專利名稱：包含乳清蛋白及水解產(chǎn)物的用于改善肌肉恢復(fù)的制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于改善肌肉恢復(fù)(尤其在運(yùn)動(dòng)后)的制劑。更特別地，
本發(fā)明涉及包含乳清蛋白(whey protein )及水解產(chǎn)物的上述制劑。
背景技術(shù)：
骨骼肌在劇烈運(yùn)動(dòng)(特別是離心運(yùn)動(dòng))期間所經(jīng)受的高強(qiáng)度機(jī)械力 可誘發(fā)機(jī)械損傷，繼而發(fā)生急性炎癥反應(yīng)、發(fā)生疼痛和喪失生力能力 (force-generating capacity )。
能夠減少肌肉損傷和/或炎癥或者加快組織修復(fù)的介入具有加速恢 復(fù)運(yùn)動(dòng)后肌肉生力的潛力。它們還有可能輔助疾病后的肌肉恢復(fù)。
發(fā)明概述
在一個(gè)方面中，提供了包含乳清蛋白或乳清蛋白水解產(chǎn)物的制劑， 其中該制劑能夠在體外抑制經(jīng)脂多糖刺激的巨噬細(xì)胞中的TNFa表達(dá)。
在另一個(gè)方面中，提供了包含乳清蛋白水解產(chǎn)物的制劑，其中該制 劑能夠在體外抑制經(jīng)脂多糖刺激的巨噬細(xì)胞的TNFa表達(dá)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑是營(yíng)養(yǎng)保健品制劑。
在前述這些方面的一些具體實(shí)施方案中，所述水解產(chǎn)物是酶水解產(chǎn) 物。在一些具體實(shí)施方案中，所述酶為細(xì)菌或真菌來(lái)源，優(yōu)選為金屬蛋 白酶。在一些實(shí)施方案中，所述酶選自國(guó)際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)合 會(huì)(IUBMB)酶命名分類EC 3.4.24.28中的酶(包括Neutrase 、蛋白 酶N "Amano"和ColoraseN)以及IUBMB酶命名分類EC 3.4.21.62 中的酶(包括Alcalase 、枯草桿菌蛋白酶A ( VIII型)和Optimase)。
在又一方面中提供了包含乳清蛋白水解產(chǎn)物的制劑用于緩解由肌 肉損傷所致的肌肉功能下降和/或用于促進(jìn)肌肉損傷恢復(fù)和/或用于增強(qiáng) 肌肉生力能力的用途。
4在任一前述方面的某些實(shí)施方案中，所述制劑主要由乳清蛋白水解 產(chǎn)物組成。
另 一方面中提供了乳清蛋白水解產(chǎn)物在制備用于緩解由肌肉損傷 所致的肌肉功能下降和/或用于促進(jìn)肌肉損傷恢復(fù)的營(yíng)養(yǎng)保健藥物中的 用途，以及乳清蛋白水解產(chǎn)物在制備用于增強(qiáng)肌肉生力能力的營(yíng)養(yǎng)保健 藥物中的用途。
還提供了制備用于緩解由肌肉損傷所致的肌肉功能下降和/或用于 促進(jìn)肌肉損傷恢復(fù)和/或用于增強(qiáng)肌肉生力能力的制劑的方法，該方法 包括水解乳清蛋白以產(chǎn)生包含乳清蛋白水解產(chǎn)物的制劑。
附圖
簡(jiǎn)述
下文的實(shí)施例將參考以下附圖
圖l是顯示實(shí)施例4中所述實(shí)驗(yàn)的時(shí)間線的示意圖。該時(shí)間線顯示 了從每位受試者取出樣品并且相對(duì)于運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的肌肉損傷而對(duì)肌肉功 能進(jìn)行評(píng)估的時(shí)間。該時(shí)間線還顯示了向每位受試者施用補(bǔ)充劑的時(shí) 間。
圖2以圖形形式提供了實(shí)施例4中所述的肌肉峰值等長(zhǎng)力矩測(cè)試結(jié) 果。"A"代表安慰劑補(bǔ)充劑，"B"代表乳清蛋白分離物(Whey Protein Isolate, WPI)水解產(chǎn)物補(bǔ)充劑，"C"代表WPI補(bǔ)充劑，"D，，代表含 有酪蛋白的補(bǔ)充劑。該結(jié)果表明，與進(jìn)行任何其它治療的受試者相比， 施加水解WPI補(bǔ)充劑的受試者產(chǎn)生顯著更高的峰值等長(zhǎng)力，并且在向 受試者施加水解WPI補(bǔ)充劑24小時(shí)時(shí)產(chǎn)生了顯著高于基線值的峰值等 長(zhǎng)力。在基線(O小時(shí))、在100次最大離心收縮剛剛結(jié)束時(shí)以及其后1、 2、 6和24小時(shí)評(píng)估峰值等長(zhǎng)力矩。
4與基線(P-0.03)和所有其它治療(PO.001)存在顯著差異。
t與補(bǔ)充劑A和C的基線存在顯著差異(P<0.05 )。
圖3以圖形形式提供了實(shí)施例4中所述的肌肉峰值離心力矩測(cè)試結(jié) 果。"A"代表安慰劑補(bǔ)充劑，"B"代表WPI水解產(chǎn)物補(bǔ)充劑，"C"代 表WPI補(bǔ)充劑，"D"代表含有酪蛋白的補(bǔ)充劑。在基線(0小時(shí))、在
5100次最大離心收縮剛剛結(jié)束時(shí)以及其后1、 2、 6和24小時(shí)評(píng)估峰值離 心力矩。
A與基線存在顯著差異(PO.OOl)。
圖4以圖形形式提供了待測(cè)樣品在LPS刺激的巨噬細(xì)胞系中影響促 炎細(xì)胞因子TNFa表達(dá)之能力的體外測(cè)試結(jié)果。
圖5以圖形形式提供了待測(cè)樣品影響成纖維細(xì)胞增殖之能力的體外 測(cè)試結(jié)果。"FBS"代表胎牛血清。
圖6以圖形形式提供了樣品在LPS刺激的巨噬細(xì)胞系中影響促炎細(xì) 胞因子TNFa表達(dá)之能力的體外測(cè)試結(jié)果，其中A為1 mg/ml (重量/ 體積)，B為0.2 mg/ml (重量/體積)。
圖7以圖形形式提供了濃度為1、 2、 4和8 mg/ml (重量/體積)的 樣品在LPS刺激的巨噬細(xì)胞系中影響促炎細(xì)胞因子TNFa表達(dá)之能力 的體外測(cè)試結(jié)果。
發(fā)明詳述
本發(fā)明人已對(duì)多種乳級(jí)分的生物活性進(jìn)行了研究。
本發(fā)明人已通過TNFa表達(dá)抑制的體外測(cè)定鑒定到，乳清蛋白分離 物(WPI)具有抗炎活性，所述WPI是包含乳清蛋白并可從多種來(lái)源
獲得的乳級(jí)分。他們還鑒定出，WPI的特定水解產(chǎn)物出人意料地具有提 高的這種抗炎活性。與WPI相比，WPI的某些水解產(chǎn)物還具有提高的 體外刺激成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。
本發(fā)明人還鑒定出，施用WPI和WPI的某些酶水解產(chǎn)物能夠在進(jìn) 行損傷肌肉的運(yùn)動(dòng)之后的受試者中緩解肌肉損傷癥狀并促進(jìn)肌肉功能 恢復(fù)。這使得運(yùn)動(dòng)員可以在運(yùn)動(dòng)后更快地恢復(fù)比賽或訓(xùn)練。水解產(chǎn)物的 活性高于相應(yīng)未水解形式WPI所具有的活性。某些WPI水解產(chǎn)物還能 夠在進(jìn)行損傷肌肉的運(yùn)動(dòng)的受試者中增強(qiáng)肌肉生力能力。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述WPI包含水份 5.0%
脂肪 0.5%
pH(5。/o溶液) 6.3
灰份 3.7%
乳糖 0.5% 蛋白質(zhì)(TNx 6.38) 90.0%
磷 0.3 %
鉀 0.15 %
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，包含WPI或WPI水解產(chǎn)物的制劑不同 時(shí)包含谷氨酰胺。在另一實(shí)施方案中，該制劑不同時(shí)包含任何另外的支 鏈氨基酸(branched chain amino acid, BCAA)如異亮氨酸、亮氨酸和 纈氨酸。在另一實(shí)施方案中，該制劑不同時(shí)包含額外的游離或經(jīng)富集的 氨基酸(如肉堿、精氨酸、酪氨酸或組氨酸)來(lái)源。在另一實(shí)施方案中， 該制劑不同時(shí)包含額外的非乳清脂質(zhì)來(lái)源。在另一實(shí)施方案中，該制劑 不同時(shí)包含額外的非乳來(lái)源的蛋白質(zhì)來(lái)源，如大豆蛋白、水稻蛋白、豌 豆蛋白、角豆蛋白、燕麥蛋白、其水解產(chǎn)物和/或其混合物。在另一實(shí) 施方案中，該制劑不同時(shí)包含任何一種或多種額外的蛋白質(zhì)來(lái)源。
乳是復(fù)雜的分子混合物，其包含大量的多肽、脂質(zhì)和脂肪以及碳水 化合物。多肽組分盡管主要為酪蛋白，但也包括具有不同功能的許多其 它蛋白質(zhì)，如a-乳白蛋白、P-乳球蛋白、免疫球蛋白和酪蛋白糖巨肽 (caseinoglycomacropeptide， CGMP )。
