專利名稱：可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的細(xì)胞核靶向給藥系統(tǒng)的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬細(xì)胞核靶向給藥系統(tǒng)的應(yīng)用，涉及一種細(xì)胞核靶向給藥系統(tǒng)在制備分子靶標(biāo)位于細(xì)胞核并可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤一直是直接威脅人類健康的重大疾病，腫瘤化療由于藥物本身缺乏分子靶向性，因而出現(xiàn)治愈率低、多藥耐藥性、毒副作用巨大等重大治療問(wèn)題。臨床化療失敗的重要原因之一，是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。多數(shù)腫瘤病人的死因，與腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的耐藥直接或間接相關(guān)。因此，尋找并研究能夠逆轉(zhuǎn)耐藥腫瘤細(xì)胞耐藥性的新型給藥系統(tǒng)，是腫瘤化療研究與發(fā)展的重要策略與方向之一。
研究發(fā)現(xiàn)，有多種原因?qū)е铝四[瘤多藥耐藥性的產(chǎn)生，并且與P-糖蛋白(P-gp)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST-л)，以及拓?fù)洚悩?gòu)酶(TOPO-II)的表達(dá)異常有關(guān)。P-糖蛋白(P-gp)主要分布于細(xì)胞膜，是依賴ATP酶的藥物輸出泵，也是一種Ca2+與Cl-的通道。P-gp能夠與進(jìn)入細(xì)胞漿的抗腫瘤藥物結(jié)合，借助ATP水解釋放出的能量，直接或間接將藥物泵出細(xì)胞；或借P-gp本身的通道作用，將藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低、細(xì)胞毒作用減弱或喪失，進(jìn)而使腫瘤產(chǎn)生耐藥。
研究顯示，聚合物載體可在一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥性。非離子型表面活性劑聚環(huán)氧乙烯-聚苯醚-聚環(huán)氧乙烯三聚體(PEO-PPO-PEO)，包裹抗腫瘤藥物后，當(dāng)聚合物濃度接近臨界膠團(tuán)濃度時(shí)，可以發(fā)揮較好的抗腫瘤效果，并體現(xiàn)逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性傾向。聚合物載體可有效減少耐藥細(xì)胞的ATP量，卻不會(huì)引起敏感細(xì)胞的ATP量的變化。耐藥細(xì)胞中ATP量的減少，直接減少了被耐藥細(xì)胞泵出的腫瘤藥物量，表現(xiàn)為對(duì)腫瘤耐藥性的逆轉(zhuǎn)。又如，聚左旋組氨酸(PolyHis)，通過(guò)咪唑基團(tuán)的“質(zhì)子海綿體”機(jī)制，可實(shí)現(xiàn)核內(nèi)體膜裂解活性。如果所設(shè)計(jì)的聚合物膠團(tuán)，能夠在早期的核內(nèi)體中發(fā)生觸發(fā)性釋放并內(nèi)在化，隨后使成熟的核內(nèi)體膜破裂，則可以使藥物逃逸，并在細(xì)胞漿和細(xì)胞核(潛在的藥物作用位點(diǎn))中表現(xiàn)出更高的藥物濃度，這樣的給藥系統(tǒng)將成為有效的克服多藥耐藥性的藥物傳遞模型。因此，帶有聚左旋組氨酸核心的聚合物膠團(tuán)，也有望成為有效的腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)劑。
大多數(shù)抗腫瘤藥物的分子作用靶標(biāo)位于細(xì)胞核，如阿霉素、絲裂霉素C等?，F(xiàn)有的腫瘤化療技術(shù)，基本沿用了藥物的非靶向給藥模式，主要依靠藥物自身的理化性質(zhì)，分布到腫瘤組織。通過(guò)合適的載體技術(shù)，將藥物直接靶向病變組織(器官)、細(xì)胞及亞細(xì)胞器，是解決癌癥化療治愈率低和毒副作用大的重要手段之一。目前，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家通過(guò)納米載體技術(shù)，在抗腫瘤藥物的組織(器官)和細(xì)胞靶向上取得了一定的進(jìn)展，但并沒(méi)有取得突破性的療效，主要原因是納米載體無(wú)法將藥物大量輸送到細(xì)胞內(nèi)，尤其是細(xì)胞核內(nèi)的藥物分子作用位點(diǎn)。因此，針對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物分子作用靶點(diǎn)(亞細(xì)胞器)的靶向性納米載體材料技術(shù)的研究開(kāi)發(fā)，是突破腫瘤化療瓶頸技術(shù)的關(guān)鍵。
