專利名稱：β-甲氧基丙烯酸酯類化合物作為新型STAT3抑制劑的醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有STAT3抑制劑活性的p-甲氧基丙烯酸酯、其異構(gòu)體，及含 有他們的藥物組合物在預防或治療惡性腫瘤、愛滋病和炎癥，及終止意外妊娠 等中的應(yīng)用，或作為用于研究腫瘤生長、增殖、分化和凋亡，及STAT3相關(guān)信 號轉(zhuǎn)導通路的工具藥的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
卩-曱氧基丙烯酸酯是一類新型殺菌劑，主要用于農(nóng)業(yè)(如谷物、水果和蔬菜 等)殺真菌。最早為天然產(chǎn)物，如嗜球果傘素類最簡單的是嗜球果傘素 A(Strobilurin)。之后，^目繼出現(xiàn)4b學合成品，如密菌醋(Azoxystrobin)和咬 氧菌酯(Picoxystrobin)，及嘧螨酯(Fluacrypyrim， FAPM)等。其中，嘧螨酯FAPM 為殺螨劑和殺線蟲劑，主要用于蔬菜和水果。p-甲氡基丙烯酸酯是主要的Q。抑制型殺菌劑。通過與細胞色素b的Q。位點 結(jié)合，阻斷細胞色素b和細胞色素cl間的電子轉(zhuǎn)移及質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)移，從而抑制 線粒體呼吸作用，阻斷ATP合成，結(jié)果導致能量循環(huán)中止，進而起到廣譜殺菌 作用。此外，也有報道苯基-P-甲氧基丙烯酸酯具有抗疾作用。 信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄活化因子(STATs)是一類因?qū)Χ喾N細胞因子和生長因子應(yīng) 答所活化的后期胞漿轉(zhuǎn)錄因子家族。STATs的活化依賴于酪氨酸磷酸化，后者通 過二分子STAT間的磷酸化酪氨酸與Src同源結(jié)構(gòu)域2 (SH2)相互作用引起STAT 二聚體化，進而轉(zhuǎn)位到細胞核，在此與耙基因的同感啟動子序列結(jié)合，并活化其轉(zhuǎn)錄。其耙基因包括細胞周期調(diào)節(jié)因子(如細胞周期素Dl與3、 p19、 p21和 p27，及c-myc)、抗凋亡基因(如存活素、Bcl-2、 Bc卜xl、 TIMP1和Mcl-1)、促 血管生成因子(國Ps和VEGF)及其它。目前已鑒定的STATs有7種STAT1-4、 5a、 5b和6。研究表明，正常細胞的STAT酪氨酸磷酸化是暫時的，持續(xù)約半小 時到數(shù)小時。但是，許多癌衍化細胞系或原發(fā)腫瘤中，STAT蛋白(告別是STAT3) 持久地磷酸化?；罨腟TAT3能引起非死亡細胞分化，具有癌原性作用，還涉 及癌細胞侵潤中病灶粘附和化學致癌中原始成瘤。而在腫瘤衍化細胞中，通過 應(yīng)用反義核酸、小干擾RNA (siRNA)、 STAT3負性決定蔟，和/或阻滯酪氨酸激 酶(TK)，及肽、肽;f莫擬物或小分子的STAT3抑制劑來抑制STAT3活性，則可導 致這些細胞的生長抑制和凋亡。因此，STAT3介導的信號轉(zhuǎn)導通路的活化對細胞 的生長與存活非常重要；阻斷STAT3信號通路可成功導致肺瘤細胞生長抑制和 凋亡。STAT3是一個發(fā)展新型癌癥治療的誘人的分子耙標[Curr Cancer Drug Targets, 2007， 7(1): 91—107; Nat Med， 2005， 11 (6): 595—6]。 基因敲除 和小分子抑制劑研究表明，抑制STAT3信號轉(zhuǎn)導的抗癌策略的優(yōu)點在于抑制 STAT3信號通路可多種抗腫瘤免疫活性一樹突狀細胞、T細胞、NK細胞和嗜中性 細胞的活性顯著增強，引起T細胞依賴的和NK細胞依賴的對已惡化的腫瘤抑制 作用和腫瘤退化(Nat Med， 2005， 11: 1314-21);產(chǎn)生多藥(如紫杉醇和鉑劑等) 抗性的腫瘤常伴有IL6表達明顯升高和磷酸化STAT3表達顯著增大，腫瘤的多 藥抗性(MDR)與免疫介導的細胞因子(特別是IL6)旁分泌活化STAT3信號通路 相關(guān)，阻斷STAT3信號通路可逆轉(zhuǎn)肺瘤對紫杉醇等化療藥物多藥抗性(Clin Cancer Res， 2006， 12 (17): 5055-63)。