專利名稱：羥基脂肪酸寡聚物及其在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度中的應(yīng)用的制作方法
羥基脂肪酸寡聚物及其在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度中的應(yīng)用 抹水領(lǐng)域
本發(fā)明涉及羥基脂肪酸寡聚物及其在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和調(diào) 節(jié)細(xì)胞生長中的用途.
背景技術(shù)：
鈣離子生理功能概述
人的身體中，鈣元素含量超過1000克，人體中的鈣99%沉積在骨 駱和牙齒中，促進(jìn)其生長發(fā)育，維持其形態(tài)與硬度；剩下的只有不到 10克存在于血液和軟組織細(xì)胞中，恰恰是這少量的鈣，在生命過程中 起著至關(guān)重要的作用.19世紀(jì)末的英國心臟生理學(xué)家悉尼'林格
(Sydney Ringer)在研究蛙心的收縮功能的實(shí)驗(yàn)中，意識到鈣是一種 能維持心臟功能的特殊因子，從此揭開了研究鈣離子的序幕
(Sydney,1884),到了20世紀(jì)60年代，鉤離子驅(qū)動肌肉收縮的機(jī)理 也得以基本闡明.隨著認(rèn)識的不斷深入，鈣離子越來越多的功能被揭 示.鈣調(diào)蛋白的發(fā)現(xiàn)，使得鈣離子被確認(rèn)為是一種細(xì)胞信號傳導(dǎo)的栽 體，鈣信號在細(xì)胞功能控制中的關(guān)鍵地位也得以最終確立
(Cheung，1980).目前為止研究的比較多的鈣離子的功能如下:作為調(diào) 節(jié)細(xì)胞功能的信使，細(xì)胞外Ca"是重要的第一信使，通過細(xì)胞膜上的 鈣通道(電壓依賴性或受體門控性)或鈣敏感體(CaSR)發(fā)揮重要調(diào) 節(jié)作用.CaSR是G蛋白耦聯(lián)受體超家族C家族的成員，它存在于各 種細(xì)胞膜上，細(xì)胞外釣離子是其主要配體和激動劑，兩者結(jié)合后，通 過G蛋白激活碑脂酶C(PLC)-IP3通路及酪氨酸激酶-絲裂原蛋白激酶 通路，引起肌漿網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，以及細(xì)胞外鈣離子經(jīng)鈣庫搮 縱性鉀流通內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加.細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為第二信使， 例如肌肉收縮的興奮-收縮輛聯(lián)因子，參與骨輅肌，心肌，平滑肌興
奮收縮.作為激素和神經(jīng)遞質(zhì)的刺激-分泌輛聯(lián)因子，對人體內(nèi)分泌腺 激素的分泌有決定性作用，對維持循環(huán)、呼吸、消化、泌尿、神經(jīng)、 內(nèi)分泌、生殖等系統(tǒng)器官的功能至關(guān)重要(Petersen etal，1994),此外它還是體溫中樞調(diào)節(jié)點(diǎn)的主要調(diào)控介質(zhì)等.此外，調(diào)節(jié)酶的活性， 維持神經(jīng)-肌肉興奮性，對細(xì)胞的粘著、細(xì)胞膜功能的維持也有重要作 用，鈣離子參與血液凝固，參與免疫過程，鈣離子呈弱堿性，有效補(bǔ) 鈣可以調(diào)節(jié)人體的酸堿平衡.最近發(fā)現(xiàn)在每個(gè)細(xì)胞外都會有一層由鉤 離子組成的波狀物進(jìn)行有節(jié)奏的振動，如果缺鈣，振動就會減慢，細(xì)
胞的壽命就會減少，人的壽命也就會縮短(Ernesto, 2002).
總之，鈣是人體不可或缺的微量元素，它既是身體的構(gòu)造者，又 是身體的調(diào)節(jié)者，是我們?nèi)梭w的生命之源.細(xì)胞的活動幾乎時(shí)時(shí)刻刻 都離不開鈣離子信號的調(diào)節(jié)，無論是精子與印子的結(jié)合、胚胎發(fā)育的 啟動，還是體細(xì)胞的凋亡；無論是基因的表達(dá)、激素的分泌，還是記 憶系統(tǒng)的構(gòu)筑等，無不有鈣信號參與其中，鈣元素與細(xì)胞的關(guān)系之密 切，可謂生死相依.鈣就是一切(Cheng etal， 2006).
與有機(jī)分子不同，鈣離子既不能被制造，也不能被降解，只能被 束綽或轉(zhuǎn)移.研究表明細(xì)胞在靜止(非激活)狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度 一般是大約100-200納摩(1納摩等于10'9摩爾)，而細(xì)胞外液的鈣
離子濃度則在毫摩量級上(l毫摩等于10-3摩爾).胞漿游離Ca^濃度， 不但遠(yuǎn)低于細(xì)胞外液，而且低于肌漿網(wǎng)和線粒體內(nèi)的Ca"濃度，隨著 細(xì)胞的活動，胞漿Ca"濃度會發(fā)生變化，而這種變化正是調(diào)節(jié)機(jī)體多 種生命過程的基礎(chǔ).例如，心肌細(xì)胞胞漿游離Ca"濃度變化是心肌舒 縮活動的基礎(chǔ).內(nèi)分泌細(xì)胞的分泌活動也伴隨有細(xì)胞內(nèi)鈣的變化，因 此細(xì)胞溶質(zhì)Ca"通過多種途徑處于極為嚴(yán)格的調(diào)節(jié)控制之中，胞質(zhì)內(nèi) 游離鉤來源有兩條途徑細(xì)胞外Ca"內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣庫鈣的釋放.研 究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜含有3種跨膜鈣轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)l.鈣通道(Ca2+ channel)， 分為三類即電壓依賴性鈣通道(VOCs)、受體門控性鈣通道(ROCs) 和儲存開啟性鈣通道(SOCs)三個(gè)通道.2.^+/032+交換體(^+^82+ exchanger), 3.鉀泵(Ca2+pump，又稱Ca2+-ATP酶)，細(xì)胞內(nèi)鈣庫082+ 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)l.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放通道又叫受體門控離子通道，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣 釋放通道包括兩種類型藍(lán)尼定(ryanodine)受體門控離子通道和三 磷酸肌醇(IP3)受體門控離子通道.2.肌漿網(wǎng)鈣泵，3.肌漿網(wǎng)腔內(nèi)鈣結(jié) 合蛋白(Bootmanetal， 2001 ),可見生物體不僅有以"鈣泵"為代表的 鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，還有作為緩沖劑的鈣結(jié)合蛋白，它們共同作用，維 持正常細(xì)胞內(nèi)外鈣穩(wěn)態(tài)，
正是由于鈣離子在細(xì)胞的功能與代謝活動中發(fā)揮著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用，它不僅是細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)中的重要因素，而且參與細(xì)胞內(nèi)的 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、動作電位的形成和各種代謝活動.因此一旦鉀穩(wěn)態(tài)失衡可
引起細(xì)胞功能障礙和代謝棄亂，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡(Pierhiigi et al, 1990),離子通道病(channelopathy)是指離子通道的結(jié)構(gòu)或功能異常所
引起的疾病，具體表現(xiàn)在編碼離子通道亞單位的基因發(fā)生突變或表達(dá) 異常，或體內(nèi)出現(xiàn)針對通道的病理性內(nèi)源性物質(zhì)時(shí)，離子通道的功能 發(fā)生不同程度的減弱或增強(qiáng)，導(dǎo)致機(jī)體整體生理功能素亂，形成某些 先天性或后天獲得性疾病，主要累及神經(jīng)、肌肉、心臟、腎臟等系統(tǒng) 和器官(Hatta，2002).鈣離子通道廣泛存在于機(jī)體的不同類型組織細(xì) 胞中，參與神經(jīng)、肌肉、分泌、生殖等系統(tǒng)的生理過程.已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的 鈣通道病有家族性偏癱型偏頭痛、低鉀型周期性癱瘓、2-型發(fā)作性共濟(jì) 失調(diào)、6-型脊拔小腦共濟(jì)失調(diào)、中央脊號性肌病(central core disease of muscle)、惡性高熱、Lambert-Eaton肌無力綜合征(Nishimune， 2004 )、 癲癇等.