本說明書的術(shù)語(yǔ)"乳級(jí)分，，是指最終來(lái)源于乳并且至少富集了全乳 中的一種或多種成分的制劑。在本說明書的上下文中，"乳級(jí)分"包含 乳中的非酪蛋白蛋白質(zhì)。乳清或"乳漿"是在"乳凝結(jié)"過程已從全乳 或脫脂乳去除大部分酪蛋白和乳脂組分之后保留的常見乳級(jí)分。
"乳級(jí)分"包括富集了乳中特定組分或組分組合的級(jí)分。例如，與 全乳相比，乳級(jí)分"乳清蛋白分離物(WPI)"中富集了乳中的非酪蛋白蛋白質(zhì)組分。
"乳清蛋白，，包括可見于乳清中并在水解時(shí)具有本文所述的所需生 物活性的一種或多種蛋白質(zhì)。不同來(lái)源的乳清蛋白均在考慮范圍內(nèi)。特 別地，源自甜乳清或酸化乳清的乳清蛋白均4皮證實(shí)具有相似的活性。例 如，存在大量用于生產(chǎn)乳清的方法，例如作為不同形式的乳酪生產(chǎn)過程 中產(chǎn)生的副產(chǎn)品或者作為酪蛋白制造過程中的副產(chǎn)品，每種上述方法都 產(chǎn)生具有某些差別的乳清制劑。
可見于乳清中的主要蛋白質(zhì)是a-乳白蛋白、p-乳球蛋白和酪蛋白糖 巨肽(CGMP)，后者形成乳酪乳清WPI中存在的約25%蛋白質(zhì)。包含 一種或多種這些蛋白質(zhì)的乳級(jí)分均考慮用作本文所述水解方法的原料， 然而不明確排除將不包含這些蛋白質(zhì)的級(jí)分作為可能的原料來(lái)源。
盡管本文提供的示例性方法使用WPI作為水解的起始原料，然而 應(yīng)當(dāng)理解，也包含乳清或WPI中存在的乳組分的其它乳級(jí)分或全乳也 可以代替WPI,而不顯著地改變終產(chǎn)物具有的所需生物特性。例如，全 乳或乳蛋白濃縮物會(huì)包含同樣的組分(包括可見于乳清中的蛋白質(zhì))， 盡管是更稀的形式?？梢娪谌榍逯械慕M分也可見于非乳清乳級(jí)分中，盡 管可能是更稀的形式。
去除或減少乳或乳蛋白濃縮物的特定組分可能證明是理想的，例如 用于提高生物活性組分的比活性。減少乳品的水、脂肪、乳糖和"灰份" (包含乳的礦物質(zhì)組分)含量的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，預(yù)期這些技術(shù)將 增強(qiáng)所需生物活性組分的比活性。
在某些實(shí)施方案中，減少乳蛋白級(jí)分中存在的酪蛋白含量可能證明 是理想的。酪蛋白(如果存在的話)有可能稀釋源自乳清的生物活性， 并且如果在水解期間存在酶失活步驟的話則可能形成凝乳。用于從乳品 中去除酪蛋白的技術(shù)(例如用酸進(jìn)行等電沉淀或使用酶(如粗制凝乳酶) 來(lái)進(jìn)行乳凝結(jié))是本領(lǐng)域公知的。
類似地，乳清蛋白可以利用不僅限于WPI制備的多種方法來(lái)濃縮， 如用于制備市售的乳清蛋白濃縮物(whey protein concentrate, WPC ) 的方法。盡管比例不同，但WPC也包含可見于WPI中的許多組分，因 此預(yù)期WPC也將具有WPI所顯示的活性。WPI的任何前體(包括生產(chǎn)WPI方法的中間產(chǎn)物)均可用作水解的起始材料，盡管所述前體的 比活性低于WPI的比活性，并且所得水解產(chǎn)物可能需要后續(xù)的純化步
在一些具體的實(shí)施方案中，用作水解起始材料的乳級(jí)分包含乳中存
在的酪蛋白糖巨肽組分、乳中存在的脈蛋白棟、a-乳白蛋白、P-乳球蛋 白、血清白蛋白和免疫球蛋白級(jí)分中的一種或多種。WPI中還有許多少 量存在和尚未明確鑒定或定量的其它蛋白質(zhì)。
包含一定比例的乳清中蛋白質(zhì)的其它乳級(jí)分也可能具有本文所述 的期望生物活性。通過使用實(shí)施例中所述的體外和體內(nèi)方法，本領(lǐng)域技 術(shù)人員能夠容易地測(cè)定任何特定乳級(jí)分在水解后是否具有期望的活性。
水解WPI中所顯示的生物活性能夠經(jīng)受WPI生產(chǎn)中所涉及的條件， 如陰離子交換、滲濾和噴霧干燥。
此外，水解WPI中所顯示的生物活性能夠經(jīng)受水解過程中特異性 酶消化和酶失活所涉及的條件。因此，任何或全部這些步驟也可以用于 制備乳級(jí)分，并且預(yù)計(jì)保留期望的生物活性。WPI中存在的生物活性還 能夠經(jīng)受巴氏消毒過程，因?yàn)閃PI中存在的物質(zhì)在WPI生產(chǎn)期間已作 為乳以及作為乳清進(jìn)行了巴氏消毒。
盡管本文中的實(shí)施例使用了來(lái)自牛乳的乳清蛋白，然而，由于家畜 的乳具有相對(duì)類似的組成，因此預(yù)計(jì)來(lái)自其它動(dòng)物(包括綿羊、山羊、 馬和水牛)的乳也將提供合適的起始材料來(lái)源。使用人源乳清蛋白也可 能具有優(yōu)勢(shì)，例如在施用于新生兒的制劑制備中有優(yōu)勢(shì)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)"水解"是指蛋白質(zhì)或多肽分解為更短的多肽、寡 肽以及在很小程度上可能為氨基酸組分。
可以通過化學(xué)方法(例如使用酸)或者通過酶處理來(lái)進(jìn)行水解。通 過化學(xué)處理進(jìn)行的水解(如酸水解)可以是生產(chǎn)水解產(chǎn)物的方法，只要 保留了期望的生物活性即可。
可以控制水解條件從而使所得水解產(chǎn)物與水解前的起始材料相比 在抑制TNFa表達(dá)(使用以下實(shí)施例中所述的體外方法)和/或提高肌肉 生力能力(使用以下實(shí)施例中所述的體內(nèi)方法)方面具有增強(qiáng)的活性。
9可能影響水解產(chǎn)物與起始材料相比的相對(duì)活性的條件包括孵育和
酶失活的溫度、反應(yīng)和失活的pH、水解的時(shí)長(zhǎng)和所使用酶的類型。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述水解為酶水解。優(yōu)選的酶是^t生物來(lái) 源(特別是細(xì)菌來(lái)源或真菌來(lái)源)的蛋白酶。金屬蛋白酶從底物特異性 以及通過控制必需金屬離子的可用性能夠使酶失活這兩方面來(lái)看都是 優(yōu)選的。
使用在接近中性pH (特別是pH5.3 8.5)下具有蛋白酶活性的蛋 白酶可能是有利的。
本說明書中示例的WPI水解是可見于商品化制劑"Neutrase " (Novozymes)中的蛋白酶活性來(lái)進(jìn)行的。該產(chǎn)品包含通過深層發(fā)酵選 定的解淀粉芽孢桿菌(丑fl"7/Ms fl y;/o//^^/iic/^fs)菌林產(chǎn)生的中性蛋白 酶組分。該蛋白酶是能夠以中度到充分程度將大多數(shù)蛋白質(zhì)分解為較小 肽的金屬(Zn)內(nèi)切蛋白酶。
預(yù)計(jì)能夠水解WPI或其它乳級(jí)分的其它蛋白酶也將獲得提高的本 發(fā)明人所鑒定之生物活性。
應(yīng)理解，來(lái)自IUBMB酶命名分類EC 3.4.24.28的金屬蛋白酶(也 叫作芽孢桿菌溶素(bacillolysin )、芽孢桿菌金屬內(nèi)切蛋白酶、枯草芽 孢桿菌中性蛋白酶、anilozyme P 10、芽孢桿菌金屬蛋白酶、芽孢桿菌 中性蛋白酶、巨大芽孢桿菌肽敏megateriopeptidase))具有與Neutrase 相似的蛋白水解活性，并且其中任意一種或多種均考慮用于水解中。例 如，同為該酶類別成員的細(xì)菌來(lái)源中性金屬蛋白酶"蛋白酶N 'Amano，" (Amano Enzyme, Inc.)和"Colorase N，， ( AB Enzymes )已由本發(fā)明 人證實(shí)會(huì)產(chǎn)生與使用Neutrase⑧相似的更高體外抗炎作用，因此，預(yù)計(jì) 使用這些酶產(chǎn)生的水解產(chǎn)物也具有提高的由Neutr386@所得水解產(chǎn)物表 現(xiàn)出的體內(nèi)生物活性。
類似地，來(lái)自IUBMB酶命名分類EC 3.4.21.62的酶(也叫作枯草 桿菌蛋白酶、Alcalase 、 alcalase 0.6L、 alcalase 2.5L、 colorase N、 ALK曙 酶、芽孢桿菌蛋白酶A、芽孢桿菌蛋白酶B、枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶 bioprase、 bioprase AL 15、 bioprase APL 30、津占菌素、枯草桿菌蛋白酶 J、枯草桿菌蛋白酶S41、仙臺(tái)枯草桿菌蛋白酶(subtilisinSendai)、枯草桿菌蛋白酶GX、枯草桿菌蛋白酶E、枯草桿菌蛋白酶BL、枯草桿菌 蛋白酶A( VIII型)、genenael、 esperase、 maxatase、 thermoase PC 10、 蛋白酶XXVII、 thermoase、 superase、枯草桿菌蛋白酶DY、枯草桿菌 肽酶、SP266、灑維奈斯(savinase ) 8.0L、灑維奈斯4.0T、 kazusase、 蛋白酶VIII、 optimase、 opticlean、枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶、protinA 3L、灑維奈斯、灑維奈斯16.0L、灑維奈斯32.0LEX、 orientase IOB、 蛋白酶S)和類似的絲氨酸內(nèi)切肽酶是可能適用于水解的候選酶。使用 來(lái)自該分類的Alcalase⑧已由本發(fā)明人證實(shí)會(huì)產(chǎn)生與使用 611汁&86@相似 的體外抗炎作用，因此，預(yù)計(jì)使用一種或多種該類的酶所產(chǎn)生的水解產(chǎn) 物也具有由Neutrase 所得水解產(chǎn)物表現(xiàn)出的體內(nèi)生物活性。
