專利名稱：一種提取和純化聚羥基脂肪酸酯生物塑料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取和純化細(xì)菌體產(chǎn)生的可生物降解的塑料一聚羥基脂肪酸 酯(PHA)的方法。
背景技術(shù)：
PHA是一種可生物降解的，生物相容的，微生物熱塑性塑料，其有可能替代由石油 衍生的熱塑性塑料。PHA的分子量在50-1000kDa范圍內(nèi)，其聚合物的特點(diǎn)與聚丙烯這樣的 常規(guī)的塑料相似。此外，PHA可由各種可再生資源如碳水化合物，有機(jī)酸，二氧化碳，有機(jī)廢 棄物等生產(chǎn)。然而，當(dāng)前生物合成的方法由于成本太高而受到限制。一種商業(yè)上可利用的共聚 物P(3HB-co-3HV)，當(dāng)前其每公斤價(jià)格超過5美元，比每公斤價(jià)格只有1 2美元的聚丙烯 昂貴得多。對(duì)生產(chǎn)成本影響較大的是菌株生產(chǎn)PHA的效率，碳來源和下游處理程序。商業(yè)開發(fā)PHA的主要障礙是從微生物回收PHA有難度，絕大部分現(xiàn)已被實(shí)施的涉 及到從細(xì)胞里提取PHA的方法不僅昂貴而且不利于環(huán)境保護(hù)。所以，需要一種簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)， 環(huán)境友好的方法來從微生物中回收細(xì)胞內(nèi)的PHA，以替代傳統(tǒng)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明描述了一種從富含PHA的細(xì)菌體內(nèi)提取和純化生物塑料聚羥基脂肪酸酯 (PHA)的方法，這種方法包括了步驟(a)提供包含富含PHA的細(xì)菌的干燥沉淀，(b)破碎干 燥沉淀，(c)用堿性溶液部分溶解步驟(b)獲得的磨碎的沉淀，(d)將步驟(c)所得富含PHA 的堿性溶液勻漿化，(e)從富含PHA的堿性溶液里分離出非PHA的細(xì)胞物質(zhì)(NPCM)，以及 (f)從富含PHA的堿性溶液里回收PHA顆粒。本發(fā)明由幾種新的特征和這些特征的結(jié)合組成，在下文的描述中將得到完整地描 述和闡述。應(yīng)當(dāng)理解的是，在不脫離本發(fā)明范圍或犧牲本發(fā)明任何優(yōu)點(diǎn)的前提下，可以在細(xì) 節(jié)上作出各種變化。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及一種提取和純化PHA的方法，在下文中，說明書將根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選 的實(shí)施例來描述本發(fā)明。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，在說明書中限制本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式僅僅 是為了方便本發(fā)明的討論，并且，可以預(yù)見到的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不脫離所附權(quán)利 要求的前提下設(shè)計(jì)出各種修改。實(shí)施例公開了從生物材料里提取和回收PHA聚合物的新的方法，其中生物材料來 自產(chǎn)生PHA的微生物。已經(jīng)有大量報(bào)道描述了從生物里溶解或鹵化提取PHA，主要是從生產(chǎn)PHA的微生 物里提取。最常用的化學(xué)物質(zhì)是三氯甲烷，二氯甲烷或1，2_二氯乙烷。通過這種回收方法， 能夠獲得細(xì)胞里超過90%的聚合物。然而，由于其對(duì)于環(huán)境有害的化學(xué)性質(zhì)，并且實(shí)施費(fèi)用昂貴，我們發(fā)現(xiàn)這種方法從經(jīng)濟(jì)角度是不可行的，特別是在需要工業(yè)規(guī)模的處理和提取PHA 的條件下。本發(fā)明的方法既適用于從能生產(chǎn)PHA聚合物的天然的或通過基因工程的微生物 里回收PHA，也可以從合成的PHAs里獲得。PHA是一種通用的微生物聚酯纖維，具有生物降 解性和生物兼容性。其物理性質(zhì)能通過改變其共聚物的成分而改變。PHA在細(xì)菌體里以獨(dú) 立的顆粒形式出現(xiàn)。PHAs是多種細(xì)菌累積碳和能量的儲(chǔ)存材料。PHA化合物是羥基烴酸的 聚酯。其聚合物單體均為D(-)構(gòu)型，暗示了生物合成路線的特性。根據(jù)材料的來源不同， PHA的分子量在200到3000KDa。由于其位于細(xì)胞內(nèi)，提取PHA的第一步是破碎細(xì)胞壁。破碎細(xì)胞壁包括機(jī)械的和 非機(jī)械的方法。完全破碎細(xì)胞壁和釋放出所有的細(xì)胞內(nèi)的成分需要破壞細(xì)胞壁中提供強(qiáng) 度的組分，也就是革蘭氏陰性細(xì)菌中的肽聚糖成分。具有最大的工業(yè)應(yīng)用潛能的細(xì)胞破壁 技術(shù)是機(jī)械方法。在機(jī)械破碎期間被監(jiān)測(cè)的性質(zhì)包括破壁效率(通過測(cè)量釋放的蛋白質(zhì)的 量，酶的活性或存活的細(xì)胞數(shù)目)以及對(duì)下游處理非常重要的物理性質(zhì)。不同的機(jī)械裝置 破碎的細(xì)胞的性質(zhì)不同(如細(xì)胞碎片的大小，微粒大小分布，粘度)，會(huì)影響到分離出目標(biāo) 產(chǎn)物的分離技術(shù)的效率。本發(fā)明已證實(shí)通過把化學(xué)方法和機(jī)械方法結(jié)合在一起能提高PHA的回收效率。如 堿性溶液的化學(xué)處理能增加細(xì)胞的滲透性，促成部分蛋白質(zhì)釋放。而這可以滿足部分分離 NPCM的需要，但釋放像細(xì)菌包涵體和PHA這樣的粒狀產(chǎn)品需要更完全的破碎。機(jī)械破碎引 起較高的能量需求，經(jīng)常導(dǎo)致細(xì)胞碎片微粉化(微粒尺寸減小)，從而阻礙了進(jìn)一步的分 離。將利用如堿性溶液的化學(xué)物質(zhì)預(yù)處理、增加單價(jià)陽離子濃度以及接下來的高壓力勻漿 技術(shù)相結(jié)合，破碎力被大大增強(qiáng)，在減小的操作壓力下被釋放的最大的蛋白質(zhì)接近單次跨 膜。