鈣離子栽體說明
隨著鈣離子在心臟功能中的關(guān)鍵性作用愈趨明朗，人們開始試?yán)?將其應(yīng)用于臨床治療.維拉帕米(Verapamil)是人類獲得的笫一種鈣 通道阻滯藥物，證實(shí)其作用機(jī)理是通過降低流入心肌細(xì)胞的鈣離子總 量，來調(diào)節(jié)心臟的功能性活動(BN Singh et al, 1978).有時(shí)，我們
需要激活胞內(nèi)鈣，升高胞內(nèi)鈣離子濃度來為我們服務(wù)，激活鈣通道或 轉(zhuǎn)運(yùn)鉤離子的藥物也受到了人們的關(guān)注，與阻斷藥物不同，這種藥物 增加胞內(nèi)鈣離子濃度，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞相關(guān)功能性代謝，
離子栽體(ionophore)是研究的較多的一種鈣激動劑，它是疏水 性的小分子，與Ca^等離子形成脂溶性復(fù)合物，可溶于雙脂層，提高 所轉(zhuǎn)運(yùn)離子的通透率，多為微生物合成，離子栽體也是以被動的運(yùn)輸 方式運(yùn)輸離子，可分成可動離子栽體(mobile ion carrier)和通道離子 栽體(channel former)兩類可動離子栽體栽體型分為中性離子栽 體和具有羧酸的羧基離子栽體二種.羧基離子栽體本來是一端具有羧 基的直鏈分子，但兩端通過氫鍵而形成環(huán)狀結(jié)構(gòu).在其內(nèi)部包以一價(jià) 或二價(jià)的陽離子.所以在膜內(nèi)的離子(M+， M2+)-離子栽體(r)復(fù)合 體作為]^+ r或M" r而存在.作為羧基離子栽體的A23187進(jìn)行Ca"的運(yùn)輸，可使膜對CaZ+的透性增高，通道離子栽體包括直鏈肽的短 桿菌肽、多烯型抗生素的菲律賓菌素、制審菌素、兩性審素B等.短 桿菌肽A ( granmicidin )形成長2.5-3 mn的螺旋狀的二分子結(jié)合體， 在膜上形成直徑0.4mn的穴，對H+有選擇能力，離子透性與越膜電位 無關(guān).后者被認(rèn)為與膽固醇形成復(fù)合體，多數(shù)集合起來形成管道，對 離子的特異性小，與陽離子相比對陰離子的透性更大，且對水那樣的 中性分子也可透過，同時(shí)離子的透性與電位大小有關(guān).這種通道并不 穩(wěn)定，不斷形成和解體，其運(yùn)輸效率遠(yuǎn)高于可動離子栽體.(楊寶峰， 2005)
下面是一些示例性的激動劑ionophoreRO 2-2985， Calcium Ionophore X-537A， calcium ionophore A23187,離子莓素(Ionomycin )， 血管緊張素II,三辨酸肌醇(內(nèi)釋)，藍(lán)尼定(Ryanodine內(nèi)釋)， 乙酰膽械(ACh)，緩激肽BK ( bradykinin )，依馬卡林(Emakalim ) 等，但是目前大部分只是在實(shí)驗(yàn)室階段使用，況且價(jià)格昂貴(劉道明， 2000)。
聚羥基脂肪酸酯及其塞聚體簡要說明
聚羥基脂肪酸醋(Polyhydroxyalkanoates， PHA)是微生物在生長 不平衡的環(huán)境下積累的能源和碳源貯藏物(Doi & Steinbttchel， 2002) . PHA優(yōu)良的生物降解性和生物相容性使其成為最為引人稱目 的組織工程材料(Chen & Wu，2005).組成PHA的單體多種多樣， 截至目前，已發(fā)現(xiàn)組成PHA的單體有100多種(Doi & Steinbiichel， 2002) . 3-羥基丁酸(3HB)是組成PHA的最常見的單體，也是動物 體內(nèi)酮體的基本成分之一.越來越多的證據(jù)表明，聚3-羥基丁酸
(PHB， 一種最為常見的PHA)不僅僅是某些細(xì)菌積累的貯藏物質(zhì)， 而且是廣泛存在的、涉及許多重要生理功能的生物活性物質(zhì)(Reusch， 1995).低分子量PHB和其他生物大分子的結(jié)合體存在于多種生物中
(Reusch, 1995)。
3HB的線狀或環(huán)狀寡聚物以及其其他衍生物可以提高體內(nèi)的明體 水平從而起到營養(yǎng)或治療的作用(Martin et al， 1999) , Tasaki等發(fā)現(xiàn) 二聚或三聚3HB可以作為受傷病人的能源底物(Tasaki etal， 1999), 3HB單體可以作為鉀離子內(nèi)流促進(jìn)劑，使胞內(nèi)鈣離子濃度上升，從而 減少鼠成纖維細(xì)胞L929在高密度培養(yǎng)條件下的死亡率(Cheng et al，2006).寡聚羥基脂肪酸及其衍生物有其特別的優(yōu)點(diǎn)l.本來是細(xì)胞膜 上的一種成分，無毒，血液中存在，可以注射使用.2借助脂質(zhì)體的 靶向性，作用于目標(biāo).
本發(fā)明一方面提供了寡聚羥基脂肪酸(OHgo hydroxyalkanoic acid 或OHA)，其結(jié)構(gòu)通式如下
<formula>formula see original document page 8</formula>
(I)
其中
中括號內(nèi)為結(jié)構(gòu)單元，各結(jié)構(gòu)單元可以相同或不同； n表示結(jié)構(gòu)單元的總數(shù)，選自1~100的整數(shù)； 各結(jié)構(gòu)單元的m獨(dú)立地選自1 ~ 3的整數(shù)；
各結(jié)構(gòu)單元的Ri獨(dú)立地選自由H、 d-C9的烷基、d-C9的烷氧基
和芳基構(gòu)成的組；
R2選自由H、 C,-C9的烷基、芳基和無毒金屬離子構(gòu)成的組.
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，R2選自由H、 d-Cs的烷基和無 毒金屬離子構(gòu)成的組；更優(yōu)選地，R2逸自由H、 d-C3的烷基、Na+、 K+和Ca^構(gòu)成的組.
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，Ri選自由H、 d-Cs的烷基、 CrCs的烷氧基構(gòu)成的組；更優(yōu)選地，R選自由H、 d-C3的烷基構(gòu)成 的組。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式，Ri選自由H、 d-C2的烷 基構(gòu)成的組，R2選自由H、 CrC2的烷基、Na+和K+構(gòu)成的組，
優(yōu)選地，m為1或2, ii為1 ~ 50的整數(shù)，并且當(dāng)m=l時(shí)，不 為甲基.通常，式(I)化合物的數(shù)均分子量不超過10000.
本發(fā)明另一方面提供了一種用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的制刑，含有作為活性成分的式(I)化合物或其對映異構(gòu)體.
所述制刑中還可以含有適當(dāng)?shù)脑泽w或賦形劑，例如蒸慵水、礦物 油、淀粉等，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)具體情況確定.該制劑可用于 提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，例如成纖維細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、 胰腺細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等.
本發(fā)明再一方面提供了一種用于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的制劑，含有作為
活性成分的權(quán)利要求i-io之任一項(xiàng)的化合物或其對映異構(gòu)體.
優(yōu)選地，所述制劑抑制細(xì)胞的增殖或者促進(jìn)細(xì)胞凋亡，優(yōu)選地， 所述細(xì)胞為癌細(xì)胞.該制劑用于治療癌癥.
本發(fā)明又一方面提供了式(I)化合物或其對映異構(gòu)體在制備用于調(diào) 節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的制劑中的用途，在制備用于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的制 劑中的用途，以及在制備用于治療鈣離子通道疾病的藥物中的用途. 所述鈣離子通道疾病例如為心臟壤?；蛐牧λソ?
