專(zhuān)利名稱：由人血清白蛋白和干擾素組成的融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由人血清白蛋白和干擾素組成的融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干擾素(interferon，IFN)是一類(lèi)具有抗病毒、抗增殖以及免疫調(diào)節(jié)活性的細(xì)胞因子。根據(jù)其活性和產(chǎn)生細(xì)胞的類(lèi)型不同，干擾素可分為α干擾素，β干擾素和γ干擾素等。其中α干擾素在臨床上被廣泛用于治療多種病毒性疾病和腫瘤。然而天然α干擾素的半衰期較短，只有頻繁的給藥(在臨床治療中往往采用每周注射三次的用藥方式)才能獲得令人滿意的療效。如此頻繁的用藥方式再加上較長(zhǎng)的治療周期(6-12個(gè)月)使得病人較難承受。因此迫切需要研制出作用時(shí)間長(zhǎng)的重組人α干擾素。
人血清白蛋白(HSA)是機(jī)體中一種穩(wěn)定的且半衰期較長(zhǎng)的蛋白。研究表明許多蛋白藥物與該白蛋白交聯(lián)或融合后可以顯著地使藥物蛋白的半衰期延長(zhǎng)，從而使用藥次數(shù)減少。HGS(Human Genome Sciences)公司的Albuferon是一個(gè)不含接頭的人血清白蛋白和干擾素α2b的融合蛋白(HSA-IFN-α2b)，在該融合融合蛋白中干擾素部分處于融合蛋白的C末端，人血清白蛋白部分處于融合蛋白的N末端。目前Albuferon已進(jìn)入了III期臨床研究。研究結(jié)果表明Albuferon具有較長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期，較高的安全性及較好的療效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定的由人血清白蛋白和干擾素組成的融合蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的融合蛋白，名稱為IFN-α2b-HSA，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有干擾素α2b活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
為了使(a)中的IFN-α2b-HSA便于純化，可在由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的N端或C端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
表1.標(biāo)簽的序列

上述(b)中的IFN-α2b-HSA可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的IFN-α2b-HSA的編碼基因可通過(guò)將序列表中SEQ ID №2的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
序列表中的序列1由750個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基末端第1-165位為IFN-α2b的氨基酸殘基序列，自氨基末端第166-750位為HSA的氨基酸殘基序列。
上述融合蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。IFN-α2b-HSA的編碼基因，具體可為如下1)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列2；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述融合蛋白的DNA分子。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％ SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的序列2由2253個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1到第2250位堿基，編碼具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
含有本發(fā)明基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增上述融合蛋白編碼基因中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種表達(dá)上述融合蛋白的方法。
本發(fā)明所提供的表達(dá)上述融合蛋白方法，是將含有上述融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到融合蛋白。
所述宿主可為酵母菌、大腸桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或枯草桿菌等，優(yōu)選為酵母菌。
所述酵母菌優(yōu)選為巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)。其中，所述巴氏畢赤酵母優(yōu)選為巴氏畢赤酵母GS115，KM71(可購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)或SMD1168(可購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)。
所述大腸桿菌可為E.coli JM109，E.coliHB101，E.coli Top10等。
