上的NH2基團(tuán)進(jìn)行季胺化改性處理，通過以下兩種方法進(jìn)行其方法一采用環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(GTMAC)同殼聚糖中的NH2基團(tuán)進(jìn)行加成反應(yīng)，冰丙酮沉淀后用甲醇重新溶解，再用丙酮甲醇(體積比4∶1)溶液沉淀。
所述的方法一，具體是將殼聚糖溶于去離子水中，85℃反應(yīng)溫度下將GTMAC分三次間隔兩小時(shí)加入到反應(yīng)溶液中，反應(yīng)10-24小時(shí)后，將透明的黃色反應(yīng)液加入到冰丙酮溶液中，攪拌后置于冰箱中過夜，第二天棄去丙酮，加入乙醇溶解，再用4∶1體積比丙酮乙醇溶液沉淀，抽率洗滌，最終產(chǎn)物再在60℃真空烘箱中烘干。反應(yīng)式如下 或其方法二對C2-NH2基團(tuán)進(jìn)行羧甲基化，依次與硫酸二甲酯、3-二甲基丙胺和2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨反應(yīng)，最后得到在C2-NH2基團(tuán)上引入兩個季胺鹽的改性殼聚糖。
所述的方法二，具體步驟如下1)取殼聚糖溶于稀醋酸中，等量乙醛酸分三次加入其中，用5％百分濃度的硼氫化鈉進(jìn)行還原反應(yīng)，加入乙醇沉淀分離，烘干得產(chǎn)物N-羧甲基殼聚糖(N-CMC)(a)。
2)取N-羧甲基殼聚糖(a)與硫酸二甲酯在溶于二甲亞砜溶液中，反應(yīng)24h，反應(yīng)完畢后，用鹽酸甲醇溶液分離，真空烘干得N-羧甲基甲酯殼聚糖(b)。
3)取N-羧甲基甲酯殼聚糖(b)和3-二甲基丙胺，溶于甲醇溶液中，0℃下反應(yīng)4小時(shí)，升溫至25℃下反應(yīng)24h，用丙酮沉淀，真空烘干得N-N，N-二甲基丙胺氨基甲酰殼聚糖(c)。
4)將上述N-N，N-二甲基丙胺氨基甲酰殼聚糖(c)和2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨，室溫反應(yīng)4h后，25℃恒溫反應(yīng)24h，最后用甲醇沉淀，置于真空烘箱中60℃烘干，得到雙季胺鹽殼聚糖。反應(yīng)式如下
所述的季胺鹽改性殼聚糖分子同NO氣體分子在甲醇鈉的甲醇溶液中進(jìn)行高壓反應(yīng)，其反應(yīng)方程是 所述的高壓反應(yīng)，條件是Na+/NH＝1-3，壓力為3atm-9atm，室溫反應(yīng)3天-7天。
所述的分離提純，具體是無水甲醇乙醚分別清洗3次。
所述的季胺鹽改性的殼聚糖親核NO供體采用季胺鹽改性產(chǎn)生帶正電荷的一個或多個氨基基團(tuán)(NR3+基團(tuán))，將季胺化改性產(chǎn)生的仲胺親核位點(diǎn)(NH基團(tuán))，與NO反應(yīng)產(chǎn)生[N(O)NO]-官能團(tuán)，其分子結(jié)構(gòu)式為
其中N[N(O)NO]-基團(tuán)為NH基團(tuán)同NO反應(yīng)形成。而NH基團(tuán)來自于季胺鹽改性的殼聚糖；R為一個或多個季胺鹽，包括一個或多個環(huán)氧丙基三甲基氯化銨，它來自于環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(GTMAC)與殼聚糖上NH2基團(tuán)的開環(huán)加成反應(yīng)。
所述的季胺鹽改性的殼聚糖親核NO供體為黃色或藍(lán)白色粉末狀固體，儲存于-20℃的干燥器內(nèi)；在室溫下能夠穩(wěn)定存在，在酸性或中性水溶液中能夠自發(fā)分解釋放出NO和季胺鹽改性殼聚糖。