來(lái)自IUBMB酶命名分類EC 3.4.24.28或EC 3.4.21.62的特定酶是 否能夠產(chǎn)生提高的所需生物活性可以使用本文實(shí)施例3所述的體外方法 和/或?qū)嵤├?中所述的體內(nèi)方法容易地確定。
似乎并非乳清蛋白的所有酶水解形式均獲得本發(fā)明人鑒定的提高 的生物活性，因?yàn)樵谟靡让浮⒁让负虳ebitrase DBP20以及胰酶和 Colorase LAP水解WPI后在體外并不表現(xiàn)出所述提高的生物活性。因 此，在一個(gè)實(shí)施方案中，水解產(chǎn)物不通過胰酶消化而產(chǎn)生。在另一些實(shí) 施方案中，水解產(chǎn)物不通過以下4壬意一種或多種產(chǎn)生MultifectP3000、 S Amano 、 P Amano 6、 Savorase MFF、 Debitrase HWY20、 A Amano 2、 Flavourzyme 500L、 Protamex、 Colorase LAP、 Debitrase DBP20、 Bioprotease N100L、M Amano 、肽酶R、P Amano 6和Debitrase DBP20、 P Amano 6和Colorase LAP、 A Amano 2和Debitrase DBP20、 A Amano 2和Colorase LAP、 S Amano和Debitrase DBP20、 S Amano和Colorase LAP、 Multifect P3000和Debitrase DBP20或者M(jìn)ultifect P3000和 Colomsc LAP。
待使用的酶可能具有許多理想的特性。期望用于水解的蛋白酶在很 寬的濃度范圍內(nèi)無(wú)毒。優(yōu)選地，所述酶在被受試者攝取時(shí)是耐受的?？?能有利的是，該酶可以容易地通過不使水解產(chǎn)物中所存在的所需生物活 性失活的條件使其失活(例如通過輕微加熱)和/或可以容易地將其從 水解產(chǎn)物中分離，例如通過將酶固定于固體支持物上，或通過超濾來(lái)保 留酶，同時(shí)使水解產(chǎn)物的活性組分通過并進(jìn)行收集。若能夠以高比活性
ii向起始材料酶，則對(duì)于生產(chǎn)水解產(chǎn)物可能是有利的。如果酶不被物理?xiàng)l
件(例如乳或乳級(jí)分的pH和離子組成)或者可見于乳級(jí)分或全乳中的 組分失活，則可能是有利的。在一些具體的實(shí)施方案中，所述酶在接近 中性的pH下具有蛋白酶活性，在一些具體的實(shí)施方案中，最佳的酶活 性在pH 5.5 ~ 8.5范圍內(nèi)，更優(yōu)選在pH 6.3 ~ 8.0范圍內(nèi)。
酶水解乳清蛋白的方法以及控制這些反應(yīng)的技術(shù)詳細(xì)描述于例如 美國(guó)專利申請(qǐng)11/083, 662 (美國(guó)專利申請(qǐng)公布2005/0164340)中，其全 部?jī)?nèi)容通過交叉引用并入本文。起始材料的水解程度也可能有助于所產(chǎn) 生水解產(chǎn)物的活性。起始材料和水解材料的水解程度都可以通過OPA 法(Lee K S, Drescher D G" Fluorometric amino-acid analysis with o國(guó)phthaldialdehyde (OPA), Int. J. Biochem. 1978; 9 (7): 457-467 ))來(lái)確 定，該文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容通過交叉引用并入本文。
本文示例的水解條件相對(duì)溫和，因而預(yù)計(jì)起始材料的完全水解不是 提高生物活性所必需的。因此，術(shù)語(yǔ)"水解"意在包括乳清蛋白的至少 部分水解。水解程度為約0.5%至約20%的乳清蛋白水解產(chǎn)物包含少于 約5%的游離氨基酸、約15Q/。至約55。/。的分子量小于1000 Da的肽、約 20%至約55%的分子量為1000 Da至5000 Da的肽以及約15%至約35 。/。的分子量大于5000 Da的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，凈水解程度(％ ) 為0.5 %至10 % ，更優(yōu)選為0.5 %至4 % 。
術(shù)語(yǔ)"水解產(chǎn)物"是指水解產(chǎn)生的完整蛋白質(zhì)或多肽、較短的多肽 以及寡肽和氨基酸組分的混合物。
眾所周知，離心運(yùn)動(dòng)可誘發(fā)肌肉損傷和炎癥。這種肌肉損傷可以通 過比較受傷肌肉與受傷前肌肉的生力能力(力矩)而容易地進(jìn)行鑒定。 使用以下實(shí)施例中所述的方法，肌肉力矩通常在受傷后多達(dá)7天內(nèi)不能 恢復(fù)至受傷前的水平。本發(fā)明人已證實(shí)，口服施用乳清蛋白產(chǎn)生的水解 產(chǎn)物顯著緩解了在重復(fù)性最大用力導(dǎo)致的肌肉損傷后的肌肉力矩喪失， 使之明顯更快地恢復(fù)至正常峰值等長(zhǎng)力矩水平，在本文實(shí)施例中為在肌 肉損傷后24小時(shí)內(nèi)。此外，所施用的水解產(chǎn)物提高了肌肉組織的生力 能力，使之在運(yùn)動(dòng)后24小時(shí)內(nèi)超過受傷前的基線水平。在施用安慰劑 或未水解WPI的受試者中不顯示這種肌肉力矩的提高。由于多種致?lián)p刺激可以誘發(fā)肌肉功能喪失，因此還考慮所述水解產(chǎn) 物也可以緩解由各種肌肉損傷來(lái)源(如瘀傷和/或外傷)所導(dǎo)致的肌肉 生力能力的喪失。
這種活性可能與WPI以及WPI水解產(chǎn)物(更大程度上)能夠在體 外下調(diào)TNFa產(chǎn)生有關(guān)，如下述在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物中所證實(shí)。基于本發(fā) 明人先前針對(duì)乳級(jí)分的研究，體外結(jié)果可能預(yù)示著水解產(chǎn)物在下調(diào)運(yùn)動(dòng) 損傷后在肌肉中產(chǎn)生的一種或多種炎癥標(biāo)記物方面的活性。因此，預(yù)計(jì) WPI和WPI水解產(chǎn)物可具有緩解肌肉損傷所導(dǎo)致炎癥(如上調(diào)受損肌 肉組織中jun-B和c-fos基因表達(dá))的活性。
此外，在巨噬細(xì)胞中對(duì)TNFa基因表達(dá)進(jìn)行體外測(cè)定可方便地用于 監(jiān)測(cè)水解產(chǎn)物的產(chǎn)生，以使其生物活性最大化。
因此，本文使用的術(shù)語(yǔ)"期望的生物活性，，是指以下任何一種或多 種減弱受試者肌肉損傷后肌肉生力能力的喪失，提高肌肉生力能力超 過基線水平，在本文所述的體外測(cè)定中下調(diào)巨噬細(xì)胞中TNFa的表達(dá)， 以及減少肌肉損傷(如運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的肌肉損傷)后肌肉中炎癥標(biāo)記物的表 達(dá)。減弱肌肉生力能力的喪失可包括降低損傷后表現(xiàn)出的力矩喪失和/ 或加快力矩恢復(fù)至受損前水平。
不希望受任何所提出機(jī)理的限制，初步體外結(jié)果提示，WPI和WPI 水解產(chǎn)物(如使用Nertrase 或入^^1&86@產(chǎn)生的水解產(chǎn)物)可刺激成纖 維細(xì)胞的生長(zhǎng)，這提示該水解產(chǎn)物可以刺激肌肉生長(zhǎng)或修復(fù)，并提示該 水解產(chǎn)物可具有超出未水解WPI的肌肉修復(fù)或建立應(yīng)用。
已證實(shí)，當(dāng)在誘導(dǎo)肌肉損傷的運(yùn)動(dòng)后立即施用于受試者時(shí)，水解產(chǎn) 物有效緩解肌肉功能喪失并提高肌肉生力能力。峰值等長(zhǎng)力矩和離心力 矩結(jié)果也提示，在運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的肌肉損傷后6小時(shí)和22小時(shí)再次施用水 解產(chǎn)物可以使肌肉損傷后肌肉生力能力的提高維持至少24小時(shí)。因此， 可以預(yù)計(jì)，所述水解產(chǎn)物不僅如本文所述可以在運(yùn)動(dòng)后施用或者在運(yùn)動(dòng) 后超過24小時(shí)施用，它們也可能額外地或可替代地在運(yùn)動(dòng)前施用。因 此，所述水解產(chǎn)物可進(jìn)行預(yù)防性(例如在預(yù)計(jì)劇烈運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致肌肉損傷 的情形中)或治療性(在運(yùn)動(dòng)后施用以減弱損傷產(chǎn)生的肌肉應(yīng)答)使用。
