專利名稱：一種含有從桑黃中提取的活性物質(zhì)的藥物組合物、制備方法及其在制備藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物組合物、制備方法及其在制備藥物中的應(yīng)用，具體講涉及一種含有從桑黃中提取的活性物質(zhì)的藥物組合物、制備方法及其在制備抗癌藥物、免疫調(diào)節(jié)藥物、降血壓藥物及降血糖藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
桑黃作為中藥材在中國早有記載，其子實(shí)體入藥，味微苦，能利五臟，軟堅(jiān)，排毒，止血，活血；多用于和胃止瀉，淋病，崩漏帶下，脾虛泄瀉等癥。在韓國、日本和東南亞國家也作為汗方治療腸胃病、淋巴疾病及各種癌癥。日本最早對(duì)桑黃的抗腫瘤作用進(jìn)行了研究，Ikekawa T，Nakanishi等人(Chem.Pharm.Bull.1995.43(12)2105-2108)在1968年進(jìn)行的真菌抗腫瘤的研究中，對(duì)包括云芝Coriolus versicolor和桑黃等在內(nèi)的擔(dān)子綱真菌用肉瘤180對(duì)ICR小鼠進(jìn)行了抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在11種擔(dān)子綱真菌中，桑黃提取物對(duì)腫瘤的抑制率最強(qiáng)，達(dá)到96.7％，而且這種水萃取物對(duì)肉瘤180細(xì)胞不表現(xiàn)細(xì)胞毒性。韓國在80年代開始對(duì)桑黃進(jìn)行正式研究并在菌種培養(yǎng)、分離純化、成分分析、藥效、藥理作用及作用機(jī)制等方面取得了豐碩的成果，1984年，韓國制藥公司成功取得桑黃菌絲體的培養(yǎng)許可；1993年韓國政府正式許可桑黃成為菌類抗癌藥品。
國際專利申請(qǐng)WO0151070公開了通過分子篩法處理木層孔菌屬菌類的熱水或低級(jí)醇萃取物，收集分子量6,000-60,000部分的活性物質(zhì)，該活性物質(zhì)顯示抗癌作用、免疫激活作用、抗氧化作用、降低血壓和血糖作用等生理作用。但并未給出這種活性物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)，也未給出其藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
國際專利申請(qǐng)WO0160385公開了從裂蹄木層孔菌屬(Phellinus linteus)提取的多糖PL用于治療糖尿病的新用途。PL是對(duì)桑黃菌絲體培養(yǎng)物的熱水萃取物進(jìn)行了醇沉、二乙氨基乙基-纖維素柱層析和凝膠滲透柱層析的提純(Chem.Pharm.Bull.，43(12)，2105-2108，1995)。用凝膠滲透HPLC法分析，發(fā)現(xiàn)其為含13.2％肽和82.5％糖的基本純物質(zhì)，其中6.8％的多糖為糖醛酸。凝膠色譜顯示PL的分子量為153KD。PL含有7.0％阿拉伯糖，3.7％木糖，21.1％葡萄糖，24.1％半乳糖，44.2％甘露糖，同時(shí)含有以谷氨酸和天冬氨酸為主的十種氨基酸。此雜多糖對(duì)B淋巴細(xì)胞的激活濃度為3μg/ml，此化合物保持完整結(jié)構(gòu)和其多糖部分對(duì)活性是至關(guān)重要的。PL具有增強(qiáng)免疫，抗腫瘤、抗病毒及抗氧化的作用是已知的(Journal of biochemistry and molecular biology34(2001)2144-149；Carcinogenesis 23(2002)71163-1169；Internationalimmunopharmacology 3(2003)91281-1292；Biotechnology Letters25(2003)242093-2096；Biotechnology Letters25(2003)2167-172；Biological&pharmaceuticalbulletin26(2003)101418-1423；Biological&pharmaceuticalbulletin26(2003)6823-831；)。但從桑黃菌絲體中提取的雜多糖藥效活性有待提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種藥物組合物，含有從桑黃子實(shí)體中提取的活性物質(zhì)及藥學(xué)上可接受的載體，此活性物質(zhì)具有抗腫瘤、抗病毒及增強(qiáng)免疫的活性。