用于構(gòu)建所述重組酵母表達(dá)載體的出發(fā)載體可為在上述宿主中表達(dá)外源基因的表達(dá)載體，如可在巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)中表達(dá)的pPIC9、pPIC3、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K或pPIC9K。
當(dāng)所述宿主為巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)時(shí)，需用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，甲醇的終濃度可為0.5％(體積百分含量)。
上述重組表達(dá)載體均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。
培養(yǎng)含有本發(fā)明的融合蛋白編碼基因的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，均可為培養(yǎng)出發(fā)宿主的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。
本發(fā)明還提供了一種可用于治療多種腫瘤及病毒性疾病的藥物。
本發(fā)明所提供的可用于治療多種腫瘤及病毒性疾病的藥物，它的活性成分為上述融合蛋白。
需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體等。
本發(fā)明的藥物可以制成注射劑。該劑型的藥物可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
上述藥物的用量一般為每個(gè)成人每次注射500-1000μg的融合蛋白，每隔14-28天給藥一次，療程為3至12個(gè)月。
本發(fā)明人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)Albuferon具有以下缺陷(1)不均一性在非還原電泳上呈“雙帶”；(2)不穩(wěn)定性在溶液中易發(fā)生共價(jià)聚合；(3)回收率較低，僅為10％左右。本發(fā)明人通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)通過(guò)改變?nèi)诤系鞍椎南辔唬磳⑷搜灏椎鞍撞糠种糜谌诤系鞍椎腃末端，將干擾素部分置于融合蛋白的N末端后可顯著提高融合蛋白的均一性，穩(wěn)定性和回收率。
實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的融合蛋白穩(wěn)定性高、半衰期較長(zhǎng)，在醫(yī)學(xué)上也具有較高的安全性及較好的療效；該融合蛋白的表達(dá)量高，易純化，并具有生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)規(guī)模大，成本低的優(yōu)點(diǎn)，具有重要的應(yīng)用前景和實(shí)際意義。


圖1是融合蛋白HSA-IFN-α2b和IFN-α2b-HSA的非還原SDS-PAGE電泳圖譜。
圖2是比較融合蛋白HSA-IFN-α2b和IFN-α2b-HSA的純化過(guò)程。
圖3是利用非還原SDS-PAGE比較融合蛋白HSA-IFN-α2b和IFN-α2b-HSA在液體劑型中的穩(wěn)定性。
圖4是利用細(xì)胞病變抑制法測(cè)定IFN-a2b及融合蛋白HSA-IFN-α2b和IFN-α2b-HSA的活性。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的主要試劑1.DNA限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、聚合酶等分別購(gòu)自GIBCO-BRL、Pharmacia、Bio-Labs及華美生物工程有限公司2.PCR擴(kuò)增試劑盒(瑞典Pharmacia公司產(chǎn)品)3.DNA序列分析試劑盒(美國(guó)USB公司產(chǎn)品)4.酪蛋白水解物 (德國(guó)MERK公司產(chǎn)品)5.Bacto-酵母抽提物 (美國(guó)Difco公司產(chǎn)品)6.酵母菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的一些溶液配制(1)SED1M山梨醇，25mM EDTA，50mM DTT，pH8.0。
(2)SCE9.1g山梨醇，1.47g檸檬酸鈉，0.168g EDTA，pH5.8。
(3)CaS1M山梨醇，10mM CaCl2。
(4)SOS1M山梨醇，0.3×YPD，10mM CaCl2。
(5)CaT20mM Tris-HCl，pH7.5，20mM CaCl2。
(6)PEG20％ PEG-3350，10mM CaCl2，10mM Tris-HCl(pH7.4)。
(7)1M PBS緩沖液132ml 1M K2HPO4，868ml 1M KH2PO4，pH6.0。
7.引物(由上海生工合成)AIFCGAAGGATCCAAACGATGAAGTGGGTTACTAIRGGGAATTCTCATTACTCCTTGGATCTCAAGCFGCTTCTCAAGCTGCTTTGGGTTTGTGTGACTTGCCACAAACCCACTCCCRGGAGTGGGTTTGTGGCAAGTCACACAAACCCAAAGCAGCTTGAGAAGCIAFCCCTCGAGAAAAGATGTGACTTGCCACAAACCCACTCCIARGGGAATTCCTATTACAAACCCAAAGCAGCTTGAGAAGCNFCAAGAGTCCTTGAGATCCAAGGAGGACGCTCACAAGTCTGAAGTTGCTNRAGCAACTTCAGACTTGTGAGCGTCCTCCTTGGATCTCAAGGACTCTTG實(shí)施例1、人血清白蛋白和干擾素融合蛋白的制備
