專利名稱：Fab糖基化抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體領(lǐng)域。具體而言，提供了在Fab部分連接有高度唾液酸化的聚糖的抗體。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了用于通過Fab唾液酸化而控制抗體的循環(huán)半衰期方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)今，抗體是醫(yī)療和研究領(lǐng)域廣泛使用的試劑。在醫(yī)療用途中，其在許多不同領(lǐng)域有所應(yīng)用。例如，抗體用作檢測(cè)特定標(biāo)記物的標(biāo)記試劑，其允許進(jìn)行疾病的診斷和/或預(yù)后或?qū)唧w身體參數(shù)如特定激素的存在情況或濃度進(jìn)行確定。進(jìn)一步地，抗體還用作多種疾病如癌癥、心血管疾病、炎性疾病、黃斑退化、移植排斥、多發(fā)性硬化及病毒感染的治療和預(yù)防中的治療試劑。在這些療法中，可以是抗體本身具有治療活性，例如通過阻斷受體或信使分子，由此抑制其疾病相關(guān)的功能，或其通過募集并激活患者免疫系統(tǒng)組分而具有治療活性。備選地，抗體可偶聯(lián)至另一種具有治療活性的試齊U。具體而言在對(duì)癌癥和感染的治療中， 所述的其他試劑具有細(xì)胞殺傷活性并可以為例如放射性同位素或細(xì)胞毒素。在另一項(xiàng)應(yīng)用中，抗體可用于通過將合適的抗體轉(zhuǎn)移至患者循環(huán)系統(tǒng)而被動(dòng)地免疫患者?？贵w的體內(nèi)應(yīng)用，特別是其治療用途的一個(gè)關(guān)鍵方面是抗體留存在患者體內(nèi)的時(shí)間，即，抗體的循環(huán)半衰期。許多增加蛋白質(zhì)的循環(huán)半衰期的方法包括對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行人工修飾，如將其與其他增加半衰期的分子結(jié)合或?qū)⑵淙诤系狡渌黾影胨テ诘牡鞍踪|(zhì)或肽上。然而，這些方法包括特定的不利之處。其通常包括復(fù)雜的生產(chǎn)過程，并且在其生物利用率和藥物許可上常常出現(xiàn)問題。此外，這些修飾經(jīng)常對(duì)抗體的生物學(xué)活性有害，特別是對(duì)其抗原結(jié)合特性及其下游信號(hào)傳導(dǎo)如抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)及補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性(CDC)有害。進(jìn)一步地,對(duì)于糖蛋白如FSH,在一些情況下連接于所述糖蛋白的碳水化合物鏈上的唾液酸的量會(huì)影響糖蛋白的清除速率，并因此影響其循環(huán)半衰期。然而，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)水平，此原則不適用于抗體。首先，連接于IgG抗體Fe區(qū)域的碳水化合物鏈的高度唾液酸化負(fù)面影響了抗體的生物學(xué)活性。具體而言，由于Fe區(qū)域與相應(yīng)Fe受體的親和力下降，抗體的ADCC極大地減少(見例如，Scallon, B.J.等人(2006)MolecularImmunology44, 1524-1534)。進(jìn)一步地，連接于Fab區(qū)域糖基化位點(diǎn)的碳水化合物鏈的唾液酸化程度被認(rèn)為對(duì)抗體的循環(huán)半衰期無影響，但是影響了抗原結(jié)合(見例如，Huang, L.等人(2006) Analytical Biochemistry349, 197-207, Millward, Τ.Α.等人(2008)Biologicals36, 41-47, Jefferis, R.(2009)Methods in Molecular Biology483, 223-238,R Sola, R.J.等人(2010) Biodrugs24, 9-21)。在另一方面，具有低的循環(huán)半衰期的抗體對(duì)一些應(yīng)用也是很重要的。例如，用于診斷目的使用放射性影像方法時(shí)，使用了結(jié)合于放射性核素的抗體。由于成像步驟是在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行的，而且結(jié)合于抗體的放射性核素具有特定的不利副作用，所以將結(jié)合物從患者循環(huán)系統(tǒng)中快速清除會(huì)很有利。因此，本領(lǐng)域有對(duì)不使用化學(xué)結(jié)合物或融合蛋白質(zhì)而調(diào)控(具體是增加或降低)抗體尤其是可用于治療或診斷的抗體的循環(huán)半衰期的需要。發(fā)明概述本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)連接于抗體Fab部分的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物鏈上的唾液酸的量極大地影響了抗體的循環(huán)半衰期。此原則可用于控制循環(huán)半衰期并由此控制抗體尤其是可用于治療或診斷的抗體的生物利用率。能夠單個(gè)地調(diào)整多種抗體的循環(huán)半衰期是有利的，例如有利于優(yōu)化治療效力及平衡抗體的治療效應(yīng)和可能的不利副作用。進(jìn)一步地，出于診斷目的，調(diào)整抗體的循環(huán)半衰期至低水平以避免不利副作用是有利的。因此，在第一方面，本發(fā)明針對(duì)用于控制抗體或其功能片段或其衍生物的循環(huán)半衰期的方法，其包括步驟(a)對(duì)于增加循環(huán)半衰期
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(al)在包含抗體或其功能片段或衍生物的組合物中增加連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中的唾液酸的量；及/或(a2)移除存在于抗體或其功能片段或衍生物的Fab部分中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)；及/或(a3)在包含抗體或其功能片段或衍生物的組合物中降低連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中的游離半乳糖單元的量；或(b)對(duì)于降低循環(huán)半衰期(bl)在包含抗體或其功能片段或衍生物的組合物中降低連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中的唾液酸的量；及/或(b2)向抗體或其功能片段或衍生物的Fab部分中引入一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)；和/或(b3)在包含抗體或其功能片段或衍生物的組合物中增加連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中的游離半乳糖單元的量。在第二方面，本發(fā)明提供了抗體組合物，其包含抗體或其功能片段或衍生物，其特征在于所述抗體或其功能片段或衍生物包含存在于其Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)，并特征在于所述組合物中連接于所述抗體或其功能片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中至少65%攜帶至少一個(gè)末端唾液酸殘基和/或連接于所述抗體或其功能片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中少于35%攜帶至少兩個(gè)游離半乳糖單元。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了特異的抗體組合物及其用于醫(yī)療的用途。在第三方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)包含具有所需的循環(huán)半衰期的抗體或其功能片段或衍生物的抗體組合物的方法，其包括的步驟為:在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述抗體或其功能片段或衍生物，其中根據(jù)本發(fā)明的用于控制抗體或其功能片段或衍生物的半衰期的方法是使用所述方法的步驟(al)、步驟(a3)、步驟(bl)或步驟(b3)進(jìn)行的及/或所述宿主細(xì)胞表達(dá)通過根據(jù)本發(fā)明使用步驟(a2)或(b2)的用于控制抗體或其功能片段或衍生物的半衰期的方法獲得的抗體或其功能片段或衍生物。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，由本發(fā)明提供的抗體此外還具有得到極大改進(jìn)的誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)不同活性(尤其是ADCC)的能力。這是通過抗體的優(yōu)化糖基化形式實(shí)現(xiàn)的，除了控制的循環(huán)半衰期外還產(chǎn)生改進(jìn)的抗體活性，特別是改進(jìn)的Fe受體結(jié)合和激活。因此，本發(fā)明在另一方面提供了包含具有增加的循環(huán)半衰期及提高的ADCC活性的抗體組合物，以及用于生產(chǎn)這些抗體的方法。這些抗體尤其適合用于治療用途，因?yàn)槠渖锢寐始捌渖飳W(xué)活性有所增加，這二者都有助于增加治療效力。因此，本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是能夠提供同時(shí)具有增加的循環(huán)半衰期及增加的生物學(xué)活性的抗體。循環(huán)半衰期的增加優(yōu)選地是通過根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法實(shí)現(xiàn)的。此外，生物學(xué)活性的增加優(yōu)選地是增加的ADCC活性，特別是由對(duì)相應(yīng)的Fe受體的結(jié)合更強(qiáng)造成的。這種增加的ADCC活性可通過優(yōu)化抗體的糖基化形式，例如通過減少連接于存在于抗體Fe部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中果糖殘基的量而實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)從以下描述及附隨的權(quán)利要求更清楚地理解本發(fā)明的其他目標(biāo)、特征、優(yōu)勢(shì)及方面。然而應(yīng)當(dāng)理解的是以下描述、附隨的權(quán)利要求及具體實(shí)施例指出了本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施方式，其只是以說明的方式給出的。本發(fā)明技術(shù)人員通過閱讀以下描述會(huì)很容易地清楚所公開的發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的多種變化和修飾。定義 如本文所使用的，以下詞語通常優(yōu)選地具有下文提出的意義，除非在其使用的上下文中有另外指出。如本文所使用的，詞語“包含”除了其字面的意義外還包括并具體指代詞語“大體上由……構(gòu)成”及“由……構(gòu)成”。因此，詞語“包含”指代這樣的實(shí)施方式，其中主語物體“包含”具體列出的元素，而不包含其他元素，還指代這樣的實(shí)施方式，其中主語物體“包含”具體列出的元素，也可/或確實(shí)包含其他元素。類似地，詞語“具有”應(yīng)當(dāng)像詞語“包含”一樣理解，也是包括并具體指代詞語“大體上由……構(gòu)成”及“由……構(gòu)成”。術(shù)語“抗體”具體而言指的是至少包含由二硫鍵連接的兩條重鏈和兩條輕鏈的蛋白質(zhì)。術(shù)語“抗體”包括天然發(fā)生的抗體也包括抗體的所有重組形式，例如，表達(dá)于原核細(xì)胞的抗體、非糖基化抗體、人源化抗體和嵌合抗體。每條重鏈都由一個(gè)重鏈可變區(qū)(VH)和一個(gè)重鏈恒定區(qū)(CH)組成。每條輕鏈都由一個(gè)輕鏈可變區(qū)(VL)和一個(gè)輕鏈恒定區(qū)(CL)組成。重鏈恒定區(qū)包含三個(gè)或在IgM或IgE型抗體的情況下包含四個(gè)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2、CH3和CH4)，其中第一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域CHl與可變區(qū)相鄰，并可通過一個(gè)鉸鏈區(qū)與第二恒定結(jié)構(gòu)域CH2相連。輕鏈恒定區(qū)只由一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。可變區(qū)可進(jìn)一步劃分為超變區(qū)(稱為互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R))，其中分散有更保守的區(qū)域(稱為骨架區(qū)(FR))。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。抗體的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，包括多種免疫系統(tǒng)細(xì)胞(例如效應(yīng)子細(xì)胞)及經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一補(bǔ)體(Clq)。然而根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“抗體”還包括抗體如重鏈抗體(即僅由一條或多條，尤其是兩條重鏈組成的抗體)以及納米抗體(即僅由單個(gè)單體可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的抗體)。具體而言，抗體可為任何同種型如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，包括任何亞型如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl或IgA2。優(yōu)選地，抗體為IgGl或IgG2抗體，更優(yōu)選地為IgGl抗體。重鏈恒定區(qū)可為任何類型如、-、δ-、α-、μ-或ε-型重鏈。進(jìn)一步地,輕鏈恒定區(qū)也可為任何類型如K-或λ-型輕鏈。優(yōu)選地，抗體的輕鏈為K-鏈。
為表明重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸位置,本文使用了 Kabat編號(hào)系統(tǒng)(Kabat, E.A.等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, NIHPublication N0.91-3242)。根據(jù)所述系統(tǒng)，重鏈包含的氨基酸位置是從0號(hào)位-113號(hào)位，包括位置35A、35B、52A-52C、82A-82C及100A-100K。根據(jù)Kabat編號(hào)，重鏈可變區(qū)的CDR位于位置31-35B (CDRl)、50_65(CDR2)及95-102 (CDR3)。剩余的氨基酸位置形成了骨架區(qū)FR1-FR4。輕鏈可變區(qū)包含位置0-109，包括位置27A_27F、95A_95F和106A。CDR位于位置24-34 (CDRl )、50-56 (CDR2)及89-97 (CDR3)。根據(jù)抗體的特異基因的起始形成，并非所有這些位置都必須存在于給定的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)中。在本文中提到重鏈或輕鏈可變區(qū)中氨基酸位置的情況下，除非另有指出，其都指代根據(jù)Kabat編號(hào)的位置?？贵w或其片段或衍生物的“Fab部分”具體而言指代抗體的一部分，其包含重鏈和輕鏈可變區(qū)(VH和VL)及第一重鏈和輕鏈恒定區(qū)(CHl和CL)。在其中抗體或其片段或衍生物不包含所有這些區(qū)域的情況下，術(shù)語“Fab部分”僅指代存在于所述抗體或其片段或衍生物中的VH、VL、CH1和CL?！癋ab部分”指代抗體的一部分，其對(duì)應(yīng)于木瓜蛋白酶消化天然抗體獲得的含有抗體的抗原結(jié)合活性的片段。具體而言，抗體或其片段或衍生物的Fab部分包括其抗原結(jié)合位點(diǎn)或抗原結(jié)合能力。優(yōu)選地，F(xiàn)ab部分至少包含抗體的VH區(qū)域。抗體或其片段或衍生物的“Fe部分”具體而言指代抗體的一部分，其包含重鏈恒定區(qū)2、3，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候還包括4 (CH2、CH3和CH4)。在其中抗體或其片段或衍生物不包含所有這些區(qū)域的情況下，術(shù)語“Fe部分”僅指代存在于所述抗體或其片段或衍生物中的CH2、CH3和CH4。優(yōu)選地，“Fe部分”指代抗體的一部分，其對(duì)應(yīng)于木瓜蛋白酶消化天然抗體獲得的不含有抗體的抗原結(jié)合活性的片段。具體而言，抗體或其片段或衍生物的Fe部分能夠結(jié)合Fe受體并因此例如包含F(xiàn)e受體結(jié)合位點(diǎn)或Fe受體結(jié)合能力。進(jìn)一步地,其優(yōu)選地能夠誘導(dǎo)ADCC。優(yōu)選地，F(xiàn)e部分至少包含抗體的CH2區(qū)域。在圖21A中可見IgG類型的抗體示意圖，包括Fab部分和Fe部分。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“嵌合抗體”具體而言指代一種抗體，其中恒定區(qū)來源于人抗體或人抗體保守序列，其中至少一個(gè)，優(yōu)選地兩個(gè)可變區(qū)都來源于非人抗體，尤其是來源于小鼠抗體。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“人源化抗體”具體而言指代一種抗體，其中至少一個(gè)CDR來源于非人抗體，其中(若其存在)恒定區(qū)及可變區(qū)的至少一個(gè)骨架區(qū)來源于人抗體或人抗體保守序列。優(yōu)選地，重鏈可變區(qū)的所有CDR，更優(yōu)選地，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的所有CDR都來源于非人抗體。進(jìn)一步地，優(yōu)選地，重鏈可變區(qū)的所有骨架區(qū)，更優(yōu)選地，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的所有骨架區(qū)都來源于人抗體或人抗體保守序列。這些CDR優(yōu)選地來源于相同的非人抗體?？勺儏^(qū)的前三個(gè)或所有骨架區(qū)都優(yōu)選地來源于相同的人抗體或人抗體保守序列，然而，重鏈可變區(qū)的骨架區(qū)不必來源于與輕鏈可變區(qū)的骨架區(qū)相同的人抗體或人抗體保守序列。在具體優(yōu)選的實(shí)施方式中，人源化抗體能夠結(jié)合于相同抗原，具體而言結(jié)合于與一種或多種CDR來源的非人抗體相同的表位。優(yōu)選地，人源化抗體中來源于非人抗體的CDR與所述非人抗體的CDR同一。進(jìn)一步地，人源化抗體中來源于人抗體或人抗體保守序列的骨架區(qū)可與所述抗體或人抗體保守序列的骨架區(qū)同一。在另一個(gè)實(shí)施方式中，人源化抗體的骨架區(qū)相比與其來源的人抗體或人抗體保守序列具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換。所置換的氨基酸殘基優(yōu)選地由一種或多種CDR所來源的非人抗體中對(duì)應(yīng)氨基酸殘基所取代(特別是根據(jù)Kabat編號(hào)位于相同位置的那些對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基)。具體而言，人源化抗體的可變區(qū)(重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū))的骨架區(qū)優(yōu)選地包含不超過30個(gè)氨基酸置換，優(yōu)選地不超過25、不超過20、不超過15、不超過