四甲基噻唑藍(lán)(Thiazolyl blue或MTT)法檢測證明本發(fā)明的寡聚 物可以抑制癌細(xì)胞的增殖，并且呈濃度依賴型.低濃度(1 ~ 20 mg/L) 的寡聚物抑制效果不明顯，高濃度(>40 mg/L)寡聚物顯著抑制癌細(xì) 胞的增殖；細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)證明，寡聚物(40mg/L)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的凋 亡和死亡；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期顯示，寡聚物(40 mg/L)可以延長 細(xì)胞的Gi期，降低癌細(xì)胞的分裂程度，進(jìn)一步的鈣成像技術(shù)檢測顯示， 寡聚物可以刺激細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子濃度的升高，上述作用可能是通 過提高胞內(nèi)游離鈣離子濃度實(shí)現(xiàn)的。
附圖簡要說明
圖la-圖lb顯示了 OHB對鼠成纖維細(xì)胞L929生長的影響，圖la. 24 小時(shí)，圖lb. 48小時(shí)，* p<0.05 OHB liposome vs Blank liposome treatment
圖2a-圖2b顯示了 OHB對食管癌細(xì)胞EC109生長的影響圖2a. 24小時(shí)，圖2b. 48小時(shí)。* p<0.05 OHB liposome vs Blank liposome treatment
圖3a-圖3b顯示了 OHB對原代食管癌細(xì)胞生長的影響閨3a. 24 小時(shí)，困3b. 48小時(shí)，* p<0.05 OHB liposome vs Blank liposome treatment困4a-困^顯示了 OmclHA對食管癌細(xì)胞EC109生長的影響困 4a. 24小時(shí)，困4b. 48小時(shí).* p<0.05 Omcl HA liposome vs Blank liposome treatment
圖5a-圖5b顯示了 OHBHHx對食管癌細(xì)胞EC109生長的影響困 5a. 24小時(shí)，困5b. 48小時(shí)，* p<0.05 OHBHHx liposome vs Blank liposome treatment
圖6顯示了 OHB對鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞凋亡的影響^p〈0.05 OHB liposome vs Blank liposome treatment
圖7顯示了 OHBHHx對原代食管癌細(xì)胞細(xì)胞消亡的影響，* p<0.05 O朋HHx liposome vs Blank liposome treatment
圖8顯示了 03HB4HB對食管癌細(xì)胞EC109細(xì)胞凋亡的影響，* p<0.05 03BB4HB liposome vs Blank liposome treatment
圖9顯示了 OHB對鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞周期的影響,p〈0.05 OHB liposome vs Blank liposome treatment
困10顯示了 03HB4HB對食管癌細(xì)胞EC109細(xì)胞周期的影響，* p<0.05 03HB4HB liposome vs Blank liposome treatment


圖11顯示了 Omcl HA對原代食管癌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，* p<0.05 Omcl HAliposome vs Blank liposome treatment
圖12a-圖12b顯示了 OHB刺激小鼠成纖維細(xì)胞L929胞內(nèi)游離鈣 離子熒光強(qiáng)度變化.圖12a.細(xì)胞外液中有/無鈣離子條件下刺激細(xì)胞胞 內(nèi)游離鉀離子變化.圖12b.添加不同鈣離子阻斷刑的對比。
圖13a-困13b顯示了 OHBHHx刺激小鼠成纖維細(xì)胞L929胞內(nèi)游 離鈣離子熒光強(qiáng)度變化.圖13a.細(xì)胞外液中添加鈣離子螯合刑與不加 鈣離子螯合劑條件的對比.圖13b.添加加鈣離子阻斷劑的對比.
困14顯示了 03HB4HB刺激大鼠原代心肌細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子爽 光強(qiáng)度變化，
圖15顯示了 Omc舊A刺激大鼠原代心肌細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子爽 光強(qiáng)度變化.
具體實(shí)施例方式
本文所用的術(shù)語"Mn"是指數(shù)均分子量(number-average molecular weight),術(shù)語"OHA"是指寡聚羥基脂肪酸，或稱羥基脂肪酸寡聚物，可 以是由一種單體構(gòu)成的均聚物，也可以是由兩種或多種單體構(gòu)成的共 聚物.
本發(fā)明所指的羥基脂肪酸單體(hydroxyalkanoic acid或HA)可 以是單一立體結(jié)構(gòu)的化合物，如R、 S型，也可以是R、 S的混合物或 者外消旋物.寡聚羥基脂肪酸OHA包括寡聚的3-羥基丁酸(01igo hydroxybutyrate或OHB)、 3-羥基戊酸(01igo hydroxy valerate或 OHV)、 3-幾基己酸(OHgo hydroxyhexanoate或OHHx)、 3-輕基庚酸 (Oligo hydroxyHeptanoate 或 OHHp) 、 3-鞋基辛酸(Oligo hydroxyoctanoate或OHO)、 3-鞋基姿酸(01igo hydroxydecanoate或 OHD)、 4-羥基丁酸(01igo (4-hydroxybutyrate)或0-4HB)、 4-鞋基戊酸 (OUgo (4-hydroxyvalerate)或0-4HV)等的均聚物或共聚寡聚物，也包 括上述寡聚物的混合物，比如寡聚3-羥基丁酸-4-羥基丁酸共聚91 (Oligo (3勿droxybutyrate-co-4勿droxybutyrate)或03HB4HB), 寡聚3-羥基丁酸-3-羥基己酸共聚酯(Oligo (hydroxybutyrate-co-hydroxyhexanoate)或OHBHHx)，寡聚中長鏈脂肪酸共聚酯(OHgo medium chain length hydroxyalkanoate或OmclHA)等
本發(fā)明所述細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、胰腺P 細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等.本發(fā)明化 合物可以提高所述細(xì)胞胞內(nèi)的游離鈣離子濃度，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的凋 亡與壞死，神經(jīng)突觸的形成，激素的分泌等。
本發(fā)明所述的寡聚體可以通過高聚物的水解或酶解獲得，也可以 化學(xué)合成獲得.以脂質(zhì)體包哀寡聚物可以提高寡聚物轉(zhuǎn)入細(xì)胞的效 率，增大寡聚物的有效濃度，
為了更加詳細(xì)地解釋本發(fā)明，下面將結(jié)合附圖給出本發(fā)明的實(shí)施 例，這些實(shí)施例僅僅是出于解釋和說明的目的，不應(yīng)該被理解為是對 本發(fā)明范圍的限制.
實(shí)施例1 3-羥基丁酸塞聚體0)HB)的制備
準(zhǔn)確稱取3 g聚3 -羥基丁酸-4 -羥基丁酸(P3HB4HB )，加入 二氯甲烷200ml，于90"C回流。待PHB全部溶解后，加入對甲苯磺酸 0.3g，水0.5g，繼續(xù)回流反應(yīng)l小時(shí)后，補(bǔ)加水0.5g。 2小時(shí)后終止反應(yīng)，過濾，以冷甲醇沉淀，過濾，索氏提取器抽提12小時(shí)后于50 X:真空條件下干燥48小時(shí)備用，經(jīng)凝膠滲透色詳(GPC， Waters 1515)檢測數(shù)均分子量(number-average molecular weight或Mn )為 2000，核磁共振波譜(NMR， Bruker 400)分析產(chǎn)物不含烯鍵等細(xì)胞毒 害物質(zhì).
實(shí)施例2 塞聚3-羥基丁酸甲酯(OHB-CH3)的制備
取1 g PHB溶于幼mL三氯甲烷，在601C加熱回流2 h充分溶解， 滴加50 mL濃硤酸甲醇溶液(10 %v/v) ， 90TC加熱回流2b.加入50 mL 4TC預(yù)冷的甲醇，靜置lh，將混合溶液在8000rpm、 4TC條件下離心20 min，棄上清，加入甲醇重懸.重復(fù)上述步碟2次，50"C真空條件下干 燥48小時(shí)備用，得到含有OHB-OCH3固體的白色粉末.經(jīng)凝膠滲透 色謙(GPC， Waters 1515)檢測Mn為2000，核磁共振波詳(NMR， Bmker400)分析產(chǎn)物不含烯鍵等細(xì)胞毒害物質(zhì).
實(shí)施例3 塞聚3-羥基丁酸-4-羥基丁酸甲酯K)3HB4HB-CH^的制備
取1 g P3HB4HB溶于50mL三氯甲烷，在60"C加熱回流2h充分 溶解，滴加50mL濃硫酸甲醇溶液(10%v/v) ， 90TC加熱回流2h, 加入50mL41C預(yù)冷的甲醇，靜置lh，將混合溶液在8000 rpm、 4TC條 件下離心20min，棄上清，加入甲醇重懸.重復(fù)上迷步驟2次，50"C 真空條件下干燥48小時(shí)備用，得到含有OHB-OCH3固體的白色粉末， 經(jīng)凝膠滲透色諮(GPC, Waters 1515)檢測Mn為2100，核磁共振波 詳(NMR， Bruker 400)分析產(chǎn)物不含烯鍵等細(xì)胞毒害物質(zhì).