1、人血清白蛋白和干擾素融合蛋白基因的獲得(1)干擾素-α2b基因干擾素-α2b基因是根據(jù)巴斯德畢赤酵母偏愛(ài)密碼子合成的人工基因。干擾素-α2b基因的合成按照文獻(xiàn)(Martinez et alPCR-based gene synthesis as anefficient approach for expression of the A+T-rich malaria genome.ProteinEngineering.1999，12(12)1113-1120)中描述的方法進(jìn)行。
(2)HSA基因HSA基因系由劉志敏等根據(jù)巴斯德畢赤酵母偏愛(ài)密碼子合成的人工基因。HSA基因的合成按照文獻(xiàn)(劉志敏等人血清白蛋白改構(gòu)基因、表達(dá)載體及其宿主。中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利專(zhuān)利號(hào)CN 99102794.9)中描述的方法進(jìn)行。
(3)人血清白蛋白和干擾素融合蛋白基因的獲得本發(fā)明中所涉及的人血清白蛋白和干擾素融合蛋白基因均利用重疊PCR方法構(gòu)建。
融合蛋白HSA-IFN-α2b基因的構(gòu)建以步驟(2)中得到的HSA基因?yàn)槟０?，在引物AIF和引物CR的引導(dǎo)下，利用PCR擴(kuò)增試劑盒(瑞典Pharmacia公司產(chǎn)品)擴(kuò)增HSA基因；以步驟(1)中得到的IFN-α2b基因?yàn)槟０澹谝顲F和引物AIR的引導(dǎo)下，利用PCR擴(kuò)增試劑盒(瑞典Pharmacia公司產(chǎn)品)擴(kuò)增IFN-α2b基因。以上述兩步中的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板以引物AIF和引物AIR為引物擴(kuò)增出HSA-IFN-α2b融合蛋白基因。PCR反應(yīng)的擴(kuò)增體系為HSA基因1μlIFN-a2b基因1μl引物AIF2μl引物AIR2μldNTP 1μl10x pfu酶緩沖液5μlpfu酶 1μl蒸餾水 37μl總體積 50μl。
反應(yīng)條件為94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 4分鐘，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。
將酵母表達(dá)載體pPIC9(購(gòu)自Invitrogen公司)和得到的HSA-IFN-α2b基因分別用BamHI和EcoRI限制性內(nèi)切酶酶切后，用T4DNA連接酶將HSA-IFN-α2b基因克隆入pPIC9，得到重組表達(dá)載體HSA-IFN-α2b/pPIC9。并用DNA序列分析試劑盒(美國(guó)USB公司產(chǎn)品)對(duì)該重組載體進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明HSA-IFN-α2b基因序列與預(yù)期相符，其核苷酸序列是序列表中的序列3。
融合蛋白IFN-α2b-HSA基因的構(gòu)建以步驟(2)中得到的HSA基因?yàn)槟０?，在引物NF和引物IAR的引導(dǎo)下，利用PCR擴(kuò)增試劑盒(瑞典Pharmacia公司產(chǎn)品)擴(kuò)增HSA基因；以步驟(1)中得到的IFN-α2b基因?yàn)槟０?，在引物IAF和引物NR的引導(dǎo)下，利用PCR擴(kuò)增試劑盒(瑞典Pharmacia公司產(chǎn)品)擴(kuò)增IFN-α2b基因。以上述兩步中的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以引物IAF和引物IAR為引物擴(kuò)增出IFN-α2b-HSA融合蛋白基因。PCR反應(yīng)的擴(kuò)增體系為HSA基因1μlIFN-α2b基因 1μl引物IAF2μl引物IAR2μldNTP 1μl10x pfu酶緩沖液5μlpfu酶 1μl蒸餾水 37μl總體積 50μl。
反應(yīng)條件為94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 4分鐘，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。
將酵母表達(dá)載體pPIC9和得到的IFN-α2b-HSA基因分別用XhoI和EcoRI限制性內(nèi)切酶酶切后，用T4DNA連接酶將IFN-α2b-HSA基因克隆入pPIC9，得到重組表達(dá)載體IFN-α2b-HSA/pPIC9。并用DNA序列分析試劑盒(美國(guó)USB公司產(chǎn)品)對(duì)該重組載體進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明IFN-α2b-HSA基因序列與預(yù)期相符，其核苷酸序列是序列表中的序列2。