本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施例中，用不同濃度的NaOH在30°C下作用1個(gè)小時(shí)來測(cè)試回 收細(xì)胞內(nèi)PHA的效率。0. lmol/L的NaOH處理后釋放的蛋白質(zhì)是0. 26g/g生物量，0. 5mol/ LNaOH處理后釋放的蛋白質(zhì)增加到0. 42g/g生物量。而且，用0. IM的NaOH處理后PHA的 純度達(dá)到46%。進(jìn)一步增加NaOH濃度到達(dá)lmol/L時(shí)，蛋白質(zhì)釋放量和PHA的純度分別達(dá) 到0. 54g/g生物量和67%。因此，隨著NaOH濃度的增加，蛋白質(zhì)的釋放量和PHA的純度也 相應(yīng)增加。另一方面，PHA的產(chǎn)量隨著NaOH濃度升高而下降，如在0. lmol/L的NaOH下PHA 產(chǎn)量是0. 26g/g生物量或80%的產(chǎn)量，在Imol/LNaOH下PHA產(chǎn)量是0. 2g/g生物量或64% 的產(chǎn)量。實(shí)施例把含有富含PHA細(xì)胞和生長(zhǎng)液的培養(yǎng)基在3500rpm離心過濾10分鐘。產(chǎn)生的沉 淀用蒸餾水漂洗2次，從而去除多余的如乙酸和丙酸的脂肪酸。棄上清液，將濕的沉淀放在 烘箱里在60°C的溫度烘干M小時(shí)，將烘干的物質(zhì)用研缽和杵進(jìn)行研磨以制備好細(xì)胞，以備 進(jìn)一步處理或4°C儲(chǔ)存。在30°C的溫度用0. 2M的NaOH處理含有PHA的5g/L的生物60分鐘，然后立刻進(jìn) 行勻漿化。勻漿用定轉(zhuǎn)子類的高速攪拌器固定在SOOOrpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行，這個(gè)轉(zhuǎn)速是節(jié)約能量 消耗的最低速度。樣本的溫度限制在不超過35°C，然后需要用冰或冷水冷卻樣品來延長(zhǎng)勻 漿時(shí)間。最后獲得的PHA用去離子水漂洗2次，在3500rpm的條件離心10分鐘，然后風(fēng)干。
權(quán)利要求
1.一種從富含聚羥基脂肪酸酯(PHA)細(xì)菌體內(nèi)提取和純化PHA的方法，該方法包括以 下步驟(a)提供包含富含PHA的細(xì)菌的干燥沉淀；(b)粉碎干燥沉淀；(c)用堿性溶液溶解步驟(b)得到的磨碎的沉淀；(d)將步驟(c)獲得的富含PHA的堿性溶液勻漿化；(e)從富含PHA的堿性溶液中分離出非PHA細(xì)胞物質(zhì)(NPCM)；以及(f)從富含PHA的堿性溶液中回收PHA顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中PHA選自由聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)，端羥 基的聚羥基丁酸酯(PHB-OH)的聚合物和共聚物組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中細(xì)菌體為能產(chǎn)生PHA的微生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中干燥沉淀是由富含PHA的細(xì)菌體在離心法分離后 制成的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中干燥沉淀于大約60°C溫度經(jīng)過約M小時(shí)制成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中堿性溶液為0.2mol/L的氫氧化鈉(NaOH)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中利用堿性溶液處理富含PHA的溶液的處理時(shí)間為 約60分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(d)在SOOOrpm轉(zhuǎn)速實(shí)施。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中對(duì)富含PHA的堿性溶液的勻漿化處理時(shí)間為18分鐘。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中NPCM從富含PHA的堿性溶液中通過離心分離而得。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中對(duì)NPCM的離心在大約3500rpm進(jìn)行兩次，每次 持續(xù)約10分鐘。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中PHA顆粒是從堿性溶液中通過在離心過程中用去 離子水漂洗兩次回收得到。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中PHA顆粒通過烘干干燥沉淀制得。
全文摘要
聚羥基脂肪酸酯(PHA)是一種微生物合成的細(xì)胞內(nèi)的聚合物，其在微生物內(nèi)作為碳和能量的貯存材料。這種可被生物降解的材料具有和基于石油化學(xué)的熱塑性塑料相似的性質(zhì)。當(dāng)前從細(xì)菌懸液中提取和純化PHA是用溶解或基于鹵化的方法，這些方法價(jià)格昂貴且對(duì)環(huán)境產(chǎn)生嚴(yán)重危害。本發(fā)明公開了一種用堿液和勻漿法結(jié)合處理來提取和純化PHA的方法，該方法獲得的PHA的純度和回收率都更高。
文檔編號(hào)C08G63/88GK102124045SQ200980100806
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2009年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月18日
發(fā)明者馮來義, 溫文帝, 白井義人, 穆赫德·艾里·漢山 申請(qǐng)人:馬來西亞博特拉大學(xué)