專利名稱：：一種利用復合蛋白酶水解制備乳清蛋白肽的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種生物活性短肽的制備方法，尤其涉及一種通過將乳清蛋白進行復合酶解以制備乳清蛋白肽的方法，屬于生物化學領域。
背景技術：
：乳中含有大量不同活性的生物活性肽，這些月太或自然存在于乳中或源于乳蛋白水解后的產(chǎn)物。由于其分子量較小，在小腸內(nèi)以完整肽段的形式被人體吸收，不會引起人體的免疫排斥反應，且具有多種t寺殊的生理活性功能。乳清蛋白經(jīng)蛋白酶酶解得到小分子乳清蛋白月太，乳清蛋白肽主要是由27個氨基酸組成的多肽混合物，是一種多功能營養(yǎng)因子，具有免疫調(diào)節(jié)、抗血栓、抗高血壓、降膽固醇、抗菌等多種生理活性功能，可廣泛應用于食品和醫(yī)藥等行業(yè)，可制成天然降血壓藥、患者營養(yǎng)補劑、嬰幼兒食品、老年食品、運動食品和各種功能健康食品等。功能性食品是二十一世紀食品工業(yè)發(fā)展的重點，開發(fā)具有多種生理活性功能的乳清蛋白肽具有深遠的意義和重要的應用價值。乳源生物活性肽的研究始于1979年，德國的Brantl等人通過酶解牛乳酪蛋白得到了一些多肽產(chǎn)物，并證明它們具有類嗎啡纟舌性，從此人們展開了生物活性肽方面的研究。國外經(jīng)過近20年的探索，到目前為止，己經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種乳源生物活性肽。國外對乳蛋白來源的ACE抑制肽研究有一定的報道，尤其是日本對來源于乳清蛋白、酪蛋白和酸奶中的ACE抑制月太進行了較多的研究，取得了較大的進展。國內(nèi)目前對此方面的研究剛剛起步。國內(nèi)數(shù)所高校進行了乳源生物活性肽的研究，在蛋白酶的選擇、酶解工藝等方面取得一定的進展。目前，采用酶解法提取的乳源生物活性肽，應用的蛋白水解酶較為單一，主要有胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等。對于大多數(shù)乳蛋白來源的生物活性肽來說，其工業(yè)化生產(chǎn)還有一定的難度，主要是因為這些生物活性肽在乳蛋白酶解液中的含量低，分離和提純難度大，檢測手段和技術不夠成熟。目前國內(nèi)關于復合蛋白酶水解乳清蛋白制取乳清蛋白肽的研究尚未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種新的乳清蛋白肽的制備方法，該方法能夠充分的將乳清蛋白水解，乳清蛋白的利用率高，所制得的乳清蛋白肽分子量分布范圍優(yōu)、肽含量高，肽產(chǎn)品質(zhì)量好，該方法可以進行規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的一種制備乳清蛋白肽的方法，包括以下步驟(1)向乳清蛋白溶液中加入復合蛋白酶進行酶解；(2)酶解完成后，滅活復合蛋白酶；(3)將酶解液進行沉淀，取上清液進行離心；(4)取離心后的上清液進行脫色處理后再接著進行脫鹽處理；(5)將脫鹽處理后的酶解液進行納tl;(6)濃縮；(7)濃縮后的產(chǎn)物包埋于壁材中；(8)噴霧干燥，即得。為了達到更好的技術效果，步驟(1)中所述乳清蛋白溶液的濃度優(yōu)選是2.0-8.0wt%，更優(yōu)選為6.0wte/。；另夕卜，將所配制的乳清蛋白溶液進行酶解之前，先按照以下步驟進行預處理將濃度是2.0-8.0wt。/。的乳清蛋白溶液在70-10(TC溫度條件下加熱10-20min，然后冷卻至30-60°C，調(diào)節(jié)pH值至5.0-9.0。優(yōu)選的，步驟(1)中所述的復合蛋白酶由木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、動物蛋白水解酶、酸性蛋白酶和胃蛋白酶中的任意兩種或兩種以上所組成；更優(yōu)選的，由胰蛋白酶與木瓜蛋白酶組成；特別優(yōu)選的，由胰蛋白酶與木瓜蛋白酶按照1-3:1的重量比例會且成；最優(yōu)選的，所述的復合蛋白酶由胰蛋白酶與木瓜蛋白酶按照2:1的重量比例組成。優(yōu)選的，步驟(1)中所述的酶解按照以下條件進行復合蛋白酶的用量為乳清蛋白重量的2.0-8.0wty。