專利名稱：一種制備乳清蛋白水解物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種制備乳清蛋白水解物的方法。
背景技術(shù)：
超高壓技術(shù)作為新型非熱加工技術(shù)之一，能在常溫或者較低溫度下實現(xiàn)殺菌、滅酶地目的，并保持食品或原材料中天然的營養(yǎng)成分及良好的感官特性，還可產(chǎn)生出傳統(tǒng)熱加工無法比擬的新的物化特性。此外，超高壓技術(shù)還具有高效節(jié)能、保護環(huán)境等特點。作為一種半工業(yè)化方法，超高壓技術(shù)作用于蛋白溶液時可以使蛋白鏈變得更加伸展，進而暴露更多的酶切位點而有利于水解反應(yīng)的進行，還可能產(chǎn)生一些新的具有特殊生理活性的功能性肽。因此，超高壓技術(shù)被公認(rèn)為是一種最具潛力和發(fā)展前景的食品加工與保藏新技術(shù)，受到了廣泛關(guān)注與研究。酶解技術(shù)是一種用于改善食物中的蛋白質(zhì)，以獲得更有價值和用途的產(chǎn)品的重要手段之一。在酶解過程中，可釋放出小分子的蛋白質(zhì)及肽段，使得蛋白質(zhì)的營養(yǎng)品質(zhì)和安全性得到改善。近年來，酶解制備抗氧化活性肽的研究得到廣泛的關(guān)注，已有從牛奶、雞蛋、肉類、魚類，以及大豆、小 麥和玉米等多種動植物中分離抗氧化活性肽的報導(dǎo)。乳清是乳品工業(yè)生產(chǎn)干酪及干酪素的副產(chǎn)物，全世界每年生產(chǎn)乳清約8000萬噸，且正以每年2.0%的速度增長。乳清蛋白具有營養(yǎng)價值高、易消化吸收、含有多種活性成分、具有很高的代謝效率和生物學(xué)價值等特點，是公認(rèn)的人體優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)補充劑之一，因而又被稱為蛋白之王。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白及其水解產(chǎn)物具有一定的抗氧化活性，如月旨質(zhì)過氧化抑制作用、氧自由基吸收能力和自由基清除活性等。因此，開發(fā)利用乳清蛋白，不僅能提供營養(yǎng)豐富、生理功能卓越的各種保健食品、化妝品及抗氧化藥物，而且能夠緩解乳品企業(yè)的環(huán)境污染，提高乳清產(chǎn)品的附加值，實現(xiàn)經(jīng)濟、社會和生態(tài)效益的有機結(jié)合。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備乳清蛋白水解物的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:將乳清蛋白在超高壓和蛋白酶的聯(lián)合作用下進行酶解反應(yīng)，收集酶解產(chǎn)物即得到乳清蛋白水解物。在上述方法中，所述蛋白酶為堿性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或酸性蛋白酶；所述蛋白酶具體為堿性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、中性蛋白酶或酸性蛋白酶。在上述方法中，所述將乳清蛋白在超高壓和蛋白酶的聯(lián)合作用下進行酶解反應(yīng)的方法為如下A或B:A包括如下步驟:I)將所述乳清蛋白溶于緩沖液中，得到乳清蛋白溶液；2)將步驟I)得到的乳清蛋白溶液與所述蛋白酶混勻后在超高壓條件下同時酶解，得到酶解產(chǎn)物；B包括如下步驟:a)將所述乳清蛋白溶于緩沖液中，得到乳清蛋白溶液；b)將步驟a)得到的乳清蛋白溶液進行超高壓處理，得到預(yù)處理產(chǎn)物；c)將步驟b)得到的預(yù)處理產(chǎn)物與所述蛋白酶混勻后酶解，得到酶解產(chǎn)物。在上述A和B中，所述超高壓的壓力為100MPa_600MPa ;所述超高壓的壓力具體為400MPa ；在上述A和B中，所述蛋白酶和所述乳清蛋白的質(zhì)量比為0.05.1。