專利名稱：：糖基化改造的抗體治療的制作方法糖基化改造的抗體治療相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求享有2006年6月9日提交的題為"實(shí)體瘤的Fc受體多態(tài)性作為抗體介導(dǎo)的治療的預(yù)后"的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/812,322的權(quán)益，并要求享有2007年1月29日提交的題為"糖基化改造的抗體治療"的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/897,966的權(quán)益。這些優(yōu)先權(quán)文件的內(nèi)容通過引用一皮整體并入本文。
背景技術(shù)：
：?jiǎn)慰寺】贵w(mAb)作為治療人疾病如癌癥的一類重要的治療劑而出現(xiàn)[l、2]。癌癥治療目前使用的mAb是IgG型，是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(CHO細(xì)胞或小鼠NSO細(xì)胞系等)中生產(chǎn)的。識(shí)別抗原并與輩巴如肺瘤細(xì)胞結(jié)合之后，mAb可以觸發(fā)各種效應(yīng)功能，包括l)抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);2)補(bǔ)體依賴性的細(xì)胞毒性(CDC);和/或3)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)變化，例如，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。已知在Fc結(jié)構(gòu)域的保守糖基化位點(diǎn)(N297)處適當(dāng)?shù)奶腔窃趍Ab和Fc受體(FcR)之間發(fā)生有效的相互作用和FcR-介導(dǎo)效應(yīng)功能，包括抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和補(bǔ)體依賴性的細(xì)胞毒性(CDC)所必需的。已證實(shí)除去N-聚糖嚴(yán)重地?fù)p害ADCC和CDC。另一方面，不同形式的糖基化(即糖基化狀態(tài))發(fā)揮顯著不同的效應(yīng)，一些是有利的，其它則是有害的。例如，在Fc-y受體IIIa(FcgRIIIa)介導(dǎo)的ADCC的效力方面，去巖藻糖基化的糖基化HERCEPTIN顯示出比具有ot-l,6-連接的巖藻糖殘基的HERCEPTIN多至少50倍的活性[2b]。利妥昔單抗(Rltximab)和其它mAb報(bào)道了相似的結(jié)果[2c、2d]。遺憾的是，重組mAb目前是通過基因工程生產(chǎn)的，得到的抗體蛋白以混合的糖基化狀態(tài)(也稱為mAb的糖形(glycoform))存在，其中可能僅存在少量活性較大的糖形(例如，去巖藻糖基化的和/或等分的含有GlcNAc的N-聚糖)或者活性較大的糖形可能以5個(gè)或更多個(gè)糖形的組件存在。由于其基因工程來源，所有目前市售的mAb得到的均是mAb糖形的混合物。此外，糖基化狀態(tài)通過例如增加或降低ADCC而影響基于抗體的治療。ADCC總效力中的另一個(gè)因素是Fcy受體(FcgR)的多態(tài)性性質(zhì)。例如，具有FcgRIIIa(CD16a)的純合的氨基酸位置158纈氨酸/纈氨酸(V/V)等位基因[2e]或具有Fcy受體IIa(FcgRIIa)氨基酸位置131組氨酸/組氨酸(H/H)等位基因的淋巴瘤患者顯示出對(duì)利妥昔單抗(rituxmab)治療更高的響應(yīng)率。FcgRIIIa(CD16a)158V等位基因和FcgRIIa(FcgRIIa,CD32)131H等位基因分別比苯丙氨酸(F)等位基因和精氨酸(R)等位基因具有更高的對(duì)人IgGl的親和力，導(dǎo)致更有效的ADCC[3]。經(jīng)多變量分析，這兩個(gè)FcY受體(FcgR)的多態(tài)性獨(dú)立地預(yù)期更長(zhǎng)的無進(jìn)展生存期[4]。鑒于此，純化或制備具有優(yōu)化了對(duì)特定FcgR多態(tài)性的親和力以增強(qiáng)ADCC、CDC等的特定糖基化狀態(tài)的重組mAb在治療上是有利的。典型的免疫球蛋白G(IgG)抗體由兩條輕鏈和兩條重鏈組成，所述兩條輕鏈和兩條重鏈彼此締合而形成通過柔性4交《連區(qū)連接的三個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域兩個(gè)相同的抗原結(jié)合(Fab)區(qū)和恒定(Fc)區(qū)。IgG-Fc區(qū)是同型二聚體，其中兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域通過非共價(jià)相互作用配對(duì)。兩個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域不配對(duì)，但是每個(gè)結(jié)構(gòu)域均在Asn-297處具有保守的N-糖基化位點(diǎn)。抗體進(jìn)行識(shí)別和與靼細(xì)胞結(jié)合之后，將通過抗體的Fc區(qū)與效應(yīng)細(xì)胞上的配體如FcgR(FcgRI、FcgRII和FcgRIII)和補(bǔ)體的Clq組分的結(jié)合而觸發(fā)ADCC和其它效應(yīng)功能?？贵w的必要效應(yīng)功能依賴于抗體Fc區(qū)的適當(dāng)糖基化[5、6]。IgG-FcN-聚糖天然以具有相當(dāng)異質(zhì)性的雙觸角復(fù)合體存在。已表明不同的IgG-Fc糖基化狀態(tài)誘發(fā)顯著不同的效應(yīng)功能。Jeffries等已證實(shí)N29^7-聚糖的核心結(jié)構(gòu)(Man3GlcNAc2),特別是開始的三個(gè)殘基(ManGlcNAc2)是賦予抗體IgG-Fc的顯著穩(wěn)定性和效應(yīng)子活性所必需的[7-9]。結(jié)構(gòu)研究提示所述N-聚糖可能主要通過穩(wěn)定Fc結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象而發(fā)揮其效應(yīng)[8、10、11〗。幾個(gè)組已寺艮道核心N297-聚糖中P-l,4-連接平分型GlcNAc殘基的存在可顯著地增強(qiáng)抗體的ADCC活性[12-14]。后續(xù)研究提示缺乏a-l,6-連接的巖藻糖殘基，而不是存在平分型GlcNAc可能在增強(qiáng)抗體的ADCC活性中發(fā)揮更大作用[15]。此外，其它組也已報(bào)道了各種結(jié)論，末端Gal殘基可能會(huì)或不會(huì)正向影響效應(yīng)功能[16-19]。值得注意的是，這些研究涉及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(例如，CHO細(xì)胞系)中表達(dá)的人IgG的異種糖基化狀態(tài)，而從此混合物中分離具有特定糖基化狀態(tài)的人IgG極其困難。少量高活性物質(zhì)的雜質(zhì)即可顯著地干擾結(jié)果和數(shù)據(jù)解讀。因此，鑒于各種報(bào)道，尚未確定特異性IgG-FcN-聚糖結(jié)構(gòu)(即糖基化狀態(tài))對(duì)生物活性的影響的明確關(guān)系。細(xì)胞內(nèi)糖基化改造作為獲得用于結(jié)構(gòu)研究和用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的人樣同種糖蛋白的有吸引力的方法應(yīng)運(yùn)而生[6,14，20-24]。例如，在重組CHO細(xì)胞系中GnTIII基因(負(fù)責(zé)向N-聚糖添加平分型GlcNAc)的過表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生具有增加數(shù)量的平分型GlcNAc的mAb,其顯示出增加的ADCC活性(通過所述mAb對(duì)FcgRIII更高親和力的結(jié)合)[13、14]。在FucT-8敲除CHO細(xì)胞(缺乏a-l,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)中表達(dá)mAb導(dǎo)致mAb的非巖藻糖基化或低巖藻糖含量糖基化狀態(tài)，所述mAb顯示出增強(qiáng)的ADCC[25、26]。更近地，Gemgross等改造了酵母畢赤酵母(尸zc/Ha/MWon力系統(tǒng)以從頭表達(dá)人樣mAb,其產(chǎn)生缺乏a-l,6-巖藻糖部分的典型的雙觸角復(fù)合體型N-聚糖[6]。細(xì)胞內(nèi)糖改造顯示出非常大的生產(chǎn)具有增加數(shù)量的所需糖基化狀態(tài)的糖蛋白的潛能。但是，預(yù)先存在的的細(xì)胞內(nèi)糖改造方法導(dǎo)致產(chǎn)生具有各種糖基化狀態(tài)的異種mAb。此外，表達(dá)系統(tǒng)的戲劇性遺傳工程可造成宿主系統(tǒng)的不穩(wěn)定和表達(dá)效率低下。因此，本領(lǐng)域長(zhǎng)期以來一直需要生產(chǎn)具有特定糖基化狀態(tài)的同種重組mAb和使用它們治療需要其的受治療者的方法。其它和進(jìn)一步的對(duì)象、特征和優(yōu)點(diǎn)將是清楚可見的。、'發(fā)明概述在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生糖基化改造的抗體的方法，所述方法包括檢測(cè)樣品中的Fc受體(FcR)多態(tài)性，其中所述多態(tài)性與對(duì)單克隆抗體(mAb)響應(yīng)度差有關(guān)；將所述mAb的Fc區(qū)去糖基化；然后用糖連接所述mAb的去糖基化Fc區(qū)以生產(chǎn)與未糖基化改造的mAb相比具有增加的生物活性的糖基化改造的抗體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述方法，其中mAb是IgG抗體，在某些實(shí)施方案中是IgGl抗體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述方法，其中用糖連接所述mAb的去糖基4匕Fc區(qū)通過轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)執(zhí)行，例如，如以產(chǎn)生卩-1,4連接。在某些實(shí)施方案中，所述去糖基化步驟包括從Fc區(qū)去除至少一個(gè)巖藻糖、N-聚糖、甘露糖或類似物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生糖基化改造的抗體的方法，所述方法包括片企測(cè)樣品中的Fc受體(FcR)多態(tài)性，其中所述多態(tài)性與對(duì)單克隆抗體(mAb)響應(yīng)度差有關(guān)；將所述mAb去巖藻糖基；切割具有異種N-聚糖的mAb,其中所述N-聚糖是在所述mAbN-297位置處連接的糖；然后用糖連接所述去巖藻糖基化和切割的mAb以生產(chǎn)與未糖基化改造的mAb相比具有增加的生物活性的糖基化改造的抗體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述方法，其中mAb是IgG抗體，在某些實(shí)施方案中是IgGl抗體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述方法，其中用糖連接所述去巖藻糖基化和切割的mAb通過轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)來進(jìn)行，例如，如以產(chǎn)生卩-1,4連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生糖基化改造的抗體的方法，所述方法包括才全測(cè)樣品中的FcR多態(tài)性，其中所述多態(tài)性與對(duì)單克隆抗體(mAb)響應(yīng)度差有關(guān)；對(duì)所述mAb的Fc區(qū)去糖基化；然后用糖連接所述mAb的去糖基化Fc區(qū)以生產(chǎn)與未糖基化改造的mAb相比具有增加的生物活性的基本上純的糖基化改造的抗體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述方法，其中mAb是IgG抗體，在某些實(shí)施方案中是IgGl抗體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述方法，其中用糖連接所述去糖基化的mAb通過轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)來進(jìn)行，例如，如以產(chǎn)生卩-1,4連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療癌癥受治療者的方法，所述方法包括檢測(cè)樣品中的FcR多態(tài)性，其中所述多態(tài)性與對(duì)抗體治療響應(yīng)度差有關(guān)；產(chǎn)生糖基化改造的抗體，其中所述糖基化改造的抗體與所述抗體治療相比具有增加的生物活性；然后為所述癌癥受治療者施用所述糖基化改造的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療癌癥受治療者的方法，所述方法包括檢測(cè)樣品中的FcR多態(tài)性，其中所述多態(tài)性與對(duì)抗體治療響應(yīng)度差有關(guān)；確定糖基化改造的抗體，其中所述糖基化改造的抗體與所述抗體治療相比具有增加的生物活性；然后為所述癌癥受治療者施用所述糖基化改造的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療具有免疫相關(guān)疾病或病癥的受治療者的方法，所述方法包括檢測(cè)樣品中的FcR多態(tài)性，其中所述多態(tài)性與對(duì)抗體治療響應(yīng)度差有關(guān)；產(chǎn)生糖基化改造的抗體，其中所述糖基化改造的抗體與所述抗體治療相比具有增加的生物活性；然后為所述具有免疫相關(guān)疾病或病癥的受治療者施用所述糖基化改造的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療需要其的受治療者的方法，其中所述方法包括施用糖基化改造的抗體，其中所述抗體誘導(dǎo)或抑制共刺激分子或途徑。