本發(fā)明的另一目的是提供所述藥物組合物的制備方法。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述組合物在制備抗癌藥物、免疫調(diào)節(jié)藥物、降血壓藥物或降血糖藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的藥用組合物，所述組合物包含從桑黃中提取的活性物質(zhì)以及藥學(xué)上可接受的載體；所述活性物質(zhì)是由分子量11～15千道爾頓的多糖PT1與分子量17～23千道爾頓的蛋白多糖PT2以1∶1～1∶4的重量比相混合，所述桑黃是指針層孔菌Phellinus igniarius以及其同屬的Phellinus vaninii；Pheliinusbaumii；Phellinus linteus；Phellinus hartigii；Phellinus pini真菌的子實(shí)體。
本發(fā)明通過將從桑黃中提取的分子量11～15千道爾頓的多糖PT1和分子量17～23千道爾頓的蛋白多糖PT2按比例混合，配以藥學(xué)上可接受的載體，成功的發(fā)明了一種抗腫瘤、抗病毒及增強(qiáng)免疫的藥物組合物。
本發(fā)明的藥用組合物，所述多糖PT1中按重量百分比計(jì)總多糖為94～98％，其中還原糖為5～10％，酸性多糖為20～25％；多糖PT1的主要組分為葡萄糖和甘露糖，其中葡萄糖∶甘露糖重量比為60-64∶1；痕量的氨基酸組成為天門冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸和賴氨酸。
本發(fā)明的藥用組合物，所述多糖PT1紅外吸收的最大波數(shù)為3410.2cm-1±50cm-1、2895.0cm-1±50cm-1、1635.3cm-1±50cm-1、1418.8cm-1±50cm-1、1374.7cm-1±50cm-1、1073.6cm-1±50cm-1、894.4cm-1±50cm-1和579.8cm-1±50cm-1。
本發(fā)明的藥用組合物，所述蛋白多糖PT2中按重量百分比計(jì)總多糖為67～90％，其中酸性多糖為30～40％，還原糖含量為10～14％；蛋白多糖PT2中構(gòu)成多糖的主要組分為葡萄糖、甘露糖和鼠李糖，其中葡萄糖∶甘露糖∶鼠李糖重量比為70-73∶1∶0.5-0.8；蛋白多糖PT2中蛋白含量是10～33％，其中氨基酸的組成為纈氨酸、賴氨酸、天門冬氨酸和甘氨酸。
本發(fā)明的藥用組合物，所述蛋白多糖PT2紅外吸收的最大波數(shù)為3388.4cm-1±50cm-1、2895.7cm-1±50cm-1、1612.1cm-1±50cm-1、1413.5cm-1±50cm-1、1298.3cm-1±50cm-1、1155.4cm-1±50cm-1、1073.6cm-1±50cm-1、896.8cm-1±50cm-1、627.7cm-1±50cm-1和585.2cm-1±50cm-1。
本發(fā)明的藥用組合物，所述活性物質(zhì)與藥學(xué)上可接受載體按制劑領(lǐng)域中的技術(shù)制成的口服制劑或非腸道給藥制劑。
例如，本發(fā)明的藥物組合物可以按常規(guī)制劑方法制備成膠囊劑，其中所述藥學(xué)上可接受載體包括微晶纖維素、淀粉、乳糖、糊精、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基淀粉鈉、微粉硅膠或40CP-100CP乙基纖維素、硬醋酸鈉等中的一種或幾種。本發(fā)明膠囊劑的制備方法是取桑黃活性物質(zhì)和所述藥學(xué)上可接受載體分別研細(xì)過篩，混合均勻，裝膠囊，或用粘合劑制成軟材，篩濾制粒，置50-60℃條件下干燥，再篩濾整粒后加入潤滑劑，混合均勻，裝膠囊。