實(shí)施例4塞聚3-羥基丁酸3-羥基己酸甲醋(OHBHHx-CH^的制備
取lgPHBHHx溶于50mL三氯甲烷，在601C加熱回流2 h充分 溶解，滴加50mL濃硫酸甲醇溶液(10%v/v) ， 90TC加熱回流2h。 加入50mL4lC預(yù)冷的甲醇，靜置lh，將混合溶液在8000rpm、 4TC條 件下離心20min，棄上清，加入甲醇重懸.重復(fù)上述步驟2次，50oC 真空條件下干燥48小時(shí)備用，得到含有OHB-OCH3固體的白色粉末， 經(jīng)凝膠滲透色詳(GPC， Waters 1515)檢測Mn為2800，核磁共振波 詳(NMR， Bruker 400)分析產(chǎn)物不含烯鍵等細(xì)胞毒害物質(zhì).實(shí)施例5塞聚中長鏈羥基脂肪酸甲酯(OmclHA-CHj)的制備
1.5 g mclPHA純品溶于37.5 ml氯仿，701C攪拌^件下冷凝回流 30min，緩慢滴加15ml甲醇(5%體積的濃硫酸)，IOOTC高速攪拌冷 凝回流10h.冷卻致室溫，加15ml水振蕩均勻，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)有機(jī)溶刑氯 仿，甲醇，加15ml氯仿劇烈振蕩，靜置分層12h，取下相。對于上相 加5ml氯仿重新萃取一次.2g無水碟酸鎂加入到收集的有機(jī)相中，劇 烈攪拌3h，稍加熱后布氏漏斗抽濾.旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分有機(jī)溶刑， 將樣品oligomclPHA甲酯601C真空干燥。得到含有OmclHA-CH3的 油狀液體.經(jīng)凝膠滲透色詳(GPC， Waters 1515)檢測Mn為2300， 核磁共振波譜(NMR， Bruker 400)分析產(chǎn)物不含烯鍵等細(xì)胞毒害物 質(zhì)。
實(shí)施例6 —系列塞聚體甲醋表征
分子量使用凝膠滲透色謙法(Gel-permeation chromatography, GPC)測定。在401C下，使用配備有A"14微分折光率檢測器和紫 外檢測器的water 1515高效液相色詳儀測定樣品的分子量和分子量分 布。使用色謙純的氯仿為洗脫液，流速為lml/min.將待測樣品以2.0 mg/ml的濃度溶解在氯仿中，進(jìn)樣量為50^.標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)窄分布聚 苯乙烯標(biāo)樣制定.通過分子量的測定我們可以確認(rèn)我們甲醇解的產(chǎn)物為 寡聚體.
1H-NMR在Bmker AV 400 NMR核磁共振儀上于室溫下分析溶于 氘代氯仿(CDC13) (20mg/mL)中的聚合物的結(jié)構(gòu)，400MHz ^-NMR 謙圖獲得條件4jis的脈沖寬度，2T777.8 Hz的峰寬，32000個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)， 2048個(gè)聚點(diǎn).首先我們把制備的寡聚體的核磁波諉困與高聚物PHA對 比，在波謙圖上發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)新的位移位點(diǎn)就是-OCH3，根據(jù)端基OCBb和 重復(fù)單元中CH2核磁波詳圖中峰積分面積比值我門可以計(jì)算出寡聚體 的聚合度n (前面結(jié)構(gòu)式中出現(xiàn)的n) 結(jié)合滲透凝膠色譜測定分子量 我們就可以判定此為我們預(yù)期的寡聚體甲酯衍生物，此外在核磁共振 波詳圖中PPM為6.0和7.1處分別表示烯鍵碳原子上的氬原子，在我 們得到的波謙圖中沒有發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)峰，判定我們制備的寡聚體中沒有 出現(xiàn)烯鍵對細(xì)胞有毒害的產(chǎn)物.實(shí)施例7 OHA脂盾體的制備
稱取0.10 g卵褲脂，O,O5 g膽固醇，溶于20 ml氯仿，充分溶解混勻， 緩慢加入0.002 g氯仿溶解的OHA (任何一種)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮發(fā)氯 仿，使混合物成膜貼附在圃底燒瓶內(nèi)壁上，真空干燥48小時(shí)驅(qū)除干凈 氯仿.加15 ml 4'C存放的N-2-羥乙基哌嗪-N，-2-乙基磺酸緩沖液(即 HEPES， pH = 7.2 )水化30分鐘，將膜充分振蕩下來，補(bǔ)充5 ml PBS.水 浴條件下超聲處理20'C l5minl00%功率，間歇15 min，重復(fù)兩次， 獲得脂質(zhì)體懸液，測pH調(diào)整到7.2， 10000g離心，過濾除菌.脂質(zhì)體 中OHA含量由氣相色謙測定。
樣品處理將一干凈離心管計(jì)重，取脂質(zhì)體溶液于管中，水凍干 燥程粉末，計(jì)算前后重量差，計(jì)算出脂質(zhì)體寡聚體總重.將粉末置于 酯化管中，加入2mlSI化液，2ml氯仿，加蓋密閉，1001C烘箱醋化4 h，冷卻致室溫，加入lml蒸镩水，充分振蕩混勻，靜置分層，取下層 氯仿相GC分析.
標(biāo)樣處理準(zhǔn)確稱量10mg左右系列剃度(最少5個(gè)梯度)標(biāo)準(zhǔn) 物質(zhì)，于酶化管中加入2ml酯化液，2ml氯仿，加蓋密閉，100X:煤箱 酯化4h，冷卻致室溫，加入lml蒸錄水，充分振蕩混勻，靜置分層， 取下層氯仿相GC分析。
酯化液組成濃碟酸(98%)與甲醇3:97體積混合，含有l(wèi)g/L癸二
酸內(nèi)標(biāo).
依照Agilent公司GC Agilent6820氣相色謙儀的說明書操作氣相色譜 儀。設(shè)定柱頭溫度為140TC,進(jìn)樣器溫度為200X:，檢測器溫度為220TC, 柱頭壓力為0.25Mpa程序升溫條件為80TC維持1.5分鐘，以30*C/min 的速度升溫至1401C ，并在此溫度保持2分鐘，以5TC/min的速度升溫至 175TC，在此溫度保持3分鐘，樣品的進(jìn)樣量為進(jìn)樣使用上海安亭微 量進(jìn)樣器廠生產(chǎn)的微量進(jìn)樣器.
處理標(biāo)準(zhǔn)樣，以質(zhì)量對峰面積做標(biāo)準(zhǔn)曲線，作出擬合方程，將樣 品峰面積帶入曲線，分別求出每個(gè)樣品中每種單體的質(zhì)量，從而計(jì)算 出寡聚體質(zhì)量(每個(gè)寡聚甲酹上端基OC私忽略不計(jì)).將計(jì)算出的 脂質(zhì)體質(zhì)量除以做酯化反應(yīng)的樣品總重(脂質(zhì)體寡聚體總重)即可計(jì) 算出脂質(zhì)體中OHA含量。實(shí)施例8原代食道癌細(xì)胞的分離及培養(yǎng)
取新鮮食管癌組織切塊(蜱癌，汕頭大學(xué)腫瘤醫(yī)院)約5g，置于 DMEM培養(yǎng)液(Dulbcco's Modifed Eagle Medium )帶回.PBS緩沖液 漂洗三次至組織塊變白.剪碎成2-3mn^的小塊.加入0.25%胰酶溶 液5ml，消化10min,輕輕磨碎，以完全培養(yǎng)液沖洗，300目篩網(wǎng)過濾. 顯微鏡下觀察細(xì)胞大小差異大，細(xì)胞核大，呈現(xiàn)典型的癌細(xì)胞特征. 取濾液加至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，于37TC、 5。/。C02條件下在含10% FBS的 DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至細(xì)胞生長至70。/。密度時(shí)傳代培養(yǎng)，
實(shí)施例9大鼠原代心肌細(xì)胞的分離及培養(yǎng)
取K3天齡的SD大鼠，在無菌條件下開胸取出心臟，立即置入4 1C PBS液(磷酸緩沖液)中剪取心室肌，用移液管反復(fù)吹打充分洗凈 殘血，換新PBS液，剪成約1 11113大小的碎塊，輕輕吹打后棄去PBS 液，然后碎塊小心吸入25 ml無菌三角瓶中，加入0.1 %胰蛋白酶8 ml左 右，用鹽水瓶膠塞蓋緊瓶口，置室溫在磁力攪拌器上攪拌消化10min， 再棄去首次的消化懸液(主要含血細(xì)胞)，加入0.1%胰蛋白蘇消化液 消化IO min，如此重復(fù)，直至組織塊消失.分別收集每次消化懸液， 加等量含5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液終止消化，離心(1000 rpm/min，10 min)，棄上清，再加入含5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，用吸管輕輕 吹散沉淀細(xì)胞，同條件下再次離心，將每次離心后沉淀細(xì)胞合并，用 含10。/n胎牛血清DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，通過300目網(wǎng)篩濾過， 接種于玻璃培養(yǎng)瓶，置371C, 5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)，根據(jù)心肌細(xì)胞相對 成纖維細(xì)胞貼壁慢，采用差速貼壁lh，在培養(yǎng)液中獲得心肌細(xì)胞，細(xì) 胞計(jì)數(shù)并調(diào)整好細(xì)胞濃度，接種于6孔培養(yǎng)板(已經(jīng)提前加入了無菌 的細(xì)胞培養(yǎng)爬片)中，置37X:， 5%C02培養(yǎng)箱內(nèi).培養(yǎng)前4Sh，在心 肌細(xì)胞的培養(yǎng)液中，加入Brdu 0.1mmol/L，以抑制成纖維細(xì)胞的增殖. 在倒置相差顯微鏡下動態(tài)觀察細(xì)胞生長情況并攝像記錄.