其中，上述酶解的溫度為35 °C -60 °C ;所述緩沖液為濃度為0.05M-0.1M、PH7.0-8.5的Tris-HCl緩沖溶液或濃度為0.05M-0.1M、pH2.2-3.0的檸檬酸緩沖液；上述蛋白酶為堿性蛋白酶Alcalase、胰凝乳蛋白酶Chymotrypsin、中性蛋白酶ASl.398或酸性蛋白酶Pepsin ；在上述A和B中，上述堿性蛋白酶Alcalase的酶解溫度及對應(yīng)的緩沖液分別50°C _60°C和濃度為0.05M-0.1Μ、ρΗ7.5-8.5的Tris-HCl緩沖溶液；上述堿性蛋白酶Alcalase的酶解溫度及對應(yīng)的緩沖液分別具體為55°C和濃度為0.05M、pH8的Tris-HCl緩沖溶液；上述胰凝乳蛋白酶Chymotrypsin的酶解溫度及對應(yīng)的緩沖液分別為40°C -50°C和濃度為0.05-0.1M、p H7.5-8.5的Tris-HCl緩沖溶液；上述胰凝乳蛋白酶Chymotrypsin的酶解溫度及對應(yīng)的緩沖液分別具體為40°C和濃度為0.05M、pH8.5的Tris-HCl緩沖溶液；上述中性蛋白酶ASl.398的酶解溫度及對應(yīng)的緩沖液分別為40 55°C和濃度為0.05 0.1Μ、ρΗ7.0 8.0的Tris-HCl緩沖溶液；上述中性蛋白酶ASl.398的酶解溫度及對應(yīng)的緩沖液分別具體為45°C和濃度為0.05M、pH7.0的Tris-HCl緩沖溶液；上述酸性蛋白酶P印sin的酶解溫度及對應(yīng)的緩沖液分別為35 40°C和濃度為0.05 0.1Μ、ρΗ2.2 3.0的檸檬酸緩沖液；上述酸性蛋白酶P印sin的酶解溫度及對應(yīng)的緩沖液分別具體為37°C和濃度為0.05M、pH2.2的檸檬酸緩沖液。上述A和B中，所述酶解時間和所述超高壓預(yù)處理的時間均為30min-120min。在上述A所示的方法的步驟2)中和B所示的方法的步驟c)中，在所述酶解的步驟后還包括將所述酶解產(chǎn)物依次進行超濾離心和凝膠過濾層析得到乳清蛋白水解物的步驟；其中超濾離心包括如下步驟:先將所述酶解產(chǎn)物進行截留分子量為IOkDa的超濾離心收集透過液1，再將所述透過液I進行截留分子量為3kDa的超濾離心，收集透過液2 ;其中凝膠過濾層析包括如下步驟:將所述透過液2經(jīng)凝膠過濾色譜柱分離，收集保留時間為300min-410min的分離產(chǎn)物，得到乳清蛋白水解物。在上述超濾離心中，所述離心的離心力均為3000g_4000g，所述離心的時間均為10min_30min ；在上述凝膠過濾層析中，所述凝膠過濾色譜柱為S印hadex G_25，所述洗脫液為經(jīng)過0.22um膜過濾的去離子水；所述凝膠過濾的流速為0.3mL/min-0.8mL/min,所述凝膠過濾的檢測波長為214nm或220nm。
在上述方法中，在所述酶解產(chǎn)物進行超濾離心的步驟前，還包括將所述酶解產(chǎn)物依次進行滅活酶、離心取上清液、冷凍干燥的步驟；上述滅活酶的溫度為100°C，滅活酶的時間為IOmin ;上述離心力為lOOOOg，上述離心時間為30min。由上述方法得到的乳清蛋白水解物也是本發(fā)明保護的范圍。上述的乳清蛋白水解物在制備具有抗氧化活性功能產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。上述抗氧化活性具體體現(xiàn)提高超氧陰離子清除能力。本發(fā)明的實驗證明，以乳清蛋白為原料，將超高壓技術(shù)與酶技術(shù)聯(lián)用，在高壓處理中和高壓處理后，分別對乳清蛋白進行酶解處理，制備具有高抗氧化活性的乳清蛋白酶解產(chǎn)物。并進一步將上述乳清蛋白酶解產(chǎn)物采用超濾離心、凝膠過濾色譜、MALD1-TOF MS及nano-LC/MS/MS分離純化后，得到具有高抗氧化活性的乳清蛋白單一活性肽段。利用本發(fā)明所生產(chǎn)的乳清蛋白抗氧化活性肽，能夠有效清除自由基，因此具有提高食品穩(wěn)定性、延長食品貨架期、延緩機體衰老及減少氧化損傷等特點。本發(fā)明不僅能夠增加乳清產(chǎn)品附加值，實現(xiàn)干酪加工副產(chǎn)物的綜合利用，而且在食品、化妝品及醫(yī)藥等領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為不同高壓處理下堿性蛋白酶Alcalase對WPI的水解作用。圖2為高壓處理中與高 壓處理后WPI的Alcalase酶解產(chǎn)物的抗氧化活性。(A)高壓處理中WPI酶解產(chǎn)物；⑶高壓處理后WPI酶解產(chǎn)物。圖3為WPI酶解產(chǎn)物不同超濾組分超氧陰離子自由基清除活性。圖4為WPI酶解產(chǎn)物超濾離心分離所得組分III的S印hadex G-25凝膠色譜圖；(A)經(jīng)S印hadex G_25凝膠過濾色譜所得不同峰組分的超氧陰離子清除活性；(B)組分III的Sephadex G-25凝膠過濾色譜圖。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的乳清蛋白(WPI)選用美國Le Sueur Cheese公司的牛乳清分離蛋白(WPI)，蛋白含量> 95% (w/w)，產(chǎn)品注冊商標(biāo):BiPRO 。