例如，本發(fā)明的藥物組合物可以按常規(guī)制劑方法制備成顆粒劑，其中所述藥學(xué)上可接受載體包括成型劑，可選用如β-環(huán)糊精、乳糖和糊精等中的至少一種，矯味劑可選用，如蔗糖、碳酸鈉、椰子香精等中的至少一種，崩解劑可選用，如可溶性淀粉、羧甲基淀粉鈉等中的一種；粘合劑可選用，如聚維酮K30或其它臨床上可接受的結(jié)構(gòu)類似物。本發(fā)明顆粒劑的制備方法為按配方量取主藥與上述輔料混合后，噴霧干燥，干式制粒，整粒即得產(chǎn)品；或?qū)⒃o料混合按配方量加入粘合劑，制成軟材，將上述軟材經(jīng)12目篩制粒，再于30-75℃干燥，12目篩整粒，將整粒好的顆粒加入已過80目篩的椰子香精混合均勻，分裝即得顆粒劑。
例如，本發(fā)明的藥物組合物可以按常規(guī)制劑方法制備成片劑，其中所述藥學(xué)上可接受載體包括藥用片劑的稀釋劑、粘合劑、崩解劑和潤滑劑；其中稀釋劑可選擇微晶纖維素、淀粉、乳糖、糊精、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇等中的一種或多種。粘合劑可選擇淀粉漿、PVP膠漿、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素和明膠漿等中的一種。崩解劑可選擇淀粉、羧甲基淀粉鈉、微粉硅膠等中的一種。潤滑劑可選擇滑石粉、硬脂酸鎂等中的一種。本發(fā)明片劑的制備方法是取桑黃活性物質(zhì)和稀釋劑、崩解劑分別研細(xì)過篩，混合均勻，用粘合劑制成軟材，篩濾制粒，置50-60℃條件下干燥，再篩濾整拉后加入潤滑劑，混合均勻，壓片。
例如，本發(fā)明的藥物組合物可以按常規(guī)制劑方法制備成注射液，賦形劑為甘露醇、山梨醇、或低分子右旋糖酐等中的一種?？寡鮿榈?dú)狻⒍趸細(xì)?、亞硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉等。本發(fā)明注射劑是通過下述方法實(shí)現(xiàn)的在潔凈條件下，將活性物質(zhì)與藥學(xué)允許的賦性劑和抗氧劑按配方量充分混合均勻，加入適量的注射用水，加熱攪拌使之完全溶解，粗濾，超濾得到無熱源的澄清液，置于安瓿瓶或西林瓶中，按水針工藝或凍干工藝制作即得產(chǎn)品。
本發(fā)明藥物組合物的制備方法，所述多糖PT1和蛋白多糖PT2是通過下述方法得到將桑黃子實(shí)體的水萃取物溶于pH為7.1-7.8的磷酸鈉緩沖液中，上載所述磷酸鈉緩沖液平衡的乙二氨基乙基纖維素柱，用所述磷酸鹽緩沖液洗脫后，再用pH為7.1-7.8的0.1～1.0M的氯化鈉磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，最后用pH為7.1-7.8的0.9-1.1M的氯化鈉磷酸鹽緩沖液洗脫，其中將對(duì)糖含量和蛋白含量的檢測方法均呈陽性的洗脫液合并，冷凍干燥，得到所述蛋白多糖PT2；其中只對(duì)糖含量檢測方法呈陽性的洗脫液合并，冷凍干燥，得到所述多糖PT1。
本發(fā)明的藥物組合物的制備方法，所述得到的多糖PT1、蛋白多糖PT2再分別通過seveg法和/或凝膠滲透方法純化，得到精提的多糖PT1、蛋白多糖PT2。
本發(fā)明所述的活性物質(zhì)更具體的制備方法是所述桑黃子實(shí)體的水萃取物以1∶1.5～8重量比溶于pH為7.7的磷酸鈉緩沖液中，上載所述磷酸鈉緩沖液平衡的4×60厘米的乙二氨基乙基纖維素柱，以流速5毫升/分鐘先后用以下洗脫液洗脫(1)pH為7.7的磷酸鈉緩沖液500毫升洗脫；(2)再用0.1-1.0M的氯化鈉磷酸鹽緩沖液溶液(pH為7.7)1000毫升進(jìn)行梯度洗脫；(3)最后用1.0M的氯化鈉磷酸鹽緩沖液溶液(pH為7.7)500毫升洗脫；其中將對(duì)糖含量的檢測方法和蛋白含量的檢測方法均呈陽性的洗脫液合并，冷凍干燥，得到所述蛋白多糖PT2；其中只對(duì)測糖含量的檢測方法呈陽性的洗脫液合并，冷凍干燥，得到所述多糖PT1。進(jìn)一步通過seveg法除游離蛋白，也可再用凝膠柱G200去游離蛋白和其他雜質(zhì)得到所述多糖PT1和蛋白多糖PT2；上述糖含量的檢測方法是指苯酚-硫酸檢測法，蛋白含量的檢測方法為Folin酚試劑法或考馬斯亮藍(lán)法。