實(shí)施例10 MTT(^唑蘭)法檢測OHB對小鼠成纖維細(xì)胞L929增殖 的影響
生長狀況良好的L929細(xì)胞(購于中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院)用胰酶消化液處理2分鐘，吸除消化液，加入新鮮培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，血 球計(jì)數(shù)板檢測細(xì)胞數(shù)量，接種于96孔板中(5xl()S個(gè)細(xì)胞/孔)，371C， 5% C02細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24小時(shí)后去掉培養(yǎng)液，PBS (褲酸鹽緩沖液， pH7,2)潤洗2遍，更換新鮮培養(yǎng)液，并加入含一系列濃度梯度(OHB 終濃度為5、 20、 40、 60mg/L)過濾滅菌的OHB脂質(zhì)體(Mn-2000， 磷脂濃度為2g/L)，每一濃度做6個(gè)平行孔；實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對照孔和 相同褲脂濃度的空白脂質(zhì)體孔.繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)后，檢測 細(xì)胞活性.每孔加入MTT(5,0g/L) lOjil， 371C溫育4小時(shí)，棄上清， 加入DMSO (二甲基亞砜)100 fil，振蕩數(shù)分鐘，30分鐘內(nèi)在全自動 酶標(biāo)儀上讀取570 nm處吸光值，并計(jì)算實(shí)驗(yàn)孔和空白對照孔的比值， 40、 60mg/L的OHB處理鼠成纖維細(xì)胞L929 24小時(shí)后，細(xì)胞活 力分別為空白孔的99.2±7.2%、 105.5±9.3%，而相同磷脂濃度的空白脂 質(zhì)體處理后細(xì)胞活力分別為對照孔的141.9±3.4%、 145.8±12.3%， 二 者相比差異顯著(P<0.05) . 40、 60mg/L的OHB脂質(zhì)體處理鼠成纖 維細(xì)胞L929 48小時(shí)后，細(xì)胞活力分別為空白孔的109.5±16.0%、 124.8±9.2 % ，而相同砩脂濃度的空白脂質(zhì)體處理后細(xì)胞活力分別為對 照孔的160.4±12.3%、 183.2±22.2%， 二者相比差異顯著(P<0.05)(圖 1).本實(shí)驗(yàn)說明了 OHB能夠抑制成纖維細(xì)胞增殖.
實(shí)施例11 MTT法檢測OHB對食管癌細(xì)胞系EC109增殖的彩響
生長狀況良好的EC109細(xì)胞(購于中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院)用胰酶 消化液處理2分鐘，吸除消化液，加入新鮮培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液， 血球計(jì)數(shù)板檢測細(xì)胞數(shù)量，接種于96孔板中(5xl()S個(gè)細(xì)胞/孔)，37 1C， 5% C02細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24小時(shí)后去掉培養(yǎng)液，PBS (砩酸鹽援沖 液，pH 7.2 )潤洗2遍，更換新鮮培養(yǎng)液，并加入含一 系列濃度梯度(OHB 終濃度為5、 20、 40、 60mg/L)過濾滅菌的OHB脂質(zhì)體(Mn = 2000， 礴脂濃度為2g/L)，每一濃度做6個(gè)平行孔；實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白孔和相同 礴脂濃度的空白脂質(zhì)體對照孔.繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)后，檢測 細(xì)胞活性.每孔加入MTT(5.0g/L) 10jU， 37TC溫育4小時(shí)，棄上清， 加入DMSO100jU,振蕩數(shù)分鐘，30分鐘內(nèi)在全自動酶標(biāo)儀上讀取570 nm處吸光值，并計(jì)算實(shí)驗(yàn)孔和空白對照孔的比值.
40、 60mg/L的OHB脂質(zhì)體處理食管癌細(xì)胞系丑(:10924小時(shí)后，細(xì)胞活力分別為空白孔的100.5±12.0%、 113.4±5.9%,而相同濃度的空 白脂質(zhì)體處理后細(xì)胞活力分別為對照孔的129,2±7.6%、 13S.2±S.8%， 二者相比差異顯著(P<0.05) . 20、 60mg/L的OHB脂質(zhì)體處理食管 癌細(xì)胞系EC109 48小時(shí)后，細(xì)胞活力分別為空白孔的101.5±8.3%、 122.2±lS.3o/。，而相同磷脂濃度的空白脂質(zhì)體處理后細(xì)胞活力分別為對 照孔的139.3±11.5%、 157.8±5.8%, 二者相比差異顯著(P<0.05 )(圖 2)。本實(shí)驗(yàn)說明了 OHB能夠抑制食管癌細(xì)胞增殖。
實(shí)施例12 MTT法檢測OHB對原代食管癌細(xì)胞增殖的彩響
生長狀況良好的原代食管癌細(xì)胞(傳至笫三代)用胰醉消化液處理 2分鐘，吸除消化液，加入新鮮培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，血球計(jì)數(shù)板檢 測細(xì)胞數(shù)量，接種于96孔板中(5"03個(gè)細(xì)胞/孔)，3710，5%(:02細(xì) 胞貼壁培養(yǎng)24小時(shí)后去掉培養(yǎng)液，PBS (磷酸鹽緩沖液，pH7.2)潤 洗2遍，更換新鮮培養(yǎng)液，并加入含一系列濃度梯度(OHB終濃度為 5、 20、 40、 60mg/L)過濾滅菌的OHB脂質(zhì)體(Mn-2000，鱗脂濃 度為2g/L)，每一濃度做6個(gè)平行孔；實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白孔和相同磷脂濃 度的空白脂質(zhì)體對照孔.繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)后，檢測細(xì)胞活 性，每孔加入MTT (5.0g/L) lOjil， 37"C溫育4小時(shí)，棄上清，加入 DMSO100jU,振蕩數(shù)分鐘，30分鐘內(nèi)在全自動蘇標(biāo)儀上讀取570nm 處吸光值，并計(jì)算實(shí)驗(yàn)孔和空白對照孔的比值.
20-60 mg/L的OHB脂質(zhì)體處理食管癌細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞活力 分別為空白孔的78,2±6.7%、 100.3±1.8%、 123.6±2.5%而相同磷脂濃 度的空白脂質(zhì)體處理后細(xì)胞活力分別為對照孔的125.8±5.7% 、 168.7±3.7%、 192.0±5.4%， 二者相比差異顯著(P<0.05) , 20-60 mg/L 的OHB脂質(zhì)體處理食管癌細(xì)胞48小時(shí)后，細(xì)胞活力分別為空白孔的 90.8±3.6%、 135.6±9.2%、 145.0±2.4%，而相同罅脂濃度的空白脂質(zhì)體 處理后細(xì)胞活力分別為對照孔的150.1±3.6%、 175.4±9.2%、 220.36±2.4 %, 二者相比差異顯著(P<0.05)(圖3).本實(shí)驗(yàn)說明了 OHB能夠 抑制食管癌細(xì)胞增殖.
實(shí)施例13 MTT法檢測OHBHHx對食管癌細(xì)胞系EC109增殖的彩響 生長狀況良好的EC109細(xì)胞(購于中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院)用胰酶 消化液處理2分鐘，吸除消化液，加入新鮮培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，
17血球計(jì)數(shù)板檢測細(xì)胞數(shù)量，接種于96孔板中(5xl()S個(gè)細(xì)胞/孔)，37 TC， 5% C02細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24小時(shí)后去掉培養(yǎng)液，PBS (砩酸鹽緩沖 液，pH 7.2)潤洗2遍，更換新鮮培養(yǎng)液，并加入含一系列濃度梯度 (OHBHHx終濃度為5、 20、 40、 60 mg/L)過濾滅菌的OHBHHx脂 質(zhì)體(Mn = 2800，含12mo1。/。 3-羥基己酸，磷脂濃度為2 g/L)，每 一濃度做6個(gè)平行孔；實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白孔和相同礴脂濃度的空白脂質(zhì)體 對照孔.繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)后，檢測細(xì)胞活性，每孔加入 MTT (5.0g/L) lOjd， 371C溫育4小時(shí)，棄上清，加入DMSO100nl， 振蕩數(shù)分鐘，30分鐘內(nèi)在全自動醉標(biāo)儀上讀取570nm處吸光值，并計(jì)
算實(shí)驗(yàn)孔和空白對照孔的比值.