聚合物膠團(tuán)(polymeric micelles，PMs)是近幾年正在發(fā)展的一類新型的納米載體，具有增溶、靶向、低毒和長(zhǎng)循環(huán)的優(yōu)點(diǎn)。聚合物膠團(tuán)由兩親性的聚合物在水性環(huán)境中自發(fā)形成，具有獨(dú)特的核-殼結(jié)構(gòu)。其內(nèi)核可為難溶性藥物提供儲(chǔ)庫(kù)，親水性外殼則可進(jìn)行理化性質(zhì)修飾。通過(guò)包封多肽蛋白類藥物及基因藥物，可達(dá)到體內(nèi)靶向分布、逃避單核巨噬細(xì)胞的吞噬、提高生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)等作用。聚合物膠團(tuán)自身可通過(guò)“增強(qiáng)的透過(guò)及滯留效應(yīng)”(enhanced permeabilityand retention effect)聚集到腫瘤組織。
殼聚糖是一類由氨基葡萄糖組成的陽(yáng)離子聚合物，具有很好的生物相容性、低毒性和可生物降解性。殼聚糖被廣泛應(yīng)用于藥物輔料、止血材料、組織工程支架等。盡管以殼聚糖為基本材料所制備的微粒和納米粒，已廣泛應(yīng)用于藥物載體材料的研究，但由于殼聚糖本身的親水性結(jié)構(gòu)，使它難以被細(xì)胞大量攝取，無(wú)法實(shí)現(xiàn)亞細(xì)胞器靶向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種細(xì)胞核靶向給藥系統(tǒng)在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的分子靶標(biāo)位于細(xì)胞核的抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
細(xì)胞核靶向給藥系統(tǒng)由細(xì)胞核靶向給藥載體和被包封的抗腫瘤藥物組成，選用殼寡糖-脂肪酸嫁接物膠團(tuán)作為細(xì)胞核靶向給藥載體，當(dāng)殼寡糖-脂肪酸嫁接物在水性介質(zhì)中的濃度超過(guò)臨界膠團(tuán)濃度時(shí)，可自發(fā)形成嫁接物膠團(tuán)，膠團(tuán)具備被細(xì)胞快速攝取，并靶向細(xì)胞核的功能。本發(fā)明的嫁接物膠團(tuán)的組成，已為專利“表面修飾疏水改性殼寡糖聚合物給藥膠團(tuán)及其制備方法”(專利申請(qǐng)?zhí)?00610051601.0)，和專利“一種非病毒基因轉(zhuǎn)染載體及制備方法和用途”(專利申請(qǐng)?zhí)?00610050516.2)所涵蓋。
由于該類嫁接物載體毒性低、具有被細(xì)胞快速攝取，并靶向細(xì)胞核的功能。因此，可作為分子靶標(biāo)位于細(xì)胞核的抗腫瘤藥物靶向治療，解決腫瘤細(xì)胞的耐藥性問(wèn)題，提高藥物的療效。
本發(fā)明提供的殼寡糖-脂肪酸嫁接物載藥膠團(tuán)，在顯著提高敏感細(xì)胞抗腫瘤藥效的同時(shí)，可完全逆轉(zhuǎn)耐藥腫瘤細(xì)胞的耐藥性。
將含羧基的疏水性物質(zhì)(如脂肪酸)，與殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中的部分氨基嫁接，可增強(qiáng)殼聚糖分子結(jié)構(gòu)的疏水性，制備得到的殼聚糖-脂肪酸嫁接物，能夠在水性介質(zhì)中通過(guò)自聚集形成嫁接物膠團(tuán)。該嫁接物膠團(tuán)的疏水性內(nèi)核，可增溶疏水性的藥物分子。通過(guò)控制殼聚糖分子量，以及嫁接物合成過(guò)程中的投料比例，可制備得到具有特定氨基取代度的嫁接物，并在水性介質(zhì)中形成嫁接物膠團(tuán)。這種膠團(tuán)能夠體現(xiàn)出被細(xì)胞快速攝取的特性，并顯示出在細(xì)胞核高濃度聚集的靶向功能。將該類藥物載體應(yīng)用于分子靶標(biāo)位于細(xì)胞核的抗腫瘤藥物的傳遞，可在提高藥物分子靶標(biāo)區(qū)域(細(xì)胞核)藥物濃度、增強(qiáng)抗腫瘤療效的同時(shí)，逆轉(zhuǎn)耐藥腫瘤細(xì)胞的耐藥性。