本發(fā)明的藥物組合物的制備方法，所述桑黃子實(shí)體的水萃取物通過下述方法得到將桑黃子實(shí)體粉碎，過20～60目篩后用4～30倍體積的水在70～100℃的溫度下回流萃取2～10小時(shí)，萃取液過濾后減壓濃縮，加入乙醇沉淀，過濾得沉淀，沉淀用丙酮和乙醇先后洗滌，冷凍干燥。
本發(fā)明組合物在制備抗癌藥物、免疫調(diào)節(jié)藥物、降血壓藥物或降血糖藥物中的應(yīng)用。
桑黃子實(shí)體的水萃取物、多糖PT1和蛋白多糖PT2的分子量的測定和純度研究采用凝膠滲透色譜，多糖分子量的測定都是以分子量已知的標(biāo)準(zhǔn)多糖在高效凝膠滲透色譜(HPGPC)系統(tǒng)中研究LgM與保留時(shí)間之間的線性關(guān)系從而確定所研究多糖的分子量，通過該色譜條件可獲得多糖純度的信息；活性多糖組合物、多糖PT1和蛋白多糖PT2中總糖含量采用硫酸苯酚法測定；酸性多糖含量采用硫酸咔唑法測定；還原糖含量采用DNS法測定；多糖PT1和蛋白多糖PT2中蛋白含量可采用Folin-酚試劑法、BCA法或Bradford法測定。
本發(fā)明的有意效果在于1.本發(fā)明從桑黃提取的活性物質(zhì)中多糖PT1與蛋白多糖PT2按比例組合表現(xiàn)很好的協(xié)同作用，使本發(fā)明從桑黃提取的活性物質(zhì)具有顯著的抗腫瘤活性和增強(qiáng)免疫活性。
2.本發(fā)明從桑黃提取的活性物質(zhì)工藝簡單，產(chǎn)量高。


圖1桑黃多糖PT1紅外線吸收?qǐng)D譜圖2桑黃多糖PT1H-NMR圖譜圖3桑黃多糖PT1C-NMR圖譜圖4桑黃蛋白多糖PT2紅外線吸收?qǐng)D譜圖5桑黃蛋白多糖PT2H-NMR圖譜圖6桑黃蛋白多糖PT2C-NMR圖譜下面實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體說明，并不是對(duì)本發(fā)明的具體限制。
實(shí)施例1一種制備桑黃中提取的活性物質(zhì)的方法包括以下步驟i.桑黃子實(shí)體的水萃取物的制備方法將桑黃子實(shí)體400g粉碎，過60目篩后用3000ml水在90℃的溫度下回流萃取8小時(shí)，過濾，固體殘?jiān)僦貜?fù)上述提取過程3次后，合并濾液，減壓濃縮至50ml體積，加入乙醇200ml，置4℃環(huán)境下放置24小時(shí)，過濾，固體用丙酮和乙醇先各30ml洗滌后，冷凍干燥，得28g；硫酸苯酚法測得多糖含量為65％。
ii.多糖PT1和蛋白多糖PT2的制備方法取桑黃子實(shí)體的水萃取物經(jīng)醇沉后所得樣品5g加15ml pH為7.7的磷酸鈉(5m mol)緩沖液，溶液用DEAE-cellulose柱(4×60cm)層析進(jìn)行初步分離。首先以緩沖液500ml作為洗脫液，再用0.1-1.0M的氯化鈉磷酸鹽緩沖液溶液(pH為7.7)1000ml作梯度洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，最后用1.0M的氯化鈉-磷酸鹽緩沖液溶液(pH為7.7)500毫升洗脫，其中將對(duì)測糖含量的苯酚-硫酸檢測法和測蛋白含量的考馬斯亮蘭檢測方法均呈陽性的洗脫液合并，冷凍干燥，得到所述蛋白多糖PT2；其中只對(duì)苯酚硫酸法檢測呈陽性的洗脫液合并，冷凍干燥，得到所述多糖PT1。進(jìn)一步通過seveg法除游離蛋白，冷凍干燥，得到粗品PT10.6g和PT21.7g。再通過凝膠滲透方法純化PT1，選用Sephadex-G200(1.6×40cm)，上樣粗品PT160mg，250mlNaCl溶液(20mmol)沖洗，流速0.2ml/min，去游離蛋白和其他雜質(zhì)，自動(dòng)收集儀分別收取各流分，冷凍干燥后得到所述多糖PT130mg；PT2無需通過此步純化步驟；PT1和PT2總收率2.8％，占水萃取物的40％。
多糖PT1的物理化學(xué)性質(zhì)(1)分子量11～15千道爾頓(2)糖含量總糖為95％，還原糖為7％，酸性多糖為22％(3)主要糖構(gòu)成比葡萄糖∶甘露糖＝62∶1；(4)氨基酸組成天門冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、賴氨酸；(5)紅外光譜見圖1(6)1H-NMR圖譜見圖2(7)13C-NMR圖譜見圖3蛋白多糖PT2的物理化學(xué)性質(zhì)(1)分子量17～23千道爾頓(2)糖含量總糖為69％，還原糖為12％，酸性多糖為37％(3)蛋白含量10％；(4)主要糖構(gòu)成比葡萄糖∶甘露糖∶鼠李糖＝72∶1∶0.7；(5)氨基酸組成纈氨酸、賴氨酸、天門冬氨酸、甘氨酸；(6)紅外光譜見圖4