40、 60 mg/L的OHBHHx脂質(zhì)體處理食管癌細(xì)胞系EC109 24小 時(shí)后，細(xì)胞活力分別為空白孔的103.8±8,1%、 101.7±7.2%，而相同磷 脂濃度的空白脂質(zhì)體處理后細(xì)胞活力分別為對照孔的128.7±5.8% 、 145.8:t6.3 % ， 二者相比差異顯著(P<0.05 ) 。 20、 60 mg/L的OHBHHx 脂質(zhì)體處理食管癌細(xì)胞系EC109 48小時(shí)后，細(xì)胞活力分別為空白孔的 129.2±7.6%、 135.2±5.8%,而相同褲脂濃度的空白脂質(zhì)體處理后細(xì)胞 活力分別為對照孔的139.3±11.5%、 157.8±5.8%， 二者相比差異顯著 (P<0.05)(圖4).本實(shí)驗(yàn)說明了 OHBHHx能夠抑制食管癌細(xì)胞增 殖.
實(shí)施例14 MTT法檢測OmdHA對食管癌細(xì)胞系EC109增殖的彩響 生長狀況良好的EC109細(xì)胞用胰酶消化液處理2分鐘，吸除消化 液，加入新鮮培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，血球計(jì)數(shù)板檢測細(xì)胞數(shù)量，接 種于96孔板中(5乂103個(gè)細(xì)胞/孔)，37"0，5%(:02細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24小 時(shí)后去掉培養(yǎng)液，PBS(礴酸鹽緩沖液，pH7.2)潤洗2遍，更換新鮮 培養(yǎng)液，并加入含一系列濃度梯度(OmclHA終濃度為5、 20、 40、 60 mg/L)過濾滅菌的Omc舊A脂質(zhì)體(Mn = 2300，含有1.6 mol% 3-羥 基己酸，24.6 rool% 3-鞋基辛酸，71.2 mol% 3-羥基癸酸和2.6 mol% 3-羥 基十二酸，辨脂濃度為2g/L)，每一濃度做6個(gè)平行孔；實(shí)驗(yàn)設(shè)置空 白孔和相同磷脂濃度的空白脂質(zhì)體對照孔.繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)和站小 時(shí)后，檢測細(xì)胞活性，每孔加入MTT (5.0g/L) lOpl， 37TC溫育4小 時(shí)，棄上清，加入DMSO 100 jil，振蕩數(shù)分鐘，30分鐘內(nèi)在全自動酶標(biāo)儀上讀取570 nm處吸光值，并計(jì)算實(shí)驗(yàn)孔和空白對照孔的比值.
40、 60mg/L的OmdHA處理食管癌細(xì)胞系EC109 24小時(shí)后，細(xì) 胞活力分別為空白孔的105.6±10.5°/。和115.0±8,9%,而相同礴脂濃度 的空白脂質(zhì)體處理后細(xì)胞活力分別為對照孔的128.7±5.8%、 145.8±6,3 %， 二者相比差異顯著(P<0.05) . OmclHA脂質(zhì)體處理食管癌細(xì)胞系 EC109 48小時(shí)后，和相同辨脂濃度的空白脂質(zhì)體處理無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖 5)。
實(shí)施例15 Annexin V-FITC檢測OHB對小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞凋 亡的彩響
0.25%胰酶溶液消化細(xì)胞，調(diào)節(jié)待測細(xì)胞的濃度為5xl()5-lxl(^個(gè) /ml, 取lml細(xì)胞，1000 rpm， 4TC離心10分鐘，棄上清。加入1 ml 冷的PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮離心，重復(fù)兩次.將細(xì)胞重懸于200^11 Binding Buffer,加入10 pl Annexin V-FITC和5 fil PI (北京寶賽試 劑)，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15分鐘，加入300 pi Binding Buffer, 在1小時(shí)內(nèi)上機(jī)(Beckman Coulter Epics XL流式細(xì)胞儀)檢測.結(jié)果 顯示，成纖維細(xì)胞經(jīng)過40 mg/L的OHB(Mn-2000，砩脂濃度為2g/L) 處理24h和48h后，調(diào)亡率分別較空白處理組高1.2%和1.9%,死亡 率分別增加了 8.42%和8.67%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(困6) 說明OHB 促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡和死亡。
實(shí)施例16 Annexin V-FITC檢測OHBHHx對原代食管癌細(xì)胞凋亡的 觸
0.25%胰酶溶液消化細(xì)胞，調(diào)節(jié)待測細(xì)胞的濃度為5xl0S-lxl()S個(gè) /ml, 取lml細(xì)胞，1000 rpm， 4TC離心10分鐘，棄上清。加入1 ml 冷的PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮離心，重復(fù)兩次.將細(xì)胞重懸于200^ Binding Buffer'加入10 Annexin V-FITC和5 pi PI (北京寶賽試 劑)，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15分鐘.加入300 ^ Binding Buffer, 在1小時(shí)內(nèi)上機(jī)(Beckman Coulter Epics XL流式細(xì)胞儀)檢測。結(jié)果 顯示，原代食管癌細(xì)胞(傳至第三代)經(jīng)過40 mg/L的OHBHHx (Mn =2800，含12moP/。3-羥基己酸，褲脂濃度為2 g/L)處理24 h和48 h 后，凋亡率分別較空白處理組高4.3%和1.7%，死亡率分別增加了8.5%和10.5%,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(閨7).說明OHBHHx促進(jìn)了細(xì)胞的 凋亡和死亡，
實(shí)施例17 Annexin V-FITC檢測Q3HB4HB對人原代食管癌細(xì)胞 EC109細(xì)胞凋亡的彩響
0.25%胰酶溶液消化細(xì)胞，調(diào)節(jié)待測細(xì)胞的濃度為5><105-1><106個(gè) /ml。 取lml細(xì)胞，1000 rpm， 4TC離心10分鐘，棄上清，加入1 ml 冷的PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮離心，重復(fù)兩次.將細(xì)胞重懸于200^1 Binding Buffer,加入10 pl Annexin V-FITC和5 PI (北京寶賽試 劑)，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15分鐘.加入300 pi Binding Buffer, 在1小時(shí)內(nèi)上機(jī)檢測，結(jié)果顯示，成纖維細(xì)胞經(jīng)過40 mg/L的03HB4HB (Mn=2100，含有7mo1。/。 4-羥基丁酸，蜂脂濃度為2 g/L)處理后24 h和48h后，凋亡率分別較空白處理組高3.1%和2.5%，死亡率分別 增加了 6.0%和6.5%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖8),說明03HB4HB促進(jìn) 了細(xì)胞的凋亡和死亡.
實(shí)施例18 流式細(xì)胞術(shù)檢測OHB對小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞周期的 彩響
胰酶消化細(xì)胞，1 ml培養(yǎng)液吹勻，1000 rpm離心10分鐘；棄去 上清，PBS清洗2次，0.5mlPBS吹勻；5ml注射器將細(xì)胞吸起并吹入 5 ml 70%預(yù)冷的乙醇中，4 TC固定過夜；1000 rpm離心10分鐘收集 固定細(xì)胞，PBS清洗2次；0.5mlPBS重懸細(xì)胞并輕輕吹勻(防止細(xì)胞 破碎)；加入1.5jilRNaseA至終濃度為10 |ig/ml， 371C消化30分鐘； 加入0,25 ml Pl溶液至終濃度為10 jig/ml，冰浴中遊光染色30分鐘； 上機(jī)(Beckman Coulter Epics XL流式細(xì)胞儀)檢測，通過軟件分析流 式細(xì)胞儀收集到的細(xì)胞群體，結(jié)果顯示，成纖維細(xì)胞經(jīng)過40 mg/L的 OHB ( Mn - 2000，罅脂濃度為2 g/L)處理24 h和48 h后，G"G，期 細(xì)胞數(shù)分別比空白脂質(zhì)體處理組增加了 10.1%和12.0°/。，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差 異(圖9)，說明了 OHB抑制成纖維細(xì)胞增殖的部分原因是延長了細(xì) 胞的Gt期所致。
實(shí)施例19 流式細(xì)胞術(shù)檢測03HB4HB對食管癌細(xì)胞系EC109細(xì)胞周期的影響
胰酶消化細(xì)胞，1 ml培養(yǎng)液吹勻，1000 rpm離心10分鐘；棄去 上清，PBS清洗2次，0.5mlPBS吹勻；5 ml注射器將細(xì)胞吸起并吹 入5ml70。/。預(yù)冷的乙醇中，4 TC固定過夜；1000 rpm離心10分鐘收 集固定細(xì)胞，PBS清洗2次；0.5mlPBS重懸細(xì)胞并輕輕吹勻(防止 細(xì)胞破碎)；加入1.5(URNaseA至終濃度為10|ig/ml， 371C消化30分 鐘；加入0.25 ml PI溶液至終濃度為10 jig/ml,冰浴中遊光染色30分 鐘；上機(jī)檢測，通過軟件分析流式細(xì)胞儀收集到的細(xì)胞群體.結(jié)果顯 示，食管癌細(xì)胞EC109經(jīng)40 mg/L的03HB4HB ( Mn 2100,含7 mol % 4-羥基丁酸，褲脂濃度為2g/L)處理24h和48h后，Gg/G,期細(xì)胞 數(shù)分別比空白脂質(zhì)體處理組增加了 11.3%和12.7°/。，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (圖10)，說明了 03HB4HB抑制食管癌細(xì)胞增殖的部分原因是延長 了細(xì)胞的G!期所致.