12、不超過10或不超過8個(gè)氨基酸置換。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，人源化抗體重鏈可變區(qū)的所有骨架區(qū)在總體上與其來源的人抗體或人抗體保守序列的重鏈可變區(qū)的骨架區(qū)共有的同源性或同一性為至少70%、優(yōu)選地至少75%、至少80%、至少85%或至少90%。進(jìn)一步地，人源化抗體輕鏈可變區(qū)的所有骨架區(qū)在總體上與其來源的人抗體或人抗體保守序列的輕鏈可變區(qū)的骨架區(qū)共有的同源性或同一性為至少70%、優(yōu)選地至少75%、至少80%、至少85%或至少90%。所述嵌合或人源化抗體的恒定區(qū)可來源于任何人抗體或人抗體保守序列。具體而言，重鏈恒定區(qū)可為任何類型如、-、δ_、α-、μ-或ε-型重鏈。嵌合或人源化抗體因此可為任何同種型如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM,包括任何亞型如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl或IgA2。優(yōu)選地,所述嵌合或人源化抗體為IgGl或IgG2抗體、更優(yōu)選地為IgGl抗體。進(jìn)一步地，輕鏈恒定區(qū)也可為任何類型如K-或λ-型輕鏈。優(yōu)選地，所述嵌合或人源化抗體的輕鏈為K鏈。如果靶標(biāo)氨基酸序列在其全長(zhǎng)上與參考氨基酸序列的對(duì)應(yīng)部分共有的同源性或同一性為至少60%、優(yōu)選地至少70%、至少75%、更優(yōu)選地為至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少95%或至少97%，則所述靶標(biāo)氨基酸序列“來源”于參考氨基酸序列。例如，如果人源抗體的骨架區(qū)來源于具體人抗體的可變區(qū)，那么所述人源化抗體的骨架區(qū)氨基酸在其全長(zhǎng)上與所述人抗體的對(duì)應(yīng)骨架區(qū)共有的同源性或同一性為至少60%、優(yōu)選地至少70%、至少75%、更優(yōu)選地至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少95%或至少97%?！皩?duì)應(yīng)部分”或“對(duì)應(yīng)骨架區(qū)”指的是例如靶標(biāo)抗體的重鏈可變區(qū)的骨架區(qū)I(FRHl)對(duì)應(yīng)著參考抗體重鏈可變區(qū)的骨架區(qū)I。對(duì)于？?jī)?cè)2、？?jī)?cè)3、？?jī)?cè)4、？虬1、？虬2、？虬3和？虬4也成立。在具體實(shí)施方式
中，“來源”于參考氨基酸的靶標(biāo)氨基酸序列在其全長(zhǎng)上于參考氨基酸序列的對(duì)應(yīng)部分為100%同源，或特別是1 00%同一?？贵w的“片段或衍生物”特別是來源于所述抗體并能與所述抗體結(jié)合于相同抗原，特別是結(jié)合于相同表位的蛋白質(zhì)或糖蛋白。因此，本文的抗體片段或衍生物一般指代功能片段或衍生物。抗體的功能片段或衍生物具體而言能夠與所述抗體結(jié)合于相同的抗原，尤其是結(jié)合于相同表位。在具體優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗體的片段或衍生物包含重鏈可變區(qū)。據(jù)顯示，抗體的抗原結(jié)合功能可由全長(zhǎng)抗體的片段或其衍生物進(jìn)行。抗體的片段或衍生物的實(shí)例包括(i)Fab片段，由每條重鏈和輕鏈的可變區(qū)和第一恒定區(qū)構(gòu)成的單價(jià)片段；(ii)F(ab)2片段，包含由鉸鏈區(qū)二硫橋相連的兩個(gè)Fab片段的雙價(jià)片段；(iii)Fd片段，由重鏈的可變區(qū)及第一恒定結(jié)構(gòu)域CHl構(gòu)成；(iv)Fv片段，由抗體單臂的重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)成；
(v)scFv片段，由單一多肽鏈構(gòu)成的Fe片段；(vi)(Fv)2片段，由兩個(gè)共價(jià)連接在一起的Fv片段構(gòu)成；(vii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域；及(viii)多價(jià)抗體，由以如下方式共價(jià)連接在一起的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)構(gòu)成:重鏈和輕鏈可變區(qū)的結(jié)合只能在分子間而不能在分子內(nèi)發(fā)生。這些抗體片段和衍生物是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得的?！疤禺愋越Y(jié)合”優(yōu)選地指代試劑如抗體對(duì)靶標(biāo)如其特異的表位的結(jié)合比結(jié)合于另一種靶標(biāo)更強(qiáng)。如果試劑結(jié)合于第一種靶標(biāo)的解離常數(shù)(Kd)比對(duì)第二種靶標(biāo)的解離常數(shù)更低，則該試劑對(duì)第一種靶標(biāo)比對(duì)第二種靶標(biāo)的結(jié)合更強(qiáng)。優(yōu)選地，對(duì)該試劑特異性結(jié)合的靶標(biāo)的解離常數(shù)比對(duì)該試劑并非特異性結(jié)合的靶標(biāo)的解離常數(shù)低超過2倍、優(yōu)選地超過5倍、更優(yōu)選地超過10倍、甚至更優(yōu)選地超過20倍、50倍、100倍、200倍、500倍或1000倍。術(shù)語“唾液酸”具體而言指代神經(jīng)氨酸的任何N-或O-置換的衍生物。其優(yōu)選地指代5-N-乙酰神經(jīng)氨酸和5-N-羥乙酰神經(jīng)氨酸羥乙酰神經(jīng)氨酸二者，更優(yōu)選地只指代5-N-乙酰神經(jīng)氨酸。唾液酸，尤其是5-N-乙酰神經(jīng)氨酸，優(yōu)選地經(jīng)由2，3-或2，6-連接與糖蛋白的碳水化合物鏈相連。優(yōu)選地，本文描述的抗體組合物中存在2，3-以及2，6-連接的唾液酸。如本文提到的術(shù)語“游離半乳糖單元”具體而言指代經(jīng)由其還原性末端連接于碳水化合物結(jié)構(gòu)且在其6號(hào)位不攜帶唾液酸的半乳糖單元。具體而言，游離半乳糖單元在其6號(hào)位不攜帶任何糖單元。在特定實(shí)施方式中，游離半乳糖單元在其6號(hào)位不攜帶任何化學(xué)修飾或取代基。具體而言，半乳糖單元在其2號(hào)位、3號(hào)位、4號(hào)位、5號(hào)位和6號(hào)位中的任何位置上不攜帶唾液酸，優(yōu)選地不攜帶任何糖、更優(yōu)選地不攜帶任何化學(xué)修飾或取代基。在這點(diǎn)上，不認(rèn)為半乳糖單元的氫及氫氧根殘基為化學(xué)修飾或取代基。
·
術(shù)語“糖基化位點(diǎn)”具體而言指代能由能夠催化單糖單元或碳水化合物鏈連接于肽鏈的酶識(shí)別的任何氨基酸序列。優(yōu)選地，糖基化位點(diǎn)包括其上連接有單糖單元或碳水化合物鏈的氨基酸殘基。優(yōu)選的糖基化位點(diǎn)為N-糖基化位點(diǎn)，特別是包含精氨酸殘基作為連接位點(diǎn)的N-糖基化位點(diǎn)以及O-糖基化位點(diǎn)，特別是包含絲氨酸或蘇氨酸殘基作為連接位點(diǎn)的O-糖基化。優(yōu)選的N-糖基化位點(diǎn)包含氨基酸序列Asn XaaSer/Thr，其中Xaa為任何氨基酸，優(yōu)選地，除了 Pro以外。此氨基酸序列指代三個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其中第一個(gè)氨基酸殘基為天冬氨酸殘基、第二個(gè)氨基酸殘基可為任何氨基酸殘基，特別是除了脯氨酸外的任何天然發(fā)生的氨基酸殘基，第三個(gè)氨基酸殘基為絲氨酸或蘇氨酸。當(dāng)糖基化時(shí)，碳水化合物鏈連接于天冬氨酸殘基上。本文給出的數(shù)字，特別是特異糖基化特性的相對(duì)量?jī)?yōu)選地應(yīng)理解為近似數(shù)字。具體而言，這些數(shù)字優(yōu)選地可為高出和/或低多至10%，特別是高出和/或低多至9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2% 或 1%。術(shù)語“核酸”包括單鏈和雙鏈核酸及核糖核酸和脫氧核糖核酸。其可包含天然發(fā)生的以及人工合成的核苷酸，可以為天然或人工修飾的，例如通過甲基化、5’-和/或3’帽化得到修飾。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“宿主細(xì)胞”涉及任何可用外源核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。術(shù)語“宿主細(xì)胞”根據(jù)本發(fā)明包含原核(例如大腸桿菌(E.coli))或真核細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，尤其是人細(xì)胞，酵母細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞)。對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞如來自人、小鼠、倉(cāng)鼠、豬、山羊或靈長(zhǎng)類動(dòng)物的細(xì)胞有特別的偏好。細(xì)胞可來源于多種組織類型并包含原代細(xì)胞和細(xì)胞系。優(yōu)選地,宿主細(xì)胞為人細(xì)胞,特別是永生化人細(xì)胞,優(yōu)選地為永生化人血細(xì)胞如永生化人髓細(xì)胞或永生化人髓性白血病細(xì)胞。進(jìn)一步地，宿主細(xì)胞還可為永生化的人腫瘤細(xì)胞。核酸可以單一拷貝或兩份或多份拷貝的形式存在于宿主細(xì)胞，在一個(gè)實(shí)施方式中，其在宿主細(xì)胞中表達(dá)。術(shù)語“患者”根據(jù)本發(fā)明指的是人類、非人靈長(zhǎng)類或另一種動(dòng)物，尤其是哺乳動(dòng)物如奶牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓或嚙齒類如小鼠和大鼠。在一個(gè)具體的優(yōu)選的實(shí)施方式中，患者為人類。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“癌癥”具體而言包含白血病、精原細(xì)胞瘤、黑色素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、腎上腺癌、甲狀腺癌、血液癌、皮膚癌、腦癌、子宮頸癌、腸癌、肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、腸癌、頭頸部癌、胃腸道癌、淋巴結(jié)癌、食道癌、大腸癌、胰臟癌、耳、鼻和喉(ENT)癌、乳腺癌、前列腺癌、子宮癌、卵巢癌和肺癌及其轉(zhuǎn)移腫瘤。其實(shí)例為肺腺癌、結(jié)腸腺癌、頭頸部腺癌以及上述癌癥類型或腫瘤的轉(zhuǎn)移腫瘤。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語癌癥還包含癌癥轉(zhuǎn)移腫瘤。通過“腫瘤”指的是一組由調(diào)控錯(cuò)誤的細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞或組織，尤其指代癌。腫瘤可顯示出部分或完全失去結(jié)構(gòu)組織及與正常組織的功能協(xié)作，經(jīng)常形成有區(qū)別的一團(tuán)組織，其可以為良性或惡性的。具體而言，術(shù)語“腫瘤”指代惡性腫瘤。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，術(shù)語“腫瘤”或“腫瘤細(xì)胞”還指代非固體癌及非固體癌的細(xì)胞如白血病細(xì)胞。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，術(shù)語“腫瘤”和“腫瘤細(xì)胞”不包括相應(yīng)的非固體癌或其細(xì)胞。通過“轉(zhuǎn)移”，指的是癌細(xì)胞從其原始位點(diǎn)向身體的另一部分?jǐn)U散。轉(zhuǎn)移的形成是非常復(fù)雜的過程，通常涉及癌細(xì)胞從原發(fā)性腫瘤的脫離，進(jìn)入身體循環(huán)系統(tǒng)并在體內(nèi)其他地方的正常組織中沉積并生長(zhǎng)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí)，新腫瘤稱為二級(jí)或轉(zhuǎn)移腫瘤，其細(xì)胞通常與原始腫瘤相似。這意味著例如如果乳腺癌轉(zhuǎn)移至肺，則二級(jí)腫瘤是由異常乳腺癌細(xì)胞而不是由異常非細(xì)胞構(gòu)成。肺中的腫瘤于是稱為轉(zhuǎn)移乳腺癌，而非肺癌。術(shù)語“藥用組合物”具體而言指代適合施用于人或動(dòng)物的組合物，S卩，含有藥用可接受組分的組合物。優(yōu)選地，藥用組合物包含活性化合物或其鹽或前體藥物，以及載體、稀釋劑或藥用輔料如緩沖液、防腐劑及滲透壓調(diào)節(jié)劑。術(shù)語“抗體組合物”具體而言指代任何包含抗體或其片段或衍生物的組合物。該抗體組合物可為液體或固體組合物，還包括凍干或配制的抗體組合物。優(yōu)選地，使用了液體組合物，更優(yōu)選地為水溶液組合物。其優(yōu)選地進(jìn)一步包含溶劑如水、用于調(diào)節(jié)PH值的緩沖液，并可選地包含其他用于穩(wěn)定抗體防止抗體降解的試劑?？贵w組合物優(yōu)選地包含合理量的抗體，特別是至少Ifmol、優(yōu)選地至少lpmol、至少Inmol或至少Iymol的抗體或其片段或衍生物。然而，在特定實(shí)施方式中，也包括只包含一種抗體分子或其片段或衍生物的抗體組合物。包含特異抗體或其片段或衍生物的組合物可另外包含其他抗體或其片段或衍生物。然而，優(yōu)選地，包含特異抗體或其片段或衍生物的組合物除了所述特異抗體或其片段或衍生物的組合物外不包含其他抗體或其片段或衍生物。具體而言，抗體組合物中至少75%、優(yōu)選地至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%，優(yōu)選地為至少100%的抗體針對(duì)或結(jié)合于相同抗體或表位。根據(jù)本發(fā)明，“每條碳水化合物鏈的唾液酸殘基的平均量”指代平均存在于一組碳水化合物鏈的碳水化合物鏈中的唾液酸殘基的數(shù)量。具體而言，其指代連接于一組碳水化合物鏈的碳水化合物鏈中的唾液酸殘基總數(shù)除以所述組中碳水化合物鏈的總數(shù)。每條碳水化合物鏈的唾液酸殘基的平均量為1.0指的是在一組碳水化合物鏈中，每條碳水化合物鏈平均包含1.0個(gè)唾液酸殘基。術(shù)語“碳水化合物鏈”在這一點(diǎn)上優(yōu)選地指代連接于抗體的多肽鏈的碳水化合物鏈。所述的一組碳水化合物鏈的碳水化合物鏈優(yōu)選地指代抗體組合物中存在的所有抗體的所有 碳水化合物鏈，或指代抗體組合物中所有特異類型的抗體的所有碳水化合物鏈，或指代、抗體組合物中所有(特異類型的)抗體的特異部分中或特異糖基化位點(diǎn)處存在的碳水化合物鏈。術(shù)語“循環(huán)半衰期”優(yōu)選地指代在試劑施用于活體(特別是人體)循環(huán)系統(tǒng)后直到只有試劑的施用量的一半存在于循環(huán)系統(tǒng)中所經(jīng)過的時(shí)間。在治療活性試劑的情況下，通常較長(zhǎng)的循環(huán)半衰期是可取的，因?yàn)檫@樣該試劑具有較長(zhǎng)的持久療效?！扒宄俾省眱?yōu)選地指代試劑從活體(特別是人體)的循環(huán)系統(tǒng)中移除的速率。較高的清除速率因此通常導(dǎo)致較低的循環(huán)半衰期。發(fā)明詳述本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn):與在先技術(shù)的教義相反，連接于具有在Fab部分中的糖基化位點(diǎn)的抗體的Fab部分的碳水化合物鏈中唾液酸的量決定了所述抗體的循環(huán)半衰期并因此決定了其生物利用率。具體而言，F(xiàn)ab部分的高度唾液酸化導(dǎo)致抗體在患者循環(huán)系統(tǒng)中的高半衰期。類似地，F(xiàn)ab部分的較低的唾液酸化度導(dǎo)致較短的循環(huán)半衰期。然而，還發(fā)現(xiàn)當(dāng)移除抗體Fab部分中的糖基化位點(diǎn)并由此移除任何Fab糖基化時(shí),抗體的循環(huán)半衰期與具有中度到高度唾液酸化Fab部分的抗體類似。因此，唾液酸化很弱的抗體的循環(huán)半衰期不能僅僅通過增加唾液酸的量而增加，但如果存在有相應(yīng)的糖基化位點(diǎn)則可通過移除抗體Fab部分中的糖基化位點(diǎn)而增加。進(jìn)一步地,本發(fā)明者意外地發(fā)現(xiàn)調(diào)整Fab部分的糖基化中唾液酸含量經(jīng)常不影響抗體的抗原結(jié)合特異性，而且進(jìn)一步地，也經(jīng)常對(duì)抗體的下游生物學(xué)特異性如ADCC和CDC活性沒有負(fù)面效應(yīng)。在其中唾液酸含量變化對(duì)抗原結(jié)合有負(fù)面影響的情況下，還可移除Fab部分中的糖基化位點(diǎn)以增加循環(huán)半衰期和/或可在Fab部分中的另一位置引入其他糖基化位點(diǎn)，此新引入的Fab糖基化中唾液酸含量可根據(jù)本文的教義而調(diào)整。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的進(jìn)一步的優(yōu)勢(shì)是有可能增加Fab糖基化的唾液酸化而同時(shí)將Fe部分的唾液酸保 持最小。因此，抗體的ADCC和CDC活性也不受Fab部分唾液酸化增加的影響。用于控制抗體循環(huán)半衰期的方法鑒于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了用于控制抗體組合物中抗體或其功能片段或衍生物的循環(huán)半衰期的方法，包括在包含抗體或其功能片段或衍生物的組合物中調(diào)整連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中的唾液酸的量及/或在抗體或其片段或衍生物Fab部分中移除或引入一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。因此，還可能生成相應(yīng)于抗體預(yù)期用途而量身定制的循環(huán)半衰期。這提供了調(diào)整抗體循環(huán)半衰期的靈活性，無需使用化學(xué)修飾(如PEG或HES)或融合蛋白質(zhì)。具體而言，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了控制抗體或其功能片段或衍生物的循環(huán)半衰期的方法，包括以下步驟(a)對(duì)增加循環(huán)半衰期(al)在包含抗體或其功能片段或衍生物的組合物中增加連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中唾液酸的量；及/或(a2)移除存在于抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)；及/或(a3)在包含抗體或其功能片段或衍生物的組合物中降低連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中游離半乳糖單元的