，酶解溫度30-60"C，酶解時間6-10h，酶解反應體系的pH值控制在5.0-9.0;更優(yōu)選的，復合蛋白酶的用量為乳清蛋白重量的4.0wt%，酶解溫度45'C，酶解時間為7h，酶解反應體系的pH值控制為7.5。步驟(1)中酶解時間可視具體情況而定，反應時間稍長或稍短對于本發(fā)明的實施或效果不構成實質(zhì)性的影響，本領域技術人員可根據(jù)實際情況很容易確定，作為參考，酶解時間最好為3-5h以上，優(yōu)選為6-10h。優(yōu)選的，步驟(2)中所述的滅活復合蛋白酶的方法如下將乳清蛋白酶解反應體系迅速升溫至70。C-10(TC并保持10-20min。步驟(3)中將酶解液優(yōu)選按照以下方法沉淀未完全酶解的乳清蛋白質(zhì)大分子在酶水解液中添加HC1溶液，調(diào)整pH至4.3-4.7，加熱15-20min。步驟(3)中將上清液按照以下條件進行離心分離未完全酶解的乳清蛋白沉淀物，得到澄清透明的酶解液離心轉(zhuǎn)速為4000-5000r/min，離心分離時間為15-20min。步驟(4)中所述的脫色處理優(yōu)選按照以下條件進行采用氫氧化鈉溶液將離心后所取上清液的pH調(diào)整至6.0-8.0，加入為上清液重量0.5-3.0%的粉末活性炭，在30-5(TC條件下進行脫色處理，1.0-3.0h后過濾分離；步驟(4)中所述的脫鹽處理優(yōu)選按照以下條件進行經(jīng)脫色處理的乳清蛋白酶解液，采用浸泡法或過柱法，先經(jīng)24g/100mL的強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，處理乳清蛋白肽30min，后經(jīng)24g/100mL的強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂處理乳清蛋白肽30min;步驟(5)中所述的納濾優(yōu)選按照以下條件進行采用NF-1即截留分子量為2000的納濾膜，在操作壓力0.3-l.OMpa的條件，截留分離分子量范圍小于2000的乳清蛋白肽；步驟(6)中所述的濃縮優(yōu)選按照以下條件進行控制真空度為600-750mmHg，在蒸發(fā)溫度60-7(TC條件下，將乳清蛋白肽溶液濃縮至固形物含量為10-30%;通過真空蒸發(fā)濃縮，得到高含量的乳清蛋白肽溶液；步驟(7)中所述的壁材由多孔淀粉與(3-環(huán)糊精復合而成。本發(fā)明中所用到的各種原料都可通過商業(yè)途徑購買得到，例如所用到的胃蛋白酶、胰蛋白酶，動物蛋白水解酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等都可從生物公司購買得到，如Novozymes公司、上海寶豐生化有限公司、南寧龐博生物工程有限公司等。本發(fā)明利用單因素試驗和正交試驗對復合蛋白酶的水解條件進行優(yōu)化，建立了pH、酶解溫度、酶解時間、酶與底物的比例、底物濃度與酶水解度的關系，得到復合蛋白酶的最佳水解條件為胰蛋白酶和木瓜蛋白酶比例1-3:1，復合蛋白酶的用量為乳清蛋白質(zhì)量的2.0-8.0wt%，底物濃度2.0-8.0wt%，pH5.0-9.0，在30-6(TC條件下酶解6-10h，其最高水解度可以達到46.5%。在此基礎上，本發(fā)明又系統(tǒng)優(yōu)化和篩選了脫色、脫鹽、納濾、真空濃縮、復合微膠囊包埋、噴霧干燥等工藝條件，與前面的復合蛋白酶的水解條件相配套，建立了一套完整的復合蛋白酶提取乳清蛋白肽的方法。本發(fā)明應用二種或二種以上的復合蛋白酶酶解乳清蛋白，制備乳清蛋白肽，有效的提高了酶水解度，顯著提高了乳清蛋白的利用率，所制備得到的乳清蛋白肽分子量分布范圍優(yōu)、肽含量高，產(chǎn)品質(zhì)量好；經(jīng)檢測，本發(fā)明方法所制備的乳清蛋白肽含量(以干基計)達75.15%;肽分子量分布范圍為小于2257道爾頓的占98.83%。本發(fā)明方法安全性高，無副作用，所制備得到的乳清蛋白肽主要是由27個氨基酸組成的多肽混合物，是一種多功能營養(yǎng)型因子，具有免疫調(diào)節(jié)、抗血栓、抗高血壓、降膽固醇、抗菌等多種生理活性功能，可廣泛應用于食品和醫(yī)藥等行業(yè)，可制成天然降血壓藥、患者營養(yǎng)補劑、嬰幼兒食品、老年食品、運動食品和各種功能健康食品等。