實施例1、超高壓技術(shù)與酶技術(shù)聯(lián)用制備乳清蛋白酶解產(chǎn)物一、超高壓技術(shù)與堿性蛋白酶聯(lián)用得到酶解產(chǎn)物方法一:高壓處理中水解1、WPI溶液的制備5% (質(zhì)量百分含量)的WPI溶液:將WPI溶于0.05M、ρΗ8.0的Tris-HCl緩沖溶液(稱取6.06g Tris，量取2.63mL濃鹽酸，加水充分溶解并混勻后，定容至1L)中得到的混合液，使WPI在混合液中的濃度為5 % (質(zhì)量百分含量)。2、WPI溶液的超高壓處理中水解將上述I得到的20mL 5% (質(zhì)量百分含量)的WPI溶液(0.05M Tris-HCl緩沖溶液，pH8.0)，裝在聚氯乙烯塑料袋中，按照酶與底物濃度比E/S = 5.0% (w/w)添加堿性蛋白酶Alcalase (丹麥諾維信公司；產(chǎn)品批號:PLN05355)，密封，迅速混勻并置于超高壓容器中進行水解反應(yīng)。各樣品的處理壓力依次為100、200、300、400、500和600MPa，保壓時間30min,反應(yīng)溫度為55°C。水解反應(yīng)結(jié)束后均迅速置于沸水浴中滅酶IOmin,冷卻后IOOOOg離心30min，取上清液冷凍干燥，獲得不同壓力下的WPI酶解產(chǎn)物粉末。將上述得到的不同壓力下的WPI酶解產(chǎn)物粉末的酶解特性用水解度(DH)來表征，水解度(DH)的測定米用Nielsen和Petersen的方法(參考文獻:Nielsen P M, PetersenD,Dambmann C,Improved method for determining food protein degree of hydrolysis.Journal of Food Science, 2001,66 (5):642-646.),其水解度的計算公式如下:DH = h/htotX 100%(公式 I)式中:htot指每個蛋白質(zhì)中總的肽鍵數(shù)，主要取決于原料的類型，乳清蛋白為
8.8mmol/g蛋白質(zhì)；h指每g蛋白質(zhì)中被水解的肽鍵數(shù),mmol/g蛋白質(zhì)。上述得到的不同壓力下的WPI酶解產(chǎn)物粉末的抗氧化活性的測定方法如下:
光化學(xué)發(fā)光法(PLC):(參考文獻:PopovI, Lewin G, Baehr R,Photochemiluminescent detection of antiradical activity.1.Assay of superoxidedismutase.Biomed Biochim Acta, 1987,46(11):775-779.) ;PCL法采用超快速抗氧化劑和自由基全自動分析儀PHT0CHEM，利用具有光化學(xué)激發(fā)作用的光敏劑(發(fā)光氨)激發(fā)反應(yīng)分子，使之在紫外光的作用下以比正常條件下快1000倍的速度發(fā)生氧化反應(yīng)，迅速生成自由基，同時用化學(xué)發(fā)光法檢測自由基。ACW 標(biāo)準(zhǔn)試劑包(德國 Analytik Jena AG ;產(chǎn)品目錄號:KIT AOfhs 400.801)用于測定樣品中水溶性成分的抗氧化能力，其包括:試劑1，稀釋液(直接用);試劑2，緩沖液(直接用);試劑3，光敏劑；試劑4，抗壞血酸干粉作為標(biāo)準(zhǔn)試劑。將一定量的樣品溶于IOmL超純水中配置成5.0mg/mL的樣品溶液，在IOOOOg條件下離心lOmin，取上清用于測定。將10 μ L濃H2SO4與490 μ L試劑I的混合液添加至標(biāo)準(zhǔn)試劑瓶中，配置成lOmmol/L的儲備液，然后用試劑I將該儲備液稀釋成0.lmmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)表I的條件參數(shù)，將各試劑依次加入到檢測試管中，迅速混勻后上樣至抗氧化劑和自由基全自動分析儀(德國Analytik Jena AG公司；產(chǎn)品型號:Photochem )進行測定。測定參數(shù)如下:檢測時間，250s ;平滑因子，40 ;調(diào)零功能，開；校正及測量參數(shù)，時間滯差I(lǐng)ag-1agO ;清洗，IX每測量一次。以0.5 2.5nmol的抗壞血酸溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的水溶性抗氧化能力表示為每毫克樣品的抗壞血酸當(dāng)量，即μ g抗壞血酸/mg。表I水溶性抗氧化能力的PCL測定法
權(quán)利要求