量;或
(b)對(duì)降低循環(huán)半衰期(bl)在包含抗體或其功能片段或衍生物的組合物中降低連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中唾液酸的量；及/或(b2)向抗體或其片段或衍生物的Fab部分中引入一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)；及/或(b3)在包含抗體或其功能片段或衍生物的組合物中增加連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中游離半乳糖單元的量。因此，當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明的方法時(shí)，有可能通過調(diào)整抗體Fab部分中已經(jīng)存在的或人工引入的糖基化位點(diǎn)上的唾液酸化度和/或游離半乳糖單元度及/或通過在Fab部分中移除或引入糖基化位點(diǎn)而單獨(dú)控制給定抗體的循環(huán)半衰期?？贵w的碳水化合物鏈中的唾液酸在碳水化合物結(jié)構(gòu)的非還原性末端連接于半乳糖單元。因此，唾液酸量的增加還導(dǎo)致游離半乳糖單元的降低，反之亦然。增加或降低游離半乳糖單元的量可例如分別通過降低或增加唾液酸的量而實(shí)現(xiàn)。然而，游離半乳糖單元的量還可通過將其他殘基連接至游離半乳糖單元如乙酰殘基、葡萄糖醛酸或硫酸及/或通過從碳水化合物中移除游離半乳糖單元而降低。類似地，增加游離半乳糖單元的量可通過降低唾液酸的量及/或?qū)⑵渌肴樘菃卧B接至未完全半乳糖基化的碳水化合物而實(shí)現(xiàn)。增加循環(huán)半衰期 為根據(jù)本發(fā)明增加抗體或其片段或衍生物的循環(huán)半衰期，可增加連接于組合物中抗體或其片段或衍生物的Fab部分中一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中唾液酸的量。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，增加唾液酸的量以使組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中至少50%包含至少一個(gè)唾液酸殘基。優(yōu)選地的，在組合物中連接于Fab部分中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中至少60%、更優(yōu)選地至少65%、至少68%、至少70%或最優(yōu)選地至少75%包含至少一個(gè)唾液酸殘基。在特定實(shí)施方式中，增加唾液酸的量以使組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中至少20%包含至少兩個(gè)唾液酸殘基。優(yōu)選地，在組合物中連接于Fab部分中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中至少25%、更優(yōu)選地至少30%、至少35%、至少40%或最優(yōu)選地至少45%包含至少兩個(gè)唾液酸殘基。優(yōu)選地，增加唾液酸的量以使組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)并含有至少一個(gè)唾液酸殘基的碳水化合物的相對(duì)量增加至少5個(gè)百分點(diǎn)、更優(yōu)選地增加至少7個(gè)百分點(diǎn)、至少10個(gè)百分點(diǎn)、至少15個(gè)百分點(diǎn)、至少20個(gè)百分點(diǎn)、至少25個(gè)百分點(diǎn)、至少30個(gè)百分點(diǎn)、至少35個(gè)百分點(diǎn)、至少40個(gè)百分點(diǎn)、至少45個(gè)百分點(diǎn)，或至少50個(gè)百分點(diǎn)。組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)并含有至少一個(gè)唾液酸殘基的碳水化合物的相對(duì)量為組合物中所有連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中包含至少一個(gè)唾液酸殘基的碳水化合物的百分比。例如，10個(gè)百分點(diǎn)的增加指代這樣的實(shí)施方式，其中組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)并含有至少一個(gè)唾液酸殘基的碳水化合物的相對(duì)量的百分比值在步驟(al)中增加了10，即，步驟(al)前相對(duì)量為X%，而步驟(al)后相對(duì)量為(X+10) %。在包含抗體或其功能片段或衍生物的組合物中，連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中唾液酸的量增加至少5個(gè)百分點(diǎn)。優(yōu)選地，在組合物中連接于Fab部分中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中至少60%、更優(yōu)選地至少65%、至少68%、至少70%或最優(yōu)選地至少75%包含至少一個(gè)唾液酸殘基。連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中唾液酸的量的增加還包括增加組合物中連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)并已經(jīng)包含至少一個(gè)唾液酸殘基的碳水化合物中唾液酸的數(shù)量。具體而言，根據(jù)本發(fā)明的方法步驟(al)的唾液酸量的增加優(yōu)選地指代組合物中連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中每條碳水化合物鏈的唾液酸殘基的平均量的增加。優(yōu)選地，所述每條碳水化合物鏈的唾液酸殘基的平均量增加了至少0.01、更優(yōu)選地增加了至少0.05、至少0.1、至少0.15、至少0.2、至少0.3或最優(yōu)選地增加了至少0.5。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，增加唾液酸的量以使組合物中連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中每條碳水化合物鏈的唾液酸殘基的平均量為至少0.5、優(yōu)選地至少0.6、至少0.7、至少0.8、至少0.9、至少1.0、至少1.05或至少1.1。所述Fab部分中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)可以在增加其循環(huán)半衰期步驟前就已經(jīng)存在于抗體中，或一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)可以作為根據(jù)本發(fā)明的方法的一部分引入抗體的Fab部分。因此，在特定實(shí)施方式中，增加連接于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中唾液酸的量的步驟包括將一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)引入Fab部分的步驟。這些新引入的糖基化位點(diǎn)在糖基化時(shí)優(yōu)選地?cái)y帶碳水化合物，其中組合物中所述的碳水化合物中至少50%、更優(yōu)選地至少60%、至少65%、至少68%、至少70%或最優(yōu)選地至少75%包含至少一個(gè)唾液酸殘基。將糖基化位點(diǎn)向抗體或其片段或衍生物的Fab部分的引入在下文有更詳細(xì)的描述。在特定實(shí)施方式中，連接于Fab部分中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中的唾液酸的量增加，而未顯著 增加連接于所述抗體或其片段或衍生物的Fe部分中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中的唾液酸的量。優(yōu)選地，在進(jìn)行了根據(jù)本發(fā)明的方法后，組合物中連接于所述抗體或其片段或衍生物的Fe部分中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中的唾液酸的量低于20%、更優(yōu)選地低于15%、低于10%、低于8%或最優(yōu)選地低于7%。具體而言，連接于抗體的Fe部分中的糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中低于20%、優(yōu)選地低于15%低于10%或低于8%、最優(yōu)選地低于7%包含一個(gè)或多個(gè)唾液酸。在特定實(shí)施方式中，降低游離半乳糖單元的量以使組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中低于50%包含至少兩個(gè)游離半乳糖單元。優(yōu)選地,組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中低于40%、低于30%、低于20%、低于15%、低于10%、低于7%或低于5%包含至少兩個(gè)游離半乳糖單元。進(jìn)一步地，組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中低于95%包含至少一個(gè)游離半乳糖單元。更優(yōu)選地，組合物中連接于存在于Fab部分中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中低于90%、低于85%、低于80%、低于75%、低于70%、低于65%、低于60%、低于55%、低于50%、低于45%或低于40%包含至少一個(gè)或多個(gè)游離半乳糖單
J Li ο優(yōu)選地，降低游離半乳糖單元的量以使組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)并包含至少一個(gè)游離半乳糖單元，優(yōu)選地包含至少兩個(gè)游離半乳糖單元的碳水化合物的相對(duì)量降低至少5個(gè)百分點(diǎn)、更優(yōu)選地降低至少7個(gè)百分點(diǎn)、至少10個(gè)百分點(diǎn)、至少15個(gè)百分點(diǎn)、至少20個(gè)百分點(diǎn)、至少25個(gè)百分點(diǎn)、至少30個(gè)百分點(diǎn)、至少35個(gè)百分點(diǎn)、至少40個(gè)百分點(diǎn)、至少45個(gè)百分點(diǎn)，或至少50個(gè)百分點(diǎn)。組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)并包含至少一個(gè)游離半乳糖單元，優(yōu)選地包含至少兩個(gè)游離半乳糖單元的碳水化合物的相對(duì)量為組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的所有碳水化合物中包含至少一個(gè)游離半乳糖單元，優(yōu)選地包含至少兩個(gè)游離半乳糖單元的碳水化合物的百分比。例如，降低至少10個(gè)百分點(diǎn)指代這樣的實(shí)施方式，其中組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)并包含至少一個(gè)游離半乳糖單元，優(yōu)選地包含至少兩個(gè)游離半乳糖單元的碳水化合物的百分比值在步驟(a3)中降低了10，S卩，步驟(a3)之前相對(duì)量為X%，步驟(a3)之后相對(duì)量為(X_10)%。連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中游離半乳糖單元的量的降低還包括降低組合物中連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)并包含超過一個(gè)游離半乳糖單元的碳水化合物中游離半乳糖單元的數(shù)量。具體而言，根據(jù)本發(fā)明的方法步驟(a3)的游離半乳糖單元的量的降低優(yōu)選地指代組合物中連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中每條碳水化合物鏈的游離半乳糖單元的平均量的降低。優(yōu)選地，所述每條碳水化合物鏈的游離半乳糖單元的平均量增降低了至少0.01、更優(yōu)選地增加了至少0.05、至少0.1、至少0.15、至少0.2、至少0.3或最優(yōu)選地增加了至少0.5。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，降低游離半乳糖單元的 量的量以使組合物中連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中每條碳水化合物鏈的游離半乳糖單元的平均量為低于1.5、優(yōu)選地低于1.4、低于1.3、低于1.2、低于1.1、低于1.0、優(yōu)選地低于0.9、低于0.8、低于0.7、低于0.6或低于0.5。優(yōu)選地，游離半乳糖單元的量的降低是通過增加唾液酸的量而實(shí)現(xiàn)的。唾液酸量的增加和/或游離半乳糖單元的量的降低可通過任何已知方式實(shí)現(xiàn)，包括在具有高唾液酸化活性的細(xì)胞或細(xì)胞系中表達(dá)所述抗體或其片段或衍生物。具有高唾液酸化度的細(xì)胞系可例如通過選擇合適的細(xì)胞系單克隆或通過遺傳改造細(xì)胞系而獲得。具有高的唾液酸化活性的細(xì)胞系具體而言可以通過對(duì)適用于表達(dá)抗體的細(xì)胞系進(jìn)行誘變篩選而獲得，其中選擇了具有高的唾液酸化活性的細(xì)胞克隆。進(jìn)一步地，可在所述細(xì)胞或細(xì)胞系中誘導(dǎo)或增強(qiáng)負(fù)責(zé)糖蛋白唾液酸化的酶的表達(dá)，例如通過誘導(dǎo)或增加內(nèi)源的酶的表達(dá)及/或通過誘導(dǎo)所述酶的外源表達(dá)盒。適合的酶為例如負(fù)責(zé)將唾液酸殘基轉(zhuǎn)移至碳水化合物鏈的唾液酸轉(zhuǎn)移酶、控制唾液酸殘基或其前體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的相關(guān)區(qū)段或細(xì)胞器的轉(zhuǎn)運(yùn)子或參與唾液酸合成的酶。具體的實(shí)例為唾液酸基轉(zhuǎn)移酶如α2，6_和α 2，3-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)運(yùn)子如CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)子、表異構(gòu)酶如UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-表異構(gòu)酶、激酶如N-乙酰甘露糖胺激酶和N-乙酰葡萄糖胺激酶、N-乙酰神經(jīng)氨酸-9-Ρ-合成酶、N-乙酰神經(jīng)氨酸-9-Ρ-磷酸酶和CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶。進(jìn)一步地，可在表達(dá)過程中使用產(chǎn)生高唾液酸化度的培養(yǎng)條件。合適的方法在本領(lǐng)域已知并在例如W02005/080585中有描述。備選地或此外地，可以使用體外唾液酸化，特別是使用唾液酸基轉(zhuǎn)移酶和適合的底物進(jìn)行酶唾液酸化，或使用適合的化學(xué)反應(yīng)物進(jìn)行化學(xué)唾液酸化。能夠提供高的唾液酸化度的示例性細(xì)胞系為GT-5s，其根據(jù)布達(dá)佩斯協(xié)議于2010年7月28日以登記號(hào)DSMACC3078保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Inhoffenstra β e7B, 38124Braunschweig (DE)),保藏人為 GlycotopeGmbH, Robert-RoSSle -Str.10，13125Berlin (DE))，或?yàn)閬碓从谄涞募?xì)胞系或與其同源的細(xì)胞系。GT-5s是一種來源于K562細(xì)胞的細(xì)胞系，由于具有高的唾液酸化活性而選擇。K562是一種人髓性白血病細(xì)胞系，存在于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心(ATCC CCL-243)。GT_5s及來源于其的細(xì)胞系可在已知的適合K562的條件下培育和維持。來源于GT-5s的細(xì)胞系可例如通過隨機(jī)或特異性地從GT-5s培養(yǎng)物中選擇單一克隆或一組細(xì)胞而獲得，可選地在之前已經(jīng)對(duì)GT-5s細(xì)胞進(jìn)行了增強(qiáng)突變率的處理，或通過遺傳改變GT-5s細(xì)胞系而獲得。所選擇的克隆或一組細(xì)胞可進(jìn)一步如上文所述的方法進(jìn)行處理并/或可進(jìn)行其他的篩選輪。同源于GT-5s的細(xì)胞系特別是永生化人類髓細(xì)胞系。優(yōu)選地，來源于或同源于GT-5s的細(xì)胞系能夠提供的抗體具有的糖基化形式類似于獲自GT-5s的形式。優(yōu)選地，由來源于或同源于GT-5s的細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體具有一種或多種本文所描述的糖基化特征，特別是高的唾液酸度，優(yōu)選地為在Fab部分有高的唾液酸度。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，來源于或同源于GT-5s的細(xì)胞系進(jìn)一步地能夠生產(chǎn)本文描述的具有低度果糖基化的抗體，特別是在其Fe部分具有低度果糖基化。由來源于或同源于GT-5s的細(xì)胞系生產(chǎn)的抗體的類似的糖基化形式與獲自GT-5s的糖基化形式差異為20%或更少、更優(yōu)選地為15%或更少、10%或更少或5%或更少，具體而言差異在于一種或多種，優(yōu)選地為所有選自以下的糖基化特性:攜帶bisGlcNAc的碳水化合物的百分比量、唾液酸化碳水化合物的百分比量、攜帶游離半乳糖殘基的碳水化合物的百分比量、2，6-偶聯(lián)的唾液酸的百分比量及攜帶果糖的碳水化合物的百分比量。