還有研究表明，抑制子宮內(nèi)膜STAT3 的活化可抑制受精卵的著床，可發(fā)展非甾體避孕藥[Proc Natl Acad Sci USA (PNAS)， 2005， 102 (24): 8585-90]。此外，抑制STAT3信號通路也可能成為炎癥和HIV的預防與治療的有效策略[Curr Cancer Drug Targets, 2007， 7(1): 91-107]。總之，STAT3抑制劑可發(fā)展成為廣語抗癌藥、非甾體事后避孕藥、消 炎藥、和抗愛滋病藥等。因此，研究與開發(fā)具有STAT3抑制劑活性的小分子藥 物是十分重要的。從化學結(jié)構(gòu)來看，目前已報道的小分子STAT3抑制劑總體可分為五大類 (l)天然產(chǎn)物及其衍生物，包括a，p-不飽和酮類(如姜黃素、2-環(huán)戊烯柄衍生物和 cucurbitacin類)、黃酮胺衍生物(f lavopiridol)、含多個酚羥基的反式1， 2-二苯乙烯類(resvera- trol)、三碎類似物(如CDDO-Im、 cucurbitacin I/JSI-124 和cucubitacin Q)、多環(huán)酮類(如deoxytetrangomycin/ STA-21) 、 N-高級月旨肪 酰高絲氨酸內(nèi)酯和3-烯-2-吲哚酮類(indirubin衍生物)等；(2) 3-芳基丙烯腈 類(tyrphostins)，如如AG490和WP1066; (3)柏配合物如CPA-7; (4)肽模擬 物(pept idomimet ics)，包括三肽書f生物(如N-芳?；?0-磷酰基酪氨酰亮氨酸)、 HIV 4中制齊'j (如nelf inavir、 saquinavir和ritonavir, 4爭另'J是nelf inavir); 和(5)氮雜螺環(huán)化合物如SK&F 106615 [Curr Cancer Drug Targets, 2007, 7 (1): 91-107]。此外，還有一些多環(huán)酮化合物如SD-1029,石克雜茚衍生物如stattic。 從作用機制來說，STAT3抑制劑可分為五大類(1)以STAT上游信號分子和信號 通路包括EGFR、 JAK、 Src和c-Kit等受體激酶和非受體激酶為靶標，特別JAK2 抑制劑等非特異性調(diào)節(jié)劑如AG490、 WP1066和piceatannol及Src抑制劑E804 等；(2)作用于STAT 二聚體化及其轉(zhuǎn)運入核如SD-1029和STA-21; (3)影響STAT3 與靶基因DNA的結(jié)合如CPE-7和CMP-6; (4)干擾STAT3的表達；和(5)作用于 STAT3的負反々貴回路(J Mol Med， 2007， doi 10.1007/ s00109—006—0152—3)。 但仍未見有p-甲氧基丙烯酸酯類STAT3抑制劑的報道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于尋找和發(fā)現(xiàn)可用于惡性肺瘤靶向預防或治療的新型STAT3抑制劑。在本發(fā)明人進行抗腫瘤藥物的研究中發(fā)現(xiàn)，式I所示的化合物是新型STAT3 抑制劑，對多種腫瘤細胞系具有明顯的抑制作用。進一步的研究表明，式I所 示的化合物對腫瘤細胞周期具有顯著的G。-Gi期抑制作用，且對STAT3磷酸化具 有明顯的抑制作用。本發(fā)明就是基于這一發(fā)現(xiàn)得以完成。本發(fā)明的第一方面涉及通式I所示的化合物、其異構(gòu)體在制備可用于預防 或治療惡性肺瘤、愛滋病和炎癥，及中止意外懷孕的藥物中用途，或作為用于 研究腫瘤生長、增殖、分化和凋亡，及STAT3相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路的工具藥的應(yīng) 用，<formula>formula see original document page 6</formula>其中!^代表苯氧基、取代的苯氧、雜芳氧基、取代的雜芳氧基；苯胺基、取代 的苯胺基、雜芳胺基、取代的雜芳胺基；其中所述的雜芳環(huán)為1-3選自N、 0或 S雜原子單環(huán)或稠環(huán)芳香烴基，每個帶有取代基的基團之取代基選自鹵素、羥基、 、硝基、d—6烷基、Cw烷lL^、 d—6烷硫基、一、二或三卣代的d—6烷基、氨 基、d—6烷胺基、Cw。