本發(fā)明的有益之處是為分子靶標(biāo)位于細(xì)胞核的藥物，提供一種靶向給藥載體材料。殼寡糖-脂肪酸嫁接物膠團(tuán)細(xì)胞毒性低，具有快速透過(guò)細(xì)胞膜、很少被細(xì)胞內(nèi)溶酶體破壞、細(xì)胞核靶向的功能。通過(guò)嫁接物膠團(tuán)自身的疏水性內(nèi)核特性，可包封分子靶標(biāo)位于細(xì)胞核的疏水性抗腫瘤藥物，形成嫁接物載藥膠團(tuán)。在顯著提高抗腫瘤藥物療效的同時(shí)，逆轉(zhuǎn)耐藥腫瘤細(xì)胞的耐藥性。


圖1共孵育3小時(shí)后，MCF-7細(xì)胞和MCF-7-adr細(xì)胞對(duì)FITC標(biāo)記的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的攝取照片。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明通過(guò)實(shí)施例和附圖作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例殼寡糖-脂肪酸嫁接物載藥膠團(tuán)在抗腫瘤藥效(乳腺癌細(xì)胞，MCF-7細(xì)胞)及逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞(乳腺癌耐藥細(xì)胞，MCF-7-adr細(xì)胞)耐藥性中的應(yīng)用1)低分子量殼聚糖(殼寡糖)制備取市售分子量為450kDa的殼聚糖(脫乙酰度為92.5％)90g，加至3000mL1.25％(v/v)的鹽酸水溶液中，55～60℃溫度條件下，溶漲2小時(shí)后，加入5％的纖維素酶(w/w)，在55～60℃溫度條件下進(jìn)行降解。控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，得低分子量殼聚糖(殼寡糖)。所得降解反應(yīng)液，使用50Kda和10Kda超濾膜(Biomax-10，Millipore Co.，USA)超濾分級(jí)后，取分子量10～50Kda超濾液冷凍干燥。凝膠滲透色譜法測(cè)定殼寡糖分子量，采用TSK-gel G3000SW色譜柱，0.1mol/L醋酸鈉(pH6.0)為流動(dòng)相，分別以分子量0.73，5.9，11.8，47.3，212.0，788.0Kda的葡聚糖標(biāo)樣制備洗脫曲線，用該洗脫曲線計(jì)算殼寡糖分子量。經(jīng)測(cè)定，所得殼寡糖的重均分子量為18.4kDa。
2)殼寡糖-硬脂酸嫁接物制備及理化性質(zhì)測(cè)定取上述殼寡糖0.4g，精密稱定，加30mL蒸餾水?dāng)嚢枞芙夂?，加入配比?殼寡糖與碳二亞胺的摩爾比為1∶100)的碳二亞胺(EDC)，攪拌溶解。按照殼寡糖∶硬脂酸(摩爾比)1∶20，稱取硬脂酸溶于20mL無(wú)水乙醇。將上述兩種溶液的混合液，在400rpm磁力攪拌條件下，80℃恒溫反應(yīng)5小時(shí)，冷卻至室溫(25℃)，繼續(xù)攪拌6小時(shí)。將終反應(yīng)液置透析袋中，蒸餾水透析48小時(shí)。透析液冷凍干燥后，以無(wú)水乙醇洗滌去除殘留的硬脂酸，得殼寡糖-硬脂酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法，測(cè)定嫁接物的氨基取代度。取不同量的殼寡糖(0.5～9mg)，精密稱定，分別溶于2mL的蒸餾水中，加入4％(w/v)的碳酸氫鈉溶液2mL和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2mL，37℃孵育2小時(shí)。加入2N鹽酸2mL，搖勻，在344nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。取上述的殼寡糖-硬脂酸嫁接物4mg，溶于2mL蒸餾水，同法操作，測(cè)定得到嫁接物的氨基取代度為14.8％。
采用芘熒光法，測(cè)定殼寡糖-硬脂酸的臨界膠團(tuán)濃度。制備不同濃度殼寡糖-脂肪酸嫁接物溶液各10mL，分別加入定量的芘(芘終濃度為7×10-7mol/L)，室溫水浴超聲30min。掃描芘的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，測(cè)定在375nm和396nm熒光強(qiáng)度，并以測(cè)定I375/I396傾斜率的突然變化，確定該嫁接物的臨界膠團(tuán)濃度為0.03mg/mL。
采用微粒粒度及表面電位分析儀，測(cè)定殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的粒徑和表面電位。經(jīng)測(cè)定，1mg/mL的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的粒徑和表面電位，分別為57.6nm和36.8mV。