具體實施方式下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。一、試驗材料乳清蛋白WPI9000(廣州利澳貿(mào)易有限公司)；胃蛋白酶120萬u/g、胰蛋白酶250萬u/g(國藥集團化學試劑有限公司)；菠蘿蛋白酶85萬u/g、動物蛋白水解酶10萬u/g(廣西南寧龐博生物科技有限公司)，中性蛋白酶200萬u/g、木瓜蛋白酶7萬u/g(上海寶豐生化有限公司)；酸性蛋白酶5萬u/g(無錫市酶制劑廠)。二、肽分子量分布測定方法A.l方法提要采用高效凝膠過濾色譜法測定。即以多孔性i真料為固定相，依據(jù)樣品組分分子體積大小的差別進行分離，在肽鍵的紫外吸^:波長220納米條件下檢測，使用凝膠色譜測定分布的專用數(shù)據(jù)處理軟件(即GPC軟件)，對色譜圖及其數(shù)據(jù)進行處理，計算得到多肽的相對分子量大小及分布范圍。A.2儀器(1)高效液相色譜儀，配有紫外檢測器和含有GPC數(shù)據(jù)處理軟件的色譜工作站或積分儀；(2)流動相真空抽濾脫氣裝置；(3)超聲波震蕩器；(4)分析天平，感量0.0001g。A.3試劑(1)乙晴，色譜純；(2)三氟醋酸，分析純；(3)水，超純級或二次蒸餾水；(4)分子量校正曲線所用標準品(a)細胞色素C(cyyochrome，MW12500)(b)抑肽酶(aprotinin，MW6500)(c)桿菌酶(bacitracin,MW1450)(d)乙氨酸一乙氨酸一清氨酸一精氨酸(MW451)(e)乙氨酸一乙氨酸一乙氨酸(MW189)A.4色譜條件與系統(tǒng)適應性實驗色譜柱TSKgelG2000SWXL300mmx7.8mm，或性能與此相近的同類型其它適用于測定蛋白質(zhì)和肽的凝膠柱。流動相乙晴水三氟乙酸，10:90:0.1(體積比)檢測波長UV220nm流速0.5ml/min柱溫30°C進樣體積IO]!L為使色譜系統(tǒng)符合檢測要求，規(guī)定在上述色譜條件下，凝膠色譜柱的柱效即理論塔板數(shù)(AO按三肽標準品(乙氨酸一乙氨酸一乙氨酸)峰計算不低于10000，肽的分配系數(shù)(&)應在01之間。A.5分子量校正曲線制作分別用流動相配制成質(zhì)量分數(shù)為0.1%的上述不同分子量肽標準品溶液，用孔徑0.2—0.5pm聚四氟乙烯或尼龍過濾膜過濾后分別進樣，得到系列標準品的色譜圖。以分子量的對數(shù)(lgMF)對保留時間作圖或作線性回歸，得到分子量校正曲線及其方程。A.6樣品制備稱取樣品約20.0mg于10ml容量瓶中，用流動相定容至刻度，超聲震蕩10min，使樣品充分溶解混勻，用孔徑為0.2pm—0.5^im聚四氟乙烯或尼龍過濾膜過濾后，上機進樣。A.7分子量分布的計算將A.5制備的樣品溶液在上述色譜條件下分t斤。然后用GPC數(shù)據(jù)處理軟件，將樣品的色譜數(shù)據(jù)代入校正曲線方程中進行計算，即可得到樣品的肽分子量及其分布范圍。用峰面積歸一法可計得不同分子量范圍肽的相對百分比。表l乳清蛋白肽分子量分布分子量范圍峰面積百分比(%，X220nm)數(shù)均分子量重均分子量>30003000~200020001000畫500500130<1300.250.922.8315.2268.6312.153777225712546273453869228512996523519三、乳清蛋白水解度測定方法1溶液中可溶性氮的測定方法(微量擴散法)取乳清蛋白酶解澄清液5ml，加入1g消化f崔化劑和10ml濃硫酸，在高溫下消化至黃綠色后，取出冷卻至室溫，加水定容。然后取5ml加入到擴散皿的外室，并在擴散皿的內(nèi)室加入2ml的硼酸溶液，向外室中加入4ml濃NaOH溶液，并迅速蓋上蓋片。在自然條件放置24h左右后，用標準的鹽酸溶液滴定硼酸溶液至紫羅蘭色即可。含氮量N(%)=(V2-V。xNHx0.014x稀釋倍數(shù)/樣品重量x1000/0注V1:空白所需鹽溶液體積(ml)V2:滴定待測液耗用標準酸體積(ml)NH:標準酸當量濃度0.0141ml當量氮的克數(shù)2水解度的測定方法——TCA法取10ml酶解物中加入10mlTCA，在水浴中加熱20min，然后在4000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min。