本發(fā)明對殼聚糖上的-C2-NH2基團(tuán)進(jìn)行季胺化改性，使其產(chǎn)生能夠帶正電的穩(wěn)定的氨基基團(tuán)，包括一個季胺基團(tuán)或多個季胺基團(tuán)。在酸性和中性水溶液中能夠自發(fā)的釋放NO分子，季胺鹽的個數(shù)決定了它們的靶向性以及它們的釋放半衰期和釋放速率。
本發(fā)明的水溶性殼聚糖在較寬的pH值范圍內(nèi)具有穩(wěn)定的電正性。這些特點(diǎn)使其在液態(tài)介質(zhì)中可與帶負(fù)電荷的聚合物、大分子甚至一些聚陰離子相互作用；從生物藥劑角度來看，帶正電荷的殼聚糖微?？梢愿街金つさ谋砻?，并能打開上皮細(xì)胞的緊密聯(lián)結(jié)。季胺鹽改性殼聚糖分子產(chǎn)生的仲胺NH基團(tuán)同NO氣體分子的產(chǎn)生[N(O)NO]-基團(tuán)，在靶向輸送NO方面，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和應(yīng)用前景。本發(fā)明制備的季胺鹽改性殼聚糖親核NO供體，具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)和較長的釋放半衰期，可廣泛的應(yīng)用于治療心血管系統(tǒng)疾病，肺部高壓，促進(jìn)傷口愈合，有效的預(yù)防成型術(shù)后再狹窄，提高醫(yī)療裝置的抗血栓性能。
具體實(shí)施例方式
下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1本實(shí)施例1是在以下實(shí)施條件和技術(shù)要求條件下實(shí)施的
(1)N-單季胺鹽殼聚糖的合成(HTCC)將殼聚糖(6g，37.0mmol)溶于去離子水中(60ml)，85℃反應(yīng)溫度下將GTMAC(7.1ml，111mmol)分三次間隔兩小時(shí)加入到上述反應(yīng)溶液中。反應(yīng)10小時(shí)過后，將透明的黃色反應(yīng)液加入到冰丙酮(200ml)溶液中，攪拌后置于冰箱中過夜。第二天棄去丙酮加入乙醇溶解，再用4∶1丙酮乙醇溶液沉淀，抽率洗滌，最終產(chǎn)物再在60℃真空烘箱中烘干得淡黃色粉末10.23g。
(2)季胺鹽改性殼聚糖/NO供體的合成將季胺鹽改性殼聚糖1.2g(0.004mol)加入到含有0.43g(0.004mol)甲醇鈉的100ml無水甲醇溶液中，在高壓釜中與NO反應(yīng)，維持壓力3atm，反應(yīng)3天，反應(yīng)結(jié)束后分別用無水甲醇和乙醚洗滌，室溫真空干燥，得到黃色粉末約1g。
-官能團(tuán)最直觀和有效地表征方法是在230-280處的紫外特征吸收，合成產(chǎn)物N-單季胺鹽殼聚糖一氧化氮供體(HTCC/NO)中[N(O)NO]-官能團(tuán)的特征吸收在262nm，測定了在磷酸鹽緩沖溶液(PBS)緩沖液中其吸光率隨時(shí)間的變化，通過釋放曲線的函數(shù)擬合求出其半衰期是31h。
實(shí)施例2本實(shí)施例2是在以下實(shí)施條件和技術(shù)要求條件下實(shí)施的(1)N-單季胺鹽殼聚糖的合成(HTCC)將殼聚糖(6g，37.0mmol)溶于去離子水中(60ml)，85℃反應(yīng)溫度下將GTMAC(7.1ml，111mmol)分三次間隔兩小時(shí)加入到上述反應(yīng)溶液中。反應(yīng)17小時(shí)過后，將透明的黃色反應(yīng)液加入到冰丙酮(200ml)溶液中，攪拌后置于冰箱中過夜。第二天棄去丙酮加入乙醇溶解，再用4∶1丙酮乙醇溶液沉淀，抽率洗滌，最終產(chǎn)物再在60℃真空烘箱中烘干得淡淡黃色粉末10.72g。
(2)季胺鹽改性殼聚糖/NO供體的合成將季胺鹽改性殼聚糖1.2g(0.004mol)加入到含有0.86g(0.008mol)甲醇鈉的100ml無水甲醇溶液中，在高壓釜中與NO反應(yīng)，維持壓力6atm，反應(yīng)5天，反應(yīng)結(jié)束后分別用無水甲醇和乙醚洗滌，室溫真空干燥，得到黃色粉末約1.03g。
