穩(wěn)定高效表達人血清白蛋白和白介素ⅱ融合蛋白的cho細胞株的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，尤其是設(shè)計一種利用基因工程手段構(gòu)建分別表達重組 蛋白HSA-IL-2和IL-2-HSA的CH0細胞株。
【背景技術(shù)】
[0002] 白細胞介素-2 (Interleukin-2，IL-2)又稱T細胞生長因子，是Morgan等人用絲 裂原、刀豆蛋白刺激T淋巴細胞時產(chǎn)生的一種因子。IL-2在機體免疫應(yīng)答中具有重要的作 用，在臨床上用于腫瘤、肝炎、免疫缺陷性疾病的治療。其中乙型肝炎是一種全球性感染性 疾病，在我國尤為多發(fā)。由于細胞因子在免疫應(yīng)中起著很重要的調(diào)節(jié)作用，因而使用細胞因 子以增強免疫接種所誘發(fā)的免疫反應(yīng)，已引起極大地重視，并獲得很有希望的實驗結(jié)果，然 而，使用細胞因子以增強免疫應(yīng)答，并用于臨床，至今并沒有取得實質(zhì)性的、突破性的進展。 宄其原因，細胞因子自身短暫的血漿循環(huán)半衰期是關(guān)鍵性的障礙。其中IL-2相對分子質(zhì)量 小，體內(nèi)半衰期僅有6. 9min，因而要達到穩(wěn)定的有效的血漿濃度就必須多次高劑量注射這 樣可能造成不良副作用，給患者帶來很大的困擾，因此限制了其在臨床上的應(yīng)用。
[0003] 人們通過構(gòu)建融合蛋白增加藥物分子量的方法來延長藥物半衰期。關(guān)波等人通過 白蛋白融合技術(shù)在畢赤酵母中成功表達了具有生物活性的融合蛋白IL-2-HSA，但在畢赤酵 母中表達融合蛋白時，產(chǎn)物存在不均一、過度糖基化和降解等問題，在生產(chǎn)應(yīng)用中受到很大 限制。目前CH0細胞已經(jīng)成為表達重組蛋白藥物最為理想的宿主之一，CH0細胞表達的糖 基化藥物最接近天然蛋白，而且很少分泌自身內(nèi)源蛋白，產(chǎn)物胞外分泌，利于純化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本申請人提供了一種穩(wěn)定高效表達人血清白蛋白 和白介素II融合蛋白的CH0細胞株的構(gòu)建方法。本發(fā)明分別獲得的可以分泌表達HSA-IL-2 和IL-2-HSA的單克隆細胞株，兩種蛋白表達量均較高，經(jīng)分離純化所獲得融合蛋白，兩種 蛋白體外生物活性較高，且生物活性比等摩爾單體IL-2活性要高，用于制備治療腫瘤、肝 炎和免疫缺陷性疾病等多種疾病的藥物。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] 本發(fā)明設(shè)計了一種重組蛋白并在中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary, CHO)中制備方法，主要包含的
【發(fā)明內(nèi)容】
包括以下幾點。
[0007] (1)將人血清白蛋白-白介素II即HSA-IL-2或人白介素II-血清白蛋白即 IL-2-HSA融合基因連接入真核質(zhì)粒載體構(gòu)建真核表達質(zhì)粒；
[0008] (2)用轉(zhuǎn)染的方法將兩種真核表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至CH0細胞株中；
[0009] (3)用含G418的選擇培養(yǎng)基篩選整合入融合基因HSA-IL-2或IL-2-HSA的穩(wěn)定轉(zhuǎn) 染細胞株；
[0010] (4)通過點雜交即Dot blot和蛋白質(zhì)免疫印跡即Western blot法篩選出能夠高 效表達融合蛋白的陽性克隆株；