在具體優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述類似的糖基化特性不包含攜帶果糖的碳水化合物的百分比量。細(xì)胞系GT-5s以及來源于其的細(xì)胞系及與其同源的細(xì)胞系尤其有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈兲峁┝朔浅７€(wěn)定和均一的蛋白質(zhì)生產(chǎn)，尤其是就抗體而言。它們具有很好的批次一致性，即，從不同生產(chǎn)運(yùn)行中獲得的或以不同規(guī)模和/或用不同培養(yǎng)步驟所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)及其糖基化形式是類似的。除了增加連接于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中的唾液酸含量的增加和/或游離半乳糖單元含量的降低外，還可通過移除存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)而增加所述抗體或其片段或衍生物的循環(huán)半衰期。通過移除所述(多個(gè))糖基化位點(diǎn)，防止所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中具有低度唾液酸化及/或高度游離半乳糖單元的碳水化合物。由于這些低唾液酸化的碳水化合物造成從患者循環(huán)系統(tǒng)中對(duì)抗體的快速速率，移除抗體的Fab部分中相應(yīng)的(多個(gè))糖基化位點(diǎn)增加其循環(huán)半衰期。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，糖基化位點(diǎn)的移除是通過遺傳改造編碼抗體或其片段或衍生物的核酸完成的。具體而言，糖基化位點(diǎn)是通過改變編碼抗體或其片段或衍生物的核酸序列而移除的。優(yōu)選地，突變了編碼糖基化位點(diǎn)氨基酸的一個(gè)或多個(gè)密碼子以在糖基化位點(diǎn)中形成至少一個(gè)氨基酸的置換、添加或刪除。具體而言，將碳水化合物鏈連接所在的氨基酸刪除或置換，優(yōu)選地由不能起碳水化合物受體功能的氨基酸置換。備選地或此外地，還可置換或刪除糖基化位點(diǎn)的另一個(gè)氨基酸，或者可將一個(gè)或多個(gè)其他的氨基酸添加到所述糖基化位點(diǎn)，以使改變的氨基酸序列不能起酶催糖基化識(shí)別位點(diǎn)的作用。要從其Fab部分移除一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的抗體或其片段或衍生物在Fab部分中的糖基化位點(diǎn)可為任意數(shù)量，如在Fab部分只有一個(gè)糖基化位點(diǎn)、至少兩個(gè)糖基化位點(diǎn)或至少三個(gè)糖基化位點(diǎn)。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，并非抗體或其片段或衍生物的Fab部分的所有糖基化位點(diǎn)都必須移除。然而，優(yōu)選地移除存在于抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的所有糖基化位點(diǎn)以最大化增加循環(huán)半衰期。降低循環(huán)半衰期根據(jù)本發(fā)明，為降低抗體或其片段或衍生物的循環(huán)半衰期，可降低所述組合物中連接于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中的唾液酸的量。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，降低唾液酸的量以使組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中低于50%包含至少一個(gè)唾液酸殘基。優(yōu)選地，組合物中連接于存在于Fab部分中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中低于40%、低于30%、低于20%、低于15%、低于10%、低于7%、低于5%、低于3%、低于2%或低于1%包含一個(gè)或多個(gè)唾液酸殘基。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，降低唾液酸的量以使組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中大約0%包含至少一個(gè)唾液酸殘基。在特定實(shí)施方式中，降低唾液酸的量以使組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中低于30%包含至少兩個(gè)唾液酸殘基。優(yōu)選地，在組合物中連接于存在于Fab部分中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中低于25%、低于20%、低于15%、低于10%、低于7%、低于5%、低于3%、低于2%或低于1%，更優(yōu)選地0%包含兩個(gè)或更多個(gè)唾液酸殘基。優(yōu)選地，降低唾液酸的量以使組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)并含有至少一個(gè)唾液酸殘基的碳水化合物的相對(duì)量減少至少5個(gè)百分點(diǎn)、更優(yōu)選地減少至少7個(gè)百分點(diǎn)、至少10個(gè)百分點(diǎn)、至少15個(gè)百分點(diǎn)、至少20個(gè)百分點(diǎn)、至少25個(gè)百分點(diǎn)、至少30個(gè)百分點(diǎn)、 至少35個(gè)百分點(diǎn)、至少40個(gè)百分點(diǎn)、至少45個(gè)百分點(diǎn)，或至少50個(gè)百分點(diǎn)。組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)并含有至少一個(gè)唾液酸殘基的碳水化合物的相對(duì)量為組合物中所有連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中包含至少一個(gè)唾液酸殘基的碳水化合物的百分比。例如，10個(gè)百分點(diǎn)的降低指代這樣的實(shí)施方式，其中組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)并含有至少一個(gè)唾液酸殘基的碳水化合物的相對(duì)量的百分比值在步驟(bl)中增加了IO，即，步驟(b I)前相對(duì)量為X%，而步驟(b I)后相對(duì)量為(X-10) %。連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中唾液酸的量的降低還包括降低組合物中連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)并包含超過一個(gè)唾液酸殘基的碳水化合物中唾液酸的數(shù)量。具體而言，根據(jù)本發(fā)明的方法步驟(bl)的唾液酸量的降低優(yōu)選地指代組合物中連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中每條碳水化合物鏈的唾液酸殘基的平均量的降低。優(yōu)選地，所述每條碳水化合物鏈的唾液酸殘基的平均量降低了至少0.01、更優(yōu)選地降低了至少0.05、至少0.1、至少0.15、至少0.2、至少0.3或最優(yōu)選地降低了至少0.5。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，降低唾液酸的量以使組合物中連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中每條碳水化合物鏈的唾液酸殘基的平均量低于0.8、優(yōu)選地低于0.7、低于0.6、低于0.5、低于0.4、低于0.3、低于0.2、低于0.1或低于0.05。在特定實(shí)施方式中，增加游離半乳糖單元的量以使組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中至少50%包含至少一個(gè)游離半乳糖單元、優(yōu)選地至少兩個(gè)游離半乳糖單元。優(yōu)選地，組合物中連接于Fab部分中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中至少60%、更優(yōu)選地至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%會(huì)最優(yōu)選地至少98%包含至少一個(gè)游離半乳糖單元、優(yōu)選地至少兩個(gè)游離半乳糖單 元。優(yōu)選地，增加游離半乳糖單元的量以使組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)并包含至少一個(gè)游離半乳糖單元，優(yōu)選地包含至少兩個(gè)游離半乳糖單元的碳水化合物的相對(duì)量增加至少5個(gè)百分點(diǎn)、更優(yōu)選地增加至少7個(gè)百分點(diǎn)、至少10個(gè)百分點(diǎn)、至少15個(gè)百分點(diǎn)、至少20個(gè)百分點(diǎn)、至少25個(gè)百分點(diǎn)、至少30個(gè)百分點(diǎn)、至少35個(gè)百分點(diǎn)、至少40個(gè)百分點(diǎn)、至少45個(gè)百分點(diǎn)，或至少50個(gè)百分點(diǎn)。組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)并包含至少一個(gè)游離半乳糖單元，優(yōu)選地包含至少兩個(gè)游離半乳糖單元的碳水化合物的相對(duì)量為組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的所有碳水化合物中包含至少 一個(gè)游離半乳糖單元，優(yōu)選地包含至少兩個(gè)游離半乳糖單元的碳水化合物的百分比。例如，增加至少10個(gè)百分點(diǎn)指代這樣的實(shí)施方式，其中組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)并包含至少一個(gè)游離半乳糖單元，優(yōu)選地包含至少兩個(gè)游離半乳糖單元的碳水化合物的百分比值在步驟(b3)中增加了 10，即，步驟(b3)之前相對(duì)量為X%，步驟(b3)之后相對(duì)量為(X+10)%。連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中游離半乳糖單元的量的增加還包括增加組合物中連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)并已經(jīng)包含至少一個(gè)游離半乳糖單元的碳水化合物中游離半乳糖單元的數(shù)量。具體而言，根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟(b3)的游離半乳糖單元的量的增加指代組合物中連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中每條碳水化合物鏈的游離半乳糖單元的平均量的增加。優(yōu)選地，所述每條碳水化合物鏈的游離半乳糖單元的平均量增加了至少0.01、更優(yōu)選地增加了至少0.05、至少0.1、至少0.15、至少0.2、至少0.3或最優(yōu)選地增加了至少0.5。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，增加游離半乳糖單元的量以使組合物中連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中每條碳水化合物鏈的游離半乳糖單元的平均量為至少0.5、優(yōu)選地至少0.6、至少0.7、至少0.8、至少0.9、至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9或至少1.95。在增加抗體的循環(huán)半衰期之前可能已經(jīng)在Fab部分中存在一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)，或已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明作為方法的一部分將一個(gè)或多個(gè)這些糖基化位點(diǎn)引入抗體的Fab部分。因此，增加連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中游離半乳糖單元的量的步驟在特定實(shí)施方式中包括將一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)引入Fab部分的步驟。這些新引入的糖基化位點(diǎn)在糖基化時(shí)優(yōu)選地?cái)y帶碳水化合物，其中組合物中至少50%、更優(yōu)選地至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或最優(yōu)選地至少98%的所述碳水化合物包含至少一個(gè)游離半乳糖單元、優(yōu)選地包含至少兩個(gè)游離半乳糖單元。將糖基化位點(diǎn)向抗體或其片段或衍生物的Fab部分的引入在下文有更詳細(xì)的描述。唾液酸的量的減少和/或游離半乳糖單元的量的增加可通過任何已知方式實(shí)現(xiàn)，包括在具有低的或沒有唾液酸化活性的細(xì)胞或細(xì)胞系中表達(dá)所述抗體或其片段或衍生物。具有低的或沒有唾液酸化度的細(xì)胞系可例如通過選擇細(xì)胞系中合適的單克隆、通過遺傳改造細(xì)胞系例如向細(xì)胞系的基因組中引入一個(gè)或多個(gè)突變、或通過針對(duì)一種或多種參與細(xì)胞系中唾液酸化途徑的基因的敲除或降低或RNA干擾而獲得。參與唾液酸化途徑的合適的基因例如編碼負(fù)責(zé)將唾液酸殘基轉(zhuǎn)移至碳水化合物鏈的唾液酸基轉(zhuǎn)移酶、控制唾液酸殘基或其前體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的相關(guān)區(qū)段或細(xì)胞器的轉(zhuǎn)運(yùn)子或參與唾液酸合成的酶。具體的實(shí)例為唾液酸基轉(zhuǎn)移酶如α 2，6-和α 2，3_唾液酸基轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)運(yùn)子如CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)子、表異構(gòu)酶如UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-表異構(gòu)酶、激酶如N-乙酰甘露糖胺激酶和N-乙酰葡萄糖胺激酶、N-乙酰神經(jīng)氨酸-9-Ρ-合成酶、N-乙酰神經(jīng)氨酸-9-Ρ-磷酸酶和CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶。進(jìn)一步地，可在表達(dá)過程中使用產(chǎn)生低唾液酸化度的培養(yǎng)條件。備選地或另外地，可使用體外去唾·液酸化，特別是使用唾液酸酶進(jìn)行酶催去唾液酸化，或使用合適的化學(xué)反應(yīng)物進(jìn)行化學(xué)去唾液酸化。用于提供具有特異調(diào)整的唾液酸含量，尤其是低含量的唾液酸的糖蛋白的合適細(xì)胞系及方法在例如W02005/080585中有描述。除了在連接于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中降低唾液酸含量和/或增加游離半乳糖單元含量之外，還可通過向抗體或其片段或衍生物的Fab部分中引入一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)而降低抗體或其片段或衍生物的循環(huán)半衰期。通過引入所述(多個(gè))糖基化位點(diǎn)，可增加抗體或其片段或衍生物中具有低度唾液酸化的碳水化合物的存在量。這些新引入的糖基化位點(diǎn)在糖基化時(shí)優(yōu)選地?cái)y帶碳水化合物，其中組合物中所述碳水化合物中低于50%、更優(yōu)選地低于40%、低于30%、低于20%、低于15%、低于10%、低于7%或最優(yōu)選地低于5%包含一個(gè)或多個(gè)唾液酸殘基。同樣地，這些新合成的糖基化位點(diǎn)在糖基化時(shí)優(yōu)選地?cái)y帶碳水化合物，其中組合物中所述碳水化合物中至少50%、更優(yōu)選地至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或最優(yōu)選地至少98%包含至少一個(gè)游離半乳糖單元、優(yōu)選地包含至少兩個(gè)游離半乳糖單元。上文描述了如何達(dá)到相應(yīng)的低的唾液酸化量。優(yōu)選地，向所述抗體或器片段或衍生物的Fab部分中引入至少一個(gè)、更優(yōu)選地至少兩個(gè)或至少三個(gè)糖基化位點(diǎn)。在特定實(shí)施方式中，引入了一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)糖基化位點(diǎn)。所述(多個(gè))糖基化位點(diǎn)可通過任何本領(lǐng)域已知方式引入。糖基化位點(diǎn)的引入優(yōu)選地是通過遺傳改造編碼所述抗體或其片段或衍生物的核酸完成的。具體而言，糖基化位點(diǎn)是通過改變編碼所述抗體或其片段或衍生物的核酸序列引入的。優(yōu)選地，突變抗體的一個(gè)或多個(gè)密碼子以使編碼的氨基酸形成糖基化位點(diǎn)。糖基化位點(diǎn)的引入可通過添加一個(gè)或多個(gè)其他密碼子而產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)添加的氨基酸完成，通過置換一個(gè)或多個(gè)核苷酸產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換而完成，及/或通過刪除一個(gè)或多個(gè)密碼子以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的刪除而完成。具體而言，將所述(多個(gè))糖基化位點(diǎn)引入抗體或其片段或衍生物的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)，優(yōu)選地為重鏈可變區(qū)。更優(yōu)選地將所述糖基化位點(diǎn)引入可變區(qū)的骨架區(qū)中。然而，還可將糖基化位點(diǎn)引入Fab部分的恒定區(qū)，尤其是重鏈恒定區(qū)I。在將一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)引入抗體或其片段或衍生物的Fab部分時(shí)，所述抗體或其片段或衍生物優(yōu)選地在其Fab部分起始并不含有糖基化位點(diǎn)。然而，在特定實(shí)施方式中，抗體或其片段或衍生物在其Fab部分已經(jīng)含有一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)，通過根據(jù)本發(fā)明的方法引入一個(gè)或多個(gè)另外的糖基化位點(diǎn)。新引入的(多個(gè))糖基化位點(diǎn)優(yōu)選地?cái)y帶碳水化合物，其中組合物中低于50%、更優(yōu)選地低于40%、低于30%、低于20%、低于15%、低于10%、低于7%或最優(yōu)選地低于5%的所述碳水化合物包含一個(gè)或多個(gè)唾液酸殘基。具體而言，組合物中連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的所有糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中低于50%、優(yōu)選地低于40%、低于30%、低于20%、低于15%、低于10%、低于7%或最優(yōu)選地低于5%優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)唾液酸殘基。同樣地，這些新引入的(多個(gè))糖基化位點(diǎn)在糖基化時(shí)優(yōu)選地?cái)y帶碳水化合物，其中組合物中至少50%、優(yōu)選地至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或最優(yōu)選地至少98%的所述碳水化合物包含至少一個(gè)游離半乳糖單元、優(yōu)選地包含至少兩個(gè)游離半乳糖單元。具體而言，組合物中連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的所有糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中至少50%、更優(yōu)選地至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或最優(yōu)選地至少98%包含至少一個(gè)游離半乳糖單元、優(yōu)選地包含至少兩個(gè)游離半乳糖單元。上文對(duì)如何達(dá)到相應(yīng)低量的唾液酸化進(jìn)行了描述。Fab糖基化位點(diǎn)