實(shí)施例20 流式細(xì)胞術(shù)檢測Omc舊A對原代食營癌細(xì)胞細(xì)胞周期的影 響
胰酶消化細(xì)胞，1 ml培養(yǎng)液吹勻，1000 rpm離心10分鐘；棄去 上清，PBS清洗2次，0.5mlPBS吹勻；5 ml注射器將細(xì)胞吸起并吹 入5ml70。/。預(yù)冷的乙醇中，4 TC固定過夜；1000 rpm離心10分鐘收 集固定細(xì)胞，PBS清洗2次；0.5 ml PBS重懸細(xì)胞并輕輕吹勻；加入 1.5plRNaseA至終濃度為10 ng/ml，37TC消化30分鐘'，加入0，25 ml PI 溶液至終濃度為10叫/ml，冰浴中避光染色30分鐘；上機(jī)檢測，通過
軟件分析流式細(xì)胞儀收集到的細(xì)胞群體.結(jié)果顯示，原代食管癌細(xì)胞 (傳至第三代)經(jīng)過40 mg/L的Omc舊A ( Mn - 2300，含有1.6 mol% 3-鞋基己酸，24,6 mol% 3-羥基辛酸，71.2 mol。/o3-羥基癸酸and 2.6 mol% 3-輕基十二酸，碑脂濃度為2 g/L)處理后24 h和48 h后，Go/Gt 期細(xì)胞數(shù)分別比空白脂質(zhì)體處理組增加了 7.1%和6.7% (困11)，無 統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.
實(shí)施例21 鈣成像法檢測塞聚3-羥基丁酸(OHB)對小鼠成纖維細(xì) L929胞內(nèi)鈣離子濃度的彩響
消化后的小鼠成纖維細(xì)胞L929在含有圃形玻片的六孔板中爬片培養(yǎng)，細(xì)胞完全貼壁后，移去培養(yǎng)孔中的原培養(yǎng)液，用PBS液沖洗細(xì)胞1 遍，加入10 jimol/L Fluo-4染料液150 jU,置于37"的COz培養(yǎng)箱里 避光醉育30 min.將染色后的細(xì)胞用Hanks液沖洗3遍，加入600 pl Hanks液后置于激光共聚焦顯微鏡(Zeiss Meta 510) 20倍可見光下尋 找區(qū)域及層面.選擇488nm氳離子激光，觀察染色的細(xì)胞的某一層面 的熒光圖像.連續(xù)掃描40張熒光圖象，灌流加脂質(zhì)體包袞的寡聚3-幾 基丁酸溶液(終濃度1 g/L)繼續(xù)掃描.相同的條件下用對照藥物處理.
鈣離子濃度檢測結(jié)果顯示，脂質(zhì)體包泉的OHB能夠引起成纖維細(xì) 胞胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度的突然升高了 400%,奉這個(gè)水平維持了 24秒， 而后鈣離子焚光強(qiáng)度逐漸下降到原來水平，熒光強(qiáng)度從出現(xiàn)變化到恢 復(fù)持續(xù)時(shí)間102秒，而對照組空白脂質(zhì)體的加入?yún)s幾乎沒有引起鈣離 子熒光強(qiáng)度的任何變化，兩者形成顯著性差異(困12)，這個(gè)現(xiàn)象在 很多重復(fù)實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證，結(jié)果顯示了 OHB可以引起成纖維細(xì)胞胞質(zhì) 內(nèi)鈣離子濃度的短暫增加
為研究OHB引起胞內(nèi)鈣離子濃度升高的機(jī)理，研究胞內(nèi)增加的鈣 離子是來源于胞外溶液，還是來源于胞內(nèi)鈣庫的釋放，分別使用含有 Ca"的Hanks溶液以及無鉀的Hanks溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn).結(jié)果顯示，在含 有鈣離子的Hanks液中，加入寡聚體之后，引起熒光強(qiáng)度升高400%， 而在無^5的Hanks液中，加入寡聚體，同樣是熒光強(qiáng)度增加，卻只是 升高了 100%,但是熒光強(qiáng)度下降比較援慢，兩者熒光強(qiáng)度從出現(xiàn)變化 到恢復(fù)持續(xù)時(shí)間相同(圖12).我們可以推測這種現(xiàn)象的原因是雖然 胞外沒有鈣離子，但是寡聚3-羥基丁酸借助脂質(zhì)體，被運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)， 啟動了胞內(nèi)鉀庫的釋放信號.
為了證實(shí)這種升高是由于藥物OHB刺激了細(xì)胞膜上的鈣通道及 胞內(nèi)相關(guān)受體信號，還是由于OHB本身引起的胞內(nèi)鈣離子濃度增加， 使用有鈣的Hanks液作為細(xì)胞外液，首先加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的的鈣釋放通道 阻斷劑普香卡因結(jié)果顯示在使用普魯卡因后，仍然觀察到細(xì)胞中鈣離 子熒光強(qiáng)度增加了 90%,持續(xù)了 90秒恢復(fù)(圖13)，由此可以推測 胞內(nèi)鈣離子不僅來源于鈣庫，還來源于胞外.Hanks液中又添加了細(xì) 胞膜鈣離子通道阻斷劑氯化鑭，仍然觀察到細(xì)胞中鈣離子熒光強(qiáng)度的 增加，但是增加幅度已經(jīng)下降到60%，持續(xù)了 90秒才恢復(fù)(困13)， 顯示了 OHB還具有攜帶釣離子進(jìn)入細(xì)胞的能力.上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明OHB促進(jìn)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加途徑是多樣 的，不僅能夠通過鈣離子通道內(nèi)流引起胞內(nèi)鈣離子升高，也能夠通過 引起胞內(nèi)鈣庫的釋放升高胞內(nèi)鈣離子濃度.更為關(guān)鍵的是也能連同脂 質(zhì)體起到向胞內(nèi)運(yùn)輸鈣離子的作用.
實(shí)施例22鈣成像法檢測塞聚3-羥基丁酸-3-羥基己酸(OHBHHx)對 小鼠成纖維細(xì)胞L929胞內(nèi)鈣離子濃度的彩響
消化后的小鼠成纖維細(xì)胞L929在含有圃形玻璃片的六孔板中爬片 培養(yǎng)，細(xì)胞完全貼壁后，移去培養(yǎng)孔中的原培養(yǎng)液，用PBS液沖洗細(xì) 胞1遍，加入10 jimol/L Fluo-4染料液150 置于37"C的C02培養(yǎng) 箱里避光孵育30mhi.將染色后的細(xì)胞用Hanks液沖洗3遍，加入600 W Hanks液后置于激光共聚焦顯微鏡(Zeiss Meta 510) 20倍可見光下 尋找區(qū)域及層面，選擇488nm氬離子激光，觀察染色的細(xì)胞的某一層 面的熒光圖像.連續(xù)掃描40張熒光困象，灌流加脂質(zhì)體包裒的寡聚-3 幾基丁酸-3-幾基己酸溶液(終濃度lg/L)繼續(xù)掃描.相同的條件下用 對照藥物處理.
鈣離子濃度檢測結(jié)果顯示，脂質(zhì)體包泉的OHBHHx也能夠引起成 纖維細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子熒光信號升高了 93%，而后鈣離子熒光強(qiáng)度緩慢 下降，持續(xù)96秒恢復(fù)到原來水平.而對照組空白脂質(zhì)體的加入?yún)s幾乎 沒有引起鈣離子熒光強(qiáng)度的任何變化，兩者差異性顯著(圖14),這 個(gè)現(xiàn)象在很多重復(fù)實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證，OHBHHx可以引起細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)鈣 離子濃度的突然變化，
為研究OHBHHx引起胞內(nèi)鈣離子濃度升高的機(jī)理，研究胞內(nèi)增加 的鈣離子是來源于胞外溶液，還是來源于胞內(nèi)鈣庫的釋放，在含鈣的 細(xì)胞外液中加入鈣離子螯合刑EGTA，結(jié)果顯示，在加入EGTA后， 同樣觀察到鈣圖象熒光強(qiáng)度緩慢增加，到最高點(diǎn)時(shí)也沒有在含有鈣離 子的Hanks液中熒光強(qiáng)度變化大(只有恥％ )(困14).我們可以推 測這種現(xiàn)象的原因是雖然胞外沒有鈣離子，但是OHBHHx借助脂質(zhì) 體，被運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)，啟動了胞內(nèi)鈣庫的釋放信號.