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述方法，其中需要其的受治療者包括癌癥受治療者或具有免疫相關(guān)疾病或病癥的受治療者。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述方法，其中需要其的受治療者具有或不具有FcR多態(tài)性。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述方法，其中共刺激分子或途徑在靼細(xì)胞或靶細(xì)胞之外的另一細(xì)胞中受到誘導(dǎo)或抑制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及控制毒性的方法，所述方法包括為需要其的受治療者施用糖基化改造的抗體，其中所述糖基化的解離常數(shù)。本文描述的方法可應(yīng)用于其中需要的受治療者和/或靶具有或缺乏FcR多態(tài)性的情況。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述方法，其中所述調(diào)節(jié)包括生物活性的增加或降^^。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)的方法，所述方法包括施用糖基化改造的抗體。本發(fā)明所述方法擁有調(diào)節(jié)的ADCC,其意味著起始(對(duì)照)mAb的生物活性的增加或降低。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述方法，其中相應(yīng)的FcR是效應(yīng)子受體，如Fc-g受體(FcgR)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用具有需要的糖基化狀態(tài)的抗體，確定所述糖基化狀態(tài)對(duì)生物活性的影響以治療需要其的受治療者的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過本文描述的方法產(chǎn)生的抗體和包含所述抗體的組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述方法，其中抗體是mAb，優(yōu)選為IgG抗體，在某些實(shí)施方案中是IgGl抗體。預(yù)期的非示例性抗體包括治療型糖基化改造的抗體，其中起始抗體包括但不限于，西妥昔單抗、利妥西單抗、莫羅莫那-CD3、阿昔單抗、達(dá)利珠單抗、巴利昔單抗、帕利珠單抗、英利昔單抗、曲妥珠單抗、吉妥珠單抗奧唑米星、阿侖單抗、替伊莫單抗(ibritumomabtiuxetan)、阿達(dá)木單抗、奧馬珠單抗(omalizumab)、托西莫單抗、1-131托西莫單抗、依法利株單抗、貝伐單抗、帕尼單抗、帕妥珠單抗、那他珠單抗、依那西普(etanercept)、IGN101(Aphton)、瓦羅西昔單抗(volodximab)(BiogenIdec和PDLBioPharm)、抗-CD80mAb(BiogenIdec)、抗-CD23mAb(BiogenIdel)、CAT-3888(CambridgeAntibodyTechnology)、CDP-791(Imclone)、依帕珠單抗(eraptuzumab)(Immunomedics)、MDX-010(Medarex和BMS)、MDX-060(Medarex)、MDX-070(Medarex)、馬妥珠單抗(Merck)、CP-675,206(Pfizer)、CAL(Roche)、SGN-30(SeattleGenetics)、才L木單4元(Serono禾口Genmab)、阿德、木單^元(Sereno)、奧戈伏單抗(UnitedTherapeutics),尼妥珠單抗(YMBioscience)、ABT-874(AbbottLaboratories)、地諾蘇單抗(Amgen)、AM108(Amgen)、AMG714(Amgen)、芳妥珠單抗(BiogenIdec和PDLBioPharm)、達(dá)利珠單抗(BiogentIdec和PDLBioPharm)、戈利木單#元(Centocor禾口Schering-Plough)、CNTO1275(Centocor)、ocrelizumab(Genetech和Roche)、HuMax-CD20(Genmab)、貝利單抗(HGS和GSK)、依帕珠單抗(Immunomedics)、MLN1202(MillenniumPharmaceuticals)、維西珠單抗(PDLBioPharm)、托珠單抗(Roche)、ocrerlizumab(Roche)、塞妥珠單抗(certolizumabpegol)(UCB,以前的Celltech)、依庫(kù)珠單抗(AlexionPharmaceuticals^培克珠單抗(AlexionPharmaceuticals和Procter&Gamble)、阿昔單抗(Centocor)、雷珠單抗(Genetech)、美泊利珠單抗(GSK)、TNX-355(Tanox)或MYO-029(Wyeth)。另一實(shí)施方案涉及生產(chǎn)具有需要的糖基化狀態(tài)的抗體的方法，所述方法包括如下步驟a)除去一個(gè)或多個(gè)糖，b)化學(xué)合成糖，和c)將所述化學(xué)合成的糖酶促連接至(l)所述抗體或(ll)與所述抗體連接的糖。另一實(shí)施方案涉及第段所述方法，其中所述化學(xué)合成的糖包含嗜唑啉環(huán)。另一實(shí)施方案涉及第或段所述方法，其中所述酶是內(nèi)切糖苷酶，所述酶促連接包含轉(zhuǎn)糖基作用。另一實(shí)施方案涉及第-,殳所述方法，其中所除去的糖是天冬酰胺連接的糖，多肽在步驟a)之后在所述天冬酰胺處保留N-乙酰葡萄糖胺，并且所述酶促連接是與所述N-乙酰葡萄糖胺連接。另一實(shí)施方案涉及第-段所述方法，其中所述抗體是單克隆抗體，并且所述方法得到基本上純的單克隆抗體。另一實(shí)施方案涉及第-段所述方法，其中所述化學(xué)合成的糖在步驟c)之后形成非天然的糖(carbohydrate)結(jié)構(gòu)。另一實(shí)施方案涉及第-段所述方法，其中所述基本上純的單克隆抗體包含能夠調(diào)節(jié)生物活性的糖基化狀態(tài)。另一實(shí)施方案涉及第-段所述方法，其中所述生物活性是(i)對(duì)Fcg受體的結(jié)合親和力或(ii)抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)月包毒性。另一實(shí)施方案涉及第-l殳所述抗體組合物，其中所述糖基化狀態(tài)包含至少四個(gè)糖。另一實(shí)施方案涉及第或l史所述的抗體組合物，其中所述抗體是單克隆抗體。另一實(shí)施方案涉及第-l史所述抗體組合物，其中所述單克隆抗體包含西妥昔單抗、利妥西單抗、莫羅莫那-CD3、阿昔單抗、達(dá)利珠單抗、巴利昔單抗、帕利珠單抗、英利昔單抗、曲妥珠單抗、吉妥珠單抗奧唑米星、阿侖單抗、替伊莫單抗、阿達(dá)木單抗、奧馬珠單抗、托西莫單抗、1-131托西莫單抗、依法利抹單抗、貝伐單抗、帕尼單抗、帕妥珠單抗、那他珠單抗、依那西普、IGN101、瓦羅西昔單抗、抗-CD80mAb、抗-CD23mAb、CAT-3888、CDP-791、依帕珠單抗、MDX-010、MDX-060、MDX-070、馬妥珠單抗、CP-675,206、CAL、SGN-30、札木單抗、阿德木單抗、奧戈伏單抗、尼妥珠單抗、ABT-874、地諾蘇單抗、AM108、AMG714、芳妥珠單抗、達(dá)利珠單抗、戈利木單抗、CNTO1275、ocrelizumab、HuMax-CD20、貝利單抗、依帕珠單抗、MLN1202、維西珠單抗、托珠單抗、ocrerlizumab、塞妥珠單抗、依庫(kù)珠單抗、培克珠單抗、阿昔單抗、雷珠單抗、美泊利珠單抗、TNX-355或MYO-029。另一實(shí)施方案涉及評(píng)價(jià)糖多肽生物活性的方法，所述方法包含如下步驟a)生產(chǎn)具有選定的糖基化狀態(tài)的糖多肽的基本上純的群體，和b)測(cè)量所述糖多肽的生物活性。另一實(shí)施方案涉及第ll所述方法，其中所述糖多肽是抗體，并且所述生物活性是(i)對(duì)Fcg受體的結(jié)合親和力或(ii)抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。另一實(shí)施方案涉及第段所述方法，其中所述抗體包含單克隆抗體。另一實(shí)施方案涉及第-段所述方法，其中所述生物活性是體內(nèi)抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。另一實(shí)施方案涉及第-段所述方法，其中所述單克隆抗體包含西妥昔單抗、利妥西單抗、莫羅莫那-CD3、阿昔單抗、達(dá)利珠單抗、巴利昔單抗、帕利珠單抗、英利昔單抗、曲妥珠單抗、吉妥珠單抗奧唑米星、阿侖單抗、替伊莫單抗、阿達(dá)木單抗、奧馬珠單抗、托西莫單抗、1—131托西莫單抗、依法利林單抗、貝伐單抗、帕尼單抗、帕妥珠單抗、那他珠單抗、依那西普、IGNIOI、瓦羅西昔單抗、抗-CD80mAb、抗-CD23mAb、CAT-3888、CDP-791、依帕珠單抗、MDX-OIO、MDX-060、MDX-070、馬妥珠單抗、CP-675,206、CAL、SGN-30、札木單抗、阿德木單抗、奧戈伏單抗、尼妥珠單抗、ABT-874、地諾蘇單抗、AM108、AMG714、芳妥珠單抗、達(dá)利珠單抗、戈利木單抗、CNTO1275、ocrelizumab、HuMax-CD20、貝利單抗、依帕珠單抗、MLN1202、維西珠單抗、托珠單抗、ocrerlizumab、塞妥珠單抗、依庫(kù)珠單抗、培克珠單抗、阿昔單抗、雷珠單抗、美泊利珠單抗、TNX-355或MYO-029。另一實(shí)施方案涉及改進(jìn)基于抗體的治療的結(jié)果的方法，所述方法包含如下步驟a)為受治療者確定在所述受治療者中存在的Fcg受體等位基因，和b)使用包含被選擇用于(i)增加對(duì)所述受治療者中存在的Fcg受體等位基因的結(jié)合親和力或(ii)增加抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的基本上純的糖基化狀態(tài)的單克隆抗體治療所述受治療者。另一實(shí)施方案涉及第段所述方法，其中所述Fcg受體等位基因是氨基酸158的FcgIIIa受體的等位基因或氨基酸131的FcgIIa受體的等位基因。另一實(shí)施方案涉及選擇單克隆抗體的糖基化狀態(tài)的方法，所述方法包含如下步驟a)確定免疫細(xì)胞上的Fcg受體等位基因，和b)選擇相對(duì)于具有異種糖基化狀態(tài)的源單克隆抗體調(diào)節(jié)下列活性的糖基化狀態(tài)i)抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性，ii)補(bǔ)體依賴性的細(xì)胞毒性，iii)Fcg受體結(jié)合親和力或1￥)單克隆抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的糖基化狀態(tài)。另一實(shí)施方案涉及生成單克隆抗體的生物等效物的方法，所述方法包含如下步驟a)確定預(yù)先存在的單克隆抗體的糖基化狀態(tài)，隆抗體具有基本l相同的糖基化狀態(tài)的單克隆:體。'''在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)補(bǔ)體依賴性的細(xì)胞毒性(CDC)的方法，所述方法包括施用糖基化改造的抗體。另一實(shí)施方案指向通過生產(chǎn)具有需要的糖基化狀態(tài)的抗體生成市售MAb的通用生物等效物的方法，所述方法包含如下步驟a)除去一個(gè)或多個(gè)糖，b)化學(xué)合成所述市售MAb中存在的糖，c)對(duì)于每個(gè)糖，將化學(xué)合成的糖酶促連接至(i)所述抗體或(ii)與所述抗體連接的糖，和d)按與所述市售MAb中存在的糖形比率基本上相似的比例混合所述MAb糖形，得到與市售抗體的糖形組成基本上匹配的抗體糖形組成。另一實(shí)施方案指向使用生產(chǎn)具有基本上純的糖基化狀態(tài)的抗體的方法通過鑒定優(yōu)選的MAb糖形對(duì)市售MAb或已處于臨床開發(fā)中的MAb來改進(jìn)效力、降低毒性和/或降低劑量，所述方法包含如下步驟a)除去所鑒定的MAb的一個(gè)或多個(gè)糖，b)化學(xué)合成所述MAb中存在的優(yōu)選糖，和C)將化學(xué)合成的糖酶促連接至(I)所述抗體或(il)與所述抗體連接的糖。另一實(shí)施方案指向選擇用于臨床開發(fā)在具有Fcg受體等位基因的群體中使用的mAb糖形的方法，所述方法包含如下步驟a)測(cè)試mAb糖形針對(duì)所述群體中存在的Fcg受體等位基因的生物活性，和b)選擇用于臨床開發(fā)的能夠(i)增加對(duì)所述群體中存在的Fcg受體等位基因的結(jié)合親和力或(ii)增加抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的mAb糖形。