存在于抗體或其片段或衍生物的Fab部分或向抗體或其片段或衍生物的Fab部分中引入或從其中移除的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)為N-糖基化位點(diǎn)和/或O-糖基化位點(diǎn)，優(yōu)選地為N-糖基化位點(diǎn)，更優(yōu)選地為具有氨基酸序列Asn Xaa Ser/Thr的N-糖基化位點(diǎn)，其中Xaa為任何氨基酸，優(yōu)選地，除了 Pro以外。它們可位于抗體或其片段或衍生物的Fab部分中任何位置。然而，它們優(yōu)選地位于重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)，更優(yōu)選地位于重鏈可變區(qū)。具體而言，它們可位于骨架區(qū)，和/或重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的CDR中，優(yōu)選地位于骨架區(qū)。然而，所述一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)還可位于Fab部分的恒定區(qū)，特別是重鏈恒定區(qū)I中。Fab部分中糖基化位點(diǎn)的引入和移除可通過改變Fab部分的氨基酸序列而實(shí)現(xiàn)，特別是通過添加、置換和/或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選地，這可通過遺傳改造編碼抗體或其片段或衍生物的氨基酸的核酸而完成，尤其是通過對(duì)所述核酸序列進(jìn)行誘變。合適的用于移除或引入糖基化位點(diǎn)的方法在上文有描述。優(yōu)選地，在其中抗體或其片段或衍生物包含兩個(gè)或更多個(gè)重鏈可變區(qū)的實(shí)施方式中，存在于重鏈可變區(qū)的糖基化位點(diǎn)也存在于所述抗體或其片段或衍生物的所有重鏈可變區(qū)中。優(yōu)選地，在其中抗體或其片段或衍生物包含兩個(gè)或更多個(gè)重鏈恒定區(qū)尤其是兩個(gè)或更多個(gè)CHl區(qū)域的實(shí)施方式中，存在于重鏈恒定區(qū)I的糖基化位點(diǎn)也存在于所述抗體或其片段或衍生物的所有重鏈恒定區(qū)I中。優(yōu)選地，在其中抗體或其片段或衍生物包含兩個(gè)或更多個(gè)輕鏈可變區(qū)的實(shí)施方式中，存在于輕鏈可變區(qū)的糖基化位點(diǎn)也存在于所述抗體或其片段或衍生物的所有輕鏈可變區(qū)中。優(yōu)選地，在其中抗體或其片段或衍生物包含兩個(gè)或更多個(gè)輕鏈恒定區(qū)的實(shí)施方式中，存在于輕鏈恒定區(qū)的糖基化位點(diǎn)也存在于所述抗體或其片段或衍生物的所有輕鏈恒定區(qū)中。分離自人血清的抗體中有近似30%在Fab部分內(nèi)有糖基化位點(diǎn)。對(duì)于抗-EGFR抗體，尤其是西妥昔單抗，這些抗體Fab部分的一個(gè)糖基化位點(diǎn)優(yōu)選地位于重鏈可變區(qū)的骨架區(qū)3中，更優(yōu)選地位于根據(jù)Kabat編號(hào)85號(hào)位氨基酸。對(duì)于抗-Mucl抗體，尤其是Pankomab,這些抗體Fab部分的一個(gè)糖基化位點(diǎn)優(yōu)選地位于重鏈可變區(qū)的⑶R2中，更優(yōu)選地位于根據(jù)Kabat編號(hào)54號(hào)位氨基酸。如果在抗體或其片段或衍生物的Fab部分中存在至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)，則組合物中至少一個(gè)抗體或其片段或衍生物在Fab部分是糖基化的。優(yōu)選地，組合物中的抗體或其片段或衍生物中有至少25%、更優(yōu)選地至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或最優(yōu)選地大約100%在Fab部分是糖基化的。進(jìn)一步地，組合物中的抗體或其片段或衍生物中有至少25%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或最優(yōu)選地大約100%在Fab部分有如本文所描述的特異糖基化位點(diǎn)，優(yōu)選地在Fab部分的所有糖基化位點(diǎn)是糖基化的。例如在例如純化過程之后或過程中通過富集方法還可獲得更高度的相應(yīng)糖基化的抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在抗體或其片段或衍生物的Fab部分中引入或移除一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)并不抑制所述抗體或其片段或衍生物的抗原結(jié)合和/或抗原特異性。優(yōu)選地，在Fab部分中引入或移除一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)并不顯著減少抗原結(jié)合和/或抗原特異性。同樣地，增加或降低連接于抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中的唾液酸的量?jī)?yōu)選地不抑制抗原結(jié)合和/或抗原特異性，優(yōu)選地不顯著減少抗原結(jié)合和/或抗原特異性。具體而言，在進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法后，具有增加或降低的循環(huán)半衰期的抗體或其片段或衍生物對(duì)其特異抗原的結(jié)合親和力為其循環(huán)半衰期得到控制前的抗體或其片段或衍生物的結(jié)合親和力的至少0.5%、至少1%、至少5%、至少10%、優(yōu)選地至少25%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。然而，為避免增加或降低連接于抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的特定糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中的唾液酸負(fù)向影響抗原結(jié)合或抗原特異性或有負(fù)向影響的風(fēng)險(xiǎn)，可將所述糖基化位點(diǎn)從抗體移除及/或?qū)⒁粋€(gè)或多個(gè)其他糖基化位點(diǎn)在不會(huì)或較少程度上影響抗原結(jié)合和/或抗原特異性的位置引入Fab部分。然后可根據(jù)需要增加或降低連接于新引入的(多個(gè))糖基化位點(diǎn)的碳水化合物的唾液酸含量以控制循環(huán)半衰期。優(yōu)選地，所述新引入的(多個(gè))糖基化位點(diǎn)位于可變區(qū)的骨架區(qū)，或更優(yōu)選地位于Fab的恒定區(qū)如重鏈恒定區(qū)I和/或輕鏈恒定區(qū)?？贵w或其片段或衍生物根據(jù)本發(fā)明的方法中使用抗體可為任何抗體，包括天然發(fā)生的抗體、多克隆或單克隆抗體、工程抗體、嵌合抗體或人源化抗體。其可為人、小鼠、大鼠、山羊、靈長(zhǎng)類或駱駝抗體。優(yōu)選地，抗體為人、嵌合或人源化抗體。其可為任何抗體類型，包括IgG、IgE、IgA、IgD和IgM抗體以及任何亞型包括IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。優(yōu)選地，抗體為IgG抗體，更優(yōu)選地為IgGl或IgG2抗體，最優(yōu)選地為IgGl抗體。例如，抗體可選自抗-EGFR抗體如西妥昔單抗、抗-TF抗體如Karomab、抗-Mucl抗體如Pankomab、抗-HE R2抗體如曲妥單抗、抗-CD20抗體如利妥昔單抗、抗_Αβ抗體如solanezumab、抗-⑶52抗體如阿侖單抗(Alemtuzumab),及其嵌合抗體或人源化形式。優(yōu)選的抗-EGFR抗體在W096/40210(具體描述了人源化和嵌合形式的抗體225)及US4, 943，533 (描述了小鼠抗體225)中有所描述，并/或包含一個(gè)或多個(gè)選自以下的⑶R:具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的CDRH2、具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的CDRH3、具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ IDNO:5的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的⑶RL3。具體而言，抗體可以為嵌合或人源化的抗-EGFR抗體，其包含⑴包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQID NO: 2的氨基酸序列的⑶RH2、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的⑶RH3的重鏈可變區(qū)；(ii)可選地，包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的⑶RL3的輕鏈可變區(qū)；(iii)存在于Fab部分中在根據(jù)Kabat編號(hào)重鏈可變區(qū)85號(hào)位氨基酸處的糖基化位點(diǎn)；以及(iv)可選地，存在于Fe部分在重鏈恒定區(qū)2的297號(hào)位氨基酸處的糖基化位點(diǎn)。所述抗體優(yōu)選地能夠與西妥昔單抗和/或抗體225結(jié)合相同的抗原，尤其是結(jié)合于相同表位。優(yōu)選的抗-Mucl抗體在專利申請(qǐng)W004/065423和EP09009942.5中有描述，其并入本文作為參考，并/或包含一個(gè)或多個(gè)選自以下的CDR:具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQ ID N0:8的氨基酸序列的CDRH2、具有SEQ ID N0:9的氨基酸序列的CDRH3、具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的CDRL2、具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的⑶RL3。具體而言，抗體可以為嵌合或人源化的抗-TA-Mucl抗體，其包含⑴包含具有SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的⑶RH2、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的⑶RH3的重鏈可變區(qū)；(ii)可選地，包含具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID N0:11的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的⑶RL3的輕鏈可變區(qū)；(iii)存在于Fab部分中在根據(jù)Kabat編號(hào)重鏈可變區(qū)54號(hào)位氨基酸處的糖基化位點(diǎn)；以及(iv)可選地，存在于Fe部分在重鏈恒定區(qū)2的297號(hào)位氨基酸處的糖基化位點(diǎn)。所述抗體優(yōu)選地能夠與Pankomab結(jié)合相同的抗原,尤其是結(jié)合于相同表位。具體而言，所述嵌合或人源化抗-TA-Mucl-抗體能夠特異性結(jié)合于包含氨基酸序列H)TR(SEQID NO: 13)的表位，更優(yōu)選地為包含H)TRP(SEQ ID NO: 14)的表位。對(duì)此表位的結(jié)合是依賴于糖基化的，其中具體而言如果相應(yīng)地有碳水化合物部分連接于序列I3DTR或PDTRP的蘇氨酸殘基時(shí)則結(jié)合增加。優(yōu)選地，如果該表位在蘇氨酸殘基處由碳水化合物部分糖基化時(shí)結(jié)合增加，所述碳水化合物部分選自:N-乙酰半乳糖胺(Τη)、唾液酸基α2-6Ν-乙酰半乳糖胺(sTn)、半乳糖β 1-3Ν-乙酰半乳糖胺(TF)及半乳糖β 1_3(唾液酸基α 2-6) N-乙酰半乳糖胺(sTF)，優(yōu)選地為Tn或TF。優(yōu)選地，碳水化合物部分通過α-O-糖苷鍵結(jié)合于蘇氨酸殘基。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合對(duì)糖基化的依賴性是由當(dāng)糖基化時(shí)所述表位采用的特異表位造成的，尤其是由上文提到的特異性碳水化合物部分。在其中結(jié)合的親和力取決于表位構(gòu)象的情況下，抗體不必結(jié)合于碳水化合物部分，可僅僅結(jié)合于表位的肽部分。優(yōu)選地，表位包含在粘蛋白Mucl的細(xì)胞外串聯(lián)重復(fù)內(nèi)。具體而言，根據(jù)本發(fā)明的抗體能夠結(jié)合于一種腫瘤相關(guān)粘蛋白表位，特別是腫瘤相關(guān)Mucl表位如表位TA-Mucl (見Karsten, U.等人(2004) Glycobiologyl4, 681_692and Danielczyk, A.等人(2006) Cancer Tmmunol.1mmunother.55, 1337-1347)。腫瘤相關(guān)粘蛋白I表位TA-Mucl優(yōu)選地指代Mucl的表位,其存在于腫瘤細(xì)胞而不存在于正常細(xì)胞上且/或僅能在存在于腫瘤細(xì)胞而不是存在于正常細(xì)胞上時(shí)由宿主循環(huán)系統(tǒng)中抗體接近。優(yōu)選的抗-⑶52抗體包含一個(gè)或多個(gè)選自以下的⑶R:具有SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的CDRH1、具有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的CDRH2、具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的CDRH3、具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的⑶RL3。具體而言，抗體可以為抗-⑶52抗體，其包含⑴包含具有SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的⑶RH2、具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的⑶RH3的重鏈可變區(qū)；(ii)可選地，包含具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的⑶RL3的輕鏈可變區(qū)；(iii)存在于Fab部分中在根據(jù)Kabat編號(hào)重鏈可變區(qū)60號(hào)位氨基酸處的糖基化位點(diǎn)；以及(iv)可選地，存在于Fe部分在重鏈恒定區(qū)2的297號(hào)位氨基酸處的糖基化位點(diǎn)。所述抗體優(yōu)選地能夠與阿倫單抗結(jié)合相同的抗原，尤其是結(jié)合于相同表位。優(yōu)選的抗-Aβ抗體包含一個(gè)或多個(gè)選自以下的⑶R:具有SEQ ID Ν0:21的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDRH2、具有SEQ ID Ν0:23的氨基酸序列的CDRH3、具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID Ν0:25的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的⑶RL3。具體而言，抗體可以為抗_Αβ抗體，其包含(i)包含具有SEQ ID NO: 21的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQ ID NO: 22的氨基酸序列的⑶RH2、具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的⑶RH3的重鏈可變區(qū)；(ii)可選地，包含具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的⑶RL3的輕鏈可變區(qū)；(iii)存在于Fab部分中在根據(jù)Kabat編號(hào)重鏈可變區(qū)55號(hào)位氨基酸處的糖基化位點(diǎn)；以及(iv)可選地，存在于Fe部分在重鏈恒定區(qū)2的297號(hào)位氨基酸處的糖基化位點(diǎn)。所述抗體優(yōu)選地能夠與Solanezumab結(jié)合相同的抗原,尤其是結(jié)合于相同表位。除了 Fab部分中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)外，抗體還可在Fe部分中包含一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。優(yōu)選的，其包含F(xiàn)e部分的天然發(fā)生糖基化位點(diǎn)。例如，其包含CH2區(qū)域中的糖基化位點(diǎn)，具體而言在IgG抗體的情況下為Asn297處。在這些實(shí)施方式中，優(yōu)選地組合物中至少一個(gè)抗體或其片段或衍生物在Fe部分糖基化。優(yōu)選地，組合物中抗體或其片段或衍生物中有至少25%、更優(yōu)選地至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%，最優(yōu)選地大約100%在Fe部分糖基化。抗體的片段或衍生物優(yōu)選地包含至少抗體的重鏈可變區(qū)。優(yōu)選地，其進(jìn)一步包含抗體的重鏈恒定區(qū)1，和/或抗體的輕鏈可變區(qū)和/或抗體的輕鏈恒定區(qū)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗體的片段或衍生物包含抗體的整個(gè)Fab部分。具體而言，抗體的片段或衍生物選自:(i)Fab片段，其是由重鏈和輕鏈各自可變區(qū)及第一恒定結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單價(jià)片段；(ii)F(ab)2片段，其是包含由鉸鏈區(qū)的二硫橋連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)Fd片段，其由重鏈的可變區(qū)及第一恒定結(jié)構(gòu)域CHl構(gòu)成；(iv)Fv片段，其由抗體單臂上的重鏈和輕鏈可變區(qū)的構(gòu)成；(V) scFv片段,其是由單一多肽鏈構(gòu)成的Fv片段；(vi) (Fv)2片段，其由兩個(gè)Fv片段共價(jià)相連而構(gòu)成；(Vii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域；以及(viii)多價(jià)抗體，其由以如下方式共價(jià)相連的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)構(gòu)成:重鏈和輕鏈可變區(qū)的結(jié)合只能在分子間而不能在分子內(nèi)發(fā)生。所述片段或衍生物優(yōu)選地能夠與抗體結(jié)合于相同抗原，優(yōu)選地結(jié)合于相同表位。糖基化形式