為了證實(shí)這種升高是由于OHBHHx刺激了細(xì)胞膜上的鈣通道及 胞內(nèi)的相關(guān)受體信號，還是由于OHBHHx本身引起的胞內(nèi)鈣離子濃度 增加，我們在細(xì)胞外液中加入了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的的鉤釋放通道阻斷刑普香卡因和細(xì)胞膜鈣離子通道阻斷刑氯化鋪.結(jié)果顯示在使用了氯化鑭和普
魯卡因后，仍然觀察到細(xì)胞中鈣離子濃度的増加(困15),看來OHBHHx 還具有攜帶鈣離子進(jìn)入細(xì)胞的能力.
結(jié)合上述分析，OHBHHx促進(jìn)胞內(nèi)^5離子濃度的增加途徑是多樣 的，不僅能夠通過鈣離子通道內(nèi)流引起胞內(nèi)鈣離子升高，也能夠通過 引起胞內(nèi)鈣庫的釋放升高胞內(nèi)鈣離子濃度.更重要的是也能連同脂質(zhì) 體起到向胞內(nèi)運(yùn)榆鈣離子的作用.
實(shí)施例23鈣成像法檢測塞聚-3羥基丁酸-4-羥基丁酸(03HB4HB) 對SD大鼠原代心肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度的彩響
按照實(shí)施例4方法分離的心肌細(xì)胞在含有圃形玻璃片的六孔板中 爬片培養(yǎng)，細(xì)胞完全貼壁后，移去培養(yǎng)孔中的原培養(yǎng)液，用PBS液沖 洗細(xì)胞1遍，加入10 jimol/L Fluo-4染料液150 置于371C的C02 培養(yǎng)箱里避光孵育30 min.將染色后的細(xì)胞用Hanks液沖洗3遍，加 入600 )il Hanks液后置于激光共聚焦顯微鏡(Zeiss Meta 510) 20倍可 見光下尋找區(qū)域及層面.選擇488nm氬離子激光，觀察染色的細(xì)胞的 某一層面的熒光困像.連續(xù)掃描60張熒光困象，灌流加脂質(zhì)體包襲的 寡聚-3鞋基丁酸-4-輕基丁酸溶液(終濃度l g/L)繼續(xù)掃描致400張. 相同的條件下用對照藥物處理.
鈣離子濃度檢測結(jié)果顯示，脂質(zhì)體包袞的03HB4HB能夠引起細(xì) 胞胞內(nèi)鈣離子熒光信號的連續(xù)的波動，隨著時(shí)間的延長，波動峰值逐 漸減小，而對照組空白脂質(zhì)體的加入?yún)s幾乎沒有引起鈣離子濃度的任 何波動變化(困16).兩者存在差異在于寡聚物所起的作用，即 03HB4HB刺激心肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子的波動.
實(shí)施例24鈣成像法檢測塞聚中長鏈3羥基脂肪酸(Omc舊A)對SD 大鼠原代心肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度的影響
細(xì)胞培養(yǎng)條件，熒光燃料染色，激光共聚焦顯微鏡參數(shù)選擇和對 照組設(shè)定與實(shí)施例18中相同.
激光共聚焦顯微鏡對鈣離子信號檢測結(jié)果顯示，脂質(zhì)體包塞的 Omc氾A能夠引起細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度的間斷性變化，而對照組 空白脂質(zhì)體的加入?yún)s幾乎沒有引起鈣離子熒光強(qiáng)度的任何變化，兩者
24存在明顯差異(困17).這種胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度波動是由于加入 OmclHA引起，
本文中所涉及的參考文獻(xiàn)，包括專利文件、學(xué)術(shù)論文、出版物等， 均以引用的方式將其全部內(nèi)容包括在本文中.
應(yīng)當(dāng)理解，在不偏離本發(fā)明的精神和范閨的情況下，本領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員可以在形式和細(xì)節(jié)上對其做出各種改變和改進(jìn)，而這些均 被認(rèn)為落入了本發(fā)明的保護(hù)范圍。春者文獻(xiàn)
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1.式(I)化合物，其中中括號內(nèi)為結(jié)構(gòu)單元，各結(jié)構(gòu)單元可以相同或不同；n表示結(jié)構(gòu)單元的總數(shù)，選自1～100的整數(shù)；各結(jié)構(gòu)單元的m獨(dú)立地選自1～3的整數(shù)；各結(jié)構(gòu)單元的R1獨(dú)立地選自由H、C1-C9的烷基、C1-C9的烷氧基和芳基構(gòu)成的組；R2選自由H、C1-C9的烷基、芳基和無毒金屬離子構(gòu)成的組。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R2選自由H、 d-Cs的烷基和無毒金屬離子構(gòu)成的組.
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的化合物，其中R2選自由H、 d-C3的烷基、Na+、 K+和Ca^構(gòu)成的組.
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中Rt選自由H、 d-Cs的烷基、 Q-Cs的烷氧基構(gòu)成的組.
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中R,選自由H、 d-C3的烷基構(gòu)成的組.
6. 根據(jù)權(quán)利要求l的化合物，其中R,選自由H、 d-C2的烷基構(gòu) 成的組，R2選自由H、 C廣Cz的烷基、Na+和K+構(gòu)成的組.
7. 根據(jù)權(quán)利要求l的化合物，其中，m為l或2，并且當(dāng)m-l時(shí)， R^不為甲基.
8. 根據(jù)權(quán)利要求l的化合物，其中，n為l-50的整數(shù).
9. 根據(jù)權(quán)利要求l的化合物，其數(shù)均分子量不超過10000.
10. 根據(jù)權(quán)利要求l的化合物，所述化合物選自由以下成員構(gòu)成的 組寡聚3-羥基丁酸、寡聚3-羥基戊酸、寡聚3-羥基己酸、寡聚3-羥 基庚酸、寡聚3-羥基辛酸、寡聚3-羥基壬酸、寡聚3-羥基癸酸、寡聚4-羥基丁酸、寡聚4-羥基戊酸、寡聚3-羥基丁酸-4-幾基丁酸共聚薛、 寡聚3-羥基丁酸-3-羥基己酸共聚醋、寡聚中長鏈脂肪酸共聚癍.
11. 一種用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的制劑，含有作為活性成分的 權(quán)利要求l-10之任一項(xiàng)的化合物或其對映異構(gòu)體，
12. 根據(jù)權(quán)利要求11的制刑，其中所述制刑用于提高細(xì)胞內(nèi)鈣離 子濃度.
13. 根據(jù)權(quán)利要求11或12的制劑，其中所述細(xì)胞選自由成纖維細(xì) 胞、食管癌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng) 膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞構(gòu)成的組.
14. 一種用于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的制劑，含有作為活性成分的權(quán)利要求 1-10之任一項(xiàng)的化合物或其對映異構(gòu)體.
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的制刑，其中所述制刑抑制細(xì)胞的增殖或者 促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡.
16. 根據(jù)權(quán)利要求14或15的制劑，其中所述細(xì)胞為癌細(xì)胞.
17. 根據(jù)權(quán)利要求16的制劑，其中所述制劑促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡.
18. 根據(jù)權(quán)利要求14的制刑，其中所述制劑用于治療癌癥.
19. 權(quán)利要求1-10之任一項(xiàng)的化合物或其對映異構(gòu)體在制備用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的制刑中的用途，
20. 權(quán)利要求1-10之任一項(xiàng)的化合物或其對映異構(gòu)體在制備用于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的制劑中的用途.
21. 權(quán)利要求1-10之任一項(xiàng)的化合物或其對映異構(gòu)體在制備用于治療鈣離子通道疾病的藥物中的用途.
22. 根據(jù)權(quán)利要求21的用途，其中所述鈣離子通道疾病為心臟驟?；蛐牧λソ?
全文摘要
本發(fā)明提供了羥基脂肪酸寡聚物及其在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度中的用途。試驗(yàn)證明，本發(fā)明的羥基脂肪酸寡聚物可以抑制癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡和死亡；延長細(xì)胞的G₁期，降低癌細(xì)胞的分裂程度。進(jìn)一步的鈣成像技術(shù)檢測顯示，本發(fā)明的寡聚物還可以刺激細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的升高。
文檔編號A61P3/14GK101313900SQ20071010667
公開日2008年12月3日 申請日期2007年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月29日
發(fā)明者代忠偉, 杰 孫, 陳國強(qiáng) 申請人:汕頭大學(xué)