另一實(shí)施方案指向第段所述方法，其中所述Fcg受體等位基因是針對(duì)氨基酸158的FcgIIIa受體的等位基因或針對(duì)氨基酸131的FcgIIa受體的等位基因。另一實(shí)施方案指向產(chǎn)生具有異種糖基化狀態(tài)的預(yù)先存在的單克隆抗體的基本上純的糖形的方法，所述方法包括如下步驟使用權(quán)利要求1-4所述方法生產(chǎn)所述預(yù)先存在的單克隆抗體中存在的兩個(gè)或多個(gè)糖形，測(cè)試所述兩個(gè)或多個(gè)糖形的生物活性或毒性以確定所述預(yù)先存在的單克隆抗體的具有較高生物活性或較低毒性的優(yōu)選的糖形，和使用第-段所述方法來生產(chǎn)具有基本上純的優(yōu)選的糖基化狀態(tài)的在步驟b)中鑒定的具有較高生物活性或較低毒性的單克隆抗體糖形。上文相當(dāng)廣泛地列出了本發(fā)明的特征和技術(shù)優(yōu)點(diǎn)以便可更好地理解下文的發(fā)明詳述。構(gòu)成本發(fā)明權(quán)利要求的主題的本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在下文中一皮描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，所公開的構(gòu)想和特定實(shí)施方案可容易用作修飾或設(shè)計(jì)執(zhí)行與本發(fā)明相同的目的的其它結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)理解，所述等效構(gòu)建物不應(yīng)背離根據(jù)所附權(quán)利要求提出的本發(fā)明的精神和范圍。當(dāng)與附圖一起考慮時(shí)，將能/人下文的說明中更好地理解浮皮認(rèn)為是本發(fā)明特征(就其組織和方法這兩個(gè)方面來"i兌)的新特4正，以及進(jìn)一步的目的和優(yōu)點(diǎn)。〗旦是，應(yīng)明確理解，提供的每幅圖僅是出于說明和描述的目的，而非意在定義本發(fā)明的界限。圖1舉例說明了天然殺傷(NK)細(xì)胞與肺瘤細(xì)胞的相互作用。圖2描述了抗體糖基化狀態(tài)的實(shí)例。圖3描述了對(duì)基因組DNA的FcgRIII等位形式的限制性內(nèi)切酶分析。在限制性內(nèi)切酶酶切消化之前，通過用苯盼抽提對(duì)40mLPCR粗產(chǎn)物進(jìn)行洗滌，然后在進(jìn)行乙醇沉淀之前進(jìn)行一次苯酚/異戊基-氯仿(isoamyl-chloroform)抽提。對(duì)于RsaI單酶切，使用15單位RsaI在37°C過夜消化15mL洗滌過的PCR產(chǎn)物，使用IX孵育緩沖液，終體積為20mL。對(duì)于雙酶切消化，使用20單位RsaI在37°C過夜消化25mL洗滌過的PCR產(chǎn)物，使用1X孵育緩沖液，終體積為30mL，然后加入50單位Eco1301限制性內(nèi)切酶(lX孵育i爰沖液)，在37。C孵育過4支。通過在3。/。(w/w)瓊脂糖凝膠(TAE緩沖液)上電泳對(duì)所有產(chǎn)物進(jìn)行分析。#1DNA指示FcgRIIIaF/F,#2DNA指示雜合F/V,弁3DNA指示純合的V/V。圖4描述了對(duì)來自基因組DNA的FcgRII等位形式的限制性內(nèi)切酶分析。DNA是從3個(gè)不同的個(gè)體純化而得的，在PCR之后，使用BstUI酶消化所述產(chǎn)物。在瓊脂糖凝膠上分離所述產(chǎn)物，然后使用溴化乙錠染色。鑒定了三個(gè)可能的基因型。圖5列出了應(yīng)用于IgG或IgG-Fc結(jié)構(gòu)域的通過組合的細(xì)胞方法和化學(xué)酶法的糖基4匕改造方法。圖6顯示了基本上純的寡糖哺唑啉的合成實(shí)例。圖7顯示了產(chǎn)生具有基本上純的寡糖內(nèi)容的肽群體的糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)實(shí)例。圖8顯示了產(chǎn)生具有基本上純的由核心的N-連4妄五糖Man3GlcNAc2構(gòu)成的糖基化狀態(tài)的核糖核酸酶B酶群體的糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)實(shí)例。圖9顯示了產(chǎn)生新型非天然糖結(jié)構(gòu)的寡糖合成方案。圖IO顯示了與麗SCC細(xì)胞系(Tu167、Tu159或012SCC)一起孵育的新鮮分離的NK細(xì)胞。A.未處理；B.使用10ug/mL西妥昔單抗處理。在孵育16小時(shí)之后通過"Cr分析進(jìn)行評(píng)估，并進(jìn)行三個(gè)重復(fù)。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)均使用K562細(xì)胞系作為陽性對(duì)照，數(shù)據(jù)未顯示。NK純度均大于90%。圖11A顯示了重組酵母IgG廣Fc結(jié)構(gòu)域蛋白的SDS-PAGE。泳道1是具有起始酵母N-聚糖的產(chǎn)物。泳道2顯示了末端-A去糖基化的IgGrFc結(jié)構(gòu)域蛋白。泳道3顯示了4吏用合成的六糖嶠唑啉進(jìn)行化學(xué)酶法轉(zhuǎn)糖基作用之后的泳道2中的去糖基化蛋白。IIB顯示了重組酵母IgGrFc結(jié)構(gòu)域蛋白的SDS-PAGE。泳道1是具有起始酵母N-聚糖的產(chǎn)物。泳道2顯示了使用合成的六糖嗜唑啉進(jìn)行化學(xué)酶法轉(zhuǎn)糖基作用之后的轉(zhuǎn)糖基蛋白。泳道3-4和5-6分別顯示PNG酶F去糖基化的泳道1的起始酵母產(chǎn)物和泳道2的轉(zhuǎn)糖基IgGrFc結(jié)構(gòu)域蛋白。發(fā)明詳述如本it明書所用，"一個(gè)"或"一種"可指一個(gè)或多個(gè)。如本文的權(quán)利要求所用的，當(dāng)與詞"包含"聯(lián)合使用時(shí)，所述詞"一個(gè)"或"一種"可指一個(gè)或多于一個(gè)。如本文所用，"另一個(gè)"可指至少第二個(gè)或更多個(gè)。如本文所用，"樣品"典型地指任何類型的生物來源材料，其包括但不限于從受治療者分離的細(xì)胞、體液、組織或器官，包括例如血液、血漿、血清、糞便物、尿液、精液、骨髓、膽汁、腦脊液、淋巴液、皮膚樣品、皮"夫的外部分泌物、呼吸道、腸道和泌尿生殖道、淚液、唾液、乳汁、血液細(xì)爿包、器官或活才全。如本文所用，"生物活性"指藥物動(dòng)力學(xué)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，包括例如，分子親和力或所造成的生物化學(xué)或生理學(xué)效應(yīng)、受體親和力或所造成的生物化學(xué)或生理學(xué)效應(yīng)、非受體親和力或生物化學(xué)或生理學(xué)效應(yīng)、效力、生物利用度、吸收、分布、代謝或消除。如本文所用，"糖"指氧化或未氧化的含糖分子，包括但不限于單糖、二并唐、三糖、寡糖或多糖，包4舌例如N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖、半乳糖、N-乙酰神經(jīng)氨酸(唾液酸)、葡萄糖、果糖、巖藻糖、山梨糖、鼠李糖、甘露庚酮糖、N-乙酰半乳糖胺、二羥丙酮、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘油醛、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖,寡糖^惡唑啉、前述任何糖的非天然變體或類似物或其L-或D-異構(gòu)體的任何組合。糖進(jìn)一步指通過天然、重組、合成、和/或半合成方式生產(chǎn)的此類分子。如本文所用，"響應(yīng)度差"指與群體的大部分相比，響應(yīng)率降低、初始響應(yīng)率降低、存活率降低或上文定義的"生物活性，，降低。如本文所用，"抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性"(ADCC)指其中抗體通過包被耙細(xì)胞使得它們易受免疫細(xì)胞攻擊的免疫響應(yīng)。如本文所用，"調(diào)節(jié)"指將糖基化改造的抗體與未糖基化改造的抗體(起始抗體、對(duì)照或其它等效術(shù)語)進(jìn)行比較時(shí)，上文定義的生物活性的增加或降低。如本文所用，"癌癥"指一種病理生理狀態(tài)，其中細(xì)胞的特征在于異常的和增生性細(xì)胞生長(zhǎng)，以及在成人或兒童中急性或慢性地通過侵入直接生長(zhǎng)到相鄰組織中或通過轉(zhuǎn)移在遠(yuǎn)端位點(diǎn)生長(zhǎng)誘導(dǎo)所述生長(zhǎng)的能力，包括但不限于癌和肉瘤，如急性成淋巴細(xì)胞白血病、急性髓系白血病、腎上腺皮質(zhì)癌、AIDS相關(guān)癌癥、AIDS相關(guān)淋巴瘤、肛門癌、星形細(xì)胞瘤(小腦或大腦的)、基底細(xì)胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、腦干膠質(zhì)瘤、腦瘤(例如，室管膜瘤、髓母細(xì)胞瘤、幕上原始神經(jīng)外胚層、:視覺途徑和下丘腦膠質(zhì)瘤)、大腦星形細(xì)胞瘤/惡性膠質(zhì)瘤、乳腺癌、支氣管腺瘤/類癌、伯基特淋巴瘤、類癌瘤(例如，胃腸道的類癌瘤)、未知原發(fā)部位癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、宮頸癌、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性髓系白血病、慢性骨髓增生病、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤、子宮內(nèi)膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因斯胂瘤家族、肝外膽管癌、眼癌(例如，眼內(nèi)黑色素瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、膽嚢癌、胃癌、胃腸類癌瘤、胃腸間質(zhì)瘤(GIST)、生殖細(xì)胞腫瘤(例如，顱外、生殖腺外、卵巢)、妊娠滋養(yǎng)細(xì)l包肺瘤、月交質(zhì)瘤、毛細(xì)月包白血病、頭頸部癌、鱗狀細(xì)l包頭頸部癌、肝細(xì)胞癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、胰島細(xì)胞癌(例如，內(nèi)分泌胰A袈)、卡波西肉瘤、。鏡癌、白血病、唇和口月空癌(oralcavitycancer)、肝癌、肺癌(例如，非小細(xì)胞)、淋巴瘤、巨球蛋白血癥、骨/骨肉瘤的惡性纖維組織細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、梅克爾細(xì)胞癌、間皮瘤、潛伏原發(fā)的轉(zhuǎn)移性鱗狀頸癌、口腔癌(mouthcancer)、多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤綜合征、多發(fā)性骨髓瘤/血漿細(xì)胞肺瘤、蕈樣肉芽肺、骨髓發(fā)育異常綜合征、骨髓發(fā)育異常/骨髓增生性疾病、骨髓瘤、鼻腔和鼻竇癌、鼻咽癌、神經(jīng)母細(xì)月包瘤、非霍奇金、淋巴瘤、口月空癌(oralcancer)、口月空癌(oralcavitycancer)、骨肉瘤、口咽癌、卵巢癌(例如，卵巢上皮癌、生殖細(xì)胞肺瘤)、卵巢低惡性潛在腫瘤、胰腺癌、鼻竇和鼻腔癌癥、甲狀旁腺癌、陰莖癌、咽癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、松果體母細(xì)胞瘤和幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤、垂體瘤、血漿細(xì)胞肺瘤/多發(fā)性骨髓瘤、胸膜肺母細(xì)胞瘤、妊娠和乳腺癌、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、前列腺癌、直腸癌、一見網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、才黃紋月幾肉瘤、唾液腺癌、軟組織肉瘤、子宮肉瘤、塞澤里綜合征、皮膚癌(例如，非黑色素瘤或黑色素瘤)、小腸癌癥、幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤、T-細(xì)胞淋巴瘤、睪丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、曱狀腺癌、腎盂和輸尿管的移4亍細(xì)胞癌、滋養(yǎng)細(xì)胞肺瘤(例如妊娠)、兒童期和成年期的罕見癌癥、尿道癌、子宮內(nèi)膜子宮癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥、維耳姆斯氏瘤和女性的癌癥。如本文所用，"與免疫相關(guān)的疾病或病癥"指其中免疫系統(tǒng)增強(qiáng)或受到抑制，或其中免疫系統(tǒng)的組分引起、介導(dǎo)或以其它方式參與發(fā)病或死亡的疾病或病癥。還包括其中刺激或干預(yù)免疫響應(yīng)對(duì)所述疾病或病癥的進(jìn)程具有改善效應(yīng)的疾病。