本發(fā)明人證實(shí)，與未水解WPI不同，口服施用水解產(chǎn)物能夠在運(yùn)
13動(dòng)后24小時(shí)誘導(dǎo)肌肉生力能力提高超過基線(受傷前)水平。因此， 所述水解產(chǎn)物可以采用定期或間歇方式長(zhǎng)期施用，優(yōu)選地配合有規(guī)律的 或間歇的運(yùn)動(dòng)，從而刺激肌肉生力能力提高。還考慮將這樣的用途用于 希望加強(qiáng)肌肉力量的受試者中或者易感于肌肉萎縮或有這種風(fēng)險(xiǎn)的受 試者(如老年人或體弱者)。
由于乳清蛋白和水解產(chǎn)物來(lái)源于已充分表征的乳品(例如已知適宜 作為膳食補(bǔ)充劑的乳清)，因此將它們作為營(yíng)養(yǎng)保健品制劑來(lái)施用可能 是有利的。本發(fā)明人已證實(shí)，當(dāng)與甜味劑混合并以液體形式施用于受試 者時(shí)，WPI水解產(chǎn)物形式的乳清蛋白水解產(chǎn)物可良好耐受并且口味宜 人。
預(yù)計(jì)所述水解產(chǎn)物可作為營(yíng)養(yǎng)保健品制劑來(lái)施用。本文定義的"營(yíng) 養(yǎng)保健品"代表分離或純化自食品(在本文的情形中來(lái)自乳)的可食用 產(chǎn)品，該產(chǎn)品已證實(shí)在口服時(shí)具有生理益處或者提供對(duì)急性或慢性疾病 或損傷的保護(hù)或使其緩解。因此，營(yíng)養(yǎng)保健品可以以膳食補(bǔ)充劑的形式 提供，單獨(dú)或與可食用食品或飲料混合均可。
所述營(yíng)養(yǎng)保健品制劑可以采用任何適當(dāng)?shù)男问?。例如，該營(yíng)養(yǎng)保健 品制劑可以采用可溶粉劑、液體或即飲制劑的形式?；蛘?，所述營(yíng)養(yǎng)保 健品制劑可以釆用固體形式，例如釆用即食棒或早餐麥片的形式。還可 以存在各種調(diào)味劑、纖維(fibre )、甜味劑和其它添加劑。
所述制劑可以經(jīng)由鼻飼管、空腸管喂給患者，或者由患者飲用或食用。
所述營(yíng)養(yǎng)保健品制劑可以常規(guī)方式生產(chǎn)，例如，該制劑可通過將乳 清蛋白或水解產(chǎn)物及其它添加劑混合在一起而進(jìn)行制備。如果使用乳化 劑的話，可將其包含在混合物中。此時(shí)可添加額外的維生素和礦物質(zhì)， 但通常在稍后添加以避免熱降解。
如果期望生產(chǎn)粉末狀的營(yíng)養(yǎng)保健品制劑，則可以將乳清蛋白或水解 產(chǎn)物與粉末狀形式的其他組分進(jìn)行混合。所述粉劑的含水量應(yīng)當(dāng)?shù)陀诩s 5% (以重量計(jì))。然后，可以將水(優(yōu)選已進(jìn)行反滲透的水)混入以形 成液體混合物。如果所述營(yíng)養(yǎng)保健品制劑以即飲液體的形式提供，則可以對(duì)其加熱 以降低細(xì)菌荷載。如果期望生產(chǎn)液體營(yíng)養(yǎng)保健品制劑，則優(yōu)選將該液體 混合物無(wú)菌灌入合適的容器中?？墒褂帽绢I(lǐng)域常見的可用技術(shù)進(jìn)行容器 的無(wú)菌灌裝。用于進(jìn)行無(wú)菌灌裝的適當(dāng)設(shè)備是市售的。
應(yīng)該理解，所施用的乳清蛋白或水解產(chǎn)物的最佳劑量取決于受試者 和所期望的應(yīng)用。預(yù)計(jì)以足以遞送至少以下量水解產(chǎn)物的量對(duì)受試者施
用制劑每千克體重每天50 1500 mg的水解產(chǎn)物蛋白質(zhì)；在一些實(shí)施 方案中為每千克體重每天50 ~ 1100 mg的水解產(chǎn)物蛋白質(zhì)；在一些具體 的實(shí)施方案中為每千克體重每天50~600 mg的水解產(chǎn)物蛋白質(zhì)。所述 制劑可以在一天內(nèi)多次給藥以將上述劑量遞送至受試者。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述劑量提供50 ~ 1500 mg/kg WPI或 水解產(chǎn)物。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，對(duì)于平均70kg的個(gè)體來(lái)說，向 成年男性提供每千克體重每天大約50、 350、 570、 1100或1500 mg水 解產(chǎn)物蛋白質(zhì)的劑量，優(yōu)選以日劑量給藥。這樣的劑量可以通過4、 25、 40、 75或100g的WPI或水解產(chǎn)物粉劑來(lái)提供。
所述制劑可以單次劑量或以2-3次分次劑量來(lái)施用。在一個(gè)優(yōu)選的 實(shí)施方案中，所述制劑在運(yùn)動(dòng)后隨即施用或者在運(yùn)動(dòng)20分鐘至2小時(shí) 內(nèi)施用。
應(yīng)當(dāng)清楚地理解，盡管本文提供的范例限于向人受試者施用營(yíng)養(yǎng)保 健品，但是也可以將相同或相似的制劑施用給需要類似的有益生理反應(yīng) 的非人哺乳動(dòng)物。例如，明顯很理想的是使針對(duì)肌肉損傷的不良反應(yīng)最
小并提高需要速度或最佳肌肉力量的哺乳動(dòng)物(例如賽馬或靈緹犬)的 肌肉生力能力，或者優(yōu)化產(chǎn)肉牲畜(如牛、豬和綿羊)中的肌肉量。
在本說明書中，除非上下文需要或者由于表達(dá)習(xí)慣或必要暗示，措 辭"包含"或變換形式如"包括"或"含有"以開放式含義使用，即說 明存在所述特征但不排除在本發(fā)明的各實(shí)施方案中存在或增加另外的 特征。
除非由于明確的表述或必要的暗示而在上下文需要并不如此，否則 本說明書中使用的術(shù)語(yǔ)"基本由……組成"意指可以加入另外的組分， 但是這些另外的組分不會(huì)實(shí)質(zhì)性影響所指特征的基本和新特性。不會(huì)實(shí)質(zhì)性影響WPI或WPI水解產(chǎn)物的基本及新特性的另外組分的實(shí)例包
括但不僅限于調(diào)味劑、甜味劑、防腐劑、溶劑和稀釋劑。
除非上下文明顯指明另外的情形，否則本說明書中使用的無(wú)量詞修 飾的名詞均無(wú)數(shù)量限制。因此，例如，"乳清蛋白，，包括一種或多種乳
清蛋白。
本發(fā)明將通過以下非限制性實(shí)施例進(jìn)行描述。 實(shí)施例1.制備乳清蛋白分離物
WPI工藝的目的是通過去除其它乳清組分如水、乳糖、脂肪和灰 份(其包含乳中的礦物質(zhì)組分如磷、鈉、鉀、鉤、鎂及其它金屬)來(lái)富 集乳清蛋白，直至剩余物質(zhì)中包含超過卯％的乳清蛋白(基于樣品)。 商業(yè)上常用的WPI生產(chǎn)工藝包括陰離子交換層析分離、超濾(UF)和 噴霧干燥等步驟。
WPI工藝基于陰離子交換層析原理進(jìn)行，其中使用使粘性材料具有 高流速的大直徑樹脂。起始材料可以是凝乳產(chǎn)生的甜乳清或者通過添加 酸來(lái)去除酪蛋白而得到的酸化乳清。預(yù)計(jì)由其它方法(如超濾、微孔過 濾或乙醇沉淀)獲得的乳清也是合適的。用于生產(chǎn)WPI的優(yōu)選起始材 料是WPC35 (35°/。(蛋白質(zhì)重量/固體重量)的乳清蛋白濃縮物)，它 是通過對(duì)粗制乳清進(jìn)行超濾以去除灰份和乳糖而得到的 一般產(chǎn)物。該工 藝為乳品業(yè)技術(shù)人員所熟知。使用脫脂乳代替乳清也得到非常相似的產(chǎn) 物。
將起始材料引入陰離子交換柱(GibcoCel CR201)上，以使樹脂載 荷主要帶負(fù)電(在乳清pH值6.5下)的乳清組分。用水洗滌該柱以去 除未結(jié)合的材料，對(duì)結(jié)合的乳清組分進(jìn)行洗脫并用包含0.75 M氯化鈉 和0.75 M氯化鉀的混合物使柱再生，之后洗滌該柱以去除殘余的氯。
通過以低溫、低分子量、螺旋巻式超濾膜(spiral ultrafiltration membrane)進(jìn)行滲濾而使從CSEP洗脫的乳清組分脫鹽和濃縮。該步 驟保留了蛋白質(zhì)，去除了鹽、灰份組分和乳糖。通過這一步驟，總固體 從4%升至25%，蛋白質(zhì)濃度從總固體的50 0/。升至超過總固體的90%。
干燥器的目的是去除產(chǎn)物中大部分殘余水，直至最多殘余5%的水。
16干燥器通過將WPI濃縮物在充滿熱氣的室中進(jìn)行霧化來(lái)工作。由于所 得的WPI粉劑隨后在其準(zhǔn)備用于水解時(shí)在水中重建，因此從本方法中