取上清液，蛋白質(zhì)總氮和上清液可溶性氮由3.1中方法測得。水解度(DH)J廣M注M空白試樣的含氮量N2乳清蛋白未經(jīng)酶解的含氮量N3乳清蛋白經(jīng)酶解后的含氮量。實施例1稱取定量乳清蛋白，水化，配制成6.0wt。/。乳清蛋白溶液，85。C加熱15min，冷卻至45'C，調(diào)節(jié)pH值至7.5;加入復合蛋白酶(該復合蛋白酶由胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按照2:1的重量比例所組成)，復合蛋白酶用量為乳清蛋白質(zhì)量的4.0%，45。C恒溫條件下，在恒溫酶解罐(酶反應裝置)中水解；水解過程中不斷加入pH調(diào)節(jié)劑，將pH值恒定在7.5;酶水解7h后，經(jīng)檢測，乳清蛋白的水解度為46.5%;將反應體系乳清蛋白酶水解液迅速升溫至卯'C并保持20min，使酶失活，控制水解度；在酶水解液中添加HC1溶液，調(diào)整pH至4.3-4.7，加熱15-20min，沉淀未完全酶解的乳清蛋白質(zhì)大分子；取酶解上清液，4000-5000r/min，離心分離15-20min，得到澄清透明的上清液；將該上清液pH調(diào)整至6.0-8.0，加入為離心上清液重量的0.5-3.0%的粉末活性炭，于30-50。C條件下脫色處理，1.0-3.0h后過濾分離；經(jīng)脫色處理的學L清蛋白酶解液采用過柱法或浸泡法，先經(jīng)24g/100mL的強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，處理30min，后經(jīng)24g/100mL的強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂處理30min,進行脫鹽處理；采用NF-1即截留分子量為2000的納濾膜，操作壓力0.3-1.0Mpa，截留分離分子量范圍小于2000的乳清蛋白肽；控制真空度為600-750mmHg，溫度60-70'C，將乳清蛋白肽溶液濃縮至固形物含量為10-30%;采用多孔淀粉與(3-環(huán)糊精復合壁材，與乳清蛋白肽均勻混合，30MPa高壓均質(zhì)，將乳清蛋白肽均勻分散于壁材中，進行復合微膠囊包埋穩(wěn)定化；噴霧干燥，控制進風溫度190°C、出風溫度95°C、進料流量40ml/min，將均質(zhì)后的乳化液，經(jīng)噴霧干燥，得到粉末狀乳清蛋白肽。經(jīng)檢測，本實施例所制備的乳清蛋白肽含量(以干基計)達75.15%;肽分子量分布范圍為小于2257道爾頓的占98.83%。實施例2稱取定量乳清蛋白，水化，配制成4.0wtH乳清蛋白溶液，85'C加熱15min，冷卻至56X:，調(diào)節(jié)pH值至6.0;加入復合蛋白酶(該復合蛋白酶由胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按照3:1的重量比例所組成)，復合蛋白酶用量為乳清蛋白重量的8,0%，在35。C恒溫條件下，在恒溫酶解罐(酶反應裝置)中水解；水解過程中不斷加入pH調(diào)節(jié)劑，將pH值恒定在6.0;酶水解10h后，經(jīng)檢測，乳清蛋白的水解度為42.5%;將反應體系乳清蛋白酶7jC解液迅速升溫至85X:并保持20min，使酶失活，控制水解度；在酶水解液中添加HC1溶液，調(diào)整pH至4.3-4.7，加熱15-20min，沉淀未完全酶解的乳清蛋白質(zhì)大分子；取酶解上清液，4000-5000r/min，離心15-20min，得到澄清透明的上清液；將該上清液pH調(diào)整至6.0-7.0，加入上清液重量的0.5-3.0%%的粉末活性炭，于30-50。