此術(shù)語包括免疫介導(dǎo)炎性疾病、非免疫介導(dǎo)的炎性疾病、傳染性疾病、免疫缺陷疾病、癌癥等，包括例如，系統(tǒng)性紅斑纟良瘡、肌萎縮側(cè)索硬化癥、帕金森病、阿爾茨海默病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、兒童慢性關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)病、系統(tǒng)性硬化癥(例如，硬皮病)、特發(fā)性炎性肌病(例如，皮肌炎、多發(fā)性肌炎)、干燥綜合征(Sjogren'ssyndrome)、結(jié)節(jié)病、自身免疫性溶血性貧血(例如，免疫全血細(xì)胞減少、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥)、自身免疫性血小板減少癥(例如，特發(fā)性血小板減少性紫癜、免疫介導(dǎo)的血小板減少癥、血栓性血小板減少性紫癜)、甲狀腺炎(例如，格雷夫斯病、橋本甲狀腺炎、兒童淋巴細(xì)胞甲狀腺炎、萎縮性甲狀腺炎)、糖尿病、免疫介導(dǎo)的腎病(例如，腎小球腎炎、間質(zhì)性腎炎)、中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘病(例如，多發(fā)性硬化癥)、特發(fā)性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病或格林-巴利綜合征、多發(fā)性肌炎、混合性結(jié)締組織病、甲亢、重癥肌無力、自身免疫肝病、自身免疫腎病、血管炎(例如川崎氏病或顳動(dòng)脈炎)、自身免疫血液病、特發(fā)性間質(zhì)性肺炎、過敏性肺炎、自身免疫皮膚病、自身免疫心臟病、心肌炎、自身免疫不孕癥、貝切特氏病、慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、肝膽疾病(例如，傳染性肝炎和其它非嗜肝病毒)、自身免疫慢性活動(dòng)性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肉芽腫性肝炎和硬化性膽管炎、炎性腸道疾病(例如，潰瘍性結(jié)腸炎克羅恩氏病)、麩質(zhì)過敏性腸病、惠普爾氏病、自身免疫或免疫介導(dǎo)的皮膚疾病包括大皰性皮膚病、白癜風(fēng)、多形性紅斑和接觸性皮炎、銀屑病、性傳播疾病、過敏性疾病如哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、食物過敏和蕁麻滲、肺部免疫性疾病如嗜酸性肺炎、特發(fā)性肺纖維化和過敏性肺炎、移植相關(guān)疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主疾病、病毒性疾病(例如，AIDS(HIV感染)、甲、乙、丙、丁和戊型肝炎、皰滲)、細(xì)菌感染、真菌感染、原生動(dòng)物感染和寄生蟲感染。如本文所用，關(guān)于抗體，"基本上純的"指與在其天然狀分離。此術(shù)語進(jìn)一步包括具有單個(gè)糖基化狀態(tài)的需要的產(chǎn)物，無論此狀態(tài)包括單個(gè)位點(diǎn)或多個(gè)位點(diǎn)的糖基化。典型地，當(dāng)抗體構(gòu)成制備物中的抗體的至少60%(重量)時(shí)，即認(rèn)為其是基本上純的。例如，制備物中的抗體為需要的抗體的至少約75%、在某些實(shí)施方案中至少約80%、在某些實(shí)施方案中約85%、在某些實(shí)施方案中至少約90%、在某些實(shí)施方案中至少約95%和最優(yōu)選地至少約99%(重量)?；旧霞兊目贵w包括天然、重組或合成生產(chǎn)的抗體。如本文所用，"糖基化狀態(tài)"指抗體具有特定或需要的糖基化模式。"糖形"是包含特定糖基化狀態(tài)的抗體。所述糖基化模式包括，例如在mAb的位置N-297處連接一個(gè)或多個(gè)糖，其中所述糖是天然的、重組的、合成或半合成生產(chǎn)的。作為實(shí)例，圖2提供了具有包含在位置N-297處與至少一個(gè)N-聚糖連接的IgGi和缺乏a-l,6-巖藻糖的糖基化狀態(tài)的mAb。如本文所用，"抗體"指稱為免疫球蛋白的免疫系統(tǒng)相關(guān)的蛋白和其獨(dú)立的功能片段。每個(gè)抗體由連接形成"Y"形分子的四個(gè)多肽-兩條重鏈和兩條輕鏈組成。使用蛋白酶處理抗體可以切割所述蛋白產(chǎn)生包括抗體的可變末端的Fab或抗原結(jié)合片段和/或恒定區(qū)片段Fc。恒定區(qū)確定破壞抗原使用的機(jī)制(例如ADCC)?？贵w才艮據(jù)其恒定區(qū)結(jié)構(gòu)和免疫功能而,皮劃分為五個(gè)主要類別IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。這些類別包括亞類，如IgGw?？贵w可以是多克隆或單克隆。如本文所用，"多肽"指包含共價(jià)連接在一起的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的分子。"糖多肽"指進(jìn)一步包含至少一個(gè)共價(jià)連接至所述多肽的糖的多肽。如本文所用，術(shù)語"治療，，指向受治療者施用治療有效量的抗體，以便所述受治療者的疾病得到改善。所述改善是癥狀的任何改善或矯正。所述改善是可觀測(cè)的或可測(cè)量的改善。因此，本領(lǐng)域:技術(shù)人員理解，治療可改善病情，但是可能無法徹底治愈所述疾病。具體地，癌癥患者的改善可包括腫瘤穩(wěn)定、腫瘤收縮、進(jìn)程時(shí)間增加、存活增加或生命質(zhì)量的改善。自身免疫疾病患者的改善可包括炎癥實(shí)驗(yàn)值的改善、血細(xì)胞計(jì)數(shù)的改善、皮滲的改善或生活質(zhì)量的改善。如本文所用，術(shù)語"治療有效量"指使疾病或疾患的癥狀得到改善或矯正的量。如本文所用，術(shù)語"受治療者"用來指根據(jù)本文描述的方法向其施用抗體組合物的任何哺乳動(dòng)物受治療者。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明方法用于治療人受治療者。另一實(shí)施方案包括治療患癌癥的人受治療者。NK細(xì)l包FcgR多態(tài)性抗原呈遞細(xì)胞(APC)如NK細(xì)胞在抗體依賴性的細(xì)胞毒性(ADCC)中具有重要作用。NK細(xì)胞擁有結(jié)合IgG的細(xì)胞表面受體FcgR，結(jié)合IgG有助于與相鄰FcgR交聯(lián)和活化NK細(xì)胞，導(dǎo)致ADCC[26b]。與FcgR結(jié)合的親和力以及造成的活化和細(xì)l包毒效應(yīng)受受體多態(tài)性的影響。例如，在氨基酸158處具有FcgRIIIa(CD16a)的純合纈氨酸/纈氨酸(V/V)等位基因或在氨基酸131處具有FcgRIIa組氨酸/組氨酸的等位基因的淋巴瘤患者顯示出對(duì)利妥昔單抗治療更高的響應(yīng)率。V等位基因的FcgRIIIa(CD16a)和H等位基因的FcgRIIa(CD32)分別比苯丙氨酸(F)的等位基因和精氨酸(R)的等位基因?qū)θ薎gGl具有更高的親和力，產(chǎn)生更加有效的ADCC[3]。經(jīng)多變量分析，這兩個(gè)FcgR多態(tài)性獨(dú)立地預(yù)期更長(zhǎng)的無進(jìn)展生存期[4]。NK細(xì)胞表達(dá)的FcgRIIIa等位基因和ADCC之間的相關(guān)性最近已得到體外證實(shí)。此研究中使用了HNSCC細(xì)胞系TU167、TU159和012SCC。ADCC分析是使用HNSCC細(xì)胞作為耙細(xì)胞和純的NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞而進(jìn)行的。將把細(xì)胞與150(iCiCr-51(Amersham,Piscataway，NJ)在37°C孵育1小時(shí)，每15分鐘充分混合一次，然后用培養(yǎng)基洗滌兩次。接著將所述細(xì)胞與10ug/mL西妥昔單抗、10ug/mL人IgGl同種型或僅培養(yǎng)基在37°C再孵育30分鐘，然后洗滌兩次以除去未結(jié)合的抗體。將效應(yīng)物和靶細(xì)"包涂布到96孔板并孵育過^復(fù)。收集細(xì)胞裂解上清液，然后將其與OptiphaseSupermix閃爍液(PerkinElmer,BostonMA)混合，在MicroBeta1450閃爍計(jì)數(shù)器(Wallac,TurkuFmdland)中計(jì)數(shù)。將結(jié)果表示為特異性裂解的百分比[(實(shí)驗(yàn)cpm-自發(fā)cpm)x100]/(最大cpm陽自發(fā)cpm)。圖IOA顯示了不存在抗體時(shí)未處理的新鮮NK細(xì)胞，每個(gè)FcgRIIIa多態(tài)性均與HNSCC細(xì)胞系一起孵育。使用51Cr測(cè)量的它們的殺傷能力范圍為0-26%,中值范圍為5-15%。圖10B表示西妥昔單抗處理的HNSCC細(xì)胞系與NK細(xì)胞孵育的平均殺傷。與未處理的HNSCC細(xì)胞系相比，西妥昔單抗處理的HNSCC細(xì)胞系顯示出顯著更高的殺傷活性。此外，當(dāng)與10jig/mL西妥昔單抗的HNSCC細(xì)胞系孵育時(shí)，F(xiàn)cgRIIIa多態(tài)性V/V介導(dǎo)的殺傷優(yōu)于V/F和F/F。一^L而言，效應(yīng)物與單巴細(xì)胞的比值為50:1時(shí)，所有細(xì)胞系在與FcgRIIIaF/FNK供體孵育時(shí)均顯示低的細(xì)胞毒活性，與FcgRIIIaF/VNK供體孵育時(shí)顯示中等的細(xì)l包毒活性，與FcgRIIIaV/VNK供體孵育時(shí)顯示高的細(xì)胞毒活性。這些數(shù)據(jù)提供了CD16a多態(tài)性與針對(duì)HNSCC的不同的抗體依賴性的細(xì)胞毒性水平有關(guān)的體外證據(jù)。假定每個(gè)NKFcgRIIIa多態(tài)性基因型與西妥昔單抗的Fc部分的不同結(jié)合親和力引起NK介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的差異。在治療開始時(shí)知道患者具有的多態(tài)性可以預(yù)測(cè)總的腫瘤響應(yīng)和單克隆抗體的臨床結(jié)果。最后，優(yōu)化NKFcgRIIIa等位基因與結(jié)合的mAb的Fc部分的結(jié)合將會(huì)改進(jìn)每個(gè)多態(tài)性的ADCC。對(duì)FcgRIIIa(CD16a)158F等位基因具有改進(jìn)的親和力的糖結(jié)構(gòu)滲透的mAb對(duì)于增強(qiáng)在這些等位基因的攜帶者的治療結(jié)果特別重要。實(shí)施例1:FcgRIIIa受體(CD16a)和FcgRIIa(CD32)等位基因多態(tài)性的檢測(cè)為了確定糖基化改造的mAb在具有各種基因型的患者中誘導(dǎo)ADCC的能力或確定非糖改造mAb的響應(yīng)度，使用例如基于PCR的策略表征FcgRIIa位置131和FcgRIIIa位置158的等位基因變體。首先，從人肺瘤細(xì)胞系、人唾液、人PBMC或石蠟包埋組織中分離基因組DNA,將其用作PCR擴(kuò)增的模板。A.使用PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶消化來檢測(cè)FcgIIIa受體(CD16a)等位基因的多態(tài)性。根據(jù)GenBank中的可用序列(FcgRIIIa的登錄號(hào)為X52645,Nieto等，2000)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。此方案使用向所有擴(kuò)增產(chǎn)物的一端引入新的Rsal位點(diǎn)的引物和在所述兩個(gè)FcgRIIIa等位基因之一中產(chǎn)生新的Styl(或Eco130I)位點(diǎn)的第二個(gè)引物。有義引物(5'-ATAAGGTCACATATTTACAGAATGGCCAAG國(guó)3，)(SEQIDNO:1)和反義引物(5,-CAGTCTCTGAAGACACATTTTTACTCCGTA畫3，)(SEQIDNO:2)擴(kuò)增含有所述多態(tài)性位點(diǎn)的147bp片段。用粗體顯示的所述有義引物的錯(cuò)配在FcgRIIIa基因的任一等位基因，而不是FcgRIIIb基因中產(chǎn)生限制酶切位點(diǎn)(StyI)。所述反義引物中的錯(cuò)配在FcgRIIIa(僅V等位基因)和FcgRIIIb基因中產(chǎn)生限制酶切位點(diǎn)(RsaI)。對(duì)于FcgRIII,由于序列相似性，F(xiàn)cgRIIIa和b基因均得到擴(kuò)增。例如，為了區(qū)分FcgRIIIa的等位基因，執(zhí)行了兩次限制性內(nèi)切酶消化，一次用Rsal消化，第二次消化使用Styl或Eco130I(Styl和Eco130I二者識(shí)別相同的序列)。表1顯示了FcgRIIIa的兩個(gè)等位基因的限制性內(nèi)切酶消化模式，圖3說明了實(shí)際的限制性內(nèi)切酶消化。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>B.使用PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶消化檢測(cè)FcgRIIa受體的限制酶切多態(tài)性。引物設(shè)計(jì)是基于McKenzie等，1996,其4吏用有義引物(5，-GGAAAATCCCAGAAATTCTCGC-3，)(SEQIDNO:3)和反義引物(5，-CAACAGCCTGACTACCTATTACGCGGG-3,)(SEQIDNO:4)擴(kuò)增含有所述多態(tài)性位點(diǎn)的366bp片段。當(dāng)相鄰核苷酸為G,而不是當(dāng)相鄰核苷酸為A時(shí)，所述有義引物的一個(gè)核苦酸置換(用粗體顯示)將向所述PCR產(chǎn)物引入BstUI剪切位點(diǎn)。向所述反義引物中引入第二個(gè)BstUI以控制消化。