烴酰氡基、d—:。烴酰胺基、CH。芳酰氧基或Cw。芳酰胺基；R2為C廣C6烴基；R3為C廣C6烷基。本發(fā)明的第二方面涉及藥物組合物，其中含有至少一種通式I所示的化合 物、其異構(gòu)體及藥用栽體或賦形劑在制備可用于預防或治療惡性腫瘤、愛滋病和炎癥，及中止意外懷孕的藥物中用途，或作為用于研究腫瘤生長、增殖、分化和凋亡，及STAT3相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路的工具藥的應(yīng)用。本發(fā)明再一方面涉及預防或治療惡性腫瘤、愛滋病和炎癥，及中止意外妊 娠的方法，其包括對惡性腫瘤、愛滋病和炎癥患者或意外M者給予有效量的 式I所示的化合物、其異構(gòu)體。


圖1表示實施例化合物l(FAPM)對FAPM對細胞內(nèi)STAT家族、PI3/Akt及 MAPK信號途徑各信號分子表達水平的影響圖2代表FAPM及其3個類似物降低STAT3磷酸化的時間、劑量效應(yīng)以及對 STAT3下游分子的調(diào)控情況圖3表示FAPM及其類似物對白血病細胞HL-60的增殖抑制作用圖4代表FAPM對HL-60細胞周期的影響圖5表示FAPM對細胞周期G1期調(diào)控蛋白的表達的影響具體實施方式
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明中所用術(shù)語"惡性腫瘤"是指已經(jīng)惡變的腫瘤，包括 血液腫瘤、腺瘤和實體瘤，如白血病、淋巴癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、頸 與腦癌等。根據(jù)本發(fā)明，通式I所示的化合物，！^優(yōu)選為苯氧基、取代的苯氧、雜芳 氧基、取代的雜芳氧基；苯胺基、取代的苯胺基、雜芳胺基、或取代的雜芳胺 基；其中所述的雜芳環(huán)為l-3選自N、 0或S雜原子單環(huán)或稠環(huán)芳香烴基，每個 帶有取代基的基團之取代基選自卣素、羥基、 、硝基、C卜6烷基、d—6烷lL^、d—6烷硫基、一、二或三卣代的Cw:^、 #J^、 Cw烷胺基、d—!。烴酰氧基、d—10 烴酰胺基、CH。芳酰氡基或(V,。芳酰胺基； W為曱基或乙基；^為曱基或乙基。根據(jù)本發(fā)明通式I所示的化合物，R'更優(yōu)選為2-異丙fu^-6-三氟曱基嘧啶 -4-氧基，或3,4-二氫-2-異丙氧基-4-氧-6-三氟曱基嘧咬-l-基；W和r均為甲 基。在本發(fā)明中的一個優(yōu)選實施方案中，所述的W為2-異丙|1^-6-三氟甲基 嘧咬-4-氡基，W和ie均為曱基，且雙鍵的構(gòu)型為反式。根據(jù)本發(fā)明，式I化合物可以存在順/反異構(gòu)體，本發(fā)明涉及順式形式和反 式形式以及這些形式的混合物。如果需要，單一立體異構(gòu)體的制備可根據(jù)常規(guī) 方法拆分混合物，或通過例如立體選擇合成制備。如果存在機動的氬原子，本 發(fā)明也涉及式I化合物的互變異構(gòu)形式。根據(jù)本發(fā)明，式I化合物及其立體異構(gòu)體在預防或治療惡性肺瘤、愛滋病 和炎癥，及中止意外妊娠等中顯示優(yōu)良效果。因此可作為預防或治療惡性腫瘤， 及中止意外 等的藥物用于動物，優(yōu)選用于哺乳動物，特別是人。本發(fā)明因此還涉及含有作為活性成份的有效劑量的至少一種式I化合物， 或其藥用鹽和/或其立體異構(gòu)體以及常規(guī)藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常 本發(fā)明藥物組合物含有0.1-90重量％的式I化合物和/或其生理上可接受的 鹽。藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備。用于此目的時，如果需要，可 將式I化合物和/或立體異構(gòu)體與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑 結(jié)合，制成可作為人用的適當?shù)氖┯眯问交騽┝啃问?。