2、人血清白蛋白和干擾素融合蛋白基因在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)將上述表達(dá)載體HSA-IFN-α2b/pPIC9和IFN-α2b-HSA/pPIC9分別用酵母原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母GS115 his4(Mut+his-)NRRLY-15851(Invitrogen公司)，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在MD平板上，得到轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)挑取24個(gè)轉(zhuǎn)化子，接種于4ml BMGY培養(yǎng)基(1％(質(zhì)量百分含量)酵母抽提物，2％(質(zhì)量百分含量)胰蛋白胨，1.34％(體積百分含量)YNB，4×10-5％(質(zhì)量百分含量)生物素，1％(體積百分含量)甘油，100mM pH6.0磷酸鉀緩沖液)培養(yǎng)液中，每隔12小時(shí)加入0.5％(體積百分含量)甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，在30℃，200rpm下培養(yǎng)36-48小時(shí)。將培養(yǎng)液用5000rpm離心10min，各取100μL上清液，真空抽干，將樣品分別進(jìn)行10％ SDS-PAGE電泳鑒定，用pPIC9空載載體表達(dá)物作對(duì)照，鑒定出1個(gè)轉(zhuǎn)入HSA-IFN-α2b/pPIC9的高表達(dá)克隆和1個(gè)轉(zhuǎn)入IFN-α2b-HSA/pPIC9的高表達(dá)克隆。然后將這些篩選出來(lái)的高表達(dá)克隆分別用15％(體積百分含量)甘油低溫保菌、斜面培養(yǎng)，用于作為進(jìn)一步表達(dá)的工程菌。
挑取上述工程菌接種于4ml上述BMGY液體培養(yǎng)基中，30℃ 100rpm搖培12-24小時(shí)。取1ml酵母菌液轉(zhuǎn)接于50ml上述BMGY培養(yǎng)液內(nèi)，繼續(xù)搖培18-24小時(shí)，再按4％接菌量將40ml種子接入1000ml上述BMGY培養(yǎng)基內(nèi)，在30℃，200rpm繼續(xù)搖培24-30小時(shí)，將培養(yǎng)液用5000rpm離心5min，棄上清，然后將工程菌用200ml BMMY(1％(質(zhì)量百分含量)酵母抽提物，2％(質(zhì)量百分含量)胰蛋白胨，1.34％(體積百分含量)YNB，4×10-5％(質(zhì)量百分含量)生物素，0.5％(體積百分含量)甲醇，100mM pH6.0磷酸鉀緩沖液)誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基懸浮菌體，在30℃ 100rpm搖培3-4天，每隔24小時(shí)補(bǔ)加甲醇(用100％甲醇加至終濃度為0.5％(體積百分含量))。這時(shí)巴斯德畢赤酵母工程菌的細(xì)胞密度已達(dá)到18-20個(gè)OD600，表達(dá)的融合蛋白大多數(shù)分泌到液體培養(yǎng)基內(nèi)。發(fā)酵培養(yǎng)基在4℃ 10000rpm(6000g)離心20min，棄菌體，獲得含大量融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的上清液，將其進(jìn)行非還原SDS-PAGE電泳鑒定，結(jié)果表明轉(zhuǎn)入HSA-IFN-α2b/pPIC9的工程菌表達(dá)的HSA-IFN-α2b在非還原電泳上呈“雙帶”(85kDa)，轉(zhuǎn)入IFN-α2b-HSA/pPIC9的工程菌表達(dá)的IFN-α2b-HSA在非還原電泳上呈單帶(85kDa)(圖1)。電泳結(jié)果表明IFN-α2b-HSA具有比HSA-IFN-α2b更好的均一性。圖1中，泳道1為分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為HSA-IFN-α2b，泳道3為IFN-α2b-HSA。
3、融合蛋白的分離純化將步驟2中的培養(yǎng)上清液的pH調(diào)至4.5，并用蒸餾水稀釋5倍后用Sepharose F.F(Amersham Bioscience公司)進(jìn)行初步純化。陽(yáng)離子交換層析所用平衡緩沖液為50mMpH4.5的醋酸緩沖液，洗脫緩沖液為含1M NaCl的50mM pH4.5醋酸緩沖液。經(jīng)陽(yáng)離子交換層析后再用Phenyl Sepharose HP(Amersham Bioscience公司)疏水層析進(jìn)行純化。疏水層析所用平衡緩沖液為含1M(NH4)2SO4的pH為6.0的20mM磷酸鹽緩沖液，洗脫緩沖液為pH為6.0的20mM磷酸鹽緩沖液。經(jīng)疏水層析純化的樣品用Sephadex G25(Amersham Bioscience公司)將緩沖體系交換為pH為6.0的20mM磷酸鹽緩沖液后用Source 30Q(Amersham Bioscience公司)陰離子交換層析進(jìn)行純化。陰離子交換層析所用平衡緩沖液為pH為6.0的20mM磷酸鹽緩沖液，洗脫緩沖液為含200mM NaCl的pH為6.0的20mM磷酸鹽緩沖液。最后用Superdex200(Amersham Bioscience公司)分子篩進(jìn)行進(jìn)一步純化獲得最終產(chǎn)物，分子篩所用緩沖液為pH為6.0的20mM磷酸鹽緩沖液。將HSA-IFN-α2b和IFN-α2b-HSA表達(dá)上清，以及分別依次經(jīng)陽(yáng)離子交換層析，疏水層析，陰離子交換層析和分子篩層析純化的樣品進(jìn)行10％非還原SDS-PAGE電泳，經(jīng)凝膠光密度掃描，IFN-α2b-HSA的回收率是HSA-IFN-α2b的2.5倍。結(jié)果表明IFN-α2b-HSA具有比HSA-IFN-α2b更高的回收率。HSA-IFN-α2b和IFN-α2b-HSA的純化結(jié)果見(jiàn)圖2。其中泳道1為HSA-IFN-α2b表達(dá)上清，泳道2-5分別為依次經(jīng)陽(yáng)離子交換層析，疏水層析，陰離子交換層析和分子篩層析純化的HSA-IFN-α2b樣品。泳道6為IFN-α2b-HSA表達(dá)上清，泳道7-10分別為經(jīng)陽(yáng)離子交換層析，疏水層析，陰離子交換層析和分子篩層析純化的IFN-α2b-HSA樣品。