兩個(gè)引物的擴(kuò)增將在兩個(gè)等位基因的兩種產(chǎn)物的C末端引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。但是只有一個(gè)等位基因?qū)⒑械诙€(gè)限制酶切(精氨酸(R))位點(diǎn)。當(dāng)用限制性內(nèi)切酶BstUI消化所述PCR產(chǎn)物時(shí)，R等位基因?qū)⒈幌瘍纱?，產(chǎn)生短產(chǎn)物(323bp),而含有組氨酸的等位基因?qū)⒅槐患羟幸淮?，產(chǎn)生343bp條帶。圖4舉例說明了將會(huì)觀察到的三種可能的類型。產(chǎn)物A和B分別是純合個(gè)體精氨酸(R/R)和組氨酸(H/H)的消化產(chǎn)物。產(chǎn)物C顯示了雜合個(gè)體(R/H)證實(shí)的情況。在所述反向引物的末端設(shè)計(jì)了BstUI內(nèi)部對(duì)照，以確保成功的BstUI消化。C.多態(tài)性檢測(cè)和與基于抗體的治療的關(guān)聯(lián)。按上文的A.和B.部分描述的方法檢測(cè)多態(tài)性之后，接下來進(jìn)行基于抗體的治療響應(yīng)度的關(guān)聯(lián)。可選地，基于抗體的治療的響應(yīng)度可在多態(tài)性4企測(cè)之后確定。對(duì)于特定多態(tài)性，臨床醫(yī)師或其它適當(dāng)?shù)膶I(yè)人員通過確定攜帶特定多態(tài)性的患者是否響應(yīng)使用糖基化改造的或非糖基化改造的抗體的治療來確定糖基化改造的或非糖基化改造的抗體治療的響應(yīng)度。通過將多態(tài)性與糖基化改造的或非糖基化改造的抗體治療的響應(yīng)度關(guān)聯(lián)，可以預(yù)測(cè)對(duì)糖基化改造的或非糖基化改造的抗體的響應(yīng)度。預(yù)言性實(shí)施例2:抗體的同質(zhì)制備物。為了獲得具有特定糖基化狀態(tài)的mAb的同質(zhì)制備物，利用了兼有高細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)量和使用化學(xué)酶法轉(zhuǎn)糖基的體外糖基化改造的系統(tǒng)[27-30]。結(jié)合化學(xué)合成內(nèi)切酶的寡糖^惡唑啉底物的力量，此方法允許制備一系列確定的mAb糖基化狀態(tài)(天然或非天然)或其IgG-Fc結(jié)構(gòu)域，而這又允許系統(tǒng)地分析IgG糖基化和ADCC活性的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系。按照J(rèn)effries等的開創(chuàng)性工作，使用無4交《連的人IgG-Fc即zl-h-Fc(aa231-447)作為模式系統(tǒng)，其中Fc的鉸鏈區(qū)已被缺失[7、31]。使用此截短的Fc形式而不是完整的人抗體IgG或IgG-Fc作為才莫式系統(tǒng)才及大地簡(jiǎn)化了合成以及后續(xù)的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系研究。無鉸鏈的IgG-Fc實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可通過完整的IgG的表達(dá)和轉(zhuǎn)糖基作用證實(shí)。此外，IgG的Fc部分可通過與生產(chǎn)具有同質(zhì)的、合成的糖成分的新的Fc片段相同的轉(zhuǎn)糖基作用過程進(jìn)行表達(dá)和修飾。至少兩個(gè)表達(dá)系統(tǒng)可以用于表達(dá)所述無4交鏈的IgG-Fc。本發(fā)明不受本文描述的表達(dá)系統(tǒng)的限制。一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)是先前用于過量產(chǎn)生人J-h-Fc糖蛋白的CH0-K1細(xì)胞系統(tǒng)[7、31]。編碼zl-h-Fc基因(aa231-447)的質(zhì)粒^按照與4艮道的方法完全相同的方法構(gòu)建，^使用可商業(yè)途徑獲得的質(zhì)粒pglL243H作為CHgl基因的來源[7、31]。所述系統(tǒng)產(chǎn)生具有異種N-聚糖的d-h-Fc糖蛋白。另一表達(dá)系統(tǒng)是高產(chǎn)量的酵母突變體表達(dá)系統(tǒng)，其產(chǎn)生具有連接了高甘露糖型寡糖的IgG-Fc糖蛋白。經(jīng)過量產(chǎn)生和后續(xù)的純化之后，用內(nèi)切-F2或內(nèi)切-M和巖藻糖苷酶(以除去CHO-細(xì)胞系表達(dá)的異種糖鏈)的混合物處理或用內(nèi)切-H或內(nèi)切-A(以除去所述酵母系統(tǒng)產(chǎn)生的高甘露糖型寡糖)處理得到的糖蛋白Zl-h-Fc。這將除去所有異種N297-聚糖，而僅保留所述糖基化位點(diǎn)處連4^的最內(nèi)部的GlcNAc。然后以得到的含有GlcNAc的IgG-Fc作為轉(zhuǎn)糖基作用的受體底物，在合適的內(nèi)切酶或其突變體的催化下回加糖嗜唑啉的各種同型寡糖[30]。使用各種合成的糖嗜唑啉作為供體底物，ENG酶催化的轉(zhuǎn)糖基作用提供具有確定的寡糖結(jié)構(gòu)的」-h-Fc、Fc結(jié)構(gòu)域蛋白和mAb的各種糖基化狀態(tài)。這些包括具有巖藻糖和具有平分型GlcNAc結(jié)構(gòu)的N-聚糖核心結(jié)構(gòu)。它還包括可進(jìn)一步參與ADCC活性的選定修飾結(jié)構(gòu)。圖5中描述了一般的方法。除了上文描述的方法之外，此方法還應(yīng)用于完整的IgG抗體制備物。本公開的范圍或廣度也不受限制，并包括例如，在第7,138,371號(hào)美國(guó)專利(DeFrees等)[32]中描述的方法、肽和抗體。實(shí)施例3:糖嗜唑啉的i殳計(jì)和合成實(shí)例。ENG酶是一類水解N-糖蛋白的核心iV,W'-二乙酰幾丁二糖部分中的(3-1,4-糖苷鍵以釋放所述N-聚糖的內(nèi)切糖苷酶。但是，一些ENG酶如原玻璃錄節(jié)桿菌04rt/z/x^a"erpra/o/7/zor脂.(2e)的內(nèi)切畫A和凍土毛霉(Mwcor/newa/M)的內(nèi)切-M,擁有轉(zhuǎn)糖基作用活性并能夠?qū)⑨尅肺牡腘-聚糖轉(zhuǎn)移至GlcNAc-肽受體以形成新的糖多肽。內(nèi)切-A和內(nèi)切-M可以將大型完整的寡糖一步轉(zhuǎn)移至GlcNAc-肽受體以形成新的糖多肽，/人而允許高度集中地合成糖多肽而無需保護(hù)基團(tuán)?；瘜W(xué)酶法方法具有低轉(zhuǎn)糖基作用產(chǎn)率(一^殳為5-20%)、產(chǎn)物水解和《又使用天然N-聚糖作為供體底物的限制。為了解決這些問題，我們使用合成的寡糖喁唑啉(保留機(jī)制中形成的假想的嗜唑啉鳙離子中間體的模擬物)作為糖多肽合成的供體底物。我們合成了與N-聚糖核心對(duì)應(yīng)的二-和四糖嗜唑啉。測(cè)試寡糖嶠唑啉是否是動(dòng)力學(xué)上比天然N-聚糖更有利的有效的N-糖多肽合成的底物。圖6顯示了基本的合成方案[33]。實(shí)施例4:將寡糖喁唑啉底物轉(zhuǎn)糖基至HIVgp41片段。接下來我們使用大型受體GlcNAc-C34測(cè)試了內(nèi)切-A催化的二-和四糖^惡唑啉的轉(zhuǎn)糖基作用(圖7)。發(fā)現(xiàn)所述寡糖也可通過內(nèi)切-A而尋皮有效轉(zhuǎn)移至所述大型GlcNAc-C34,以分別形成糖肽14(73%)和15(75%)。通過ESI-MS和NMR分碎斤對(duì)所述糖肽進(jìn)行表4正。對(duì)糖多肽15的進(jìn)一步結(jié)構(gòu)表征是通過鏈霉蛋白酶消化進(jìn)行的，該消化產(chǎn)生單個(gè)Asn-連接的寡糖，1HNMR、ESIMS和DionexHPAEC分析表明，其與真實(shí)的Asn-連接的核心戊糖Man3GlcNAc2Asn相同。還》見察到雖然Man-卩l(xiāng),4-GlcNAc,惡唑啉和Man3GlcNAc-嗜唑啉充當(dāng)轉(zhuǎn)糖基作用的有效底物，但得到的糖多肽ManGlcNAc2-C34(14)卻抗內(nèi)切-A水解，而糖多肽Man3GlcNAc2-C34(15)僅被內(nèi)切-A緩慢水解。這些結(jié)果顯示，寡糖嗜唑啉是比基態(tài)N-糖肽活性更大的底物，因而在動(dòng)力學(xué)上有利于產(chǎn)物積累。實(shí)施例5:非天然六糖(Gal2Man3GlcNAc)噶唑啉的合成。我們?cè)O(shè)計(jì)和合成了非天然六糖(Gal2Man3GlcNAc)哺唑啉，其具有兩個(gè)與Man3-GlcNAc核心中的末端甘露糖殘基卩-l,4-連接的半乳糖殘基。此六糖衍生物是雙觸角復(fù)合體類型N-聚糖的不具有互連的GlcNAc部分的模擬物(圖9)。用小GlcNAc-肽Ac-Asn(GlcNAc)-Ile-Thr作為受體進(jìn)行沖莫式反應(yīng)。通過反相HPLC監(jiān)測(cè)酶學(xué)反應(yīng)。內(nèi)切-A對(duì)具有六糖，惡唑啉的受體的糖基化基本上在30分鐘內(nèi)完成，形成具有基本上純的糖基化狀態(tài)的糖多肽，產(chǎn)率為98%。實(shí)施例6:寡糖嗜唑啉底物向核糖核酸酶B的轉(zhuǎn)^唐基作用。為了4企測(cè)所述化學(xué)酶法方法合成和重構(gòu)糖蛋白的可4亍性，選捧牛核糖核酸酶B作為才莫式系統(tǒng)。用內(nèi)切-H處理核糖核酸酶B將除去N-聚糖，僅保留Asn-34位點(diǎn)處最內(nèi)側(cè)的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)，產(chǎn)生基本上純的GlcNAc-RB。發(fā)現(xiàn)，當(dāng)所述六糖喁唑啉6(圖8)和GlcNAc-RB(摩爾比，2:1)在存在內(nèi)切-A的條件下被孵育(磷酸鹽緩沖液(pH6.5),23。C)時(shí)，GlcNAc-RB糖基化產(chǎn)生轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物10。此轉(zhuǎn)化在2h反應(yīng)后基本上是定量的，以96%的產(chǎn)率分離到基本上純的糖蛋白產(chǎn)物。相似地，內(nèi)切-A催化的GlcNAc-RB與四糖嗜唑啉11的反應(yīng)以82%的產(chǎn)率產(chǎn)生基本上純的攜帶核心N-連接五糖Man3GlcNAc2的糖蛋白12。核心N-連接五糖(Man3GlcNAc2)與蛋白的有效連接為用各種糖基轉(zhuǎn)移酶通過所述核心的順序糖基化快速組裝各種糖基化狀態(tài)提供了重要的起始結(jié)構(gòu)。實(shí)施例7:六糖向重組Fc結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)糖基作用。通過PCR擴(kuò)增人IgGl-Fc結(jié)構(gòu)域的編碼序列，將其克隆至酵母表達(dá)載體pYES2/CT(INVITROGEN)。將得到的IgGl-Fc-pYES2/CT轉(zhuǎn)化入釀酒酵母(Sacc/Mrawyce^cerewwae)的OCH-l突變體[44]并進(jìn)行表達(dá)。SDS-PAGE證實(shí)純的IgGl-Fc被糖基化，PNG酶F處理揭示大量N-聚糖一皮除去。天然IgGl-Fc在還原條件下顯示為35KDa條帶，其對(duì)應(yīng)于單體形式，但是在天然條件下顯示為70KDa條帶，表明所述純的IgGl-Fc連接為二聚體，這同在天然IgGl結(jié)構(gòu)中的發(fā)現(xiàn)一致。純化表達(dá)的糖蛋白，將其用作轉(zhuǎn)糖基作用的靶蛋白。為了纟全測(cè)所述化學(xué)酶法重構(gòu)抗體糖形的可^f亍性，我們使用上文所述的在酵母中生產(chǎn)的IgGl-Fc部分。我們的初步研究揭示內(nèi)切-A可以成功地除去酵母表達(dá)的IgGl-Fc的異種高甘露糖型N-聚糖以生產(chǎn)GlcNAc-IgG廣Fc，其顯示為約33KDa的條帶(圖5和11A-B)。將六糖"惡唑啉(Gal2Man3GlcNAc-嗜唑啉)用作這些抗體轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)的才莫式糖嗜唑啉。先前已證實(shí)此糖喁唑啉是內(nèi)切-A轉(zhuǎn)糖基作用重構(gòu)核糖核酸酶B的優(yōu)秀底物[30]。當(dāng)將GlcNAc-IgGl-Fc與所述六糖嘈、唑啉在存在內(nèi)切-A的條件下孵育時(shí)，形成新糖基4li的IgGl-Fc，其在SDS-PAGE上顯示為與原始重組的糖基化的IgGl-Fc相似的大小(圖IIA和B)。此結(jié)果表明，所述轉(zhuǎn)糖基作用對(duì)IgGl-Fc和核糖核酸酶B才莫式系統(tǒng)的效應(yīng)相同。為了證實(shí)轉(zhuǎn)移的寡糖,皮連接到所述蛋白的GlcNAc上，我們《吏用PNG酶F處理所述新形成的糖基化IgGl-Fc，僅當(dāng)所述聚糖是以GlcNAc-Asn鍵形式進(jìn)4亍連4妻時(shí)，PNG酶F才可以除去所述N-聚糖。如圖IIB所示，處理原始的IgGl-Fc和重構(gòu)的糖基化IgGl-Fc得到了如通過SDS-PAGE所判斷的具有相同大小的去糖基化IgGl-Fc。這些數(shù)據(jù)表明如所預(yù)期，所述轉(zhuǎn)糖基作用六糖浮皮連接到由內(nèi)切-A形成的GlcNAc-Asn上。進(jìn)一步通過MALDI-TOF和ESI質(zhì)譜進(jìn)行詳細(xì)的N-聚糖分析。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和mAbC225(西妥昔單抗)。