本發(fā)明的式I化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥 途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜 或直腸等。給藥劑型例如片劑、膠嚢、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、 混懸劑、乳劑、顆粒劑、脂質(zhì)體、透皮劑、口含片、栓劑、凍干粉針劑等?？?以是普通制劑、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將單位給藥劑 型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于栽體的例子是，例如 稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸釣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤劑與粘合劑，如 水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、 阿拉伯膠漿、明膠漿、羧曱基纖維素鈉、紫膠、曱基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯 吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫 鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖 維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫 化油等；吸收促進劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、 二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片 劑進一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和 多層片。為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān) 于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫 化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑如阿拉伯 膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、 干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、曱基纖維素、乙基纖維素等。為了將 給藥單元制成栓劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是， 例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級醇、高級醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將給藥單元制成膠嚢，將有效成分式I化合物或其立體異構(gòu)體與上述 的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明明膠嚢或軟膠嚢中。也可將有效成分式I化合物或其立體異構(gòu)體制成微嚢劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混 懸劑，亦可裝入硬膠嚢中或制成注射劑應(yīng)用。為了將給藥單元制成注射用制劑， 如溶液劑、乳劑、凍干粉針劑和混懸劑，可以^_用本領(lǐng)域常用的所有稀釋劑， 例如，水、乙醇、聚乙二醇、1， 3-丙二醇、乙氧基化的異石更脂醇、多氧化的 異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向 注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助 溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、 甜味劑或其它材料。