一種從牛血清中分離高純度牛血清白蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及蛋白純化技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種從牛血清中分離高純度牛血清白蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]牛血清白蛋白(BSA)，又稱第五組分(Cohn Fract1n V)，也是牛血液的主要成分，包含583個氨基酸殘基，分子量為66.430 kDa，等電點約為4.7。該命名(第五組分)規(guī)則源于最初采用冷乙醇沉淀法的Cohn血清白蛋白分離法。根據(jù)Cohn氏法，在第五個乙醇饋分中找到了血清白蛋白。其實所謂的牛血清白蛋白第五組分是一種主要含有牛血清白蛋白的混合物，而不是純的牛血清白蛋白。白蛋白可與多種陽離子、陰離子和其他小分子物質(zhì)結(jié)合。血液中的白蛋白主要起維持滲透壓作用、PH緩沖作用、載體作用和營養(yǎng)作用。在動物細胞無血清培養(yǎng)中，添加白蛋白可起到生理和機械保護作用和載體作用。牛血清白蛋白在生化實驗中有廣泛的應用，例如在western blot和制備ELISA板中的封閉試劑。BSA —般做為穩(wěn)定劑被用于限制酶或者修飾酶的保存溶液和反應液中，因為有些酶在低濃度下不穩(wěn)定或活性低。加入BSA后，它可能起到“保護”或“載體”作用，不少酶類添加BSA后能使其活性大幅度提尚。牛血清白蛋白是一種具有很強疏水性和未水性等多功能特征的蛋白質(zhì)，其它蛋白質(zhì)不具有這樣的特征，如果牛血清白蛋白不純，例如含有其它蛋白質(zhì)或者小分子物質(zhì)，將會影響其功能。
[0003]分離獲得純的血清白蛋白的目的主要是分離除去血漿中其它二百多種雜蛋白和可能存在的污染物質(zhì)，得到無熱原、無抗原抗體反應、無污染的白蛋白等。目前，血清白蛋白純化的報道多數(shù)是關(guān)于人源血清白蛋白的分離純化:早期的方法如，Denis的氯化納法(1847年)，Hofmeister的硫酸鈉法(1890年)和Hermmarsten的硫酸錢分級鹽析結(jié)晶法(1894年)。我國早期使用硫酸銨鹽析法生產(chǎn)人血清白蛋白，但由于硫酸銨生產(chǎn)過程繁瑣，后來也采用冷乙醇沉淀法。至今在工業(yè)上仍是生產(chǎn)人血清白蛋白的主要方法。利用冷乙醇沉淀法也有一些不足:乙醇是一種非特異性沉淀劑，盡管對人血清白蛋白生產(chǎn)效果顯著，但產(chǎn)品純度不是很高；作為有機溶劑的乙醇還可能使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集或變性；在非封閉式的環(huán)境中有機溶劑對工作人員危害也較大，同時殘留于產(chǎn)品中乙醇難于除。為此也有人改用PEG沉淀法，以避免蛋白質(zhì)聚集或變性，而且不易從白蛋白溶液中除去，工業(yè)生產(chǎn)有一定困難。為解決硫酸銨、乙醇、PEG等小分子化學試劑在血清白蛋白中殘留和血清白蛋白純度不高的問題，就采用色譜法生產(chǎn)的白蛋白。但單純采用色譜法難以有效地抑制或除去熱原或者外源病毒等，嚴重影響產(chǎn)品的安全性。為彌補色譜法的不足，近期發(fā)展了色譜與冷乙醇沉淀相結(jié)合的方法，二者優(yōu)勢互補，應用生產(chǎn)后一定效果。
[0004]但是，這些方法純化的牛血清白蛋白會存在以下缺點:1)血清白蛋白中殘留大量的小分子物質(zhì)或者化學試劑，例如氯化鈉、硫酸銨、PEG、乙醇、氨基酸、維生素、微量元素等；2)血清白蛋白純度不夠高；3)血清中外源病毒等微生物沒有完去除，影響血清白蛋白的安全性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種從牛血清中分離高純度牛血清白蛋白的方法。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的:
一種從牛血清中分離高純度牛血清白蛋白的方法，包括以下步驟:
51.向牛血清中加入生理鹽水或PBS溶液將牛血清稀釋；向稀釋后的牛血清中加入適量硫酸銨，2~8°C靜置30min以上，離心收集上清液；
52.向上清液中加入2~3倍體積的PBS溶液，混勻后進行疏水層析，使用PBS溶液洗脫，收集洗脫液；
53.將洗脫液進行分子篩層析，收集不含鹽和其它小分子的蛋白峰；所述層析填料為G10-G75葡聚糖；
54.使用陰離子交換層析進一步純化牛血清白蛋白，通過0.1~1.5M濃度氯化鈉進行梯度洗脫，收集精純的牛血清白蛋白；
55.加入非蛋白質(zhì)變性類的滅活劑對病原微生物進行滅活，之后進行分子篩層析，使用超純水洗脫收集牛血清白蛋白；所述分子篩層析填料為G25或G50的葡聚糖；
56.使用孔徑為30K的膜包進行超濾濃縮，使牛血清白蛋白最終濃度達到5mg/ml以上；最后使用0.2微米的濾膜進行過濾除菌。