刪除干燥步驟是可能的。
本發(fā)明人已對(duì)從干酪乳清以及酸化乳清獲得的WPI水解產(chǎn)物進(jìn)行 了研究。二者對(duì)酶消化均具有相似的生物活性，所以預(yù)計(jì)WPI的類型 不會(huì)實(shí)質(zhì)性改變WPI水解產(chǎn)物所產(chǎn)生的生物活性。
使用來(lái)自甜乳清和酸化乳清中每一種的WPI來(lái)制備體外測(cè)試的水 解產(chǎn)物，然而只有甜乳清WPI水解產(chǎn)物用于體內(nèi)測(cè)試。產(chǎn)自甜乳清WPI 和酸化乳清WPI的水解產(chǎn)物在體外測(cè)定中被證實(shí)幾乎沒有差別，因此 預(yù)計(jì)甜乳清WPI水解產(chǎn)物的體內(nèi)結(jié)果可擴(kuò)展至酸化乳清水解產(chǎn)物。
實(shí)施例2.WPI水解
該實(shí)施例中使用的蛋白酶溶液是市售產(chǎn)品"Neutrase " (Novozymes )。
水解反應(yīng)的目標(biāo)pH值為pH 6.5。水解過程中的pH變化是有限的， 所以實(shí)踐中在pH 6.6時(shí)開始水解并且在反應(yīng)期間不再調(diào)整pH。最終pH 約為6.4。
將根據(jù)實(shí)施例1制備的三千克WPI在27L水中重建，得到30L 10 % (重量/體積)的固體溶液。在加熱至50"C前，用4MNaOH將pH調(diào) 至6.6。
一旦開始加熱，即持續(xù)攪拌該溶液。
將4.5g Neutrase 1.5MG ( Novozyme )溶解在45 ml水中，制備10 %溶液，然后將其加至WPI溶液中。持續(xù)監(jiān)測(cè)pH，只要pH低于6.4 即進(jìn)行調(diào)整?？梢酝ㄟ^pH的降低來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)水解過程。之后可以通過 使用基于鄰苯二甲醛法(例如Lee等，1978;如上)測(cè)量"水解程度" 來(lái)測(cè)定發(fā)生水解的實(shí)際量。在上述條件下發(fā)生水解的實(shí)際量不是非常 高，所觀察到的凈水解程度(％ )為0.3-3.0。
水解60分鐘后，用4MHCl將溶液調(diào)整至pH4.0，在50'C維持30 分鐘以使Neutrase 失活。將所得水解產(chǎn)物冷卻至25°C,將pH再調(diào)整至》pH6.5，理想情況下調(diào)至pH7.0。
然后對(duì)該水解產(chǎn)物進(jìn)行干燥，優(yōu)選地通過在35""C冷凍干燥來(lái)實(shí)現(xiàn)。
使用其它蛋白酶來(lái)生產(chǎn)WPI或包含乳清蛋白的其它乳級(jí)分的水解 產(chǎn)物，使用實(shí)施例3所述的體外方法對(duì)其抑制巨噬細(xì)胞中TNFa表達(dá)或 者刺激成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的活性進(jìn)行篩選。還使用下述方法對(duì)這些水解產(chǎn) 物在受試者中緩解肌肉損傷癥狀以及提高肌肉收縮力方面的活性進(jìn)行 篩選。
實(shí)施例3.在體外調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中的TNFa表達(dá)以及刺激成纖維細(xì)胞分 裂。
TNFa釋放
將RAW264.7巨噬細(xì)胞以2 x 104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中 含有10 %熱滅活胎牛血清(FBS )的DMEM培養(yǎng)基中。然后在37。C培 養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)。到達(dá)最佳細(xì)胞密度后，去除含有血清的培養(yǎng)基，在載 體對(duì)照(0.9。/。鹽7JC)或測(cè)試乳樣品(2mg/ml)存在下，用50ng/ml細(xì) 菌脂多糖(大腸桿菌055:B5)在無(wú)血清條件以37。C刺激細(xì)胞6小時(shí)。 所有樣品均含有甜味劑和調(diào)味劑；安慰劑樣品不包含其它化合物；WPI 樣品含有根據(jù)實(shí)施例1所述方法獲得的WPI;水解WPI樣品取自根據(jù) 實(shí)施例2所述方法生產(chǎn)的兩個(gè)不同的Neutrase 水解批次；酪蛋白樣品 含有市售的酪蛋白(酸性酪蛋白，Murray Goulburn Co-Operative )。
在6小時(shí)刺激期后，使用高度特異性的TNFa夾心ELISA來(lái)測(cè)量存 在于細(xì)胞條件化培養(yǎng)基中的TNFa水平，將數(shù)據(jù)表示為TNFa釋放抑制 百分比(相對(duì)于只用載體進(jìn)行預(yù)處理的細(xì)胞)。通過Alamar Blue染色 來(lái)評(píng)估細(xì)胞生存力。
成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)
將BalbC3T3成纖維細(xì)胞以0.8 x 104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔 板中含有10。/。胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中，并37。C培養(yǎng)過夜。 在過夜培養(yǎng)后，去除含有血清的培養(yǎng)基，在含有載體對(duì)照(0.9%鹽水) 或測(cè)試樣品(2mg/ml)的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中刺激細(xì)胞。所有測(cè)試 樣品均含有甜味劑和調(diào)味劑；安慰劑樣品不包含其它化合物；WPI樣品含有根據(jù)實(shí)施例i的方法獲得的WPI;水解WPI樣品取自根據(jù)實(shí)施例
2所述方法生產(chǎn)的兩個(gè)不同的 611仕386@水解批次。
將細(xì)胞再培養(yǎng)48小時(shí)，之后吸出培養(yǎng)基，通過Alamar Blue染色對(duì) 細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)行定量。數(shù)據(jù)表示為(高于用載體對(duì)照處理的細(xì)胞的)生長(zhǎng) 百分比。
這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖4和圖5中。
在所有測(cè)試樣品中，經(jīng) 611汁&86@水解的WPI在抑制LPS刺激的巨 噬細(xì)胞中TNFa表達(dá)以及刺激成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)方面均具有最高的活性。
實(shí)施例4.調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)i秀發(fā)的肌肉損傷。
下述研究使用了以安慰劑作對(duì)照的隨機(jī)雙盲平行設(shè)計(jì)。在通過進(jìn)行 最大離心運(yùn)動(dòng)誘發(fā)肌肉損傷之前、誘發(fā)肌肉損傷剛剛結(jié)束后以及其后1 、 2、 6和24小時(shí)對(duì)右腿四頭肌的強(qiáng)度、力量和局部肌肉耐力以及肌肉疼 痛和炎癥血液標(biāo)記物進(jìn)行評(píng)估。
在誘發(fā)肌肉損傷后，立即隨機(jī)指派受試者服用250 ml經(jīng)調(diào)味和加 糖的水(對(duì)照)或250 ml含有25 g經(jīng)Neutrase⑧處理的WPI (根據(jù)實(shí) 施例2制備)、25 g WPI (根據(jù)實(shí)施例1制備)或25 g酪蛋白(酸性酪 蛋白，Murray Goulburn Co-operative Ltd)的經(jīng)調(diào)p未和加糖的水。在 誘發(fā)肌肉損傷后立即進(jìn)行的評(píng)估肌肉功能和炎癥剛剛結(jié)束時(shí)服用這些 測(cè)試樣品，并在第6小時(shí)及之后在第22小時(shí)的評(píng)估后(即在最終評(píng)估 前2小時(shí))再次服用。
使用飲食日志來(lái)評(píng)估在測(cè)試前24小時(shí)中和介入期24小時(shí)中的食 物攝入。圖l標(biāo)明了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。排除滿足以下條件的受試者
為了改善或保持身體健康而有規(guī)律地參加體育鍛煉(每周超過一 次)。
在預(yù)計(jì)參與本研究之前的3個(gè)月中進(jìn)行過四頭肌抗阻力訓(xùn)練。
有膝、四頭肌或者其它肌骨骼或身體方面的問題，這些問題可能已 影響到其進(jìn)行所需運(yùn)動(dòng)的能力并誘發(fā)肌肉疼痛。