[0011] (5)進行重復(fù)低密度鋪板克隆篩后獲得穩(wěn)定且融合蛋白表達量最高的陽性CHO單 克隆細胞株，穩(wěn)定高效表達人血清白蛋白-白介素II融合蛋白的CHO單克隆細胞株即CHO/ HSA-IL-2和穩(wěn)定高效表達人白介素II-血清白蛋白融合蛋白的CHO單克隆細胞株即CHO/ IL-2-HSA；
[0012] (6)將篩選得到的穩(wěn)定表達融合蛋白陽性克隆株進行懸浮馴化與發(fā)酵；用 Western blot和ELISA方法檢測收集蛋白液中融合蛋白的表達量；
[0013] (7)收集發(fā)酵液進行蛋白純化，先通過Blue親和柱調(diào)取含HSA的蛋白并除去大部 分的雜蛋白；調(diào)節(jié)電導(dǎo)與Phenyl柱平衡液相同后，上樣出去部分雜蛋白并將目的蛋白換液 至低鹽溶液中；再經(jīng)Q柱，獲得純的目的蛋白；
[0014] (8)經(jīng)脫鹽柱置換至PBS緩沖液中，根據(jù)藥典，利用CTLL-2細胞/MTT比色法對藥 物蛋白進行體外活性檢測，并與IL-2單體活性進行比較。
[0015] 所述融合蛋白在CH0細胞中分泌表達；優(yōu)先在CH0-S細胞表達。所述融合蛋白在 CH0細胞中懸浮培養(yǎng)表達。所述真核質(zhì)粒載體優(yōu)先選用pMH 3質(zhì)粒。
[0016] 所述CH0細胞株的用途在于制備治療腫瘤、肝炎和免疫缺陷性疾病的藥物。
[0017] 本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：
[0018] 本發(fā)明利用CH0表達系統(tǒng)的優(yōu)勢，建立構(gòu)建穩(wěn)定高效表達HSA和IL-2融合蛋白的 CH0細胞株的方法，篩選單克隆細胞，分別獲得高效表達融合蛋白HSA-IL-2和IL-2-HSA的 CH0細胞系，為HSA融合蛋白藥物提供新的表達思路。
【附圖說明】
[0019] 圖1為表達融合蛋白HSA-IL-2的細胞株96孔板Dot blot篩選圖；
[0020] 圖2為表達融合蛋白IL-2-HSA的細胞株96孔板Dot blot篩選圖；
[0021] 圖3為細胞株表達蛋白的Western blot篩選圖；挑選的12株高表達細胞株CH0/ HSA-IL-2的Western blot圖，泳道13為陽性對品；
[0022] 圖4為細胞株表達蛋白的Western blot篩選圖；挑選的11株高表達細胞株CH0/ IL-2-HSA的Western blot圖，泳道12為陽性對品；
[0023] 圖5為CH0/HSA-IL-2細胞株的3L搖瓶過程中細胞密度與活率監(jiān)測；
[0024] 圖6為CH0/HSA-IL-2細胞株的3L搖瓶過程中目的蛋白HSA-IL-2表達量監(jiān)測；
[0025] 圖7為CH0/IL-2-HSA細胞株的3L搖瓶過程中細胞密度與活率監(jiān)測；
[0026] 圖8為CH0/IL-2-HSA細胞株的3L搖瓶過程中目的蛋白IL-2-HSA表達量監(jiān)測；
[0027] 圖9為CH0細胞株表達藥物蛋白生物活性檢測；
[0028] 圖10為CH0細胞株表達藥物蛋白與單體蛋白等摩爾活性比較。
【具體實施方式】
[0029] 下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明進行具體描述。
[0030] 1、實驗材料：
[0031] 中國倉鼠卵巢細胞（CH0-S)、遺傳霉素G418(sigma)、表達載體pMH3、貼壁培養(yǎng)基 D001、懸浮培養(yǎng)基B001、流加培養(yǎng)基R)01均來自杭州安瑞普；兔抗人IL-2和鼠抗人HAS來 自HRP ;鼠抗人HAS來自abeam ;山羊抗兔二抗和山羊抗小鼠二抗來自碧云天公司；所用其 它試劑皆為分析純試劑。
[0032] 2、實驗儀器
[0033] 電轉(zhuǎn)儀；細胞培養(yǎng)箱；細胞搖床；常規(guī)的一次性耗材。
[0034] 3、實驗步驟