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，循環(huán)半衰期受到根據(jù)本發(fā)明的方法控制并包含于根據(jù)本發(fā)明的抗體組合物中的抗體或其片段或衍生物具有為所述抗體或其片段或衍生物提供特定所需特性的其他糖基化特征。這些抗體或其片段或衍生物上的碳水化合物優(yōu)選地為復(fù)合型碳水化合物。具體而言，連接于抗體或其片段或衍生物的Fab部分和/或Fe部分的碳水化合物中優(yōu)選地有至少50%、更優(yōu)選地至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%最優(yōu)選地大約100%具有圖21B中所示的核心結(jié)構(gòu)，其中黑色方塊代表N-乙酰葡萄糖胺殘基(GlcNAc)而灰色圓圈代表甘露糖殘基(Man)。更優(yōu)選地，具有所述核心結(jié)構(gòu)的碳水化合物為復(fù)合型碳水化合物如雙天線復(fù)合型碳水化合物，其具有圖21C中所示的核心結(jié)構(gòu)，其中黑色方塊代表N-乙酰葡萄糖胺殘基(GlcNAc)、灰色圓圈代表甘露糖殘基(Man)、白色圓圈代表半乳糖殘基(Gal)、灰色菱形代表唾液酸殘基(SA)、黑色三角代表果糖殘基(Fuc)而灰色方塊代表平分型N-乙酰葡萄糖胺殘基(bisGlcNAc);其中碳水化合物的分支中的GlcNAc、Gal和SA、bisGlcNAc以及Fuc僅僅是可選地存在于碳水化合物結(jié)構(gòu)中的，也可能不存在。具體而言，這些可選的殘基以本文描述的量存在。具體而言，抗體組合物中連接于所述抗體或其片段或衍生物的碳水化合物中有至少50%攜帶至少一個(gè)半乳糖殘基。更優(yōu)選地，組合物中所述碳水化合物中有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%或至少80%攜帶至少一個(gè)半乳糖殘基。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗體組合物中連接于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中有至少70%攜帶至少一個(gè)半乳糖殘基。更優(yōu)選地，組合物中所述碳水化合物中有至少至少75%、至少80%、至少85%或至少90%攜帶至少一個(gè)半乳糖殘基。所述半乳糖殘基優(yōu)選地為末端半乳糖殘基，具體而言連接于N-乙酰葡萄糖胺殘基，后者特別是位于碳水化合物鏈的一個(gè)或多個(gè)分支的末端并可選地進(jìn)一步攜帶一個(gè)唾液酸殘基。術(shù)語“末端的”在這一點(diǎn)上僅指代半乳糖殘基在碳水化合物鏈中的位置，具體而言指的是其在碳水化合物某個(gè)分支上的位置。這并不意味著該半乳糖殘基必須是碳水化合物鏈的非還原性末端的最后一個(gè)單糖單元。具體而言，末端半乳糖單元可進(jìn)一步攜帶一個(gè)唾液酸殘基。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗體或其片段或衍生物具有人的或類似人的糖基化形式。具體地，連接于抗體或其片段或衍生物的碳水化合物優(yōu)選地不包含具有Gal α (1- 3)GalP (I— 4)GlcNAc結(jié)構(gòu)的Galili表位。優(yōu)選地，它們不包含Gal a (1- 3)Gal結(jié)構(gòu)。連接于抗體或其片段或衍生物的碳水化合物還優(yōu)選地不包含N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NeuGc)殘基。進(jìn)一步地，在組合物中連接于抗體或其片段或衍生物的碳水化合物中唾液酸優(yōu)選地有至少25%是通過2，6-連接偶聯(lián)的。更優(yōu)選地，組合物中連接于抗體或其片段或衍生物的碳水化合物中唾液酸優(yōu)選地有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%或至少68%是通過2，6-連接偶聯(lián)的。通過使用類似于天然人糖基化的糖基化形式，減少了施用抗體或其片段或衍生物引起的不利副作用。具體而言，應(yīng)當(dāng)避免碳水化合物結(jié)構(gòu)如Galili表位、NeuCg或高量的2，3-連接唾液酸，因?yàn)槠淇赡芤l(fā)患者免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。例如，使用具有類似人糖基化形式的嵌合的或優(yōu)選地人源化抗體可避免人抗-小鼠抗體(HAMA)應(yīng)答。尤其已知的是Galili表位引起大量嚴(yán)重的超敏反應(yīng)。具體而言，表達(dá)于小鼠SP2/0細(xì)胞的嵌合抗-EGFR抗體西妥昔單抗(Erbitux)包含的碳水化合物攜帶有Galili表位及NeuGc,因此在人類患者中誘導(dǎo)了針對(duì)所述抗體的免疫反應(yīng)。由根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的抗體，特別是根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的EGFR抗體如嵌合或人源化西妥昔單抗抗體或具有與西妥昔單抗相同表位的抗體(其可包含在根據(jù)本發(fā)明的抗體組合物中)不包含這些不利的碳水化合物結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步地，在根據(jù)本發(fā)明的組合物中，連接于抗體或其片段或衍生物的碳水化合物優(yōu)選地有至少10%、更優(yōu)選地至少15%、至少20%、至少23%、至少25%、至少27%、至少29%或至少30%攜帶平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)殘基。具體而言，組合物中連接于抗體或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物優(yōu)選地有至少50%、更優(yōu)選地至少55%、至少60%、至少65%或甚至70%攜帶bisGlcNAc。在特定實(shí) 施方式中，根據(jù)本發(fā)明的組合物中連接于抗體或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中不超過50%、優(yōu)選地不超過40%、不超過30%、不超過25%、不超過20%、不超過15%、不超過13%或不超過10%攜帶果糖殘基。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的組合物中連接于抗體或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物優(yōu)選地有至少1%、更優(yōu)選地至少2%、至少5%、至少7%、至少8%、至少9%或至少10%攜帶果糖殘基。增強(qiáng)的生物學(xué)活性在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，具有增加的循環(huán)半衰期的抗體此外還具有增強(qiáng)的生物學(xué)活性。在此方面的抗體的生物學(xué)活性包括例如ADCC和⑶C。增強(qiáng)的生物學(xué)活性主要是通過優(yōu)化的糖基化形式達(dá)到的，尤其是在抗體Fe部分優(yōu)化的糖基化形式。例如，IgG型抗體的ADCC活性由抗體通過其Fe部分與Fe Y -受體特別是Fe YRIIIa的結(jié)合介導(dǎo)。Fe Y RIIIa表達(dá)于天然殺傷(NK)細(xì)胞及巨噬細(xì)胞上，在受抗體激活時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞因子以及細(xì)胞毒性顆粒的釋放，導(dǎo)致抗體包圍的靶標(biāo)細(xì)胞的凋亡?？贵w對(duì)Fe Y -受體的結(jié)合親和力受到連接于抗體Fe部分的糖基化位點(diǎn)的碳水化合物的影響。因此，優(yōu)化抗體Fe部分的糖基化形式會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的Fe YRIIIa結(jié)合并因此產(chǎn)生增強(qiáng)的ADCC活性。除了抗體的循環(huán)半衰期外，其治療效力在很多情況下也取決于針對(duì)抗體所結(jié)合的靶標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)的誘導(dǎo)。因此，增加抗體的ADCC活性也增加了其的治療價(jià)值。例如，使用ADCC活性得到優(yōu)化的抗體時(shí)，施用于患者相同量的抗體會(huì)實(shí)現(xiàn)高得多的治療益處。進(jìn)一步地，為達(dá)到相同的治療效應(yīng)，只需要施用量低得多的所述抗體。如本文所討論的，抗體的循環(huán)半衰期的增加也產(chǎn)生增強(qiáng)的治療效應(yīng)。因此，增加的循環(huán)半衰期和增加的生物學(xué)活性這兩種特征的組合提供了高度優(yōu)勢(shì)的治療抗體。然而，這兩種特性優(yōu)選地都是通過控制抗體的糖基化形式而優(yōu)化的。具體而言，在抗體Fab部分的唾液酸度的增加會(huì)增加其循環(huán)半衰期而在抗體Fe部分的果糖化度的降低增加其ADCC活性。進(jìn)一步地，在Fe部分的高唾液酸化度可干擾ADCC活性。本發(fā)明的一項(xiàng)成果在于將這兩種特征在一個(gè)抗體組合物中組合并因此提供在Fab部分的糖基化形式優(yōu)化達(dá)到高循環(huán)半衰期且在Fe部分的糖基化形式優(yōu)化達(dá)到高生物學(xué)活性的抗體。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)尤其是連接于IgG抗體Fe部分的碳水化合物中減少的果糖量、增加的平分型GlcNAc的量和/或減少的唾液酸的量會(huì)增加抗體對(duì)Fe yRIIIa的親和力及/或其ADCC活性。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的抗體組合物中的抗體或其片段或衍生物在連接于抗體或其片段或衍生物的Fe部分的碳水化合物中有低的果糖量。備選地或除了此低的果糖量之外，抗體或其片段或衍生物在連接于Fe部分的碳水化合物中優(yōu)選地具有高的平分型GlcNAc的量和/或低的唾液酸量。在抗體的Fe部分的這種糖基化形式產(chǎn)生增加的抗體ADCC活性。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的抗體組合物中連接于抗體或其片段或衍生物的Fe部分的碳水化合物中優(yōu)選地至少50%、更優(yōu)選地至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少95%或至少97%不攜帶果糖殘基。在抗體Fe部分的糖基化中低的果糖含量對(duì)該抗體的高抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)十分重要。尤其在IgG抗體的情況下，在Fe糖基化中高的果糖量減少抗體對(duì)Fe Y -受體的親和力，特別是對(duì)由天然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)并介導(dǎo)ADCC的Fe Y RIIIa的親和力。進(jìn)一步地，連接于IgG抗體的Fe部分的糖基化位 點(diǎn)的碳水化合物中低的果糖量也減少了抗體對(duì)人Fe Y RIIIa的不同多態(tài)性變體(FcyRIIIa-158F和FcyRIIIa-158V)的結(jié)合親和力中的差異。因此，在連接于Fe部分的碳水化合物中具有低的果糖量，尤其是具有如上文描述的果糖量的IgG抗體可用于以一定的量治療患者，當(dāng)以該量施用相同的在Fe部分有高果糖含量的抗體時(shí)不引起治療作用。進(jìn)一步地，使用這些低果糖抗體時(shí)，可以相同量的抗體治療具有不同的Fe Y RIIIa多態(tài)性變體的患者如純合Fe Y RIIIa-158F患者、純合Fe Y RIIIa-158V患者和雜合Fe Y RIIIa-158F/V患者，產(chǎn)生類似對(duì)所施用的相同量的抗體的應(yīng)答。具體而言，在其Fe部分具有高果糖含量的抗體對(duì)Fe YRIIIa-158F的結(jié)合具有尤其降低的親和力。因此，使用所述低果糖抗體擴(kuò)大了抗體治療的患者覆蓋率。這一點(diǎn)在其中使用了根據(jù)本發(fā)明的相應(yīng)抗體組合物的實(shí)施例中也有表明。進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明的組合物中連接于抗體或其片段或衍生物的Fe部分的碳水化合物中優(yōu)選地至少5%、更優(yōu)選地至少7%、至少10%、至少12%、至少15%、至少18%、至少20%或至少22%攜帶bisGlcNAc。在抗體，尤其是IgG抗體的Fe部分較高量的bisGlcNAc可使該抗體產(chǎn)生增加的ADCC。進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明的組合物中連接于抗體或其片段或衍生物的Fe部分的碳水化合物中優(yōu)選地至少60%、更優(yōu)選地至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少95%或至少97%不攜帶唾液酸殘基。進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明的組合物中連接于抗體或其片段或衍生物的Fe部分的碳水化合物中優(yōu)選地至少75%、更優(yōu)選地至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少95%或至少97%不攜帶兩個(gè)或更多個(gè)唾液酸殘基。在抗體的Fe部分較高的唾液酸化度對(duì)與Fe受體特別是Fe Y RIIIa的結(jié)合有負(fù)面影響，因此也影響抗體的ADCC。用于生產(chǎn)這些抗體組合物的細(xì)胞和細(xì)胞系優(yōu)選地能夠提供在Fab部分具有高唾液酸化度并在Fe部分具有低唾液酸化度的抗體。合適的細(xì)胞系的實(shí)例為細(xì)胞系GT-5s及由其來源或與其同源的細(xì)胞或細(xì)胞系?？贵w組合物在第二方面，本發(fā)明提供了抗體組合物，其包含抗體或其功能片段或衍生物，特征在于所述抗體或器片段或組合物包含在其Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)，特征還在于組合物中連接于抗體或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中至少65%攜帶至少一個(gè)末端唾液酸殘基且/或連接于抗體或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中低于35%攜帶至少兩個(gè)游離半乳糖單元。所述抗體組合物優(yōu)選的特征，特別是優(yōu)選的糖基化形式在上文有所描述并符合下文的糖基化形式。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的抗體組合物中抗體或其片段或衍生物中至少75%、更優(yōu)選地至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%且最優(yōu)選地大約100%識(shí)別、結(jié)合于且/或特異于相同抗原，優(yōu)選地為相同表位。所述抗體組合物可由根據(jù)本發(fā)明的控制抗體或其片段或衍生物的循環(huán)半衰期的方法獲得，或確實(shí)是通過該方法獲得的，其中連接于一個(gè)或多個(gè)所述抗體或其片段或衍生物Fab部分存在的糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中唾液酸的量得到增加。

具體而言，根據(jù)本發(fā)明的抗體組合物中的抗體或其片段或衍生物優(yōu)選地在根據(jù)本發(fā)明的用于控制循環(huán)半衰期的方法上具有上文描述的一項(xiàng)或多項(xiàng)特征。具體而言，相應(yīng)組合物中包含的與根據(jù)本發(fā)明的用于控制循環(huán)半衰期的方法相關(guān)而描述的所述抗體或其片段或衍生物的這些特征，特別是糖基化形式、Fab糖基化位點(diǎn)的特征以及糖基化形式的特征，如上文描述的，還可應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明的抗體組合物中的抗體或其片段或衍生物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物中連接于抗體或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中有至少68%、至少70%、至少75%或至少80%攜帶至少一個(gè)末端唾液酸殘基。具體而言，組合物中連接于存在于抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中每條碳水化合物鏈的唾液酸平均量為至少0.65、優(yōu)選地至少0.7、至少0.75、至少0.8、至少0.9、至少1.0、至少1.05或至少1.1。進(jìn)一步地,組合物中連接于抗體或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中優(yōu)選地低于30%、低于25%、低于20%、低于15%、低于10%、低于7%或低于5%攜帶兩個(gè)或更多游離半乳糖單元。具體而言，組合物中連接于存在于抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中每條碳水化合物鏈的游離半乳糖單元平均量低于1.2、更優(yōu)選地低于1.1、低于1.0、低于0.9、低于0.85、低于0.8、低于0.75或低于0.7。優(yōu)選地，組合物中至少一種抗體或其片段或衍生物在Fab部分糖基化。更優(yōu)選地，組合物中抗體或其片段或衍生物中至少25%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或至少90%在Fab部分糖基化。進(jìn)一步地，組合物中抗體或其片段或衍生物中優(yōu)選地至少25%、更優(yōu)選地至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或最優(yōu)選地至少90%如本文描述的在Fab部分的特異糖基化位點(diǎn)，優(yōu)選地在Fab部分存在的所有糖基化位點(diǎn)處有糖基化。還可例如在純化過程中或之后就相應(yīng)糖基化形式富集抗體或其片段或衍生物。優(yōu)選地，抗體組合物中的抗體或其片段或衍生物進(jìn)一步在其Fe部分包含至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)。所述糖基化位點(diǎn)優(yōu)選地是由碳水化合物糖基化的，其中組合物中攜帶果糖殘基的碳水化合物的量?jī)?yōu)選地低于50%、更優(yōu)選地低于40%、低于30%、低于25%、低于20%、低于15%、更優(yōu)選地低于10%且最優(yōu)選地低于5%。進(jìn)一步地，組合物中連接于Fe部分并攜帶一個(gè)或多個(gè)唾液酸殘基的碳水化合物的量?jī)?yōu)選地低于50%、更優(yōu)選地低于40%、低于30%、低于25%、低于20%、低于15%、低于10%，最優(yōu)選地低于7%或低于5%。組合物中的抗體或其片段或衍生物優(yōu)選地具有下表列出的糖基化形式:
權(quán)利要求
1.用于控制抗體或其功能片段或衍生物的循環(huán)半衰期的方法，其包括步驟 (a)對(duì)于增加循環(huán)半衰期(al)在包含抗體或其功能片段或衍生物的組合物中增加連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中的唾液酸的量；及/或(a2)移除存在于抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)；及/或(a3)在包含抗體或其功能片段或衍生物的組合物中降低連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中的游離半乳糖單元的 量;或 (b)對(duì)于降低循環(huán)半衰期(bl)在包含抗體或其功能片段或衍生物的組合物中降低連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中的唾液酸的量；及/或(b2)向抗體或其片段或衍生物的Fab部分中引入一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)；和/或(b3)在包含抗體或其功能片段或衍生物的組合物中增加連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中的游離半乳糖單元的量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(al)包含一項(xiàng)或多項(xiàng)以下特征: (i)增加唾液酸的量以使組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中至少50%包含至少一個(gè)唾液酸殘基； ( )增加唾液酸的量以使組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中每條碳水化合物鏈的唾液酸殘基的平均量為至少0.8 ； (iii)增加連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中唾液酸的量而組合物中連接于存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fe部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中低于20%、優(yōu)選地低于10%包含至少一個(gè)唾液酸，以及 (iv)增加唾液酸的量的步驟,包括在細(xì)胞或細(xì)胞系具有高的唾液酸化活性的條件下，于所述細(xì)胞或細(xì)胞系中表達(dá)所述抗體或其片段或衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中步驟(a2)包含一項(xiàng)或多項(xiàng)以下特征: (i)通過改變編碼所述抗體或其片段或衍生物的核酸序列而移除所述一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)； ( )要移除的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)存在于所述抗體或其片段或衍生物的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)，優(yōu)選地在重鏈可變區(qū)中，更優(yōu)選地為在其骨架區(qū)中； (iii)移除存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的所有糖基化位點(diǎn)； (iv)所述一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的移除不會(huì)顯著減少或消除所述抗體或其片段或衍生物的抗原結(jié)合和/或抗原特異性；以及 (v)抗原結(jié)合親和力降低不超過20%、優(yōu)選地不超過15%、不超過10%或不超過5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的方法，其中步驟(a3)包含一項(xiàng)或多項(xiàng)以下特征: (i)降低游離半乳糖單元的量以使組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中低于50%包含至少兩個(gè)游離半乳糖單元；以及 ( )降低游離半乳糖單元的量的步驟，包括在細(xì)胞或細(xì)胞系具有高的唾液酸化活性的條件下，于所述細(xì)胞或細(xì)胞系中表達(dá)所述抗體或其片段或衍生物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(bl)包含一項(xiàng)或多項(xiàng)以下特征: (i)降低唾液酸的量以使組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中低于50%包含至少一個(gè)唾液酸殘基； ( )降低唾液酸的量以使組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中的每條碳水化合物的唾液酸殘基的平均量為低于0.8 ;以及 (iii)降低唾液酸的量的步驟，包括在細(xì)胞或細(xì)胞系具有低的或無唾液酸化活性的條件下，于所述細(xì)胞或細(xì)胞系中表達(dá)所述抗體或其片段或衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5的方法，其中步驟(b2)包含一項(xiàng)或多項(xiàng)以下特征: (i)向所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中引入恰好一個(gè)、至少兩個(gè)或至少三個(gè)糖基化位點(diǎn)； ( )所述一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)是通過改變編碼所述抗體或其片段或衍生物的核酸序列而引入； (iii)向所述抗體或其片段或衍生物的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)中引入至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)，優(yōu)選地向重鏈可變區(qū)中引入，更優(yōu)選地是在其骨架區(qū)中； (iv)向重鏈恒定區(qū)I或輕鏈恒定區(qū)中引入至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)； (v)所述抗體或其片段或衍生物在引入一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)前在其Fab部分不含糖基化位點(diǎn)； (vi)向Fab部分中引入的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)具有序列AsnXaaSer/Thr,其中Xaa為任何的氨基酸，優(yōu)選地除了 Pro以外； (vii)所述一個(gè)或多個(gè)引入的糖基化位點(diǎn)和/或連接于所述糖基化位點(diǎn)的碳水化合物不會(huì)顯著減少或消除所述抗體或其片段或衍生物的抗原結(jié)合和/或抗原特異性；以及 (viii)在包含所述抗體或其片段或衍生物的組合物中連接于一個(gè)或多個(gè)引入的糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中低于50%包含至少一個(gè)唾液酸殘基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、5和6中任何一項(xiàng)的方法，其中步驟(b3)包含一項(xiàng)或多項(xiàng)以下特征: (i)增加游離半乳糖單元的量以使組合物中連接于存在于Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中至少50%包含至少兩個(gè)游離半乳糖單元；以及 ( )增加唾液酸的量的步驟，包括在細(xì)胞或細(xì)胞系具有低的或無唾液酸化活性的條件下，于所述細(xì)胞或細(xì)胞系中表達(dá)所述抗體或其片段或衍生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任何一項(xiàng)的方法，其中存在于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)存在于重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)中，優(yōu)選地在重鏈可變區(qū)中，更優(yōu)選地是在可變區(qū)的骨架區(qū)中。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)的方法，其中包含所述抗體或其片段或衍生物的組合物中，所述抗體或其片段或衍生物中至少50%在Fab部分糖基化。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任何一項(xiàng)的方法，其中所述抗體或其片段或衍生物包含在Fe部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)，優(yōu)選地在CH2區(qū)域中，最優(yōu)選地是在氨基酸Asn297處。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述抗體或其片段或衍生物具有一項(xiàng)或多項(xiàng)以下特征:(i)在包含所述抗體或其片段或衍生物的組合物中，所述抗體或其片段或衍生物中至少50%在Fe部分糖基化； (ii)在包含所述抗體或其片段或衍生物的組合物中，連接于Fe部分的碳水化合物中至少80%、優(yōu)選地至少90%不攜帶果糖殘基； (iii)在包含所述抗體或其片段或衍生物的組合物中，連接于Fe部分的碳水化合物中至少80%、優(yōu)選地至少90%不攜帶唾液酸殘基；以及 (iv)在包含所述抗體或其片段或衍生物的組合物中，連接于Fe部分的碳水化合物中至少5%攜帯平分型N-こ酰葡萄糖胺殘基。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任何ー項(xiàng)的方法，其中所述抗體或其片段或衍生物具有ー項(xiàng)或多項(xiàng)以下特征: (i)在包含所述抗體或其片段或衍生物的組合物中，連接于所述抗體或其片段或衍生物的碳水化合物中至少70%攜帯至少ー個(gè)半乳糖殘基； (ii)所述抗體或其片段或衍生物具有人的糖基化形式； (iii)連接于所述抗體或其片段或衍生物的碳水化合物不包含具有結(jié)構(gòu)Gala (1-3)Gal 3 (I — 4)GlcNAc 的 Galili 表位; (iv)連接于所述抗體或其片段或衍生物的碳水化合物不包含N-羥こ酰神經(jīng)氨酸(NeuGc)殘基; (v)在包含所述抗體或其片段或 衍生物的組合物中，連接于所述抗體或其片段或衍生物的碳水化合物中的唾液酸有至少40%是通過2，6-連接偶聯(lián)的； (vi)在包含所述抗體或其片段或衍生物的組合物中，連接于所述抗體或其片段或衍生物的碳水化合物中至少23%攜帶平分型N-こ酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)殘基； (vii)所述抗體為IgG、IgE、IgA、IgD或IgM抗體,優(yōu)選地為IgGl或IgG2抗體,更優(yōu)選地為IgGl抗體； (viii)所述抗體為人、小鼠、大鼠、山羊、靈長(zhǎng)類或駱駝抗體；以及 (ix)所述抗體為工程改造的抗體、單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任何ー項(xiàng)的方法，其中抗體的片段或衍生物具有ー項(xiàng)或多項(xiàng)以下特征: (i)其包含至少抗體的重鏈可變區(qū)，可選地其進(jìn)ー步包含抗體的重鏈恒定區(qū)1，和/或抗體的輕鏈可變區(qū)，和/或抗體的輕鏈恒定區(qū)； (ii)其選自由以下構(gòu)成的一組:(a)Fab片段，其為由每條重鏈和輕鏈的可變區(qū)和第一恒定結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單價(jià)片段； (b)F (ab)2片段，其為包含由鉸鏈區(qū)ニ硫橋相連的兩個(gè)Fab片段的雙價(jià)片段； (c)Fd片段，其由重鏈的可變區(qū)及第ー恒定結(jié)構(gòu)域CHl構(gòu)成； (d)Fv片段，其由抗體單臂的重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)成； (e)scFv片段,其由單ー多肽鏈構(gòu)成的Fe片段； (f)(Fv)2片段,其由兩個(gè)共價(jià)連接在一起的Fv片段構(gòu)成； (g)重鏈可變結(jié)構(gòu)域；及 (h)多價(jià)抗體，其由以如下方式共價(jià)連接在一起的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)構(gòu)成:重鏈和輕鏈可變區(qū)的結(jié)合只能在分子間而不能在分子內(nèi)發(fā)生；以及(iii)其能夠與所述抗體結(jié)合于相同抗原，優(yōu)選地結(jié)合于相同表位。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任何一項(xiàng)的方法，其中組合物中連接于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中至少50%、優(yōu)選地至少60%、更優(yōu)選地至少70%攜帶bisGlcNAco
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任何一項(xiàng)的方法，其中抗體為嵌合或人源化抗-EGFR抗體，其包含 ⑴包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQID N0:2的氨基酸序列的CDRH2、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDRH3的重鏈可變區(qū)； ( )可選地，包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID N0:5的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的⑶RL3的輕鏈可變區(qū)； (iii)存在于Fab部分中在根據(jù)Kabat編號(hào)重鏈可變區(qū)85號(hào)位氨基酸處的糖基化位點(diǎn)；以及 (iv)存在于Fe部分在重鏈恒定區(qū)2的297號(hào)位氨基酸處的糖基化位點(diǎn)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任何一項(xiàng)的方法，其中抗體為嵌合或人源化抗-TA-Mucl抗體，其包含 (i)包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQID NO:8的氨基酸序列的CDRH2、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDRH3的重鏈可變區(qū)； ( )可選地，包含具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID N0:11的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的⑶RL3的輕鏈可變區(qū)； (iii)存在于Fab部分中在根據(jù)Kabat編號(hào)重鏈可變區(qū)54號(hào)位氨基酸處的糖基化位點(diǎn)；以及 (iv)存在于Fe部分在重鏈恒定區(qū)2的297號(hào)位氨基酸處的糖基化位點(diǎn)。