3)殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)細(xì)胞攝取采用異硫氰基熒光素(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記殼寡糖-硬脂酸嫁接物，進(jìn)行殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的亞細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)研究。取殼寡糖-硬脂酸嫁接物20mg，精密稱定后溶解于2.4mL的50％甲醇溶液中。另取5.0mg異硫氰基熒光素，精密稱定后溶解于5.0mL乙醇。取0.5mL FITC的乙醇溶液與0.5mL蒸餾水混合，在冰浴、避光與磁力攪拌條件下，將殼寡糖-硬脂酸嫁接物的甲醇溶液，滴加到FITC乙醇溶液中，繼續(xù)反應(yīng)24小時(shí)后，使用蒸餾水透析(MWCO 10,000)24小時(shí)，最終得FITC標(biāo)記殼寡糖-硬脂酸嫁接物，避光保存?zhèn)溆谩?br> 分別取MCF-7和MCF-7-adr細(xì)胞，在含有10％小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)(5％CO2，37℃孵箱)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，pH7.4的PBS潤(rùn)洗后，加入胰酶消化并用培養(yǎng)液稀釋，按每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度，接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，孵箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)。24孔培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，棄去舊培養(yǎng)液，PBS潤(rùn)洗2次后，分別加入新鮮培養(yǎng)液1mL及FITC標(biāo)記殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液(終濃度200μg·mL-1)。孵育一定時(shí)間后，用PBS沖洗細(xì)胞2次，置熒光倒置顯微鏡觀察并拍照。分別與MCF-7和MCF-7-adr細(xì)胞孵育3小時(shí)后，嫁接物膠團(tuán)的細(xì)胞攝取熒光顯微鏡照片見(jiàn)圖1，其中A圖為MCF-7細(xì)胞攝取照片，B圖為MCF-7-adr細(xì)胞的攝取照片。
4)殼寡糖-硬脂酸嫁接物載藥膠團(tuán)制備稱取殼寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，加水5ml溶解。于磁力攪拌下，逐滴滴入阿霉素二甲亞砜溶液適量，使阿霉素的投藥量為1.5％。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，轉(zhuǎn)移至透析袋中，外相為水，透析24小時(shí)除去二甲亞砜。將透析液加適量水定容至10ml，使殼寡糖-硬脂酸嫁接物的終濃度為1mg/mL。將透析液繼續(xù)以4000rpm離心10min，除去尚未增溶的阿霉素，得載藥膠團(tuán)。取載藥膠團(tuán)分散液適量，以微粒粒度與表面電位測(cè)定儀，測(cè)定載藥膠團(tuán)的粒徑及表面電位。
經(jīng)測(cè)定，殼寡糖-硬脂酸嫁接物載藥膠團(tuán)的粒徑為76.1nm，表面電位為35.2mV。藥物包封率為56.5％。
5)殼寡糖-硬脂酸嫁接物載藥膠團(tuán)的抗腫瘤藥效及逆轉(zhuǎn)耐藥腫瘤細(xì)胞的耐藥性本發(fā)明以腫瘤細(xì)胞抑制率，評(píng)價(jià)殼寡糖-脂肪酸嫁接物載藥膠團(tuán)的抗腫瘤藥效，以及對(duì)耐藥腫瘤細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)效率。具體方法為分別以乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)及其耐藥細(xì)胞(MCF-7-adr)為模型細(xì)胞，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μL含5×103個(gè)MCF-7細(xì)胞或MCF-7-adr細(xì)胞的培養(yǎng)液，置37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)24小時(shí)。