[0035] 3. 1、質(zhì)粒提取
[0036] 溶液配制：溶液 I :50mM 葡萄糖；25mM Tris-cl(pH 8.0) ;10mM EDTA(pH 8.0)，配 好后滅菌放在 4°C。溶液 II :0. 2mol/L NaoH;l% (m/L)的 SDS，現(xiàn)用現(xiàn)配。0. 4mol/L NaoH 與 2% (m/L)的 SDS 等體積混勻。溶液 III (lOOmL) :5mol/L KAc 60mL ;冰醋酸 11. 5ml ;水 28. 5mL〇
[0037] 操作步驟。培養(yǎng)12-16h的新鮮菌液6-8mL，12000rpm lmin，吸掉管底殘留培養(yǎng)基。 溶液I 300 yL，用移液器吹打使菌體充分重懸。溶液II 300 yL，小心翻轉(zhuǎn)EP管，待液體變 清澈后，靜置lmin。溶液III 300 yL，小心的混勻，有大量的白色絮狀析出（液體是透明 的）。12000rpm離心15min，移上清至一新EP管中，再重復(fù)一遍。加異丙醇至1. 5mL，-20°C， lOmin。12000rpm離心25min。在管里加lmL的75%乙醇漂洗沉淀，倒掉乙醇，瞭干。加 入超純水溶解，加入適量RNA酶，37°C lh。按體積比1:1加入苯酚，劇烈混勻，靜置2min。 12000rpm離心10min，小心吸取上清至一新EP管。按體積比1:1加入氯仿，劇烈混勾，靜置 2min。12000rpm離心10min，小心吸取上清至一新EP管。在上清中加入75 y L3M的NaAc， 加異丙醇至1. 5mL，_20°C，10min。12000rpm離心25min，倒掉上清，加入lmL的75%乙醇漂 洗。12000rpm離心2min，倒掉乙醇，瞭干。溶于適量的超純水中（100yL左右）。
[0038] 3. 2、細胞培養(yǎng)
[0039] 細胞復(fù)蘇：從液氮罐中取出凍存管，迅速置于37°C恒溫水浴鍋中，輕輕晃動，使其 快速融化。將凍存管中細胞懸液吸至離心管中，lOOOrpm ?min-1離心5min，棄去上清，加入 適量新鮮培養(yǎng)基重懸細胞（T25,5mL ;T75,10mL)，放入37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0040] 細胞傳代：CH0細胞培養(yǎng)于貼壁培養(yǎng)基中，37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞長至 融合度達80%以上時，將培養(yǎng)基吸出，用PBS洗滌2遍，加入lmL 0. 25%胰酶溶液消化，輕 晃細胞瓶待胰酶浸潤瓶壁，吸出部分胰酶，以殘留的少量胰酶繼續(xù)消化，并至于倒置顯微鏡 下觀察，待細胞變圓變亮后傾去剩余胰酶溶液，加入5mL含血清的新鮮培養(yǎng)基終止消化，并 用吸管輕吹瓶壁至細胞全部脫落，棄去部分細胞液，吸管輕微吹制成單個細胞懸液，再加入 適量培養(yǎng)基（T25,5mL;I75，10mL)，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。懸浮細胞則取處于生長對數(shù)期 細胞，計數(shù)，觀察細胞狀態(tài)，按照所需濃度和體積進行計算后，用一定量新鮮培養(yǎng)基B001重 懸，吹打混勾后置于llOrpm ? min-1，37°C恒溫搖床中培養(yǎng)。
[0041 ] 細胞計數(shù)：CH0貼壁培養(yǎng)細胞則待細胞匯合度至80 %時，消化細胞，收集所有細胞 離心管中，lOOOrpm ?min-1離心5min，棄去培養(yǎng)基，用lmL培養(yǎng)基重懸，吹打混勾，適當(dāng)稀釋 并以0. 1%臺盼藍進行染色計數(shù)。懸浮細胞則將培養(yǎng)瓶搖勻，直接吸取一定量細胞液，適當(dāng) 稀釋并以0. 1 %臺盼藍進行染