C條件下進行脫色處理，1.0-3.0h后過濾分離；經(jīng)脫色處理的乳清蛋白酶解液，采用過柱法或浸泡法，先經(jīng)24g/100mL的強酸性苯乙烯系陽離子交換樹月旨，處理30min，后經(jīng)24g/100mL的強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂處理30min,進行脫鹽處理；采用NF-1即截留分子量為2000的納濾膜，壓力0.3-1.0Mpa，截留力、離分子量范圍小于2000的乳清蛋白肽；控制真空度為600-750mmHg，溫度60-7(TC，將乳清蛋白肽溶液濃縮至固形物含量為10-30%;采用多孔淀粉與P-環(huán)糊精復合壁材，與乳清蛋白肽均勻混合，30MPa壓力高壓均質(zhì)，將乳清蛋白肽均勻分散于壁材中，進行復合微膠囊包埋穩(wěn)定化；噴霧干燥，控制進風溫度190°C、出風溫度95°C、進料流量40ml/min，將均質(zhì)后的乳化液，經(jīng)噴霧干燥，得到粉末狀乳清蛋白肽產(chǎn)品。經(jīng)檢測，本實施例所制備的乳清蛋白肽含量(以干基計)達72.34%;肽分子量分布范圍為小于2257道爾頓的占96.73%。實施例3稱取定量乳清蛋白，水化，配制成2.0%乳清蛋白溶液，IOO'C加熱10min，冷卻至3(TC，調(diào)節(jié)pH值至5.0;加入復合蛋白酶(該復合蛋白酶由胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按照1:1的重量比例所組成)，復合蛋白酶的加入量為乳清蛋白質(zhì)量的2.0%，6(TC恒溫條件下，在恒溫酶解罐(酶反應裝置)中水解；水解過程中不斷加入pH調(diào)節(jié)劑，將pH值恒定在5.0;酶7jC解10h后，經(jīng)檢測，乳清蛋白的水解度為41.2%;將反應體系乳清蛋白酶水解液迅速升溫至88'C并保持20min，使酶失活，控制水解度；在酶水解液中添加HC1溶液，調(diào)整pH至4.3-4.7,加熱15-20min,沉淀未完全酶解的乳清蛋白質(zhì)大分子；取酶解上清液，4000-5000r/min，離心分離15-20min，得到澄清透明的上清液；將該上清液pH調(diào)整至6.0-7.0，加入上清液重量0.5-3.0%的粉末活性炭，于30-5(TC條件下進行脫色處理，1.0-3.0h后過濾分離；經(jīng)脫色處理的乳清蛋白酶解液釆用過柱法或浸泡法，先經(jīng)24g/100mL的強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，處理30min，后經(jīng)24g/100mL的強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂處理30min,進行脫鹽處理；采用NF-1即截留分子量為2000的納濾膜，0.3-1.0Mpa，截留分離分子量范圍小于2000的乳清蛋白肽。在真空度600-750mmHg，溫度60-7(TC條件下，將乳清蛋白肽溶液濃縮至固形物含量為10-30%;采用多？L淀粉與P-環(huán)糊精復合壁材，與乳清蛋白肽均勻混合，30MPa壓力高壓均質(zhì)，將乳清蛋白肽均勻地分散于壁材中，進行復合微膠囊包埋穩(wěn)定化；噴霧干燥，控制進風溫度190°C、出風溫度95°C、進料流量40ml/min，將均質(zhì)后的乳化液，經(jīng)噴霧干燥，得到粉末狀乳清蛋白肽產(chǎn)品。經(jīng)檢測，本實施例所制備的乳清蛋白肽含量(以干基計)達73.42%;肽分子量分布范圍為小于2257道爾頓的占95.76%。實施例4稱取定量乳清蛋白，水化，配制成8.0%乳清蛋白溶液，7(TC加熱20min，冷卻至6(TC，調(diào)節(jié)pH值至9.0;加入復合蛋白酶(該復合蛋白酶由木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶按照1:1的重量比例所組成)，復合蛋白酶用量為乳清蛋白質(zhì)量的4.0%，37"C恒溫條件下，在恒溫酶解罐(酶反應裝置)中水解；水解過程中不斷加入pH調(diào)節(jié)劑，將pH值恒定在9.0;酶水解6h后，經(jīng)檢測，乳清蛋白的水解度為34.5%;將反應體系乳清蛋白酶水解液迅速升溫至90'C并保持20min，使酶失活，控制水解度；在酶水解液中添加HC1溶液，調(diào)整pH至4.3-4.7，加熱15-20min，沉淀未完全酶解的乳清蛋白質(zhì)大^^子；取酶解上清液，4000-5000r/min，離心分離15-20min，得到澄清透明的上清液；將該上清液pH調(diào)整至6.0-7.0，加入上清液重量0.5-3.0%的粉末活性炭，于30-50'