將依次經(jīng)陽(yáng)離子交換層析，疏水層析，陰離子交換層析和分子篩層析純化的IFN-α2b-HSA和HSA-IFN-α2b樣品進(jìn)行N-末端氨基酸序列測(cè)定，結(jié)果表明IFN-α2b-HSA的N-末端15個(gè)氨基酸殘基是CDLPQTHSLGSRRTL，HSA-IFN-α2b的N-末端15個(gè)氨基酸殘基是DAHKSEVAHRFKDLG，表明表達(dá)的IFN-α2b-HSA和HSA-IFN-α2b的序列正確。
實(shí)施例2、融合蛋白穩(wěn)定性的比較將融合蛋白的蛋白濃度調(diào)整至1mg/ml后將樣品在4℃和37℃下放置不同時(shí)間后取10μl樣品用非還原SDS-PAGE檢測(cè)共價(jià)聚體的含量，結(jié)果如圖3所示。在該圖中泳道1為經(jīng)最后一步純化后馬上進(jìn)行電泳的HSA-IFN-α2b樣品，泳道2為在4℃下放置60天后的HSA-IFN-α2b樣品，泳道3，4分別為在37℃下放置1天和10天后的HSA-IFN-α2b樣品。泳道5為經(jīng)最后一步純化后馬上進(jìn)行電泳的IFN-α2b-HSA樣品，泳道6為在4℃下放置60天后的IFN-α2b-HSA樣品，泳道7，8分別為在37℃下放置1天和10天后的IFN-α2b-HSA樣品。電泳結(jié)果表明HSA-IFN-α2b放置后易產(chǎn)生共價(jià)聚體，而IFN-α2b-HSA在37℃放置10天后仍無(wú)共價(jià)聚體生成，說(shuō)明IFN-α2b-HSA具有比HSA-IFN-α2b更高的穩(wěn)定性。
實(shí)施例3、融合蛋白抗病毒活性的測(cè)定利用細(xì)胞病變抑制法測(cè)定IFN-α2b(天津華立達(dá)生物工程公司的安福隆)及最后一步純化的融合蛋白HSA-IFN-α2b和IFN-α2b-HSA的活性。
細(xì)胞培養(yǎng)Wish細(xì)胞(中國(guó)藥品生物制品檢定所)為貼壁細(xì)胞，采用0.25％(質(zhì)量百分含量)胰酶消化，含10％(體積百分含量)小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基加入雙抗(青霉素鏈霉素各100單位)，37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)隔天傳代。
灰鴿子變種VSV病毒制備取9～10日齡的雞胚，去頭、翅膀、內(nèi)臟制成細(xì)胞懸液，接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24小時(shí)形成致密的單細(xì)胞層，接種VSV病毒(中國(guó)藥品生物制品檢定所)在細(xì)胞瓶中培養(yǎng)30小時(shí)收取培養(yǎng)上清-45℃保存待用。
微量板染色法將處理干凈的微量板放在紫外線燈下照射30分鐘，每孔加入100μl Wish細(xì)胞培養(yǎng)液，IFN-α2b、HSA-IFN-α2b和IFN-α2b-HSA預(yù)稀釋后在微量板上進(jìn)行倍比稀釋(設(shè)立對(duì)照孔及空白孔，對(duì)照孔加入細(xì)胞但不加入干擾素進(jìn)行保護(hù)，而空白孔則不加入細(xì)胞)，每孔加入100μl細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為40萬(wàn)個(gè)/ml)，加蓋靜置放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)6～8小時(shí)，顯微鏡下觀察，細(xì)胞已生長(zhǎng)成為單層每孔加入100μl VSV病毒懸液開(kāi)始攻毒20～30小時(shí)，觀察病毒對(duì)照孔(未加入IFN-α2b、HSA-IFN-α2b或IFN-α2b-HSA)細(xì)胞全部病變倒去培養(yǎng)液，取50mg結(jié)晶紫加入20ml乙醇溶解，用蒸餾水定容至100ml進(jìn)行染色(約30～40分鐘)，倒去染液沖洗干凈晾干，每孔加入200μl脫色液(50％乙醇，50％蒸餾水，0.1％乙酸(體積比))脫色后用酶聯(lián)儀(在A570nm)處讀取結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。以A570nm為縱坐標(biāo)，干擾素蛋白濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，EC50定義為最大A570nm的一半所對(duì)應(yīng)的干擾素的蛋白濃度。融合蛋白抗病毒活性的測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)圖4。IFN-α2b及融合蛋白HSA-IFN-α2b和IFN-α2b-HSA的EC50分別為1.42±0.28ng/ml，120±12.5ng/ml，和160±11.3ng/ml。