紫外光譜測定[N(O)NO]-官能團(tuán)的特定吸收在260nm。在PBS緩沖液中釋放半衰期是33h。
實(shí)施例3
本實(shí)施例3是在以下實(shí)施條件和技術(shù)要求條件下實(shí)施的(1)N-單季胺鹽殼聚糖的合成(HTCC)將殼聚糖(6g，37.0mmol)溶于去離子水中(60ml)，85℃反應(yīng)溫度下將GTMAC(7.1ml，111mmol)分三次間隔兩小時(shí)加入到上述反應(yīng)溶液中。反應(yīng)24小時(shí)過后，將透明的黃色反應(yīng)液加入到冰丙酮(200ml)溶液中，攪拌后置于冰箱中過夜。第二天棄去丙酮加入乙醇溶解，再用4∶1丙酮乙醇溶液沉淀，抽率洗滌，最終產(chǎn)物再在60℃真空烘箱中烘干得黃色粉末11.02g。
(2)季胺鹽改性殼聚糖/NO供體的合成將季胺鹽改性殼聚糖1.2g(0.004mol)加入到含有1.29g(0.012mol)甲醇鈉的100ml無水甲醇溶液中，在高壓釜中與NO反應(yīng)，維持壓力9atm，反應(yīng)7天，反應(yīng)結(jié)束后分別用無水甲醇和乙醚洗滌，室溫真空干燥，得到黃色粉末約1.12g。
紫外光譜測定[N(O)NO]-官能團(tuán)的特定吸收在260nm。在PBS緩沖液中釋放半衰期是37h。
實(shí)施例4本實(shí)施例4是在以下實(shí)施條件和技術(shù)要求條件下實(shí)施的(1)N-雙季胺鹽殼聚糖的合成1)N-羧甲基殼聚糖的合成(N-CMC)(a)將一定質(zhì)量的殼聚糖溶于一定體積的稀醋酸(0.7％v/v；pH＝3)中并置于500ml燒瓶中(室溫下)磁力攪拌，將等量乙醛酸分三次加入燒瓶中(間隔25min)，室溫下攪拌1h。然后用稀氫氧化鈉溶液將反應(yīng)液pH調(diào)制4.5。將稀的硼氫化鈉(5％)溶液逐滴加入到上述反應(yīng)液中，繼續(xù)攪拌1h，然后加入乙醇沉淀分離。60℃恒溫烘箱中烘干，得產(chǎn)物N-羧甲基殼聚糖(a)。
2)在300ml圓底燒瓶中加入5.0g N-羧甲基殼聚糖(N-CMC)，再加入100ml二甲亞砜和20.0ml硫酸二甲酯，45℃下加熱24h，反應(yīng)完畢后，用鹽酸甲醇溶液分離，并真空烘干得N-羧甲基甲酯殼聚糖(b)。
3)將3-二甲基丙胺置于150ml圓底燒瓶中(0℃)將30mlN-羧甲基甲酯殼聚糖的甲醇溶液加入圓底燒瓶中，0℃下反應(yīng)四小時(shí)，升溫至25℃下反應(yīng)24h，用丙酮沉淀，真空烘干得N-N，N-二甲基丙胺氨基甲酰殼聚糖(c)。
4)先將4.0mmolN-N，N-二甲基丙胺氨基甲酰殼聚糖(c)，置于150ml圓底燒瓶中，然后向其中加入3.0g 2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨，攪拌下加入NaOH和另外2.0g 2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨，反應(yīng)4h，再升溫至25℃反應(yīng)24h，最后用甲醇沉淀，置于真空烘箱中60℃烘干，得到C2-NH2上帶兩個季胺鹽的改性殼聚糖白色粉末。
(2)季胺鹽改性殼聚糖/NO供體的合成方法同實(shí)施例3，得藍(lán)白色粉末約1.22g。
紫外光譜測定[N(O)NO]-官能團(tuán)的特定吸收在260nm。在PBS緩沖液中釋放半衰期是45h。
權(quán)利要求
1.一種季胺鹽改性的殼聚糖親核NO供體的合成方法，其特征在于，具體步驟包括如下(1)取殼聚糖作為反應(yīng)物，對殼聚糖上的NH2基團(tuán)進(jìn)行季胺化改性處理，得到季胺鹽改性殼聚糖分子；(2)季胺鹽改性殼聚糖分子同NO氣體分子在甲醇鈉的甲醇溶液中進(jìn)行高壓反應(yīng)，產(chǎn)生[N(O)NO]-基團(tuán)；將合成產(chǎn)物用甲醇乙醚分別清洗多次，分離提純，重結(jié)晶，室溫真空干燥，儲存于-20℃的干燥器內(nèi)。