C條件下進行脫色處理，1.0-3.0h后過濾分離；經(jīng)脫色處理的乳清蛋白酶解液采用過柱法或浸泡法，先經(jīng)24g/100mL的強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，處理30min，后經(jīng)24g/100mL的強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂處理30min,進行脫鹽處理；采用NF-1即截留分子量為2000的納濾膜，壓力0.3-1.0Mpa，截留分離分子量范圍小于2000的乳清蛋白肽。在真空度600-750mmHg，溫度60-70。C條件下，將乳清蛋白肽溶液濃縮至固形物含量為10-30%。采用多孔淀粉與P-環(huán)糊精復合壁材，與乳清蛋白肽均勻混合，30MPa高壓均質(zhì)，將乳清蛋白肽均勻地分散于壁材中，進行復合微膠囊包埋穩(wěn)定化。噴霧干燥，控制進風溫度190'C、出風溫度95'C、進料流量40ml/min，將均質(zhì)后的乳化液，經(jīng)噴霧干燥，得到粉末狀乳清蛋白肽口經(jīng)檢測，本實施例所制備的乳清蛋白肽含量(以干基計)達66.25%;肽分子量分布范圍為小于2257道爾頓的占90.83%。實施例5稱取定量乳清蛋白，水化，配制成5.0°/。乳清蛋白溶液，85'C加熱15min，冷卻至56t:，調(diào)節(jié)pH值至7.5;加入復合蛋白酶(該復合蛋白酶由胃蛋白酶和動物蛋白水解酶按照2:1的重量比例所組成)，復合蛋白酶用量為乳清蛋白質(zhì)量的4.0%，在45t:恒溫條件下，在恒溫酶解罐(酶反應裝置)中水解；水解過程中不斷加入pH調(diào)節(jié)劑，將pH值恒定在6.0;酶水解10h后，經(jīng)檢測，乳清蛋白的水解度為29.8%;將反應體系乳清蛋白酶水解液迅速升溫至85'C并保持20min，使酶失活，控制水解度；在酶水解解液中添加HC1溶液，調(diào)整pH至4.3-4.7，加熱15-20min，沉淀未完全酶解的乳清蛋白質(zhì)大分子；取酶解上清液，4000-5000r/min，離心分離15-20min，分離得到澄清透明的上清液；將該上清液pH調(diào)整至6.0-7.0，加入上清液重量0.5-3.0%的粉末活性炭，于30-5(TC條件下脫色處理，1.O-3.0h后過濾分離；經(jīng)脫色處理的乳清蛋白酶解液采用過柱法或浸泡法脫鹽，先經(jīng)24g/100mL的強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，處理30min，后經(jīng)24g/100mL的強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂處理30min;采用NF-1即截留分子量為2000的納濾膜，壓力0.3-1.0Mpa,截留分離分子量范圍小于2000的乳清蛋白月太。在真空度600-750mmHg，溫度60-7(TC條件下，將乳清蛋白肽溶液濃縮至固形物含量為10-30%;采用多孔淀粉與(3-環(huán)糊精復合壁材，與乳清蛋白肽均勻混合，攪拌后，30MPa壓力高壓均質(zhì)，將乳清蛋白肽均勻地分散于壁材中，進行復合微膠囊包埋穩(wěn)定化；噴霧干燥，控制進風溫度19(TC、出風溫度95。C、進料流量40ml/min，將均質(zhì)后的乳化液，經(jīng)噴霧干燥，得到粉末狀乳清蛋白肽產(chǎn)品。經(jīng)檢測，本實施例所制備的乳清蛋白肽含量(以干基計)達62.85%;肽分子量分布范圍為小于2257道爾頓的占84.82%。實施例6稱取定量乳清蛋白，水化，配制成6.0%乳清蛋白溶液，85'C加熱15min，冷卻至50。C，調(diào)節(jié)pH值至7.5;加入復合蛋白酶(該復合蛋白酶由胰蛋白酶和菠蘿蛋白酶按照2:1的重量比例所組成)，復合蛋白酶用量為乳清蛋白質(zhì)量的6.0%,在37。