19 在預(yù)計(jì)參與本研究之前的3個(gè)月中，其四頭肌有過明顯的遲發(fā)性肌 肉酸痛(delayed onset muscle soreness, DOMS )。
先前對(duì)乳蛋白有任何變應(yīng)性或敏感性反應(yīng)。
告知受試者在本研究之前至少7天不要進(jìn)行"感冒和流感"治療， 不要服用非處方藥、止痛劑、阿司匹林或其它抗炎制劑，并且在本研究 前48小時(shí)或研究期間戒酒。
通過利用Kin-Com等速測(cè)力儀(Chattecx， TN, USA)對(duì)右腿四 頭肌進(jìn)行100次最大主動(dòng)離心等速收縮，以誘發(fā)肌肉損傷。為了誘發(fā) DOMS,每位受試者在低抗阻力下進(jìn)行10次熱身重復(fù)動(dòng)作，然后對(duì)膝 伸肌進(jìn)行100次最大主動(dòng)離心肌肉收縮(以40。/秒的角速度跨越80°的 運(yùn)動(dòng)范圍)。受試者在每次離心收縮開始前相對(duì)于測(cè)力儀桿臂的最大等 長(zhǎng)收縮約1秒，并且用持續(xù)的最大努力來(lái)抵抗被迫伸長(zhǎng)的膝伸肌。在離 心收縮結(jié)束時(shí)放松膝伸肌，并且在恢復(fù)期期間，實(shí)驗(yàn)者將放松的腿放回 到起始位置。身體位置、膝關(guān)節(jié)旋轉(zhuǎn)的近似軸以及測(cè)力儀桿臂的長(zhǎng)度對(duì) 于每位受試者來(lái)說是一致的，并在所有收縮期間給與口頭鼓勵(lì)。
在即將誘發(fā)肌肉損傷之前、運(yùn)動(dòng)剛剛完成之后以及運(yùn)動(dòng)后1、 2、 6和24小時(shí)，l吏用已公開的技術(shù)(Huskinsson， E., Visual analogue scales, in Pain measurement and assessment, R. Melzack, Editor. 1983, Raven Press: New York. p. 33-37 )以100 mm視覺類比評(píng)分法(visual analogue scale, VAS)來(lái)評(píng)估肌肉疼痛程度。
VAS由100 mm末端封閉的水平線組成，定位點(diǎn)由左側(cè)的"無(wú)疼 痛"和右側(cè)的"最大可能疼痛"組成。受試者坐下并被要求伸膝(因此 腿是水平的)，使用從其踝部懸垂的5 kg重物來(lái)評(píng)估疼痛。受試者在VAS 上對(duì)應(yīng)于他們感覺該腿四頭肌疼痛的點(diǎn)放置標(biāo)記物。肌肉疼痛程度定量 表示為從線段(continuum )左端至受試者所做標(biāo)記之間的測(cè)量距離(以 亳米為單位)。
所得到的VAS數(shù)據(jù)表明，在離心收縮后所有組中的肌肉疼痛均增 加，并且在整個(gè)研究期間保持升高，各組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。
使用等速測(cè)力儀(Kin-Com 125AP, Chattecx Corporation,
20Tennessee, USA)來(lái)評(píng)估右腿四頭肌的肌肉強(qiáng)度、離心及向心肌肉力量 以及肌肉耐力。根據(jù)膝彎曲卯。時(shí)3次最大等長(zhǎng)收縮獲得的峰值力矩來(lái) 測(cè)定等長(zhǎng)肌肉強(qiáng)度。根據(jù)在膝伸肌3次最大離心肌肉收縮(以40。/秒的 角速度跨越80°的運(yùn)動(dòng)范圍)期間獲得的峰值力矩來(lái)測(cè)定離心肌肉力矩。 根據(jù)15次連續(xù)最大等速膝伸展運(yùn)動(dòng)(以40。/秒的角速度跨越80°的運(yùn)動(dòng) 范圍)來(lái)評(píng)估向心肌肉力量和肌肉耐力。
評(píng)估了作為對(duì)運(yùn)動(dòng)的反應(yīng)而產(chǎn)生的肌肉損傷和炎癥應(yīng)答。在基線、 剛剛完成100次離心肌肉收縮之后以及運(yùn)動(dòng)后1、 2、 6和24小時(shí)收集 血液樣品，用于評(píng)估血清肌酸激酶活性和炎癥標(biāo)記物。將運(yùn)動(dòng)前和運(yùn)動(dòng) 后的血液樣品置于血清管(用于肌酸激酶測(cè)定)或EDTA管(用于測(cè)定 炎癥標(biāo)記物)中。然后，將樣品在離心機(jī)中離心，并將血清和血漿儲(chǔ)存 于-80。C直至分析。
在進(jìn)行離心運(yùn)動(dòng)后24至48小時(shí)顯示肌酸激酶活性提高，這通常 用作離心運(yùn)動(dòng)后的肌肉損傷標(biāo)記物。
對(duì)作為對(duì)離心運(yùn)動(dòng)的響應(yīng)而提高的多種促炎細(xì)胞因子血漿濃度進(jìn) 行測(cè)量。腫瘤壞死因子a(TNFa)在運(yùn)動(dòng)結(jié)束時(shí)顯示到達(dá)峰值，白介素 (IL ) -ip (IL-ip )和1L-6在運(yùn)動(dòng)后多達(dá)24小時(shí)仍提高。
使用商業(yè)試劑盒針對(duì)這些細(xì)胞因子中的每一種來(lái)分析血液樣品。
在雙盲研究中，將受試者隨機(jī)分配至上述4組中的任一組。在整 個(gè)研究中，每一組服用同樣的測(cè)試樣品。以包含補(bǔ)充劑和甜味劑的預(yù)稱 重小袋提供補(bǔ)充劑，在服用前加水并充分混合。將補(bǔ)充劑小袋標(biāo)記為A、 B、 C和D，研究人員在研究和后續(xù)的結(jié)果分析期間對(duì)該編碼不知情。 補(bǔ)充劑A是安慰劑，B是WPI水解產(chǎn)物補(bǔ)充劑，C是WPI補(bǔ)充劑，D 是含酪蛋白的補(bǔ)充劑。
在使用離心運(yùn)動(dòng)誘發(fā)肌肉損傷之后進(jìn)行的肌肉功能測(cè)試和血液取 樣剛剛結(jié)束之后服用所述測(cè)試樣品，然后在6小時(shí)再次服用，在22小 時(shí)(即在最終評(píng)估前2小時(shí))再次服用。
將在測(cè)試前24小時(shí)中以及在介入期24小時(shí)中的所吃的食物記錄 在飲食日志中，用于隨后使用Foodworks ( Xyris software, Brisbane )和澳大利亞營(yíng)養(yǎng)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)(Australian Nutrient database, NUTTAB ) 進(jìn)行的分析。
<吏用單因素方差分才斤(one-way analysis of variance, ANOVA)對(duì) 4個(gè)補(bǔ)充劑組的基線參數(shù)進(jìn)行比較。不同治療對(duì)峰值等長(zhǎng)力矩和峰值離 心力矩隨時(shí)間的影響4吏用重復(fù)測(cè)量ANOVA (repeated measures ANOVA)進(jìn)行比較。當(dāng)ANOVA顯示顯著的主效果時(shí)，完成事后分析 以使用最小顯著性差異確定測(cè)試方法間的差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性設(shè)置為P 〈0.05的a-水平。所有數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(SEM)。
結(jié)果-峰值等長(zhǎng)力矩
圖2顯示峰值等長(zhǎng)力矩的結(jié)果。在基線水平上，各組之間的峰值 等長(zhǎng)力矩沒有差異。ANOVA表明，測(cè)量時(shí)間(P<0.001)以及處理與 時(shí)間的相互作用(P<0.01)具有顯著效果，但處理沒有顯著效果(P-0.06)。事后分析表明，這種相互作用是由服用WPI水解產(chǎn)物測(cè)試樣品 的受試者中力矩顯著提高所致，這^f吏得力矩在24小時(shí)內(nèi)顯著高于基線 (P = 0.03 )，服用酪蛋白測(cè)試樣品的受試者中力矩沒有變化(P > 0.12 )， 服用安慰劑和WPI測(cè)試樣品的受試者中力矩顯著減小(P<0.05)。然 而，盡管服用酪蛋白測(cè)試樣品的受試者中力矩沒有顯著減小，但是這一 反應(yīng)與服用安慰劑或WPI的受試者中的反應(yīng)沒有顯著差異。服用WPI 水解產(chǎn)物的受試者中力矩的提高(24小時(shí)之內(nèi))表示為從基線提高14.4 ± 8.9 % ，這與以下形成對(duì)比服用酪蛋白測(cè)試樣品的受試者減小4.3 ± 7.6 % (并非顯著減小)，服用安慰劑和WPI的受試者中分別減小31.0 ±3.0 %和21.3 ±8.8%。
結(jié)果-峰值離心力矩
圖3顯示峰值離心力矩的結(jié)果。在基線水平上，各組之間的峰值 離心力矩沒有差異。ANOVA表明沒有顯著的處理效果(P = 0.26)或相 互作用(P-0.79)效果，但是由于在所有治療組中力矩在剛剛運(yùn)動(dòng)后 整體減小而存在顯著的時(shí)間效應(yīng)，并且在24小時(shí)的研究期間力矩保持 低于基線水平(P< 0.001)。