本發(fā)明式I化合物，或其異構(gòu)體的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預防或治療疾病的性質(zhì)和嚴重程度，患者或動物的性別、年齡、體重及個體反應(yīng)，所用的具體化合物，給藥途徑及給藥次數(shù)等。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個，例如二、三或四個劑量形式給藥。本發(fā)明可通過下列實施例得到進一步說明，但這些實施例子不意味著對本 發(fā)明的任何限制。實施例1 (E)-3-曱氧基-2-[2-(2-異丙氧基-6-三氟甲基嘧咬-4-氧基) 苯基]丙烯酸曱g旨(化合物1， Fluacrypyrim, FAPM)的制備(1) 鄰曱基苯乙酸曱酯稱取7. 5g(0. 05mol)鄰甲基苯乙酸，溶于75mL無水 甲醇，攪拌下加入0. lmL硫酸，加熱回流反應(yīng)2小時，然后冷卻，減壓回收 溶劑，加入30mL二氯曱烷和20mL水，分液，水層以15mL 二氯甲烷再提取一 次，合并二氯曱烷溶液，水洗滌一次，無水碌u酸鈉干燥，濾去回固體，回收 溶劑，得無色液體?？芍苯佑糜谙乱徊椒磻?yīng)。(2) 3-羥基-2-(2-甲基苯基)-2-丙烯酸甲酯稱取2. 50g(0. 062mol)氪化鈉， 懸浮于25mL干燥四氫呋喃中，水水冷卻下及攪拌下加入20mL經(jīng)無水碳酸鈉 干燥的甲酸曱酯，然后再滴加溶有上步制備的產(chǎn)物的20mL干燥四氫呋喃溶液， 滴畢，使自然升溫為室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)5小時，然后減壓回收溶劑，冷卻， 以3N鹽酸酸化至pH3-4， 二氯曱烷提取，水洗滌，無水碗b酸鈉干燥，濾去固 體，回收溶劑，即得淺黃色液體?？芍苯佑糜谙乱徊椒磻?yīng)。(3) (Z)-3-甲氧基-2-(2-曱基苯基)-2-丙烯酸甲酯將上一步制備的產(chǎn)物溶 于50mL丙酮，加入5mL硫酸二曱酯，攪拌下加入8. Og無水碳酸鉀，攪拌加 熱回流100分鐘，然后冷卻，濾去固體，回收溶劑，再以45mL乙醚提取，稀 氨水洗滌，再水洗三次，無水辟b酸鈉干燥，濾去固體，回收溶劑，得黃色液 體，可直接用于下一步反應(yīng)。(4) (E) -3-曱lL^-2- (2-溴曱基苯基)-2-丙烯酸曱酯(中間體1):將上一步制 備的產(chǎn)物溶于75mL干燥的四氯化碳，攪拌下加入lOg N-溴代丁二酰亞胺和約0. 3g偶氮二異丁腈，攪拌回流反應(yīng)4小時，然后冷卻，濾去固體，四氯化碳 洗滌，合并，回收溶劑，冷卻，加入水250mL，以二氯曱烷300mLx2提取， 合并提取液，水洗一次，無水碌^酸鈉干燥，回收溶劑，加入乙醚-石油醚結(jié)晶， 活性>^色，得黃色固體，10. 75g， mp 94-96X:。 'H-麗R (CDC13， ppm)5: 3. 7066 (s， 3H)， 3. 8372 (s， 3H)， 4.4092 (s， 2H)， 7.10-7. 20 (m， 1H)， 7. 30—7. 40 (m， 2H) ， 7. 45—7. 50(m， 1H)， 7. 6402 (s， 1H)。(5) O-異丙基異脲鹽酸鹽(中間體2):稱取決8. 4g (0. lOmol) 50%氰胺水溶液， 加入40mL異丙醇，在攪拌下滴加入8. 3mL濃鹽酸(12N， 0. lOmol)，加畢，立 即升溫到85。C，回流反應(yīng)40分鐘，降溫到50。C以下，減壓蒸干，殘留物以 異丙醇重結(jié)晶，不溶物濾去，析出的無色方塊狀晶體，得4.16g,收率30.1%, mp 94-96X:。(6) 4-羥基-2-異丙氧基-6-三氟甲基嘧啶(中間體3):稱取1. 65g(0. 072mol) 鈉，溶于10mL無水曱醇，在攪拌及水水冷卻下滴加到溶有9. 48g (0. 068mol) 中間體2的240mL無水乙醇溶液，滴畢，繼續(xù)攪拌15分鐘，然后于7(TC油浴 中加熱，再滴加lOmL三氟乙酰乙酸乙酯，滴畢，攪拌回流反應(yīng)過夜(12小時 以上)，減壓濃縮，冷卻，加入20mL水，以鹽酸酸4匕至pH3，再以乙醚35mLx2 提取，合并，水洗，無7jc琉酸鈉干燥，濾去固體，回收溶劑，以石油醚結(jié)晶， 先得白色固體9. 70g, mp 129-131°C;母液濃縮，補加石油瞇，又得固體11. 