C恒溫條件下，在恒溫酶解罐(酶反應裝置)中水解；水解過程中不斷加入pH調(diào)節(jié)劑，將pH值恒定在7.5;酶水解7h后，經(jīng)檢測，乳清蛋白的水解度為31.8%;將反應體系乳清蛋白酶水解液迅速升溫至9(TC并保持20min,使酶失活，控制水解度；在酶水解解液中添加HC1溶液，調(diào)整pH至4.3-4.7，加熱15-20min，沉淀未完全酶解的乳清蛋白質(zhì)大分子；取酶解上清液，4000-5000r/min，離心分離15-20min，分離得到澄清透明的上清液；將該上清液pH調(diào)整至6.0-7.0，加入上清液重量0.5-3.0%的粉末活性炭，于30-5(TC條件下進行脫色處理，1.0-3.0h后過濾分離；經(jīng)脫色處理的乳清蛋白酶解液采用過柱法或浸泡法脫鹽，先經(jīng)24g/100mL的強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，處理30min，后經(jīng)24g/100mL的強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂處理30min;采用NF-1即截留分子量為2000的納濾膜，壓力0.3-1.0Mpa，截留分離分子量范圍小于2000的乳清蛋白肽。在真空度600-750mmHg，溫度60-7(TC條件下，將乳清蛋白肽溶液濃縮至固形物含量為10-30%;采用多孔淀粉與P-環(huán)糊精復合壁材，與乳清蛋白肽均勻混合，30MPa壓力高壓均質(zhì)，將乳清蛋白肽均勻地分散于壁材中，進行復合微膠囊包埋穩(wěn)定化；噴霧干燥，控制進風溫度190°C、出風溫度95°C、進料流量40ml/min，將均質(zhì)后的乳化液，經(jīng)噴霧干燥，得到粉末狀乳清蛋白肽產(chǎn)品。經(jīng)檢測，本實施例所制備的乳清蛋白肽含量(以干基計)達66.24%;肽分子量分布范圍為小于2257道爾頓的占86.91%。試驗例l蛋白酶的篩選試驗試驗選用木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、動物蛋白水解酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶等七種蛋白酶。在各種酶的適宜條件下進行酶解，比較分析各種蛋白酶對乳清蛋白的水解度(DH)，結果見表2。表2不同蛋白酶的水解度<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>由表2可見，采用胰蛋白酶或木瓜蛋白酶的水解度明顯大于其它5種蛋白酶，且兩者的水解度相近；現(xiàn)有文獻表明，兩種或兩種以上蛋白酶同時作用底物時，往往具有協(xié)同增效作用。所以，本試驗采用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶復合酶解乳清蛋白制取乳清蛋白肽。試驗例2胰蛋白酶和木瓜蛋白酶復合酶對乳清蛋白水解的正交試驗單因素試驗結果分析酶解溫度和酶解時間對乳清蛋白水解度的影響明顯小于其它四個因素(蛋白酶比例，底物濃度，酶比底物值，pH)，所以，酶解溫度和酶解時間不作為正交試驗因素；根據(jù)單因素試驗結果確定，酶解溫度選擇45°C、酶解時間選擇7h。試驗以胰蛋白酶與木瓜為試驗因素，采用L9(34)正交試驗表，對胰蛋白酶與木瓜蛋白酶復合酶酶解乳清蛋白的工藝進行優(yōu)化研究，其優(yōu)化工藝結果見表3。表3正交試驗因素設計與結果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>通過表2的極差分析可見，各因素對水解度的影響主次順序為酶比底物值〉底物濃度〉胰蛋白酶與木瓜蛋白酶的比例〉PH;胰蛋白酶和木瓜蛋白酶復合酶解乳清蛋白最佳工藝條件是QB2A3D3，即酶比底物值4.0%,底物濃度6.0%，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶比例為2:1,PH為7.5。采用最佳工藝條件(QB2A3D3)對乳清蛋白進行酶解，其水解度大于正交表中任何一種組合，且水解度為46.5°/。。權利要求1.一種利用復合蛋白酶水解制備乳清蛋白肽的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)向乳清蛋白溶液中加入復合蛋白酶進行酶解；(2)酶解完成后，滅活復合蛋白酶；(3)將酶解液進行沉淀，取上清液進行離心；(4)取離心后所得到的上清液進行脫色處理后再接著進行脫鹽處理；(5)將脫鹽處理后的酶解液進行納濾；(6)濃縮；(7)濃縮后的產(chǎn)物包埋于壁材中；(8)噴霧干燥，即得。