序列表<160>3<210>1<211>750<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15Phe Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe50 55 60Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65 70 75 80Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu115 120 125Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser145 150 155 160Leu Arg Ser Lys Glu Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe165 170 175Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe180 185 190Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val195 200 205Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala210 215 220Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys225 230 235 240Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys245 250 255Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp260 265 270Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met275 280 285Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu290 295 300
Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu305 310 315 320Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala325 330 335Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp340 345 350Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu355 360 365Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu370 375 380Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val385 390 395 400Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu405 410 415Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn420 425 430Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu435 440 445Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro450 455 460Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val465 470 475 480Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu485 490 495
Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu500 505 510Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala515 520 525Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro530 535 540Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe545 550 555 560Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr565 570 575Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser580 585 590Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala595 600 605Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln610 615 620Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys625 630 635 640Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu645 650 655Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe660 665 670Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile
675 680 685Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala690 695 700Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val705 710 715 720Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu725 730 735Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu740 745 750<210>2<211>2253<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2tgtgacttgc cacaaaccca ctccttgggt tccagaagaa ccttgatgtt tttggctcaa 60atgagaagaa tctccttgtt ctcttgtttg aaggacagac acgacttcgg tttcccacaa120gaggagttcg gtaaccaatt ccaaaaggct gagaccatcc cagttttgca cgagatgatc180caacaaatct tcaacttgtt ctccaccaag gactcctccg ctgcttggga cgagaccttg240ttggacaagt tctacaccga gttgtaccaa caattgaacg acttggaggc ttgtgttatc300caaggtgttg gtgttaccga gaccccattg atgaaggagg actccatctt ggctgttaga360aagtacttcc aaagaatcac cttgtacttg aaggagaaga agtactcccc atgtgcttgg420gaggttgtta gagctgagat catgagatcc ttctccttgt ccaccaactt gcaagagtcc480ttgagatcca aggaggacgc tcacaagtct gaagttgctc acagattcaa ggacttgggt540gaagaaaact tcaaggcttt ggttttgatt gctttcgctc aatacttgca acaatgtcca600ttcgaagacc acgttaagtt ggttaacgaa gttactgaat ttgctaagac ttgtgttgct660gacgaatctg ctgaaaactg tgacaagtct ttgcacactt tgttcggtga caagttgtgt720actgttgcta ctttgagaga aacttacggt gaaatggctg actgttgtgc taagcaagaa780ccagaaagaa acgaatgttt cttgcaacac aaggacgaca acccaaactt gccaagattg840gttagaccag aagtcgacgt tatgtgtact gctttccacg acaacgaaga aactttcttg900
aagaagtact tgtacgaaat tgctagaaga cacccatact tctacgctcc agaattgttg 960ttcttcgcta agagatacaa ggctgctttc actgaatgtt gtcaagctgc tgacaaggct1020gcttgtttgt tgccaaagtt ggacgaattg agagacgaag gtaaggcttc ttctgctaag1080caaagattga agtgtgcttc tttgcaaaag ttcggtgaaa gagctttcaa agcttgggct1140gttgctagat tgtctcaaag attcccaaag gctgaatttg ctgaagtttc taagttggtt1200actgacttga ctaaggttca cactgaatgt tgtcacggtg acttgttgga atgtgctgac1260gacagagctg acttggctaa gtacatttgt gaaaaccaag actctatttc ttctaagttg1320aaggaatgtt gtgaaaagcc attgttggaa aagtctcact gtattgctga agttgaaaac1380gacgaaatgc cagctgactt gccatctttg gctgctgact tcgttgaatc taaggacgtt1440tgtaagaact acgctgaagc taaggacgtt ttcttgggta tgttcttgta cgaatacgct1500agaagacacc cagactactc tgttgttttg ttgttgagat tggctaagac ttacgaaact1560actttggaaa agtgttgtgc ggccgctgac ccacacgaat gttacgctaa ggttttcgac1620gaatttaagc cattggttga agaaccacaa aacttgatta agcaaaactg tgaattgttc1680gaacaattgg gtgaatacaa gttccaaaac gctttgttgg ttagatacac taagaaggtt1740ccacaagttt ctactccaac tttggttgaa gtttctagaa acttgggtaa ggttggttct1800aagtgttgta agcacccaga agctaagaga atgccatgtg ctgaagacta cttgtctgtt1860gttttgaacc aattgtgtgt tttgcacgaa aagactccag tttctgacag agttactaag1920tgttgtactg aatctttggt taacagaaga ccatgtttct ctgctttgga agttgacgaa1980acttacgttc caaaggaatt taacgctgaa actttcactt tccacgctga catttgtact2040ttgtctgaaa aggaaagaca aattaagaag caaactgctt tggttgaatt ggttaagcac2100aagccaaagg ctactaagga acaattgaag gctgttatgg acgacttcgc tgctttcgtt2160gaaaagtgtt gtaaggctga cgacaaggaa acttgtttcg ctgaagaagg taagaagttg2220gttgctgctt ctcaagctgc tttgggtttg