5g， mpl27-129"C; ^一NMR (CDC13， ppm)5: l眉6(d， J=6. 4Hz， 6H)， 5. 30-5. 50(m 1H), 6.5777 (s， 1H)， 11.6691 (br， 1H)。(7) (E)-3-甲氣基-2-[2-(2-異丙lL^-6-三氟甲基嘧咬-4-氧基)苯基]丙烯酸甲 酯(化合物l， Fluacrypyrim):稱取7. 25g (0. t)33mo1)中間體3和7. OOg (0. 051mol)無7jc碳酸鉀，加入50mL丙嗣和1. Olg硫酸氬化四丁基銨，于40匸油浴中加熱及攪拌下，滴加溶有9. (0. 032mol)中間體1的20mL 丙酮溶液，再升溫至50"C，攪拌反應(yīng)過夜。次日，冷卻，濾去固體，丙酮洗 滌，合并丙酮溶液，回收溶劑，然后加入水，乙醚35mLx2提取，合并，水洗， 無7jo;克酸鈉干燥，濾去固體，回收溶劑，石油醚結(jié)晶，得淺黃色固體，先得 5. 50g，母液濃縮，柱層析，取第一主點，又得1. 45g，共6. 95g。力-薩R (CDC13, ppm) 5: 1. 399 (d， J=6. OlHz， 6H), 3. 6755 (s， 3H), 3. 8057 (s， 3H)， 5.25—5. 32 (m， 1H)， 5. 3259 (s， 2H) ， 6. 6289 (s， 1H), 7. 18-7. 21 (m， 1H), 7.35-7. 40(m， 2H) ， 7.48—7.51(m， 1H), 7.5561 (s， 1H) 。 mp 108-110。C。 實驗例2 (E)-3-甲絲-2-[2-(3， 4-二氫-2-異丙錄-4-氧-6-三氟甲基 嘧咬-1-基)苯基]丙烯酸曱酯(化合物2， IFAPM)的制備(1)-(6)步同化合物1的制備，第(7)步操作基本與化合物1的相同，只是要 分離的目標產(chǎn)品是在柱層析分離化合物l后第二(后)主點，得5.85g， mp 94-96 。C。 1H-NMR(CDC13， ppm) 5:1. 089 (br-s， 6H), 3. 621(s，3H)， 3. 843(s, 3H)， 4.90(br-s， 1H)， 5. 231(m， 2H), 6. 457 (s， 1H)， 7. 09—7.15(m, 2H), 7. 24-7. 29 (m, 2H) ， 7. 484(s, 1H)。下面的生物活性實驗用來進一步說明本發(fā)明。生物效應(yīng)實驗1 FAPM對細胞內(nèi)STAT家族、PI3/Akt及MAPK信號途徑各 信號分子表達水平的影響圖1表示了 FAPM對細胞內(nèi)STAT家族、PI3/Akt及MAPK信號途徑各信號分 子表達水平的影響。如圖la: FAPM處理24h后誘導phospho-Stat3""，)蛋白水 平的劑量依賴性降低，而phospho-Stat5(一")只在高劑量FAPM處理后表達水平 才有明顯降低，phospho-Statl"y，)表達水平則無明顯改變。另外，F(xiàn)APM對p-Akt和MAPK途徑的各信號分子p-ERK1/2, p-p38， p-JNK的表達水平均沒有明顯的 影響(圖lb ),結(jié)杲提示FAPM可能通過特異性抑制STAT3途徑發(fā)揮細胞內(nèi)效應(yīng)，而對PI3/Akt及MAPK途徑?jīng)]有作用。生物效應(yīng)實驗l研究方法Western Blotting檢測方法。各劑量FAPM處理細胞24h后收集細胞，用冰冷的PBS洗一次，加入預冷的細胞裂解液(106cells/50jil)。將收集的細胞裂解液在4X:水浴45min，使細胞徹底裂解，隨后12000rpm、 4。C離心5min，取部分上清液，用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，取20ug蛋白提取液，加入等量2 x SDS凝膠上樣buffer混勻，煮沸5min變性蛋白，冷卻后進行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后穩(wěn)流160mA lh將蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。