服用WPI水解產(chǎn)物測(cè)試樣品的受試者中的受試者間峰值離心力 矩變異大約是其它組的兩倍，因此為了減小這種變異，將數(shù)據(jù)表示為相對(duì)于基線的峰值離心力變化百分比。使用這種分析，ANOVA表明沒有 顯著的相互作用效應(yīng)(治療x時(shí)間，p = 0.97)，但是存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的 時(shí)間效應(yīng)(P-O.OOl)，這是由于在完成100次四頭肌最大離心收縮(P 〈0.001)后第一小時(shí)力矩降低，然后在24小時(shí)研究期間保持被抑制。 然而，重要的是，由于服用WPI水解產(chǎn)物的受試者中的力矩減少較少， 因此存在力矩百分?jǐn)?shù)減少(P-0.17)的治療效果趨勢(shì)。
該數(shù)據(jù)分析表明，與其它3種測(cè)試樣品相比，WPI水解產(chǎn)物不僅 對(duì)重復(fù)進(jìn)行最大離心肌肉收縮之后發(fā)生的峰值等長(zhǎng)力矩及離心力矩減 小提供保護(hù)，而且顯著提高四頭肌的等長(zhǎng)力生成能力。
所有組中的肌肉疼痛均有所增加，并且各組間的肌肉疼痛沒有統(tǒng) 計(jì)學(xué)差異。盡管目前尚未獲得肌肉損傷及炎癥標(biāo)記物的數(shù)據(jù)，然而認(rèn)為 離心運(yùn)動(dòng)誘發(fā)肌肉損傷和炎癥，導(dǎo)致肌肉組織的生力能力喪失。服用水 解WPI的受試者中生力能力喪失的緩解以及峰值等長(zhǎng)力超過基線 14 %的提高表明，該測(cè)試樣品不僅減小了任何針對(duì)肌肉收縮功能的損傷影 響，而且改善了肌肉組織的生力能力。
盡管這些受試者中提高生力能力的確切機(jī)制尚不清楚，但是已知 肌肉生力的能力通過調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)單元募集的神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)制和收縮蛋白含 量來(lái)介導(dǎo)。來(lái)自先前研究的數(shù)據(jù)可能提示，本研究中觀察到的肌肉功能 改善更可能是通過收縮蛋白含量提高以及炎癥降低來(lái)介導(dǎo)，而不是通過 任何神經(jīng)效應(yīng)來(lái)介導(dǎo)。
實(shí)施例5.調(diào)節(jié)肌肉炎癥標(biāo)記物的表達(dá)。
受試者以未進(jìn)食狀態(tài)到達(dá)實(shí)驗(yàn)室，對(duì)股外側(cè)肌進(jìn)行休止肌活檢 (resting muscle biopsy )。
在休止肌活檢后，受試者完成一系列高強(qiáng)度抗阻力運(yùn)動(dòng)，其由重 復(fù)12次最大腿伸展運(yùn)動(dòng)的3組組成。在剛剛運(yùn)動(dòng)后，受試者被隨機(jī)分 配服用如實(shí)施例4中所述的測(cè)試樣品。受試者和測(cè)試者均對(duì)所服用的補(bǔ) 充劑不知情。
在運(yùn)動(dòng)后2和4小時(shí)再收集肌肉樣品。在第三次活檢后，受試者 再次攝入與先前相同的補(bǔ)充劑。
23運(yùn)動(dòng)后24小時(shí)，受試者再次以未進(jìn)食狀態(tài)回到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行第四次 (最后一次)肌肉活檢。
從收集的肌肉活檢中提取RNA，并分析肌肉增生肥大標(biāo)記物和肌 肉炎癥標(biāo)記物的表達(dá)變化。
研究了肌肉恢復(fù)的兩個(gè)方面(l)運(yùn)動(dòng)后肌肉中的炎癥程度；(2) 肌肉通過增加體積(增生肥大)來(lái)適應(yīng)的能力。
c-Fos和JunB共同組成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1。 AP-1復(fù)合物對(duì)于 高強(qiáng)度和損傷運(yùn)動(dòng)后炎癥相關(guān)基因的調(diào)節(jié)而言是非常重要的。c-Fos和 JirnB基因的表達(dá)在高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后被迅速誘導(dǎo)，其提供了肌肉內(nèi)早期炎 癥反應(yīng)的有用標(biāo)記物。使用市售試劑盒來(lái)測(cè)定肌肉活檢中c-Fos和JunB 的表達(dá)。
骨骼肌增生肥大部分受控于堿性-環(huán)-螺旋家族的生肌調(diào)節(jié)因子 (myogenic regulatory factor, MRF )的活性。先前已將MRF成員MyoD 和成肌蛋白(Myogenin )鑒定為在骨骼肌針對(duì)抗阻力運(yùn)動(dòng)的適應(yīng)性反應(yīng) 中具有重要性。肌肉生長(zhǎng)的另一重要調(diào)節(jié)因子是肌肉生長(zhǎng)抑制素。已知 高水平的肌肉生長(zhǎng)抑制素抑制肌肉生長(zhǎng)，并且在高強(qiáng)度抗阻力運(yùn)動(dòng)后肌 肉生長(zhǎng)抑制素基因的表達(dá)明顯受到抑制。因此，選擇MyoD、成肌蛋白 和肌肉生長(zhǎng)抑制素基因表達(dá)作為肌肉增生肥大的標(biāo)記物。使用已公開的 方法(例如Megeney等(1996). Genes Dev. 10: 1173-1183; Ohkawa等， The EMBO Journal (2006) 25, 490-501;以及Roth等，Experimental Biology and Medicine 228: 706-709 (2003))來(lái)測(cè)定這些基因的表達(dá)。
實(shí)施例6.生產(chǎn)進(jìn)一步的WPI水解產(chǎn)物。
使用兩個(gè)EC分類的各3個(gè)實(shí)例對(duì)根據(jù)實(shí)施例1生產(chǎn)的WPI進(jìn)行
酶水解，以證實(shí)生物活性不是根據(jù)實(shí)施例2的 611&386@消化所特有的。
EC 3.4.24.28的實(shí)例
—Neutrase -蛋白酶N "Amano"—Colomsc N EC 3.4.21.62的實(shí)例
-枯草桿菌蛋白酶A (類型VIII)
—Optinms6
生產(chǎn)流程(實(shí)驗(yàn)室規(guī)模)
在1600h,將根據(jù)實(shí)施例1生產(chǎn)的WPI溶于水中，得到1L 10% (重量/重量)WPI溶液。將WPI儲(chǔ)存于4。C過夜。第二天，在1400h 將含有WPI的1L瓶溫和加熱至50。C，并通過小心加入2M NaOH將 pH調(diào)至pH 6.6。將該1L WPI溶液分成6瓶，每瓶含有100 mL 10 % (重 量/重量)WPI溶液。
將大約50 mg的酶(Neutrase㊣、蛋白酶N"Amano"、 ColoraseN、 Alcalase 、枯草桿菌蛋白酶A ( VIII型)或Opti mase )加至WPI中， 然后將WPI溶液在50'C孵育1小時(shí)。
定期測(cè)量pH,但是在1小時(shí)孵育期間不進(jìn)行調(diào)整。通過加入2M HC1將水解WPI溶液的pH調(diào)至4.0然后在50。C孵育30分鐘，從而使 剩余的酶失活。
然后通過加入2M NaOH來(lái)中和(pH 5.5)溶液。將所述樣品在 45。C加熱，在1 mBar的真空下凍干48小時(shí)。
將粉末送至TGR Biosciences進(jìn)4亍生物活性測(cè)定，測(cè)定如實(shí)施例3 先前所述進(jìn)行，只是樣品以0.2 mg/ml和1 mg/ml進(jìn)行測(cè)定。
結(jié)果顯示于圖6中。1 mg/ml枯草桿菌蛋白酶A ( VIII型)是目 前經(jīng)LPS刺激的巨噬細(xì)胞中TNFa表達(dá)的最好抑制劑，但是所有其它水 解產(chǎn)物在0.2 mg/ml和1.0 mg/ml下都比未水解的WPI具有更好的抑制 活性。
結(jié)果證實(shí)了圖4的發(fā)現(xiàn)。實(shí)施例7.調(diào)節(jié)經(jīng)LPS刺激的巨噬細(xì)胞中的TNFa表達(dá)-竟?fàn)幬飳?duì)照
用市售的乳級(jí)分產(chǎn)品作為對(duì)照重復(fù)進(jìn)行實(shí)施例3中的實(shí)驗(yàn)，以顯 示本發(fā)明水解產(chǎn)物在TNFa表達(dá)方面的作用不同于本領(lǐng)域已知的制劑。
進(jìn)4亍測(cè)試的樣品為
A"isol00"可得自Dymatize ( 89 %蛋白質(zhì))
B"黃金標(biāo)準(zhǔn)品"可得自O(shè)ptimum ( 81.63蛋白質(zhì))