taa 2253<210>3<211>2328<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3atgaagtggg ttactttcat ttctttgttg ttcttgttct cttctgctta ctccagaggt 60gttttccgta gagacgctca caagtctgaa gttgctcaca gattcaagga cttgggtgaa120gaaaacttca aggctttggt tttgattgct ttcgctcaat acttgcaaca atgtccattc180gaagaccacg ttaagttggt taacgaagtt actgaatttg ctaagacttg tgttgctgac240gaatctgctg aaaactgtga caagtctttg cacactttgt tcggtgacaa gttgtgtact300gttgctactt tgagagaaac ttacggtgaa atggctgact gttgtgctaa gcaagaacca360gaaagaaacg aatgtttctt gcaacacaag gacgacaacc caaacttgcc aagattggtt420
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權(quán)利要求
1.一種由人血清白蛋白和干擾素組成的融合蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有干擾素α2b活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述的由人血清白蛋白和干擾素組成的融合蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述融合蛋白的編碼基因，是如下1)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列2；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述融合蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述融合蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.一種表達(dá)權(quán)利要求1所述的由人血清白蛋白和干擾素組成的融合蛋白的方法，是將含有所述融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到融合蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述宿主為酵母菌、大腸桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或枯草桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述宿主為酵母菌，優(yōu)選為巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)；所述巴氏畢赤酵母優(yōu)選為巴氏畢赤酵母GS115，KM71或SMD1168。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于用于構(gòu)建所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為pPIC9、pPIC3、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K或pPIC9K；優(yōu)選為pPIC9。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述重組表達(dá)載體為將核苷酸序列是序列表中的序列2的核苷酸片段插入pPIC9的XhoI和EcoRI酶切位點(diǎn)間得到的重組表達(dá)載體IFN-α2b-HSA/pPIC9。
10.一種預(yù)防和/或治療腫瘤，和/或抑制病毒的藥物，它的活性成分為權(quán)利要求1所述的由人血清白蛋白和干擾素組成的融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種由人血清白蛋白和干擾素組成的融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該融合蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有干擾素α2b活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。與已公開(kāi)的同類(lèi)融合蛋白(如美國(guó)HGS公司的Albuferon)不同，該融合蛋白中干擾素部分處于融合蛋白的N末端而人血清白蛋白部分處于融合蛋白的C末端。由于以上改進(jìn)使得該融合蛋白比Albuferon具有更好的均一性，更高的穩(wěn)定性和更高的回收率。該融合蛋白可用于治療多種腫瘤及病毒性疾病。
文檔編號(hào)A61P31/12GK101062952SQ20071009932
公開(kāi)日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2007年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月16日
發(fā)明者劉志敏, 趙洪亮, 薛沖, 王洋, 熊向華, 姚學(xué)勤, 李獻(xiàn)玉 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所