1.一種制備乳清蛋白水解物的方法，包括如下步驟: 將乳清蛋白在超高壓和蛋白酶的聯(lián)合作用下進行酶解反應(yīng)，收集酶解產(chǎn)物即得到乳清蛋白水解物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述蛋白酶為堿性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或酸性蛋白酶；所述蛋白酶具體為堿性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、中性蛋白酶或酸性蛋白酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于: 所述將乳清蛋白在超高壓和蛋白酶的聯(lián)合作用下進行酶解反應(yīng)的方法為如下A或B: A包括如下步驟: 1)將所述乳清蛋白溶于緩沖液中，得到乳清蛋白溶液； 2)將步驟I)得到的乳清蛋白溶液與所述蛋白酶混勻后在超高壓條件下同時酶解，得到酶解產(chǎn)物； B包括如下步驟: a)將所述乳清蛋白溶于 緩沖液中，得到乳清蛋白溶液； b)將步驟a)得到的乳清蛋白溶液進行超高壓處理，得到預(yù)處理產(chǎn)物； c)將步驟b)得到的預(yù)處理產(chǎn)物與所述蛋白酶混勻后酶解，得到酶解產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于: A和B中，所述超高壓的壓力為100MPa-600MPa ;所述超高壓的壓力具體為400MPa ； 所述蛋白酶和所述乳清蛋白的質(zhì)量比為0.05: I ； 所述酶解的溫度為35 V -60 °C ;所述緩沖液為濃度為0.05M-0.1M、pH7.0-8.5的Tris-HCl緩沖溶液或濃度為0.05M-0.1M、pH2.2-3.0的檸檬酸緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于: 所述酶解時間和所述超高壓預(yù)處理的時間均為30min-120min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法,其特征在于: A所示的方法的步驟2)中和B所示的方法的步驟c)中，在所述酶解的步驟后還包括將所述酶解產(chǎn)物依次進行超濾離心和凝膠過濾層析得到乳清蛋白水解物的步驟； 所述超濾離心包括如下步驟:先將所述酶解產(chǎn)物進行截留分子量為IOkDa的超濾離心收集透過液1，再將所述透過液I進行截留分子量為3kDa的超濾離心，收集透過液2 ； 所述凝膠過濾層析包括如下步驟:將所述透過液2經(jīng)凝膠過濾色譜柱分離，收集保留時間為300min-410min的分離產(chǎn)物，得到乳清蛋白水解物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法,其特征在于: 所述超濾離心中，所述離心的離心力均為3000g-4000g，所述離心的時間均為10min_30min ； 所述凝膠過濾層析中，所述凝膠過濾色譜柱為Sephadex G_25，所述洗脫液為經(jīng)過0.22 μ m膜過濾的去離子水；所述凝膠過濾的流速為0.3mL/min_0.8mL/min,所述凝膠過濾的檢測波長為214nm或220nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于: 在所述酶解產(chǎn)物進行超濾離心的步驟前，還包括將所述酶解產(chǎn)物依次進行滅活酶、離心取上清液、冷凍干燥的步驟。
9.由權(quán)利要求1-8中任一所述方法得到的乳清蛋白水解物。
10.由權(quán)利要求9所述 的乳清蛋白水解物在制備具有抗氧化活性功能產(chǎn)品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備乳清蛋白水解物的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟將乳清蛋白在超高壓和蛋白酶的聯(lián)合作用下進行酶解反應(yīng)，收集酶解產(chǎn)物即得到乳清蛋白水解物。本發(fā)明的實驗證明，利用本發(fā)明所生產(chǎn)的乳清蛋白抗氧化活性肽，能夠有效清除自由基，因此具有提高食品穩(wěn)定性、延長食品貨架期、延緩機體衰老及減少氧化損傷等特點。本發(fā)明不僅能夠增加乳清產(chǎn)品附加值，實現(xiàn)干酪加工副產(chǎn)物的綜合利用，而且在食品、化妝品及醫(yī)藥等領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A61Q19/08GK103160558SQ20111041455
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者木泰華, 張苗, 盛小波 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所