C"HP100"可得自ASN (89%蛋白質(zhì))
D"VP2"可得自AST (85.7%蛋白質(zhì))
E"Hydroxyphase，，可得自Max (卯％蛋白質(zhì))
FWPI參見實(shí)施例1 (89%蛋白質(zhì))
G根據(jù)實(shí)施例2制備的經(jīng)Neutrase消化的WPI ( 88 %蛋白質(zhì))nWGFE乳清生長(zhǎng)因子提取物根據(jù)PCT/AU2006/001323來(lái)制備。
圖7中顯示的結(jié)果說明，與其它樣品(大多刺激TNFa表達(dá))相 比，本發(fā)明的水解產(chǎn)物能夠抑制經(jīng)LPS刺激的巨噬細(xì)胞的TNFa表達(dá)。
很顯然，盡管本文提到了許多現(xiàn)有技術(shù)公開文獻(xiàn)，但是這種引用 不構(gòu)成承認(rèn)任何這些文獻(xiàn)構(gòu)成任何國(guó)家中本領(lǐng)域公知常識(shí)的一部分。
在不脫離本發(fā)明寬泛描述的精神或范圍的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以對(duì)如具體實(shí)施方案所示的本發(fā)明進(jìn)行多種變形和/或改變。因此，本文 的實(shí)施方案是示例性的而非限制性的。
2權(quán)利要求
1. 包含乳清蛋白或乳清蛋白水解產(chǎn)物的制劑，其中該制劑不包含谷氨酰胺、支鏈氨基酸、維生素E或維生素C中的一種，并且該制劑能夠在體外抑制經(jīng)脂多糖刺激的巨噬細(xì)胞的TNFα表達(dá)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的制劑，所述制劑是乳清蛋白的水解產(chǎn)物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的制劑，其中所述水解產(chǎn)物是酶水解產(chǎn)鉤。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的制劑，其中所述酶是細(xì)菌來(lái)源的。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3的制劑，其中所述酶是真菌來(lái)源的。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)的制劑，其中所述酶是金屬蛋白酵。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3至5的制劑，其中所述酶是來(lái)自IUBMB酶命 名分類EC 3.4.24.28的酶或來(lái)自IUBMB酶命名分類EC 3.4.21.62的酶。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的制劑，其中所述酶是Neutrase 、 Alcalase 、 枯草桿菌蛋白酶A (VIII型)、ColoraseN、 Optimase或蛋白酶N"Amano"。
9. 包含乳清蛋白水解產(chǎn)物的制劑，所述水解產(chǎn)物是通過用來(lái)自 IUBMB酶命名分類EC 3.4.24.28的酶或者IUBMB酶命名分類EC 3.4.21.62的酶進(jìn)行酶處理而獲得的，其中所述酶不是Alcalase或 Neutrase,該制劑能夠在體外抑制經(jīng)脂多糖刺激的巨噬細(xì)胞中的TNFa 表達(dá)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的制劑，其中所述酶是枯草桿菌蛋白酶A( VIII 型)、ColoraseN、 Optimase或蛋白酶N "Amano"。
11. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的制劑，其中所述乳清蛋白是乳清蛋 分離物或乳清蛋白濃縮物。
12. 包含根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述制劑的營(yíng)養(yǎng)保健品制劑。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12的營(yíng)養(yǎng)保健品制劑，其用于緩解由肌肉損傷 所致的肌肉功能下降和/或用于促進(jìn)肌肉損傷恢復(fù)和/或用于增強(qiáng)肌肉的 生力能力。
14. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述制劑用于緩解由肌肉損傷所致的 肌肉功能下降和/或用于促進(jìn)肌肉損傷恢復(fù)和/或用于增強(qiáng)肌肉生力能力 的用途。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中所述肌肉損傷是由運(yùn)動(dòng)誘 發(fā)的肌肉損傷。
16. 用于緩解由肌肉損傷所致的肌肉功能下降和/或用于促進(jìn)肌肉損傷恢復(fù)和/或用于增強(qiáng)肌肉生力能力的方法，該方法包括向受試者施用權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的制劑。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述肌肉損傷是由運(yùn)動(dòng)誘 發(fā)的肌肉損傷。
18. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途或者根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其 中施用所述制劑以提供至少50 mg/kg體重至1500 mg/kg體重的乳清蛋 白或水解產(chǎn)物。
19. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途或者根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其 中所述制劑在運(yùn)動(dòng)后立即施用。
20. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途或者根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其 中所述制劑在運(yùn)動(dòng)后20分鐘至2小時(shí)施用。
21. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途或者根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其 中所述制劑用于口服施用。
22. 包含權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)所述的制劑的食物、飲料、片劑 或膠嚢，其用于權(quán)利要求14所述的用途或者權(quán)利要求16的方法。
23. 制備用于緩解由肌肉損傷所致的肌肉功能下降和/或用于促進(jìn) 肌肉損傷恢復(fù)和/或用于增強(qiáng)肌肉生力能力之制劑的方法，該方法包括 水解乳清蛋白以生產(chǎn)包含乳清蛋白水解產(chǎn)物的制劑。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述乳清蛋白水解產(chǎn)物通過乳 清蛋白的酶水解來(lái)生產(chǎn)。
25. 根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述制劑是權(quán)利要求2至9任 一項(xiàng)所述的制劑。
26. 根據(jù)權(quán)利要求23的方法或者根據(jù)權(quán)利要求2的制劑，其中所 述水解產(chǎn)物具有0.5 % ~ 10 %的凈水解程度。
27. 根據(jù)權(quán)利要求23的方法或者根據(jù)權(quán)利要求2的制劑，其中所 述水解產(chǎn)物具有0.5% ~4%的凈水解程度。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含乳清蛋白或乳清蛋白水解產(chǎn)物的制劑，該制劑能夠在體外抑制經(jīng)脂多糖刺激的巨噬細(xì)胞中的TNFα表達(dá)。還提供了所述制劑用于緩解由肌肉損傷所致的肌肉功能下降和/或用于促進(jìn)肌肉損傷恢復(fù)和/或用于增強(qiáng)肌肉生力能力的用途，以及制備該制劑的方法。
文檔編號(hào)A61K38/01GK101466389SQ200780021776
公開日2009年6月24日 申請(qǐng)日期2007年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月15日
發(fā)明者喬納森·大衛(wèi)·巴克利, 安德魯·布朗, 玉 潘, 米歇爾·羅尼 申請(qǐng)人:墨累古爾本合作有限公司