然后將膜轉(zhuǎn)入平m中，5%的脫脂牛奶封閉lh, TBS/T洗3次x 5min,適當比例的一抗稀釋液孵育過夜，用TBS/T洗4次x 5min,相應(yīng)的適當比例二抗稀釋液再孵育lh, TBS/T洗4次x 5min， LumiGLO substrate孵育lmin， X光片感光顯影。生物效應(yīng)實驗2 FAPM抑制STAT3砩酸化作用的時間、劑量效應(yīng)以及對 STAT3下游分子的調(diào)控圖2代表了 FAPM降低STAT3磷酸化的時間、劑量效應(yīng)以及對STAT3下游分 子的調(diào)控情況。如圖2a所示3jnM FApM在6h時就能明顯謗導HL-60細胞內(nèi) phospho-Stat3""7。5)表達降低，隨著劑量的增大和處理時間的延長 phospho-Stat3(w)表達水平降低更加明顯，而FAPM處理并不影響STAT3總蛋 白的表達。同時檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)APM的類似物沒有明顯降低phospho-Stat3""則的 作用(如圖2b)。通過對受STAT3調(diào)控的下游基因表達進行檢測發(fā)現(xiàn)(圖2C),FAPM處理后可i秀導下游周期調(diào)控蛋白c-Myc以及CyclinDl的水平降低，但對凋 亡相關(guān)蛋白BC-xL和Mcl-1的表達水平?jīng)]有明顯影響。結(jié)果提示FAPM對細胞 周期的調(diào)節(jié)作用可以抑制持續(xù)的STAT3激活，降低細胞內(nèi)c~Myc以及CyclinDl 等周期調(diào)控蛋白的表達水平；FAPM可特異性細胞內(nèi)STAT3信號轉(zhuǎn)導通路。 生物效應(yīng)實驗2研究方法同實驗l。生物效應(yīng)實驗3 FAPM及其類似物對白血病細胞HL-60的增殖抑制作用 如圖3所示3a圖為FAPM及3個類似物IFAPM、 FAPMA、 HTFPMPA的結(jié)構(gòu)， 3b圖用MTT法檢測FAPM及其類似物對白血病細胞HL-60的增殖抑制作用。在各 化合物不同濃度(0-48 一)處理HL-60細胞48h后，結(jié)果表明FAPM顯著抑制 HL-60細胞的增殖，具有劑量依賴效應(yīng)，而其3個類似物對HL-60細胞的增殖抑 制作用較弱，只有化合物IFAPM在高劑量時能夠抑制細胞增殖。為了進一步確 證上述增殖抑制效應(yīng)，通過臺盼藍染色計數(shù)法觀察FAPM誘導HL-60細胞增殖抑 制的時間和劑量效應(yīng)，如圖3c:與對照相比，低劑量O. 75 FAPM處理12h就 能觀察到明顯的增殖抑制效應(yīng)，3-12 jiM FAPM處理后的各個時間點細胞幾乎不 增殖。上述結(jié)果顯示化合物FAPM處理HL-60細胞后可強烈誘導時間、劑量依賴 性的增殖抑制效應(yīng)。生物效應(yīng)實驗3的研究方法細胞增殖能力檢測(MTT):通過計數(shù)將細胞濃 度調(diào)至107ml,加入細胞懸液至96孔板中，將化合物FAPM、 IFAPM、 FAPMA、 HTFPMPA 設(shè)置不同濃度后分別加入96孔板細胞懸液中，并置于細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h， 隨后力口入3-(4， 5-dimethylthiazol-2-y1)-2， 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)染色劑再培養(yǎng)4-5h，用10。yiSDS終止反應(yīng)，過夜溶解后于酶標分析儀570nm 波長處測定OD值；臺盼藍染色計數(shù)將細胞調(diào)整為5， 000/cm2 / 60-咖培養(yǎng)臟， 加入O. 75-12 nM劑量的化合物FAPM與細胞共同孵育分別培養(yǎng)12、 24、 36、 48、72h，然后收集細胞懸液加入O. W臺盼藍溶液l(Ha/ml,用毛細吸管吸少許混合液 置細胞計數(shù)板，并在顯微鏡下計算未被染色(即存活)的細胞數(shù)。重復三次求算 平均值及標準差.