17.包含抗體或其片段或衍生物的抗體組合物，特征為所述抗體或其片段或衍生物包含在其Fab部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)，且特征還在于組合物中連接于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中至少65%攜帶至少一個(gè)末端唾液酸殘基及/或連接于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中低于35%攜帶至少兩個(gè)游離半乳糖單元。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的抗體組合物，其中所述抗體或其片段或衍生物具有如權(quán)利要求2、4和8-16中限定的一項(xiàng)或多項(xiàng)特征。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的抗體組合物，其中所述抗體或其片段或衍生物具有一項(xiàng)或多項(xiàng)以下特征: (i)組合物中所述抗體或其片段或衍生物中至少50%在Fab部分糖基化； ( )組合物中連接于Fab部分的碳水化合物中至少70%、優(yōu)選地至少75%攜帶至少一個(gè)末端唾液酸殘基； (iii)其包含在Fe部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)，優(yōu)選地在CH2區(qū)域中，更優(yōu)選地是在氨基酸Asn 297處； (iv)組合物中所述抗體或其片段或衍生物中至少50%在Fe部分糖基化； (V)組合物中連接于Fe部分的碳水化合物中至少80%不攜帶果糖殘基； (vi)組合物中連接于Fe部分的碳水化合物中至少70%、優(yōu)選地至少80%不攜帶唾液酸殘基; (vii)組合物中連接于Fe部分的碳水化合物中至少5%攜帶平分型N-乙酰化葡萄糖胺殘基； (viii)組合物中連接于所述抗體或其片段或衍生物的碳水化合物中至少70%攜帶至少一個(gè)半乳糖殘基； (ix)其具有人的糖基化形式； (x)連接于所述抗體或其片段或衍生物的碳水化合物不包含具有結(jié)構(gòu)Galα (1- 3)Gal β (I — 4)GlcNAc 的 Galili 表位; (xi)連接于所述抗體或其片段或衍生物的碳水化合物不包含N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NeuGc)殘基; (xii)組合物中連接于所述抗體或其片段或衍生物的碳水化合物中的唾液酸有至少40%是通過2，6-連接偶聯(lián)的； (xiii)組合物中連接于所述抗體或其片段或衍生物的碳水化合物中至少23%攜帶平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)殘基； (xiv)組合物中連接于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中至少50%、優(yōu)選地至少60%、更優(yōu)選地至少70%攜帶bisGlcNAc; (xiv)所述抗體為IgG、IgE 、IgA、IgD或IgM抗體,優(yōu)選地為IgGl或IgG2抗體,更優(yōu)選地為IgGl抗體; (xv)所述抗體為人、小鼠、大鼠、山羊、靈長(zhǎng)類或駱駝抗體； (xvi)所述抗體為工程改造的抗體、單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體； (xvii)抗體的片段或衍生物包含至少抗體的重鏈可變區(qū)以及Fab部分中的糖基化位占.(xviii)所述片段或衍生物選自由以下構(gòu)成的一組: (a)Fab片段，其是由每條重鏈和輕鏈的可變區(qū)和第一恒定結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單價(jià)片段； (b)F (ab)2片段，其是包含由鉸鏈區(qū)二硫橋相連的兩個(gè)Fab片段的雙價(jià)片段； (c)Fd片段，其由重鏈的可變區(qū)及第一恒定結(jié)構(gòu)域CHl構(gòu)成； (d)Fv片段，其由抗體單臂的重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)成； (e)scFv片段，其是由單一多肽鏈構(gòu)成的Fe片段； (f)(Fv)2片段,其由兩個(gè)共價(jià)連接在一起的Fv片段構(gòu)成； (g)重鏈可變結(jié)構(gòu)域；及 (h)多價(jià)抗體，其由以如下方式共價(jià)連接在一起的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)構(gòu)成:重鏈和輕鏈可變區(qū)的結(jié)合只能在分子間而不能在分子內(nèi)發(fā)生； (xix)所述片段或衍生物能夠與所述抗體結(jié)合于相同抗原，優(yōu)選地結(jié)合于相同表位；以及 (XX)所述抗體選自抗-EGFR抗體如西妥昔單抗、抗-TF抗體如Karomab、抗-Mucl抗體如Pankomab、抗-HER2抗體如曲妥單抗、抗-CD20抗體如利妥昔單抗。
20.包含嵌合或人源化抗-EGFR抗體的抗體組合物，其中嵌合或人源化抗-EGFR抗體包含的重鏈可變區(qū)包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的⑶RHl、具有SEQ ID N0:2的氨基酸序列的⑶RH2、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的⑶RH3;包含的輕鏈可變區(qū)包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID N0:5的氨基酸序列的CDRL2、具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的⑶RL3，特征為 (i)所述抗體在根據(jù)Kabat編號(hào)重鏈可變區(qū)的85號(hào)位氨基酸處包含存在于Fab部分中的糖基化位點(diǎn)，其中組合物中連接于所述存在于Fab部分中的所述糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中有至少65%攜帶至少一個(gè)末端唾液酸殘基且/或連接于所述存在于Fab部分中的所護(hù)糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中低于35%攜帶至少兩個(gè)游離半乳糖單元，或( )所述抗體不包含在Fab部分中的糖基化位點(diǎn)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的抗體組合物，其中抗體具有所有以下特征 (i)所述抗體包含存在于Fe部分中的糖基化位點(diǎn)； ( )組合物中連接于 Fe部分的碳水化合物中至少80%不攜帶果糖殘基； (iii)組合物中連接于Fe部分的碳水化合物中至少70%、優(yōu)選地至少80%不攜帶唾液酸殘基； (iv)組合物中連接于Fe部分的碳水化合物中至少10%攜帶平分型N-乙酰葡萄糖胺殘基; (v)組合物中連接于抗體的碳水化合物中至少70%攜帶至少一個(gè)半乳糖殘基； (vi)連接于抗體的碳水化合物不包含具有結(jié)構(gòu)Galα (I — 3) Gal β (I — 4) GlcNAc的Galili表位；以及 (vii)連接于抗體的碳水化合物不包含N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NeuGc)殘基； (viii)可選地，組合物中連接于所述抗體或其片段或衍生物的Fab部分的碳水化合物中優(yōu)選地至少50%、優(yōu)選地至少60%、更優(yōu)選地至少70%攜帶bisGlcNAc。
22.包含嵌合或人源化抗-MucI抗體的抗體組合物，其中嵌合或人源化抗-Muc I抗體包含的重鏈可變區(qū)包含具有SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的⑶RHl、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的⑶RH2、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的⑶RH3;包含的輕鏈可變區(qū)包含具有SEQID NO: 10的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的CDRL2、具有SEQ IDNO: 12的氨基酸序列的CDRL3，特征為所述抗體在根據(jù)Kabat編號(hào)重鏈可變區(qū)的54號(hào)位氨基酸處包含存在于Fab部分中的糖基化位點(diǎn)，其中組合物中連接于所述存在于Fab部分中的所述糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中有至少65%攜帶至少一個(gè)末端唾液酸殘基且/或連接于所述存在于Fab部分中的所述糖基化位點(diǎn)的碳水化合物中低于35%攜帶至少兩個(gè)游離半乳糖單元。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的抗體組合物，其中抗體具有所有以下特征 (i)所述抗體包含存在于Fe部分中的糖基化位點(diǎn)； ( )可選地，組合物中連接于Fe部分的碳水化合物中至少80%不攜帶果糖殘基； (iii)組合物中連接于Fe部分的碳水化合物中至少80%不攜帶唾液酸殘基； (iv)組合物中連接于Fe部分的碳水化合物中至少5%攜帶平分型N-乙酰葡萄糖胺殘基; (v)組合物中連接于抗體的碳水化合物中至少70%攜帶至少一個(gè)半乳糖殘基； (vi)連接于抗體的碳水化合物不包含具有結(jié)構(gòu)Galα (I — 3) Gal β (I — 4) GlcNAc的Galili表位；以及 (vii)連接于抗體的碳水化合物不包含N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NeuGc)殘基。
24.根據(jù)權(quán)利要求17-23中任何一項(xiàng)的抗體組合物用于醫(yī)療的用途，優(yōu)選地為用于癌癥的治療。
25.根據(jù)權(quán)利要求17-24中任何一項(xiàng)的抗體組合物，其為藥用組合物。
26.根據(jù)權(quán)利要求20-23中任何一項(xiàng)的抗體組合物，用于在具有至少一個(gè)編碼Fe Y RIII a-158F的等位基因的患者中治療癌癥。
27.根據(jù)權(quán)利要求20或21的抗體組合物，用于在Erbitux治療失敗后治療癌癥。
28.根據(jù)權(quán)利要求20或21的抗體組合物，用于治療癌癥，其中腫瘤細(xì)胞在EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中包含至少一個(gè)激活突變。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的抗體組合物，其中激活突變產(chǎn)生組成型活化的K-Ras突變體、組成型活化的PI3激酶突變體或Raf激酶的過表達(dá)。
30.用于生產(chǎn)包含具有所需的循環(huán)半衰期的抗體或其功能片段或衍生物的抗體組合物的方法，其包括將所述抗體或其功能片段或衍生物在宿主細(xì)胞中表達(dá)的步驟，其中根據(jù)權(quán)利要求I的用于控制所述抗體或其片段或衍生物的半衰期的方法是使用所述方法的步驟(al)、步驟(a3)、步驟(bl)或步驟(b3)進(jìn)行的，且/或該宿主細(xì)胞表達(dá)通過根據(jù)權(quán)利要求1的方法使用步驟(a2)或(b2)獲得的抗體或其功能片段或衍生物。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中進(jìn)行或已經(jīng)進(jìn)行了根據(jù)權(quán)利要求2-16中任何一項(xiàng)的方法。
32.根據(jù)權(quán)利要求30或31的方法，其中抗體組合物具有權(quán)利要求2-25中一項(xiàng)或多項(xiàng)中限定的一項(xiàng)或多項(xiàng)特征。
33.抗體或其功能片段或衍生物，其中所述抗體或其片段或衍生物中至少一個(gè)CDR的氨基酸序列來源于包含存在于Fe部分中的至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的參考抗體，且其中所述抗體或其片段或衍生物不包含在Fab部分中的糖基化位點(diǎn)，其中所述抗體或其片段或衍生物比參考抗體具有更高的循環(huán)半衰期。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的抗體或其功能片段或衍生物，其具有一項(xiàng)或多項(xiàng)以下特征: (i)其與參考抗體結(jié)合相同的表位； ( )所述抗體或其片段或衍生物的重鏈可變區(qū)的所有三個(gè)CDR的氨基酸序列都來源于參考抗體； (iii)所述抗體或其片段或衍生物的輕鏈可變區(qū)的所有三個(gè)CDR的氨基酸序列都來源于參考抗體； (iv)所述抗體或其片段或衍生物的重鏈可變區(qū)的整段氨基酸序列和/或輕鏈可變區(qū)的整段氨基酸序列都來源于參考抗體； (v)所述抗體或其功能片段或衍生物的抗原結(jié)合親和力類似于或高于參考抗體的抗原結(jié)合未和力； (vi)所述抗體或其功能片段或衍生物的循環(huán)半衰期比參考抗體的循環(huán)半衰期高出至少5%、優(yōu)選地高出至少10%、至少15%、至少20%或至少25%; (vii)抗原結(jié)合親和力降低不超過20%、優(yōu)選地不超過15%、不超過10%或不超過5%; (viii)參考抗體選自抗-EGFR抗體如西妥昔單抗或與西妥昔單抗結(jié)合于相同表位的抗體、抗-Mucl抗體如Pankomab或與Pankomab結(jié)合于相同表位的抗體、抗_Αβ抗體如solanezumab以及抗-CD52抗體如阿侖單抗或與阿倫單抗結(jié)合于相同表位的抗體；以及(ix)參考抗體的Fab部分中的糖基化位點(diǎn)為N-糖基化位點(diǎn)，其優(yōu)選地具有氨基酸序列Asn Xaa Ser/Thr,其中Xaa為任何氨基酸,優(yōu)選地除了 Pro以外。
35.根據(jù)權(quán)利要求33或34的抗體或其功能片段或衍生物，其中參考抗體為抗-EGFR抗體，其包含 (i)包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQID N0:2的氨基酸序列的CDRH2、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDRH3的重鏈可變區(qū)； ( )可選地，包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID N0:5的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的⑶RL3的輕鏈可變區(qū)； (iii)存在于Fab部分中在根據(jù)Kabat編號(hào)重鏈可變區(qū)85號(hào)位氨基酸處的糖基化位點(diǎn)；以及 (iv)可選地，存在于F e部分在重鏈恒定區(qū)2的297號(hào)位氨基酸處的糖基化位點(diǎn)；或 其中參考抗體為抗-TA-Mucl抗體，其包含 (i)包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQID NO:8的氨基酸序列的CDRH2、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDRH3的重鏈可變區(qū)； ( )可選地，包含具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID N0:11的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的⑶RL3的輕鏈可變區(qū)； (iii)存在于Fab部分中在根據(jù)Kabat編號(hào)重鏈可變區(qū)54號(hào)位氨基酸處的糖基化位點(diǎn)；以及 (iv)可選地，存在于Fe部分在重鏈恒定區(qū)2的297號(hào)位氨基酸處的糖基化位點(diǎn)；或 其中參考抗體為抗-CD52抗體，其包含 (i)包含具有SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQID NO: 16的氨基酸序列的⑶RH2、具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的⑶RH3的重鏈可變區(qū)； ( )可選地，包含具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID N0:19的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的⑶RL3的輕鏈可變區(qū)； (iii)可選地，存在于Fab部分中在根據(jù)Kabat編號(hào)重鏈可變區(qū)60號(hào)位氨基酸處的糖基化位點(diǎn)；以及 (iv)可選地，存在于Fe部分在重鏈恒定區(qū)2的297號(hào)位氨基酸處的糖基化位點(diǎn)；或 其中嵌合抗體為抗-A β抗體，其包含 ⑴包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQID Ν0:22的氨基酸序列的⑶RH2、具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的⑶RH3的重鏈可變區(qū)； ( )可選地，包含具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDRLl、具有SEQ ID N0:25的氨基酸序列的⑶RL2、具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的⑶RL3的輕鏈可變區(qū)； (iii)可選地，存在于Fab部分中在根據(jù)Kabat編號(hào)重鏈可變區(qū)55號(hào)位氨基酸處的糖基化位點(diǎn)；以及 (iv)可選地，存在于Fe部分在重鏈恒定區(qū)2的297號(hào)位氨基酸處的糖基化位點(diǎn)。
36.根據(jù)權(quán)利要求33-35中任何一項(xiàng)的抗體或其功能片段或衍生物，其中 (i)參考抗體Fab部分中的糖基化位點(diǎn)在重鏈或輕鏈可變區(qū)中，且 ( )所述抗體或其功能片段或衍生物的重鏈或輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與參考抗體的對(duì)應(yīng)氨基酸序列差異為至少一個(gè)氨基酸，以移除重鏈或輕鏈可變區(qū)中的糖基化位點(diǎn)。
37.用于生產(chǎn)編碼具有增加的循環(huán)半衰期的抗體或其功能片段或衍生物的核酸的方法，其包括步驟: (a)提供編碼具有Fab部分中的糖基化位點(diǎn)的抗體或其功能片段或衍生物的核酸；以及 (b)向所述核酸中引入突變以移除所編碼的抗體或其功能片段或衍生物的Fab部分中的糖基化位點(diǎn)。
38.可由根據(jù)權(quán)利要求37的方法獲得的核酸。
39.用于生產(chǎn)具有增加的循環(huán)半衰期的抗體或其功能片段或衍生物的方法，其包括步驟: (a)提供編碼具有Fab部分中的糖基化位點(diǎn)的抗體或其功能片段或衍生物的核酸； (b)向所述核酸中引入突變以移除所編碼的抗體或其功能片段或衍生物的Fab部分中的糖基化位點(diǎn)。
(C)表達(dá)步驟(b)中獲得的核酸以生產(chǎn)不具有Fab部分中的糖基化位點(diǎn)并比具有Fab部分中的糖基化位點(diǎn)的抗體或其功能片段或衍生物有更高循環(huán)半衰期的抗體或其功能片段或衍生物。
40.可由根據(jù)權(quán)利要求39的方法獲得的抗體或其功能片段或衍生物。
41.抗體組合物，其包 含如權(quán)利要求33-36中一項(xiàng)或多項(xiàng)所限定的抗體或其功能片段或衍生物。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的組合物，其中組合物中的抗體或其功能片段或衍生物具有如權(quán)利要求11和/或12所限定的在Fe部分中的糖基化形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于通過調(diào)整連接于抗體Fab部分的碳水化合物中唾液酸的量而控制抗體半衰期的方法。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了具有增加的循環(huán)半衰期的抗體。
文檔編號(hào)C07K16/28GK103119064SQ201180039635
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2011年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月10日
發(fā)明者S·戈萊茨, A·丹尼爾奇克, L·施特克爾 申請(qǐng)人:葛萊高托普有限公司