2、按照權利要求l的方法，其特征在于步驟(1)將乳清蛋白溶液進行酶解之前，先按照以下步驟進行預處理將乳清蛋白配成濃度為2.0-8.0wt。/。的水溶液，在70-10(TC溫度條件下加熱10-20min，然后冷卻至30-60°C，調(diào)節(jié)pH值至5.0-9.0。3、按照權利要求l的方法，其特征在于歩驟(1)中所述的復合蛋白酶由木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、動物蛋白水解酶、酸性蛋白酶和胃蛋白酶中的任意兩種或兩種以上所組成；優(yōu)選的，由胰蛋白酶與木瓜蛋白酶組成；優(yōu)選的，由胰蛋白酶與木瓜蛋白酶按照1-3:1的重量比例組成；更優(yōu)選的，所述的復合蛋白酶由胰蛋白酶與木瓜蛋白酶按照2:1的重量比例組成。4、按照權利要求l的方法，其特征在于，歩驟(1)中所述的酶解按照以下條件進行復合蛋白酶的用量為乳清蛋白重量的2.0-10.0wt%，酶解溫度30-60°C，酶解時間6-10h，酶解反應體系的pHiS控制在5.0-9.0。5、按照權利要求4的方法，其特征在于，歩驟(1)中所述的酶解按照以下條件進行復合蛋白酶的用量為乳清蛋白重量的4.0wt。/。；酶解溫度45"，酶解時間為7h，酶解反應體系的pH值控制為7.5。6、按照權利要求1的方法，其特征在于歩驟(2)中按照以下方法將所述的復合蛋白酶滅活將乳清蛋白酶解反應體系迅速升溫至70。C-10(TC并保持10-20min。7、按照權利要求l的方法，其特征在于歩驟(3)中將酶解液按照以下方法沉淀未完全酶解的乳清蛋白質(zhì)大分子在酶^K解液中添加鹽酸溶液，調(diào)整pH至4.3-4.7，加熱15-20分鐘。8、按照權利要求1的方法，其特征在于步驟(4)中所述的脫色處理按照以下條件進行采用氫氧化鈉溶液將離心后所取上清液的pH調(diào)整至6.0-8.0，加入為上清液重量0.5-3.0%的粉末活性炭，在30-50。C條件下進行脫色處理，1.0-3.0小時后過濾分離。9、按照權利要求1的方法，其特征在于步驟(4)中所述的脫鹽處理按照以下條件進行經(jīng)脫色處理的乳清蛋白酶解液采用過柱法或浸泡法，先經(jīng)24g/100mL的強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂處理乳清蛋白肽30分鐘后，后經(jīng)24g/100mL的強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂處理乳清蛋白肽30分鐘。10、按照權利要求l的方法，其特征在于步驟(5)中所述的納濾按照以下條件進行采用NF-1即截留分子量為2000的納濾膜，在操作壓力0.3-l.OMpa的條件，截留分離分子量范圍小于2000的乳清蛋白肽；步驟(6)中所述的濃縮按照以下條件進行控制真空度為600-750mmHg，在蒸發(fā)溫度60-70'C條件下，將乳清蛋白肽溶液濃縮至固形物含量為10-30%;步驟(7)中所述的壁材由多孔淀粉與p-環(huán)糊精復合而成。全文摘要本發(fā)明公開了一種制備乳清蛋白肽的方法，包括以下步驟(1)向乳清蛋白溶液中加入復合蛋白酶進行酶解；(2)滅活復合蛋白酶；(3)將酶解液進行沉淀，取上清液進行離心；(4)取離心后所得到的上清液進行脫色處理后再接著進行脫鹽處理；(5)將脫鹽處理后的酶解液進行納濾；(6)濃縮；(7)濃縮后的產(chǎn)物包埋于壁材中；(8)噴霧干燥，即得。本發(fā)明應用復合蛋白酶酶解乳清蛋白，有效提高了酶水解度，顯著提高了乳清蛋白的利用率，產(chǎn)品收率高，乳清蛋白肽分子量分布范圍優(yōu)，肽含量高，產(chǎn)品質(zhì)量好。經(jīng)檢測，本發(fā)明方法所制備的乳清蛋白肽含量(以干基計)高達75.15％，小于2257道爾頓的肽分子量分布范圍可達到98.83％。文檔編號C12P21/06GK101260421SQ20081009403公開日2008年9月10日申請日期2008年4月28日優(yōu)先權日2008年4月28日發(fā)明者周利根,王君虹,郜海燕,陳新峰申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學院