生物效應(yīng)實驗4 FAPM對HL-60細胞周期的影響如圖4所示4a圖觀察了從6—48h不同時間點不同劑量FAPM處理后HL-60 細胞周期改變情況，從結(jié)果可以看出低劑量FAPM(0.75一)處理后各時間點的 細胞幾乎都出現(xiàn)少許S期升高現(xiàn)象，隨著劑量的增加這種現(xiàn)象逐漸消失；從12h 開始1.5-12 pM的FAPM就可誘導細胞Gl期升高，隨著時間的增長G1期升高 的效應(yīng)呈現(xiàn)穩(wěn)定不可逆的趨勢，并伴隨有G2/M期和S期的明顯下降。但是其他 幾個類似物對細胞周期進展沒有顯著影響(圖4b)。生物效應(yīng)實驗4研究方法收集FAPM及其幾個類似物不同時間和劑量處理后 的細胞，用PBS洗3次，1000rpm離心5min，倒去上層PBS， 700^1 70%乙醇4匸固 定過夜。次日1000rpm離心5min,用PBS洗一次，加入lmg/ml RNAse于37X:孵育 30min，然后加propidium iodide (PI) 50ug/ml, ; 充式細Jife儀上;tM^效寸。生物效應(yīng)實驗5 FAPM^細胞周期G1期調(diào)控蛋白的表達的影響如圖5所示為了進一步檢測Gl期阻滯，用Western Blotting方法，見察 了細胞周期G1期調(diào)控蛋白的表達變化情況。實驗中提取不同劑量FAPM(3-12 p M)處理后24h HL-60全細胞蛋白，結(jié)果顯示FAPM處理細胞后誘導CyclinDl 發(fā)生明顯的劑量依賴性的表達水平下調(diào)，同時Rb""8。"811)， CyclinD3， CDK4的表 達水平也明顯降低，而其它蛋白包括Rb""795)， CDK6以及CyclinE2蛋白的表達 水平?jīng)]有變化。結(jié)果提示Cycl固，CyclinD3， CDK4， phospho-Rb(s"8°7/m)蛋 白表達水平下調(diào)可能是化合物FAPM誘導細胞G1期阻滯的重要作用環(huán)節(jié)。 生物效應(yīng)實驗5研究方法同實驗l。
權(quán)利要求
1. 涉及通式I所示的化合物、其異構(gòu)體在制備可用于預防或治療惡性腫瘤、愛滋病和炎癥，及中止意外懷孕的藥物中用途，或作為用于研究腫瘤生長、增殖、分化和凋亡，及STAT3相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路的工具藥的應(yīng)用，其中R1代表苯氧基、取代的苯氧、雜芳氧基、取代的雜芳氧基；苯胺基、取代的苯胺基、雜芳胺基、取代的雜芳胺基；其中所述的雜芳環(huán)為1-3選自N、O或S雜原子單環(huán)或稠環(huán)芳香烴基，每個帶有取代基的基團之取代基選自鹵素、羥基、氰基、硝基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、一、二或三鹵代的C1-6烷基、氨基、C1-6烷胺基、C1-10烴酰氧基、C1-10烴酰胺基、C6-10芳酰氧基或C6-10芳酰胺基；R2為C1-C6烴基；R3為C1-C6烷基。
2、 如權(quán)利要求l應(yīng)用，其中，所述的R2和R3為甲基或乙基。
3、 如權(quán)利要求l應(yīng)用，其中，所述的R2和R3為甲基；R,為2-異丙氧基-6-三氟曱基嘧咬-4-lLi^ 3， 4-二氫-2-異丙氧基-4-氧-6-三氟曱基嘧咬-1-基.
4、 如權(quán)利要求1應(yīng)用，其中，所述的化合物為(E)-3-曱^J^-2-[2-(2-異 丙lL^-6-三氟甲基嘧咬-4-氧基)苯基]丙烯酸甲酯.
全文摘要
本發(fā)明涉及具有STAT3抑制劑活性的通式I所示化合物、其異構(gòu)體，及含有他們的藥物組合物在預防或治療惡性腫瘤、艾滋病和炎癥，及終止意外妊娠等中的應(yīng)用，或作為用于研究腫瘤生長、增殖、分化和凋亡，及STAT3相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路的工具藥的應(yīng)用。
文檔編號A61K31/505GK101269076SQ20071008712
公開日2008年9月24日 申請日期2007年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月22日
發(fā)明者從玉文, 余祖胤, 善亞君, 楊日芳, 趙振虎, 陳家佩, 銳 黃 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所