(7)1H-NMR圖譜見圖5(8)13C-NMR圖譜見圖6iii.PT1和PT2以1∶3重量比相混合。
實(shí)施例2制備桑黃中提取的活性物質(zhì)的方法基本同實(shí)施例1，所不同之處在于所用測蛋白含量的檢測方法為Folin酚試劑法。
實(shí)施例3一種含有從桑黃提取的活性物質(zhì)的混合物制成的片劑，活性物質(zhì)是PT1和PT2按重量比1∶3的混合物(PT1和PT2制備方法如實(shí)施例1)，處方如下桑黃活性物質(zhì)200g乳糖200g淀粉漿 適量羧甲基淀粉納10g硬脂酸鎂6g共制的1000片制備方法桑黃活性物質(zhì)，乳糖，羧甲基淀粉鈉，分別研細(xì)過60目篩，按上述處方稱重、配料并混合均勻，在攪拌下，用淀粉漿制成軟材，過18目篩制成濕顆粒并在60℃的溫度下干燥4小時(shí)，再篩濾整粒后加入硬脂酸鎂，混合均勻，壓片。
本發(fā)明的用法與用量口服，飯間服用；每日兩次，每次兩片。
實(shí)施例4一種藥物組合物制成的抗癌的顆粒劑，活性物質(zhì)是PT1和PT2按重量比1∶3的混合物(PT1和PT2制備方法如實(shí)施例1)，處方如下桑黃活性物質(zhì)200g乳糖400g蔗糖1000g椰子香精30g
聚維酮K3030g共制的1000袋制備方法取桑黃活性提取物、乳糖、蔗糖、椰子香精、聚維酮K30，分別研細(xì)過60目篩，按處方量取主藥與上述輔料混合后，噴霧干燥，干式制粒，整粒即得產(chǎn)品；或?qū)⒃o料混合按處方量加入粘合劑，制成軟材，將上述軟材經(jīng)12目篩制粒，再于60℃干燥，12目篩整粒，將整粒好的顆粒加入已過80目篩的椰子香精混合均勻，分裝即得顆粒劑。
本發(fā)明的用法與用量口服，飯間服用；每日兩次，每次一袋。
實(shí)施例5一種藥物組合物制成提高免疫的膠囊劑，活性物質(zhì)是PT1、PT2重量比為1∶2.5的混合物(PT1和PT2制備方法如實(shí)施例1)，處方如下桑黃活性物質(zhì)200g微晶纖維素 150g乳糖150g羧甲基淀粉鈉30g2％羥丙基纖維素 適量硬脂酸鎂6g共制的1000袋制備方法取桑黃活性物質(zhì)、微晶纖維素、乳糖、羧甲基淀粉鈉，別研細(xì)過60目篩，按處方量取主藥與上述輔料，混合均勻，用黏合劑2％羥丙基纖維素制成軟材，18目篩篩濾制粒，置60℃條件下干燥，整粒后加入硬脂酸鎂，混合均勻，裝膠囊。
本發(fā)明的用法與用量口服，飯間服用；每日兩次，每次一粒。
實(shí)施例6一種藥物組合物制成的治療癌癥的注射劑，活性物質(zhì)是PT1、PT2重量比為1∶3的混合物(PT1和PT2制備方法如實(shí)施例1)，處方如下
桑黃活性物質(zhì)200g甘油50g亞硫酸鈉2g氯化鈉 4g共制的1000支制備方法在潔凈條件下，將活性物質(zhì)與甘油、亞硫酸鈉、氯化鈉溶于注射用水，用0.2μm的微孔濾膜過濾，分裝于2ml安剖瓶中，封口、滅菌，制成0.2g的產(chǎn)品。
本發(fā)明的用法與用量注射，每次一支。
實(shí)施例7小鼠體內(nèi)抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)材料及方法1.1動(dòng)物瑞士種昆明遠(yuǎn)交系小鼠，雌性，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，二級(jí)動(dòng)物，合格證SCXK-(軍)2002-001。選擇健康狀況良好、發(fā)育正常的3-4周齡、體重為17□22g的小鼠。每個(gè)劑量組小鼠混養(yǎng)在一個(gè)大的飼養(yǎng)缸中，自由攝食、飲水，飼料由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物房溫度控制在25℃，相對(duì)濕度50-60％。