待細(xì)胞完全貼壁后，細(xì)胞孔中分別加入不同濃度的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液、殼寡糖-硬脂酸嫁接物載藥膠團(tuán)溶液和阿霉素溶液，以未經(jīng)處理的空白細(xì)胞為對(duì)照，每孔設(shè)復(fù)孔。正常DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，每孔加5mg/mL噻唑蘭(MTT)溶液20μL，置于37℃、5％CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜150μL，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，并計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率采用下式計(jì)算細(xì)胞抑制率％＝(空白對(duì)照組吸光度-實(shí)驗(yàn)組吸光度)/空白對(duì)照組吸光度×100％經(jīng)計(jì)算，殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液、阿霉素溶液，以及殼寡糖-硬脂酸嫁接物載藥膠團(tuán)溶液，對(duì)MCF-7敏感和耐藥細(xì)胞的IC50(細(xì)胞半數(shù)致死率)值，見(jiàn)表1。
表1殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液、阿霉素溶液和殼寡糖-硬脂酸嫁接物載藥膠團(tuán)溶液，對(duì)MCF-7敏感和耐藥細(xì)胞的細(xì)胞毒性

研究結(jié)果表明，殼寡糖-硬脂酸嫁接物為低細(xì)胞毒性材料，阿霉素經(jīng)殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)包封后，可提高M(jìn)CF-7敏感細(xì)胞2.7倍的抗腫瘤療效，提高M(jìn)CF-7耐藥細(xì)胞87.8倍的抗腫瘤療效，并完全逆轉(zhuǎn)MCF-7耐藥細(xì)胞的耐藥性。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞核靶向給藥系統(tǒng)在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的分子靶標(biāo)位于細(xì)胞核的抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，細(xì)胞核靶向給藥系統(tǒng)由細(xì)胞核靶向給藥載體和被包封的抗腫瘤藥物組成，細(xì)胞核靶向給藥載體選用殼寡糖-脂肪酸嫁接物膠團(tuán)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種細(xì)胞核靶向給藥系統(tǒng)，在制備可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的分子靶標(biāo)位于細(xì)胞核的抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。細(xì)胞核靶向給藥系統(tǒng)由細(xì)胞核靶向給藥載體和被包封的抗腫瘤藥物組成，細(xì)胞核靶向給藥載體選用殼寡糖－脂肪酸嫁接物膠團(tuán)。本發(fā)明提供的殼寡糖－脂肪酸嫁接物載藥膠團(tuán)，細(xì)胞毒性低，具有快速透過(guò)細(xì)胞膜、很少被細(xì)胞內(nèi)溶酶體破壞、細(xì)胞核靶向的功能。通過(guò)嫁接物膠團(tuán)自身的疏水性內(nèi)核特性，可包封分子靶標(biāo)位于細(xì)胞核的疏水性抗腫瘤藥物，形成嫁接物載藥膠團(tuán)。在顯著提高抗腫瘤藥物療效的同時(shí)，逆轉(zhuǎn)耐藥腫瘤細(xì)胞的耐藥性。本發(fā)明為分子靶標(biāo)位于細(xì)胞核的藥物，提供一種靶向給藥載體材料。
文檔編號(hào)A61K45/00GK101066458SQ20071006915
公開(kāi)日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2007年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月31日
發(fā)明者胡富強(qiáng), 杜永忠, 袁弘, 游劍 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)