EGFR是受體酪氨酸激酶erbB家族的成員。當(dāng)配體結(jié)合時(shí)，發(fā)生二聚化和寡聚化，進(jìn)而活化細(xì)胞質(zhì)蛋白酪氨酸激酶。接著是下游和第二信使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過活化轉(zhuǎn)錄因子和上調(diào)細(xì)胞周期蛋白Dl促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活/抗凋亡[33b]。過表達(dá)可見于各種實(shí)體瘤，并與更晚期、增加的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、更短的無復(fù)發(fā)存活和總存活有關(guān)[33c]。Ang等證實(shí)在SCCHN中的過表達(dá)與降低的存活和獨(dú)立預(yù)測(cè)的局部復(fù)發(fā)有關(guān)[33d]。使用針對(duì)晚期SCCHN的嵌合mAbC225(西妥昔單抗)進(jìn)行的針對(duì)EGFR的定向治療，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化療方案作為重要的治療就應(yīng)運(yùn)而生。西妥昔單抗是針對(duì)EGFR配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的IgGl單克隆抗體，其阻止酪氨酸激酶的活化。n和III期試驗(yàn)已證實(shí)使用西妥昔單抗得到改善的結(jié)果[33e、33c]。預(yù)言性實(shí)施例8:寡糖噴唑啉底物向mAbC225和其zl-h-Fc對(duì)應(yīng)部分的轉(zhuǎn)糖基作用。將具有與ASN297的異種糖連接的人-小鼠嵌合的EGF受體抗體mABC225或mABC225的」-h-Fc版本(version)用內(nèi)切-H處理，留下了ASN297上最內(nèi)側(cè)的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)。將內(nèi)切-H處理的mABC225與核心N-連接五糖(Man3GlcNAc2)11和內(nèi)切-H或具有轉(zhuǎn)糖基作用活性的相似的糖酵解酶混合。常規(guī)純化技術(shù)產(chǎn)生基本上純的、同質(zhì)糖基化的mAbC225。進(jìn)一步使用標(biāo)準(zhǔn)糖轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)對(duì)所述核心N-連接五糖進(jìn)行其它糖基化修飾，以產(chǎn)生各種基本上純的mAbC225糖基化狀態(tài)。參見，例如[40]。預(yù)言性實(shí)施例9:糖基化改造的」-h-FcmAbC225抗體的,丈應(yīng)功能。首先通過受體結(jié)合分沖斤對(duì)zl-h-FcmABC225的各種糖基化狀態(tài)的效應(yīng)功能進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試了多種FcgR,包括FcgRIIb(抑制性受體)、FcgRIIIa158V和FcgRIIIa158F(受體多態(tài)性)。所述結(jié)合分析遵循凈艮道的方案[6]。結(jié)合研究揭示一組特定的糖基化狀態(tài)對(duì)FcgRIIIa(V和F兩種變體)顯示出高親和力的結(jié)合，而對(duì)FcgRIIb具有低親和力。鑒定出特定的糖基化狀態(tài)顯示改進(jìn)的結(jié)合性質(zhì)。還通過竟?fàn)幮砸种品治?遵循報(bào)道的方案)[7、8、31]確定」-h-Fc的各種糖基化狀態(tài)與人FcgRI相互作用的能力檢測(cè)了它們的效應(yīng)功能。簡(jiǎn)單而言，用y-IFN刺激U937白細(xì)胞以誘導(dǎo)分化和人FcgRI的表達(dá)。用人源化IgGl敏化靶JY細(xì)胞。與系列濃度的特定糖基化狀態(tài)的J-h-FcC225和光澤精孵育之后，將所述敏化JY細(xì)胞與U937效應(yīng)細(xì)胞混合，測(cè)量超氧化物產(chǎn)生(用化學(xué)發(fā)光的變化表示)。比較」-h-FcC225的不同的糖基化狀態(tài)的抑制活性。此研究揭示了N-聚糖中的單個(gè)糖殘基如何影響效應(yīng)功能。特別是，此研究清楚地闡明了平分型GlcNAc殘基在增強(qiáng)效應(yīng)功能中的作用。除了上文描述的結(jié)構(gòu)-關(guān)系活性研究之外，此方法還應(yīng)用于完整IgG抗體表達(dá)和糖基化重構(gòu)，以生產(chǎn)與效應(yīng)細(xì)月包，如刺激ADCC活性的NK細(xì)胞具有高親和力結(jié)合的糖基化狀態(tài)?？傊?，這些研究提供了關(guān)于IgG-Fc上的N-聚糖的功能性作用的重要信息，為通過特定糖基化狀態(tài)增強(qiáng)治療性單克隆抗體的效應(yīng)功能提供了基礎(chǔ)。糖基化改造的mAb的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的分析。ADCC的體外沖莫型對(duì)于初始鑒定糖基化改造的mAb的功能是有用的，而體內(nèi)模型提供支持臨床轉(zhuǎn)化的進(jìn)一步的數(shù)據(jù)。為了具體地評(píng)估糖基化改造形式的C225或其它治療抗體對(duì)誘導(dǎo)ADCC的效用，使用復(fù)合的異種移植SCID小鼠才莫型(已清除內(nèi)源小鼠NK)繼承性地轉(zhuǎn)移帶有確定的FcgR多態(tài)性的NK細(xì)胞[34、35]。使用此系統(tǒng)允許評(píng)估用于誘導(dǎo)ADCC的糖基化改造的抗體[36、37、38]。優(yōu)選地，所述NK細(xì)胞來自V/V或F/F(在FcgRIIIa的氨基酸158處)或H/H或R/R(在FcgRIIa的氨基酸131處)純合個(gè)體。使用不同的肺瘤細(xì)胞系評(píng)估具有基本上純的糖基化狀態(tài)的糖改造的C225mAb(天然結(jié)構(gòu)或無鉸鏈)。M24met是已知在此才莫式系統(tǒng)中響應(yīng)C225抗體治療的黑色素瘤細(xì)胞系。此細(xì)胞系表達(dá)EGFR的突變形式，所述突變形式與小鼠和嵌合225mAb二者均結(jié)合，但是不產(chǎn)生酪氨酸激酶磷酸化和后續(xù)的EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過FACS分析可用的黑色素瘤細(xì)胞系鑒定了其它不表達(dá)EGFR的黑色素瘤細(xì)胞系。用在細(xì)月包表面表達(dá)的無功能的EGFR突變體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EGFR-A細(xì)胞。使用接種野生型EGFR陽性黑色素瘤細(xì)胞系如A431和M21的小鼠比較CHO細(xì)胞系產(chǎn)生的C225和C225糖改造的形式，所述糖改造形式顯示含有M24met的ADCC和/或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的黑色素瘤細(xì)胞系。預(yù)言性實(shí)施例IO:EGFR突變?nèi)朔瘟黾?xì)胞系在體內(nèi)的生長(zhǎng)。使用M24met和/或轉(zhuǎn)染無功能的、表達(dá)的EGFR(例如激酶活性突變體)的人SCCHN細(xì)胞系確定SCID/SCID小鼠的生長(zhǎng)曲線。具體地，在肺瘤接種之前三天，通過尾靜脈注射抗脫唾液酸1.1抗體耗i盡動(dòng)物的內(nèi)源NK細(xì)月包。共6只動(dòng)物(2只動(dòng)物/組)皮內(nèi)注射0.1mlPBS中的lx105、1x106或1x107個(gè)細(xì)胞。隔日測(cè)量胂瘤生長(zhǎng)，當(dāng)肺瘤達(dá)到體重的約10%時(shí)，當(dāng)胂瘤潰瘍時(shí)，當(dāng)所述動(dòng)物無法進(jìn)食或進(jìn)水時(shí)或當(dāng)研究人員認(rèn)為所述動(dòng)物處于發(fā)病前狀況時(shí)，處死動(dòng)物。在處死時(shí)，；險(xiǎn)查肺、肝臟和脾是否存在轉(zhuǎn)移性疾病。這些研究確定了肺瘤接種和生長(zhǎng)成SCID小鼠的參數(shù)。預(yù)言性實(shí)施例11:繼承性地轉(zhuǎn)移至SCID小鼠后人NK細(xì)胞的存活。我們使用variomacs珠從棕黃層血液(buffycoatblood)純化了CD56陽性細(xì)胞。為了除去NKT細(xì)胞，從此群體耗盡了CD3陽性細(xì)胞。在人NK轉(zhuǎn)移之前三天，通過IV注射抗脫唾液酸1.1抗體清除小鼠的內(nèi)源NK細(xì)胞。在轉(zhuǎn)移當(dāng)天，用CFSE對(duì)NK細(xì)胞進(jìn)行染色，然后通過尾靜脈或腹腔注射繼承性地轉(zhuǎn)移1x106、1x107或5x107個(gè)細(xì)胞(0.5ccPBS)。每周處死一個(gè)動(dòng)物/組，對(duì)它們的外周血、骨ft和脾進(jìn)行CFSE陽性細(xì)胞的存在和增殖的分析。為了確保內(nèi)源NK清除的效力，使用這些相同的器官系統(tǒng)評(píng)估小鼠NK的存在。這些研究確定了NK繼承性地轉(zhuǎn)移到SCID小鼠中的參數(shù)。預(yù)言性實(shí)施例12:糖改造的C225mAB的體內(nèi)評(píng)估。第0天，注射抗脫唾液酸1.1抗體以清除內(nèi)源小鼠NK細(xì)胞。在第3天，注射黑色素瘤腫瘤細(xì)胞系，允許根據(jù)預(yù)言性實(shí)施例10的結(jié)果形成腫瘤。在第6天，根據(jù)預(yù)言性實(shí)施例11的結(jié)果繼承性地轉(zhuǎn)移人NK細(xì)胞?？蛇x擇繼承性地轉(zhuǎn)移的NK細(xì)胞以覆蓋所有的CD16a和CD32多態(tài)性組合，進(jìn)而鑒定特定受體等位基因的最佳糖基化結(jié)構(gòu)。在第7、14和21天，根據(jù)[39]中的方案注射C225mAB或具有基本上純的糖基化狀態(tài)的糖改造的C225mAB。治療組如表2所示(糖C225是4唐改造的C225mAb或無4交鏈的等效物)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>預(yù)言性實(shí)施例13:糖改造的C225mAb與具有異種糖基化的親本C225mAb的比較性體內(nèi)評(píng)估。根據(jù)預(yù)言性實(shí)施例13的結(jié)果，對(duì)具有基本上純的糖基化狀態(tài)的C225mAb和前體C225mAb進(jìn)行了體內(nèi)比較。具有基本上純的糖基化狀態(tài)的C225在抑制腫瘤生長(zhǎng)和/或降低轉(zhuǎn)移中更有效。增加C225mAb效力的糖基化狀態(tài)將通過增加所述mAb誘導(dǎo)ADCC的能力來實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。因此，鑒定的糖結(jié)構(gòu)將適合改進(jìn)誘導(dǎo)ADCC的任何mAb的效力，所述mAb包括但不限于西妥昔單抗、利妥西單抗、莫羅莫那-CD3、阿昔單抗、達(dá)利珠單抗、巴利昔單抗、帕利珠單抗、英利昔單抗、曲妥珠單抗、吉妥珠單抗奧唑米星、阿侖單抗、替伊莫單抗、阿達(dá)木單抗、奧馬珠單抗、托西莫單抗、1-131托西莫單抗、依法利抹單抗、貝伐單抗、帕尼單抗、帕妥珠單抗、那他珠單抗、依那西普、IGN101(Aphton)、瓦羅西昔單抗(BiogenIdec和PDLBioPharm)、抗-CD80mAb(BiogenIdec)、抗-CD23mAb(BiogenIdel)、CAT-3888(CambridgeAntibodyTechnology)、CDP-791(Imclone)、依帕珠單抗(Immunomedics)、MDX-010(Medarex和BMS)、MDX-060(Medarex)、MDX-070(Medarex)、馬妥珠單抗(Merck)、CP-675,206(Pfizer)、CAL(Roche)、SGN-30(SeattleGenetics)、禮木單抗(Serono和Genmab)、阿德木單抗(Sereno)、奧戈伏單抗(UnitedTherapeutics)、尼妥珠單抗(YMBioscience)、ABT-874(AbbottLaboratories)、地諾蘇單抗(Amgen)、AM108(Amgen)、AMG714(Amgen)、芳妥珠單抗(BiogenIdec和PDLBioPharm)、達(dá)利珠單抗(BiogentIdec和PDLBioPharm)、戈利木單抗(Centocor和Schering-Plough)、CNTO1275(Centocor)、ocrelizumab(Genetech和Roche)、HuMax-CD20(Genmab)、貝利單抗(HGS和GSK)、依巾白珠單^t(Immunomedics)、MLN1202(MillenniumPharmaceuticals)、維西珠單抗(PDLBioPharm)、托珠單抗(Roche)、ocrerlizumab(Roche)、塞妥珠單抗(UCB,以前的Celltech)、依庫(kù)珠單抗(AlexionPharmaceuticals)、培克珠單抗(AlexionPharmaceuticals禾口Procter&Gamble)、阿昔單抗(Centocor)、雷珠單抗(Genetech)、美泊利珠單抗(GSK)、TNX-355(Tanox)或MYO-029(Wyeth)。糖改造的C225(西妥昔單抗)的示例性醫(yī)學(xué)應(yīng)用。SCCHN的種力矣差異。