1.2藥物桑黃多糖PT1桑黃蛋白多糖PT2桑黃中提取的活性物質(zhì)(桑黃多糖PT1∶桑黃蛋白多糖PT2＝1∶3，w/w)注射用環(huán)磷酰胺(CTX)，購于解放軍307醫(yī)院，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)蘇衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1996)第403501號(hào)，生產(chǎn)日期2003年11月，臨用前，準(zhǔn)確稱100mg，加入10ml生理鹽水溶解混勻，按0.1ml/10g.bw腹腔注射給藥，給藥劑量100mg/kg.bw。
1.3小鼠腫瘤肝癌(H22)；肉瘤(S180)；肺癌(Lewis)
1.4實(shí)驗(yàn)方法1.4.1 H22和S180小鼠實(shí)體瘤模型選擇接種傳代后第7天健康狀況較好的H22和S180腹水型瘤源動(dòng)物，頸椎脫臼，固定于蠟板上，腹部皮膚用碘酊、酒精消毒后，剪開并剝?nèi)ジ共科つw，無菌抽取乳白色腹水，置于放置在冰塊上的無菌小燒杯內(nèi)，加適量生理鹽水稀釋成1∶3的瘤組織懸液，使?jié)舛葹?×106個(gè)/ml活的癌細(xì)胞。立即接種于小鼠右前肢腋窩處皮下，每只接種細(xì)胞懸液0.2ml，制成局灶性實(shí)體瘤試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br> 1.4.2 Lewis肺癌小鼠實(shí)體瘤模型選擇接種后10天，腫瘤生長旺盛而動(dòng)物健康狀況較好的瘤源動(dòng)物，頸椎脫臼，用碘酊、酒精消毒操作部位皮膚。切開皮膚、選擇生長良好的重量大約1克左右的Lewis肺癌腫瘤，剔除包膜和壞死部分，選取數(shù)個(gè)完好的瘤塊混合，放入含少許無菌生理鹽水的無菌平皿內(nèi)保存瘤塊，將瘤塊剪成2-3cm3的小塊，置于玻璃勻漿器內(nèi)，加入適量的生理鹽水，按1∶5的比例配制成瘤細(xì)胞懸液。每只小鼠右前肢腋窩處皮下注射細(xì)胞懸液0.2ml，制成局灶性腫瘤模型。
1.4.3動(dòng)物分組及給藥方法小鼠接種24小時(shí)后，隨機(jī)分組，每組10-15只動(dòng)物，所述藥物給藥劑量定為500mg/kg.bw，按0.2ml/10g.bw灌胃給藥；環(huán)磷酰胺組(陽性對(duì)照)100mg/kg.bw一次性腹腔注射給藥；腫瘤模型對(duì)照組(陰性對(duì)照)，每天灌胃蒸餾水0.4ml。每天給藥一次，連續(xù)10-13天。腫瘤對(duì)照組小鼠平均瘤重達(dá)1-2g時(shí)，停止給藥。
1.4.4樣本處理和觀察方法于末次給藥后24小時(shí)，各組小鼠稱體重后，脫頸處死，剖取腫瘤稱重。按照公式(對(duì)照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)×100％/對(duì)照組平均瘤重，求出抑瘤率，進(jìn)行組間比較。所用小鼠均為雌性。
2結(jié)果列于表1表1.本發(fā)明從桑黃中提取的活性物質(zhì)對(duì)小鼠腫瘤的抑制作用不同提取成分對(duì)腫瘤的抑制率(％)

表中數(shù)字為3次實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差由表1可知，本發(fā)明從桑黃中提取的活性物質(zhì)對(duì)小鼠肝癌H22、小鼠肉瘤S180以及小鼠肺癌Lewis具有一定的生長抑制作用。
實(shí)施例8本發(fā)明從桑黃中提取的活性物質(zhì)對(duì)小鼠免疫功能的影響1實(shí)驗(yàn)材料1.1藥物桑黃中提取的活性物質(zhì)(桑黃多糖PT1∶桑黃蛋白多糖PT2＝1∶3，w/w)用培養(yǎng)液(RMPI1640)配成25mg/ml的母液，0.2μm濾器過濾除菌后，4℃保存。臨用時(shí)用培養(yǎng)液配成所需濃度。
1.2陽性藥脂多糖(LPS)，購自Sigma公司，具有多方面的免疫刺激作用。用培養(yǎng)液配成1mg/ml保存液，-20℃保存。臨用取出，用培養(yǎng)液配成所需濃度。
1.3動(dòng)物瑞士種昆明遠(yuǎn)交系小鼠，6-8周齡，♀，購自本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