[0007]牛血清中蛋白質(zhì)種類組成復雜，因此要想將牛血清白蛋白從中高純度分離出來，必須排除其他雜蛋白的摻雜。傳統(tǒng)技術(shù)大多是采用普遍適用的氯化納法、硫酸鈉法和硫酸銨分級鹽析結(jié)晶法，這些普遍適用的方法雖然也能分離到牛血清白蛋白，但是根本無法排除其他雜蛋白的摻雜，即得到的牛血清白蛋白的純度不高。本發(fā)明通過多年對牛血清的成分組成的分析研究，根據(jù)血清白蛋白與其他雜蛋白或雜物質(zhì)的生物活性區(qū)別，開發(fā)出一種高純度分離白蛋白的方法。本發(fā)明使用到的疏水層析、分子篩層析、離子交換層析雖然都是用于蛋白分離純化的常規(guī)技術(shù)手段，但是，各種層析的先后順序卻是不可隨意調(diào)整改變的，并且我們研究發(fā)現(xiàn)，疏水層析的分辨率和載流量在分離白蛋白時均比離子交換好，因此該組合是最優(yōu)組合。
[0008]優(yōu)選地，SI所述生理鹽水或PBS溶液的加入量為牛血清體積的1~3倍。
[0009]硫酸銨的作用是使蛋白質(zhì)變性，暴露蛋白內(nèi)的疏水基團，以便根據(jù)疏水性質(zhì)不同進行分離，優(yōu)選地，SI所述硫酸銨的用量為每100毫升稀釋血清中加入10~30g硫酸銨。
[0010]更優(yōu)選地，SI所述硫酸銨按每100毫升稀釋血清中加入15~25g硫酸銨的量加入。
[0011]最優(yōu)選地，SI所述硫酸銨按每100毫升稀釋血清中加入20~25g硫酸銨的量加入。
[0012]向稀釋后的牛血清中加入硫酸銨后，最好在2~8°C靜置I小時以上再進行離心，收集上清液；所述離心的優(yōu)選條件為5000~8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘至I小時。
[0013]疏水層析是利用固定相載體上偶聯(lián)的疏水性配基與流動相中的一些疏水分子發(fā)生可逆性結(jié)合而進行分離。該方法基于的是蛋白質(zhì)的疏水差異，在高鹽溶液中，蛋白質(zhì)會與疏水配基相結(jié)合，而其他的雜蛋白則沒有此種性質(zhì)，利用此種性質(zhì)，可以將蛋白質(zhì)初步的分離。優(yōu)選地，S2所述疏水層析的填料為苯基-葡聚糖或丁基-葡聚糖其它疏水填料。疏水層析時，雜蛋白存在于穿透液中，使用PBS溶液洗脫，收集洗脫液，洗脫液中主要含有血清白蛋白。
[0014]本發(fā)明進行分子篩層析的目的是脫鹽和去除小分子物質(zhì)，例如，硫酸銨、氯化鈉、氨基酸、維生素、小分子蛋白質(zhì)等物質(zhì)。
[0015]優(yōu)選地，S4所述陰離子交換層析的填料為DEAE-葡聚糖。
[0016]優(yōu)選地，S5所述非蛋白質(zhì)變性類的滅活劑為丙內(nèi)酯。使用丙內(nèi)酯對病原微生物進行滅活的優(yōu)選條件為37°C滅活24小時。β -丙內(nèi)酯按照其在溶液中的終濃度為5%。的加入量加入。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
通過本發(fā)明制備得到的牛血清白蛋白中牛血清白蛋白的純度高于99.5%，而且，牛血清白蛋白中不含有小分子物質(zhì)，例如氯化鈉、硫酸銨、氨基酸等；另外，牛血清白蛋白中不含活病毒。
【附圖說明】
[0018]圖1為實施例1中牛血清苯基-葡聚糖疏水層析分離血清白蛋白的效果圖；其中，藍色曲線為血清中蛋白質(zhì)在疏水層析過程中的分離變化情況；紅色曲線為溶液中電導(各種離子濃度)變化情況；黑色箭頭為牛血清白蛋白峰。
[0019]圖2為實施例1中牛血清白蛋白溶液通過G25葡聚糖分子篩除鹽和小分子物質(zhì)的效果圖；其中，藍色曲線為牛血清白蛋白溶液中蛋白在分子篩層析過程中蛋白質(zhì)變化情況；紅色曲線為溶液中電導(各種離子濃度)變化情況；黑色箭頭為牛血清白蛋白峰；紅色箭頭為小分子物質(zhì)蛋白峰。
[0020]圖3為實施例1中牛血清白蛋白通過DEAE-葡聚糖離子交換層析進一步精純的效果圖；其中，藍色曲線為牛血清白蛋白粗純樣品通過離子交換層析蛋白質(zhì)分離情況；紅色曲線為溶液中電導(各種離子濃度)變化情況；黑色箭頭為牛血清白蛋白峰。
[0021]圖4為實施例1中精純牛血清白蛋白溶液通過G50葡聚糖分子篩層析除鹽和小分子物質(zhì)的效果圖；其中，藍色曲線為精純后牛血清白蛋白溶液中蛋白質(zhì)分離情況；紅色曲線為溶液中電導(各種離子濃度)變化情況；黑色箭頭為牛血清白蛋白峰；紅色箭頭為小分子物質(zhì)蛋白峰。
[0022]圖5為實施例1中精純化后的牛血清白蛋白和牛血清進行SDS-PAGE電泳效果比對圖；Μ:標準蛋白質(zhì)Marker ；2:精純后的牛血清白蛋白；3:箭頭對應的蛋白質(zhì)的分子量。
[0023]圖6為實施例2中牛血清丁基-葡聚糖疏水層析分離血清白蛋白的效果圖；其中，藍色曲線為血清中蛋白質(zhì)在疏水層析過程中的分離變化情況；紅色曲線為溶液中電導(各種離子濃度)變化情況；黑色箭頭為牛血清白蛋白峰。
[0024]圖7為實施例2中牛血清白蛋白溶液通過G50葡聚糖分子篩除鹽和小分子物質(zhì)的效果圖；其中，藍色曲線為牛血清白蛋白溶