如上所述，F(xiàn)cgRIIIa和FcgRIIa的特定等位基因與mAb誘導(dǎo)ADCC的效力降低相關(guān)聯(lián)。這些遺傳變異很可能代表具有頻率差異的不同的種族和民族組。人們對(duì)民族組，特別是非洲裔美國(guó)人間的癌癥差異的公共健康影響的認(rèn)識(shí)日益增加。構(gòu)建了部分腫瘤登記，以便可以評(píng)估癌癥結(jié)果以了解疾病行為和改善癌癥結(jié)果。已顯示多個(gè)解剖部位的腫瘤的癌癥發(fā)病率和結(jié)果存在種族差異[41]。與主要是北歐后裔的人(白人)相比，非洲裔美國(guó)人的SCCHN發(fā)病率增加。在1973-1995年間，非洲裔美國(guó)男性的口腔癌和咽癌的發(fā)病率增加了39.7%,死亡率增加了1.8%,而白人男性相應(yīng)的發(fā)病率和死亡率分別降低了17.6%和35.7%[42]。女性的趨勢(shì)相似，但是數(shù)量級(jí)更小。此外，口腔癌已上升為非洲裔美國(guó)男性第四大經(jīng)常診斷到的癌癥(白人男性最常見的第十一位)，年發(fā)病率為20.4/106[42]。僅前列腺癌、肺癌和結(jié)腸癌在此組中具有更大的發(fā)病率；在SEER計(jì)劃評(píng)估的11個(gè)種族和民族組中，沒有其它組的口腔癌發(fā)病率排在前五位。SCCHN腫瘤是35-54歲的非洲裔美國(guó)男性中第四大癌癥死亡因素。非洲裔美國(guó)人在更小的年齡診斷出更晚期的頭頸部癌。TumorRegistriesoftheEastOrange,NewJerseyVAMedicalCenterandSchoolofMedicineandDentistry之前的一份綜述揭示，70%的年齡在45歲以下的診斷案例是非洲裔美國(guó)人。此組的6P/。呈現(xiàn)III或IV期；非洲裔美國(guó)人和白人晚期疾病的兩年存活率分別為23%和40%。Hoffman報(bào)道了國(guó)家癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)(NationalCancerDatabase)的數(shù)據(jù)，1985-1994年間有295，000個(gè)頭頸部癌案例；發(fā)現(xiàn)非洲裔美國(guó)人患晚期疾病(III或IV期)的比率是57.6%,而白人僅40.3%[43]。在控制病期和流行病學(xué)因素之后仍然存在顯著的結(jié)果差異。我們最近對(duì)我們機(jī)構(gòu)在馬里蘭大學(xué)醫(yī)學(xué)院的實(shí)踐的總結(jié)與其他人，見察到的晚期SCCHN癌癥結(jié)果的種族差異相同。我們?cè)u(píng)估了103位每周進(jìn)行一次卡鉑和紫杉醇(Taxol)方案和定量輻射(70.2Gy)治療的患者。非洲裔美國(guó)人(42%)和白人(58%)在年齡、性別、臨床分期、腫瘤部位和治療持續(xù)時(shí)間上相似。非洲裔美國(guó)人比白人具有更高的未調(diào)整的疾病復(fù)發(fā)率(分別為57%和37%,p=0.05),且更經(jīng)常失敗(分別為27%和12%,p=0.06)。在執(zhí)-f亍多變量分析時(shí)，非洲裔美國(guó)人獨(dú)立地比白人具有增加的復(fù)發(fā)可能性。IV期疾病和口咽腫瘤也是重要的復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)對(duì)象。我們?cè)谝唤M20位非洲裔美國(guó)人中評(píng)估了EGFR表達(dá)。我們確定了可重復(fù)的免疫組織化學(xué)染色(IHC)方案，EGFR著色指數(shù)(SI)如Ang等[33d]先前所述。先前的工作顯示，與具有低EGFR表達(dá)的HNSCC患者相比，具有高EGFR表達(dá)^平均吸光度的中值)的SCCHN的患者具有高度顯著更低(分別為P=0.0006和P=0.0016)的總存活和無病存活率和高度地顯著更高(P-0.0031)的局部復(fù)發(fā)率[33d]。在20位非洲裔美國(guó)人的組織樣品中，所有樣品均具有EGFR陽性IHC染色。根據(jù)胂瘤分化的平均SC染色如下所示良好至中度分化的SC二3.2;中度分化的SC=2.9;中度至差分化的SC-2.8;差分化的SC-2.4。整個(gè)組的SI中值為67.5。根據(jù)在非洲裔美國(guó)人的非惡性組織中的EGFR表達(dá)結(jié)果，我們確定了適當(dāng)?shù)臉颖玖恳源_定非洲裔美國(guó)人是否具有相對(duì)較高的EGFR表達(dá)。計(jì)算需要的樣本量以保守地;險(xiǎn)測(cè)非洲裔美國(guó)人和白人之間20。/。的EGFR表達(dá)SI差異，顯著性水平(1=0.05,冪(l-P)-0.90。根據(jù)我們先前對(duì)非洲裔美國(guó)人中EGFR表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，我們記錄的平均SI為68.7，并假設(shè)白人的SI小20%。用于根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)和對(duì)照腫瘤生長(zhǎng)差異的樣本量為n=[2*cT2*/(a,(3)]/[(XAA-Xw)2]其中w是每個(gè)組的樣本量；xaa-xw分別是非洲裔美國(guó)人和白人的平均EGFR表達(dá)SI,ci表示標(biāo)準(zhǔn)偏差(13.6)。最后，/(a，(3)是a,p的函數(shù)，顯著性水平a=0.05和冪(l-P)-O.卯，數(shù)量級(jí)為10.5。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，我們的治療組11=21。我們將樣品四舍五入，上調(diào)約10%至11=25，以考慮意外的技術(shù)失誤或丟失隨訪數(shù)據(jù)。預(yù)言性實(shí)施例14:EGFR表達(dá)的回顧性分析。使用上述免疫組織化學(xué)染色方案，使用VENTANABENCHMARK系統(tǒng)(Tucson,AZ),用針對(duì)EGFR(表皮生長(zhǎng)因子受體，31G7克隆)的抗體對(duì)石蠟包埋的SCCHN組織切片染色。使用CHROMAVISIONACIS(AutomatedCellularImagingSystem,SanJuanCapistrano，CA)分析染色的載玻片，其使用圖像采集技術(shù)以基于顏色、色純度和樣品中的染色強(qiáng)度定量EGFR染色。EGFR陽性染色的測(cè)量范圍是0(未檢測(cè)到染色)至4+(最大染色)。染色強(qiáng)度(SI)的測(cè)量范圍為O(未檢測(cè)到染色)至194(最大染色)。ACIS用來報(bào)告SI的數(shù)值范圍與Ang等[33d]報(bào)道的方案中使用的范圍相當(dāng)。確定所述組的EGFR表達(dá)，過表達(dá)基于高于所述組的染色強(qiáng)度中值的染色強(qiáng)度水平[33d]。使用SAS9.0(Carey,NC)進(jìn)行所有統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算。使用卡方檢驗(yàn)比較非洲裔美國(guó)人和白人的EGFR表達(dá)。相對(duì)于白人受治療者的腫瘤，用染色強(qiáng)度測(cè)量的非洲裔美國(guó)人的肺瘤中的EGFR表達(dá)更高。預(yù)言性實(shí)施例15:FcgRIIIa和FcgRIIa多態(tài)性的回顧性分析。我們確定非洲裔美國(guó)人的組織樣品中FcgRIIIa(158F/V)和FcgRIIa(131H/R)二者的多態(tài)性頻率。我們從患者的唾液、血液或從甲醛固定石蠟包埋的胂瘤樣品中純化了DNA。按上文所述方法進(jìn)行兩種Fc受體的等位基因多態(tài)性分析，如圖3和4所示。使用卡方檢驗(yàn)分析比較了非洲裔美國(guó)人和白人受治療者的FcgR多態(tài)性頻率。FcgRIIIa(158F)和/或FcgRIIa(131R)在非洲裔美國(guó)人中更常見。預(yù)言性實(shí)施例16:接受C225(西妥昔單抗)mAb的患者的復(fù)發(fā)情況的回顧性分析。分析的患者組包括同時(shí)接受放化療和西妥昔單抗的患者。我們會(huì)評(píng)估未調(diào)整的局部復(fù)發(fā)和無疾病率。此外，我們會(huì)執(zhí)行多變量回歸分析以調(diào)整疾病和人口統(tǒng)計(jì)學(xué)變量，以確定EGFR表達(dá)、NKFcgR多態(tài)性或種族/民族性是否獨(dú)立地預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算將使用SAS統(tǒng)計(jì)軟件包9.0(Carey，NC)執(zhí)行。在SCCHN患者中，EGFR過表達(dá)是復(fù)發(fā)的統(tǒng)計(jì)學(xué)上有效的獨(dú)立預(yù)言者，并且這與種族/民族組間的差異相關(guān)。此外，我們根據(jù)對(duì)C225治療的臨床響應(yīng)和FcgR親和力和多態(tài)性之間的相關(guān)性，證實(shí)ADCC機(jī)制在治療響應(yīng)中具有重要作用。如上所述，可以優(yōu)化針對(duì)EGFR的單克隆抗體，如C225(西妥昔單抗)的Fc糖組成。改造Fc糖使之對(duì)患者的FcgR等位基因具有最佳的親和力，進(jìn)而改進(jìn)結(jié)合和隨后的ADCC?？蛇x地，基于使用種族或民族FcgR的等位基因頻率替代個(gè)體化遺傳圖譜，來選擇C225糖內(nèi)容而使最佳結(jié)合的概率最大化。參考文獻(xiàn)本說明書提及的所有專利和公布均指示本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。本文的所有專利和公布均通過引用并入本文，就像特異性地和單獨(dú)地指出每個(gè)獨(dú)立的公布均通過引用整體并入本文。下列所有參考文獻(xiàn)均已在本專利申請(qǐng)中引用[1]Adams,G.P.和Wemer，L.M.2005.Monoclonalantibodytherapyofcancer(癌癥的單克隆抗體治療).NatBiotechnol23:1147-1157.[2]Carter,P.2001.Improvingtheefficacyofantibody-basedcancertherapies(改進(jìn)基于抗體的癌癥治療的*支力).NatRevCancer1:118-129.[2b]Shields,RobertL.等.LackofFucoseonHumanIgGlN-LinkedOligosaccharideImprovesBindingtoHumanFcyyRIIIandAntibody-dependentCellularToxicity(人IgGlN-連接寡糖缺乏巖藻糖改進(jìn)了與人FqRIII的結(jié)合和抗體依賴性的細(xì)胞毒性)，J.Biol.Chem.，第277巻,第30期，26733-26740,2002年7月26日。[2c]Shinkawa,Toyohide等.TheAbsenceofFucosebutNotthePresenceofGalactoseorBisectingN-AcetylglucosamineofHumanIgGlComplex-typeOligosaccharidesShowstheCriticalRoleofEnhancingAntibody-dependentCellularCytotoxicity(人IgGl復(fù)合類型寡糖缺乏巖藻糖而不是存在半乳糖或平分型N-乙酰葡萄糖胺顯示出對(duì)增強(qiáng)抗體依賴性的細(xì)胞毒性的重要作用).J.Biol.Chem.,2003年1月；278:3466-3473.[2d]N憩，Rinpei等.DefucosylatedChimericAnti-CCChemokineReceptor4IgGlwithEnhancedAntibody-DependentCellularCytotoxicityShowsPotentTherapeuticActivitytoT-CellLeukemiaandLymphoma(具有增強(qiáng)的抗體依賴性的細(xì)胞毒性的去巖藻糖基化的嵌合抗-CC趨化因子受體4IgGl顯示了對(duì)T-細(xì)胞白血病和淋巴瘤的強(qiáng)治療活性).CancerRes.200464:2127-2133[2e]Wu，J.,等，AnovelpolymorphismofFcgRIIIa(CD16a)altersreceptorfunctionandpredisposestoautoimmunedisease(新的FcgRIIIa(CD16a)多態(tài)性改變了受體功能并預(yù)示自身免疫疾病).JClmInvest,1997.100(5):第1059-70頁。[3]Weng,W.K.和R.Levy,TwoimmunoglobulinGfragmentCreceptorpolymorphismsindependentlypredictresponsetorituximabinpatientswithfollicularlymphoma(兩種免疫王求蛋白G片l爻C受體多態(tài)性在患有濾泡性淋巴瘤的患者中獨(dú)立預(yù)期對(duì)利妥西單抗的響應(yīng)).JClinOncol,2003.21(21):第3940-7頁。[4]Weng,W.K.，等,ClinicaloutcomeoflymphomapatientsafteridiotypevaccinationiscorrelatedwithhumoralimmuneresponseandimmunoglobulinGFcreceptorgenotype('淋巴瘤患者進(jìn)4亍獨(dú)特型疫苗才妾種后的臨床結(jié)果與體液免疫響應(yīng)和免疫球蛋白GFc受體基因型有關(guān)).JClmOncol,2004.22(23):第4717-24頁。