1.4細(xì)胞小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞，引自醫(yī)科院藥物所。
2方法和結(jié)果
2.1巨噬細(xì)胞(MФ)對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒反應(yīng)取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，2×105個(gè)/孔接種于U型底96孔組織培養(yǎng)板。分別加LPS1μg/ml，所述藥物各組加入50μg、100μg、200μg、300μg、500μg、1000μg/ml，作用24h后，加小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞5000個(gè)/孔共同孵育6h。以LDH釋放法測巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。細(xì)胞毒％＝(實(shí)驗(yàn)孔-MФ自然釋放孔-B16自然釋放孔)/(B16最大釋放孔-B16自然釋放孔)100，結(jié)果見表2。
表2桑黃粗提物誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞對(duì)小鼠腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒反應(yīng)

從表2對(duì)細(xì)胞毒性的結(jié)果可以看到本發(fā)明從桑黃中提取的活性物質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用，最小有效劑量為100μg/ml。
2.2腫瘤壞死因子(TNF-α)的測定藥物對(duì)MФ分泌腫瘤壞死因子-α的測定。小鼠MФ經(jīng)粘附培養(yǎng)純化后，以2×105個(gè)/孔接種于96孔板。藥物處理24h后，吸取培養(yǎng)液上清，ELISA法測TNF-α，每個(gè)樣品測兩個(gè)孔。以吸光值對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的點(diǎn)計(jì)算其濃度，結(jié)果見表3。
表3.從桑黃中提取的活性物質(zhì)對(duì)MФ分泌腫瘤壞死因子-α的測定

從表3的結(jié)果可以看到本發(fā)明從桑黃中提取的活性物質(zhì)能促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子，并有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，實(shí)驗(yàn)中本發(fā)明從桑黃中提取的活性物質(zhì)100μg/ml產(chǎn)生TNF是陰性對(duì)照組的4倍。
3小結(jié)初步的試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明從桑黃中提取的活性物質(zhì)對(duì)小鼠有免疫調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子。
權(quán)利要求
1.一種藥用組合物，其特征在于所述組合物包含從桑黃中提取的活性物質(zhì)以及藥學(xué)上可接受的載體；所述活性物質(zhì)是由分子量11～15千道爾頓的多糖PT1與分子量17～23千道爾頓的蛋白多糖PT2以1∶1～1∶4的重量比相混合，所述桑黃是指針層孔菌Phellinus igniarius以及其同屬的Phellinus vaninii；Phellinusbaumii；Phellinus linteus；Phellinus hartigii；Phellinus pini真菌的子實(shí)體。
2.按照權(quán)利要求1所述的藥用組合物，其特征在于所述多糖PT1中按重量百分比計(jì)總多糖為94～98％，其中還原糖為5～10％，酸性多糖為20～25％；多糖PT1的主要組分為葡萄糖和甘露糖，其中葡萄糖∶甘露糖重量比為60-64∶1；痕量的氨基酸組成為天門冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸和賴氨酸。