2.如權(quán)利要求1所述的季胺鹽改性的殼聚糖親核NO供體的合成方法，其特征是，所述的對殼聚糖上的NH2基團(tuán)進(jìn)行季胺化改性處理，通過以下方法進(jìn)行其方法一采用環(huán)氧丙基三甲基氯化銨同殼聚糖中的NH2基團(tuán)進(jìn)行加成反應(yīng)，冰丙酮沉淀后用甲醇重新溶解，再用以4∶1體積比的丙酮甲醇溶液沉淀；或其方法二對C2-NH2基團(tuán)進(jìn)行羧甲基化，依次與硫酸二甲酯、3-二甲基丙胺和2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨反應(yīng)，最后得到在C2-NH2基團(tuán)上引入兩個季胺鹽的改性殼聚糖。
3.如權(quán)利要求2所述的季胺鹽改性的殼聚糖親核NO供體的合成方法，其特征是，所述的方法一，具體是將殼聚糖溶于去離子水中，85℃反應(yīng)溫度下將環(huán)氧丙基三甲基氯化銨分三次間隔兩小時(shí)加入到反應(yīng)溶液中，反應(yīng)10-24小時(shí)后，將透明的黃色反應(yīng)液加入到冰丙酮溶液中，攪拌后置于冰箱中過夜，第二天棄去丙酮，加入乙醇溶解，再用4∶1體積比丙酮乙醇溶液沉淀，抽率洗滌，最終產(chǎn)物再在60℃真空烘箱中烘干。
4.如權(quán)利要求2所述的季胺鹽改性的殼聚糖親核NO供體的合成方法，其特征是，所述的方法二，具體步驟如下1)取殼聚糖溶于稀醋酸中，等量乙醛酸分三次加入其中，用5％百分濃度的硼氫化鈉進(jìn)行還原反應(yīng)，加入乙醇沉淀分離，烘干得產(chǎn)物N-羧甲基殼聚糖；2)取N-羧甲基殼聚糖與硫酸二甲酯在溶于二甲亞砜溶液中，反應(yīng)24h，反應(yīng)完畢后，用鹽酸甲醇溶液分離，真空烘干得N-羧甲基甲酯殼聚糖；3)取N-羧甲基甲酯殼聚糖和3-二甲基丙胺，溶于甲醇溶液中，0℃下反應(yīng)4小時(shí)，升溫至25℃下反應(yīng)24h，用丙酮沉淀，真空烘干得N-N，N-二甲基丙胺氨基甲酰殼聚糖；4)將上述N-N，N-二甲基丙胺氨基甲酰殼聚糖和2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨，室溫反應(yīng)4h后，25℃恒溫反應(yīng)24h，最后用甲醇沉淀，置于真空烘箱中60℃烘干，得到雙季胺鹽殼聚糖。
5.如權(quán)利要求1所述的季胺鹽改性的殼聚糖親核NO供體的合成方法，其特征是，所述的季胺鹽改性殼聚糖分子同NO氣體分子在甲醇鈉的甲醇溶液中進(jìn)行高壓反應(yīng)，其反應(yīng)方程是
6.如權(quán)利要求1或5所述的季胺鹽改性的殼聚糖親核NO供體的合成方法，其特征是，所述的高壓反應(yīng)，其條件是Na+/NH＝1-3，壓力為3atm-9atm，室溫反應(yīng)3天-7天。
7.如權(quán)利要求1所述的季胺鹽改性的殼聚糖親核NO供體的合成方法，其特征是，所述的分離提純，具體是無水甲醇乙醚分別清洗3次。
全文摘要
一種季胺鹽改性的殼聚糖親核NO供體的合成方法，屬于醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域。具體步驟包括如下(1)取殼聚糖作為反應(yīng)物，對殼聚糖上的NH
文檔編號A61K47/36GK101066460SQ20071004171
公開日2007年11月7日 申請日期2007年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月7日
發(fā)明者萬錒俊, 孫燕, 李慧麗, 張隱西 申請人:上海交通大學(xué)