[5]Jefferis,R.2005.Glycosylationofrecombinantantibodytherapeutics(重組抗體的糖基化治療).BiotechnolProg21:11-16.[6]Li,H.,Sethuraman,N.,Stadheim，T.A.,Zha,D.，Prmz,B.，Ballew,N.,Bobrowicz，P.,Choi,B.K.,Cook,W.J.,Cukan,M,Houston-Cummings,N.R.,Davidson,R.,Gong,B.,Hamilton,S.R.,Hoopes,J.P.,Jiang,Y.,Kim,N.,Mansfield,R.,Nett,J.H.,Rios,S.,Strawbridge,R.,Wildt,S.和Gerngross，T.U.2006.OptimizationofhumanizedIgGsinglycoengineeredPichiapastoris(在糖改造的畢赤酵母(Pichmpastoris)中優(yōu)化人源化IgG).NatBiotechnol24:210-215.[7]Limd，J.,Takahashi,N.,Popplewell,A.,Goodall,M.，Pound,J.D.,Tyler,R.,King,D.J.和Jefferis,R.2000.ExpressionandcharacterizationoftruncatedformsofhumanizedL243IgGl.ArchitecturalfeaturescaninfluencesynthesisofitsoligosaccharidechainsandaffectsuperoxideproductiontriggeredthroughhumanFc畫greceptorI(截4豆開j式的人源化L243IgGl的表達(dá)和表征。結(jié)構(gòu)特征可以影響其寡糖鏈合成和影響通過人Fc-g受體I觸發(fā)的超氧化物產(chǎn)生).EurJBiochem267:7246-7257.[8]Mimura，Y.,Church,S.,Ghirlando,R.,Ashton，P.R.,Dong,S.,Goodall,M.,Lund,J.和Jefferis,R.2000.Theinfluenceofglycosylationonthethe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雖然已詳細(xì)描述了本發(fā)明和其優(yōu)點(diǎn)，但是應(yīng)理解，本文可執(zhí)行各種更改、置換和改變，而不背離所附權(quán)利要求中確定的本發(fā)明的精神和范圍。此外，本申請(qǐng)的范圍不預(yù)期局限于說明書中描述的過程、機(jī)器、制造、物質(zhì)組成、手段、方法和步驟的特定實(shí)施方案。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容將容易理解，可根據(jù)本發(fā)明利用與本文描述的相應(yīng)實(shí)施方案執(zhí)行基本上相同的功能或達(dá)到基本上相同的結(jié)果的預(yù)先存在的的或待開發(fā)的過程、機(jī)器、制造、物質(zhì)組成、手段、方法和步驟。因此，所附權(quán)利要求意在將此類過程、機(jī)器、制造、物質(zhì)組成、手段、方法和步驟包括在其范圍中。權(quán)利要求1.一種生產(chǎn)具有需要的糖基化狀態(tài)的抗體的方法，所述方法包括如下步驟a)除去一個(gè)或多個(gè)糖，b)化學(xué)合成糖，和c)將所述的化學(xué)合成的糖酶促連接至(i)所述抗體或(ii)與所述抗體連接的糖。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化學(xué)合成的糖包含w惡唑啉環(huán)。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述酶是內(nèi)切糖苷酶，并且所述酶促連接包含轉(zhuǎn)糖基作用。4.如權(quán)利要求1-3所述的方法，其中所除去的糖是天冬酰胺連接的糖，多肽在步驟a)之后在天冬酰胺處保留N-乙酰葡萄糖胺，并且所述酶促連接是與所述N-乙酰葡萄糖胺的連接。5.如權(quán)利要求1-4所述的方法，其中所述抗體是單克隆抗體，并且所述方法產(chǎn)生基本上純的單克隆抗體。6.如權(quán)利要求1-5所述的方法，其中所述化學(xué)合成的糖在步驟c)之后產(chǎn)生非天然的糖結(jié)構(gòu)。7.如權(quán)利要求5-6所述的方法，其中所述基本上純的單克隆抗體包含能夠調(diào)節(jié)生物活性的糖基化狀態(tài)。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述生物活性是(i)對(duì)Fcg受體的結(jié)合親和力或(ii)抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。9.如權(quán)利要求5-8所述的方法，其中所述單克隆抗體包含西妥昔單抗、利妥西單抗、莫羅莫那-CD3、阿昔單抗、達(dá)利珠單抗、巴利昔單抗、帕利珠單抗、英利昔單抗、曲妥珠單抗、吉妥珠單抗奧唑米星、阿侖單抗、替伊莫單抗、阿達(dá)木單抗、奧馬珠單抗、托西莫單抗、1-131托西莫單抗、依法利抹單抗、貝伐單抗、帕尼單抗、帕妥珠單抗、那他珠單抗、依那西普、IGN101、瓦羅西昔單抗、抗-CD80mAb、抗-CD23mAb、CAT-3888、CDP-791、依帕珠單抗、MDX-OIO、MDX-060、MDX-070、馬妥珠單抗、CP-675,206、CAL、SGN-30、札木單抗b、阿德木單抗、奧戈伏單抗、尼妥珠單抗、ABT-874、地諾蘇單抗、AM108、AMG714、芳妥珠單抗、達(dá)利珠單抗、戈利木單抗、CNTO1275、ocrelizumab、HuMax-CD20、貝利單抗、依帕珠單抗、MLN1202、維西珠單抗、托珠單抗、ocrerlizumab、塞妥珠單抗、依庫(kù)珠單抗、培克珠單抗、阿昔單抗、雷珠單抗、美泊利珠單抗、TNX-355或MYO-029。10.—種抗體組合物，其包含具有基本上純的糖基化狀態(tài)的抗體。11.如權(quán)利要求IO所述的抗體組合物，其中所述糖基化狀態(tài)包含至少四個(gè)糖。12.如權(quán)利要求10-11所述的抗體組合物，其中所述抗體是單克隆抗體。13.如權(quán)利要求12所述的抗體組合物，其中所述單克隆抗體包含西妥昔單抗、利妥西單抗、莫羅莫那-CD3、阿昔單抗、達(dá)利珠單抗、巴利昔單抗、帕利珠單抗、英利昔單抗、曲妥珠單抗、吉妥珠單抗奧唑米星、阿侖單抗、替伊莫單抗、阿達(dá)木單抗、奧馬珠單抗、托西莫單抗、1-131托西莫單抗、依法利抹單抗、貝伐單抗、帕尼單抗、帕妥珠單抗、那他珠單抗、依那西普、IGNIOI、瓦羅西昔單抗、抗-CD80mAb、抗-CD23mAb、CAT-3888、CDP-791、依帕珠單抗、MDX-010、MDX-060、MDX-070、馬妥珠單抗、CP-675,206、CAL、SGN-30、札木單抗、阿德木單抗、奧戈伏單抗、尼妥珠單抗、ABT-874、地諾蘇單抗、AM108、AMG714、芳妥珠單抗、達(dá)利珠單抗、戈利木單抗、CNTO1275、ocrelizumab、HuMax-CD20、貝利單抗、依帕珠單抗、MLN1202、維西珠單抗、托珠單抗、ocrerhzumab、塞妥珠單抗、依庫(kù)珠單抗、培克珠單抗、阿昔單抗、雷珠單抗、美泊利珠單抗、TNX-355或MYO-029。14.一種評(píng)價(jià)糖多肽的生物活性的方法，所述方法包括如下步驟a)生產(chǎn)具有選定的糖基化狀態(tài)的糖多肽的基本上純的群體，和b)測(cè)量所述糖多肽的生物活性。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述糖多肽是抗體，并且所述生物活性是(i)對(duì)Fcg受體的結(jié)合親和力或(ii)抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)月包毒性。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述抗體包含單克隆抗體。17.如權(quán)利要求15-16所述的方法，其中所述生物活性是體內(nèi)抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。18.如權(quán)利要求16-17所述的方法，其中所述單克隆抗體包含西妥昔單抗、利妥西單抗、莫羅莫那-CD3、阿昔單抗、達(dá)利珠單抗、巴利昔單抗、帕利珠單抗、英利昔單抗、曲妥珠單抗、吉妥珠單抗奧唑米星、阿侖單抗、替伊莫單抗、阿達(dá)木單抗、奧馬珠單抗、托西莫單抗、1-131托西莫單抗、依法利株單抗、貝伐單抗、帕尼單抗、帕妥珠單抗、那他珠單抗、依那西普、IGN101、瓦羅西昔單抗、抗-CD80mAb、抗-CD23mAb、CAT-3888、CDP-791、依帕珠單抗、MDX國(guó)O10、MDX-060、MDX-070、馬妥珠單抗、CP-675,206、CAL、SGN-30、札木單抗、阿德木單抗、奧戈伏單抗、尼妥珠單抗、ABT-874、地諾蘇單抗、AM108、AMG714、芳妥珠單抗、達(dá)利珠單抗、戈利木單抗、CNTO1275、ocrelizumab、HuMax-CD20、貝利單抗、依帕珠單抗、MLN1202、維西珠單抗、托珠單抗、ocrerlizumab、塞妥珠單抗、依庫(kù)珠單抗、培克珠單抗、阿昔單抗、r雷珠單抗、美泊利珠單抗、TNX-355或MYO-029。19.一種改進(jìn)基于抗體的治療的結(jié)果的方法，所述方法包括如下步驟a)為受治療者確定所述受治療者中存在的Fcg受體等位基因，和b)用包含被選擇用于(i)增加對(duì)所述受治療者中存在的Fcg受體等位基因的結(jié)合親和力或(ii)增加抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的基本上純的糖基化狀態(tài)的單克隆抗體治療所述的受治療者。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述Fcg受體的等位基因是氨基酸158的FcgIIIa受體的等位基因或氨基酸131的FcgIIa受體的等位基因。21.—種為單克隆抗體選擇糖基化狀態(tài)的方法，所述方法包括如下步驟a)確定免疫細(xì)胞上的Fcg受體等位基因，和b)選擇相對(duì)于具有異種糖基化狀態(tài)的源單克隆抗體調(diào)節(jié)下列活性的糖基化狀態(tài)i)抗體依賴性的細(xì)胞毒性，n)補(bǔ)體依賴性的細(xì)胞毒性，in)Fcg受體結(jié)合親和力，或iv)單克隆抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)事件。22.—種生成單克隆抗體的生物等效物的方法，所述方法包括如下步驟a)確定預(yù)先存在的單克隆抗體的糖基化狀態(tài)，和b)使用如權(quán)利要求1-4所述的方法來生產(chǎn)與所述預(yù)先存在的單克隆抗體具有基本上相同的糖基化狀態(tài)的單克隆抗體。23.—種選擇用于臨床開發(fā)在具有Fcg受體等位基因的群體中使用的單克隆抗體的糖形的方法，所述方法包括如下步驟a)測(cè)試單克隆抗體的糖形針對(duì)所述群體中存在的Fcg受體等位基因的生物活性，和b)選擇用于臨床開發(fā)的能夠(i)增加對(duì)所述群體中存在的Fcg受體等位基因的結(jié)合親和力或(ii)增加抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的單克隆抗體的糖形。24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述Fcg受體等位基因是針對(duì)氨基酸158的FcgIIIa受體等位基因或針對(duì)氨基酸131的FcgIIa受體等位基因。25.—種生成具有異種糖基化狀態(tài)的預(yù)先存在的單克隆抗體的基本上純的糖形的方法，所述方法包括如下步驟a)使用如權(quán)利要求1-4所述的方法來生產(chǎn)在所述預(yù)先存在的單克隆抗體中存在的兩個(gè)或多個(gè)糖形，b)測(cè)試所述兩個(gè)或多個(gè)糖形的生物活性或毒性以確定具有更高的生物活性或更低的毒性的預(yù)先存在的單克隆抗體的優(yōu)選的糖形，和c)使用如權(quán)利要求1-4所述的方法來生產(chǎn)具有基本上純的優(yōu)選糖基化狀態(tài)的在步驟b)中鑒定的具有更高的生物活性或更低的毒性的單克隆抗體的糖形。全文摘要本發(fā)明涉及生產(chǎn)糖基化改造的抗體的方法和使用所述糖基化改造的抗體治療患者，特別是癌癥患者或具有免疫疾病或病癥的患者的方法。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)用于治療具有不響應(yīng)常規(guī)抗體治療的多態(tài)性的患者的糖基化改造的抗體的方法。本發(fā)明還涉及通過糖基化改造改進(jìn)抗體生物活性的方法。本發(fā)明還涉及使用糖基化改造的抗體調(diào)節(jié)抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)的方法。文檔編號(hào)A61K39/00GK101466402SQ200780021500公開日2009年6月24日申請(qǐng)日期2007年6月9日優(yōu)先權(quán)日2006年6月9日發(fā)明者L·-X·王,S·斯特羅姆申請(qǐng)人:馬里蘭卅大學(xué)(巴爾的摩);馬里蘭大學(xué)生物科技學(xué)院