3.按照權(quán)利要求1所述的藥用組合物，其特征在于所述多糖PT1紅外吸收的最大波數(shù)為3410.2cm-1±50cm-1、2895.0cm-1±50cm-1、1635.3cm-1±50cm-1、1418.8cm-1±50cm-1、1374.7cm-1±50cm-1、1073.6cm-1±50cm-1、894.4cm-1±50cm-1和579.8cm-1±50cm-1。
4.按照權(quán)利要求1所述的藥用組合物，其特征在于所述蛋白多糖PT2中按重量百分比計(jì)總多糖為67～90％，其中酸性多糖為30～40％，還原糖含量為10～14％；蛋白多糖PT2中構(gòu)成多糖的主要組分為葡萄糖、甘露糖和鼠李糖，其中葡萄糖∶甘露糖∶鼠李糖重量比為70-73∶1∶0.5-0.8；蛋白多糖PT2中蛋白含量是10～33％，其中氨基酸的組成為纈氨酸、賴氨酸、天門冬氨酸和甘氨酸。
5.按照權(quán)利要求1所述的藥用組合物，其特征在于所述蛋白多糖PT2紅外吸收的最大波數(shù)為3388.4cm-1±50cm-1、2895.7cm-1±50cm-1、1612.1cm-1±50cm-1、1413.5cm-1±50cm-1、1298.3cm-1±50cm-1、1155.4cm-1±50cm-1、1073.6cm-1±50cm-1、896.8cm-1±50cm-1、627.7cm-1±50cm-1和585.2cm-1±50cm-1。
6.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的藥用組合物，其特征在于所述活性物質(zhì)與藥學(xué)上可接受載體按制劑領(lǐng)域中的技術(shù)制成的口服制劑或非腸道給藥制劑。
7.按照權(quán)利要求1所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于所述多糖PT1和蛋白多糖PT2是通過下述方法得到將桑黃子實(shí)體的水萃取物溶于pH為7.1-7.8的磷酸鈉緩沖液中，上載所述磷酸鈉緩沖液平衡的乙二氨基乙基纖維素柱，用所述磷酸鹽緩沖液洗脫后，再用pH為7.1-7.8的0.1～1.0M的氯化鈉磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，最后用pH為7.1-7.8的0.9-1.1M的氯化鈉磷酸鹽緩沖液洗脫，其中將對(duì)糖含量和蛋白含量的檢測方法均呈陽性的洗脫液合并，冷凍干燥，得到所述蛋白多糖PT2；其中只對(duì)糖含量檢測方法呈陽性的洗脫液合并，冷凍干燥，得到所述多糖PT1。
8.按照權(quán)利要求7所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于本發(fā)明的藥物組合物的制備方法，所述得到多糖PT1、蛋白多糖PT2再分別通過seveg法和/或凝膠滲透方法純化，得到精提的多糖PT1、蛋白多糖PT2。
9.按照權(quán)利要求1所述組合物在制備抗癌藥物、免疫調(diào)節(jié)藥物、降血壓藥物或降血糖藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種含有從桑黃中提取的活性物質(zhì)的藥物組合物、制備方法及其在制備抗癌藥物、免疫調(diào)節(jié)藥物、降血壓藥物或降血糖藥物中的應(yīng)用。所述組合物包含從桑黃中提取的活性物質(zhì)以及藥學(xué)上可接受的載體；所述活性物質(zhì)是由分子量11～15千道爾頓的多糖PT
文檔編號(hào)A61P37/00GK101032532SQ20071009759
公開日2007年9月12日 申請(qǐng)日期2007年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月28日
發(fā)明者王洪權(quán), 王毅民, 竇媛媛, 丁建新, 竇茜茜, 王京燕, 王海燕, 張敏, 鄭成貴, 紀(jì)曉光, 何偉庭, 鄭文俊 申請(qǐng)人:北京鴻華新康生物技術(shù)有限公司