專(zhuān)利名稱(chēng)：一種阿霉素-二肽復(fù)合物的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物與醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗癌活性的 阿霉素-二肽復(fù)合物的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由于其廣泛的抗腫瘤作用，阿霉素作為治療癌癥的一線藥物常用 于肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和多種血癌等的臨床治療中。 然而，阿霉素的骨髓抑制和心臟毒性等不良反應(yīng)往往破壞病人的免疫 功能，嚴(yán)重影響了治療效果。因此，尋找一種降低阿霉素毒性、提高 阿霉素對(duì)腫瘤組織的選擇性的修飾方法成為目前研究的重點(diǎn)之一。前體藥物技術(shù)的一個(gè)核心是許多抗腫瘤小分子化學(xué)藥物的結(jié)構(gòu) 中含有可發(fā)生酰化反應(yīng)的游離氨基，并且這些游離氨基往往影響著藥 物的化學(xué)和生物學(xué)特性， 一旦被其他化學(xué)基團(tuán)修飾或封閉，將導(dǎo)致藥 物的細(xì)胞毒性顯著降低，而去除修飾基團(tuán)其細(xì)胞毒性則即可恢復(fù)。這些藥物包括阿霉素(doxorubicin, Dox)、道諾霉素(daunomycin， DM)等等。Bairrain等制備了多個(gè)道諾霉素的多肽衍生物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， Ala-Leu-DM與Leu-Leu-DM的細(xì)胞毒性分別下降至母體藥物DM的 1/100和1/250。而一旦水解去除多肽，DM的細(xì)胞毒性即可恢復(fù) [Baurain R， et al. J Med Chem. 23 (11) :1171—4. 1980]。 Trouet 報(bào)道，阿霉素的四肽衍生物N-alanyl-leucyl-alanyl-leucyl-Dox對(duì) 正常小鼠及荷瘤小鼠的毒性僅為阿霉素的1/9[Trouet A， etal. Cancer Res. 61 (7) :2843-6. 2001.]分子靶向藥物依據(jù)腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間分子生物學(xué)上的差 異，選擇性作用于靶細(xì)胞的基因、酶、信號(hào)傳導(dǎo)分子等，從而達(dá)到治 療的目的。雖然分子靶向藥物治療是一種理想的治療方式，但單藥使 用效果并不佳，尚存在許多問(wèn)題。其中由于腫瘤細(xì)胞基因的不穩(wěn)定性， 腫瘤細(xì)胞往往通過(guò)靶分子的調(diào)變或缺失逃避藥物的攻擊，致使分子靶 向藥物失去療效就是一個(gè)亟待解決的課題。近年來(lái)，研究者開(kāi)始將目 光轉(zhuǎn)向基因組穩(wěn)定的腫瘤間質(zhì)細(xì)胞。在腫瘤間質(zhì)中，成纖維細(xì)胞通過(guò) 與腫瘤細(xì)胞相互作用而活化，這種活化成纖維細(xì)胞被稱(chēng)為腫瘤相關(guān)成 纖維細(xì)胞(Carcinoma-Associated Fibroblasts, CAF) [BhowmickNA， et al. Nature. 432(7015) :332-7. 2004.]。大量證據(jù)表明，CAF對(duì) 腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著必要的支持促進(jìn)作用，比如表達(dá)細(xì)胞因子、蛋白 酶及粘附分子等促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移[Tuxhorn JA， et al. Clin Cancer Res. 8(9) :2912-23. 2002.]。
鑒于CAF對(duì)于腫瘤發(fā)生發(fā)展 的重要性，選擇這群細(xì)胞為靶標(biāo)，切斷其對(duì)腫瘤細(xì)胞的支持促進(jìn)作 用，不失為提高腫瘤靶向治療有效性的必要措施?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，腫瘤相 關(guān)成纖維細(xì)胞含有多種水解第二位由脯氨酸殘基形成的肽鍵的蛋白 酶，比如成纖維激活蛋白。這類(lèi)蛋白酶通常存在于腫瘤組織，傷口愈 合組織，胚胎成纖維細(xì)胞[Niedermeyer J， et al. Int J CANCER. 71:383-389. 1997]，使腫瘤間質(zhì)細(xì)胞具有與周?chē)＝M織不同的特 性。但現(xiàn)有技術(shù)中，阿霉素-二肽復(fù)合物的制備方法一般耗時(shí)較長(zhǎng)，反應(yīng)速率較低，產(chǎn)物的產(chǎn)率和純度也比較低。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種阿霉素-二肽復(fù) 合物的制備方法，弓i入可被腫瘤間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的蛋白水解酶選擇性水 解的二肽來(lái)修飾阿霉素。本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種阿霉素-二肽復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟(1) 稱(chēng)取N-芐氧羰基甘氨酰脯氨酸(二肽)溶于N， N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入氯甲酸乙酯，室溫下攪拌，加入三乙胺，室溫?cái)?拌，得到活化的二肽的溶液；(2) 鹽酸阿霉素溶于含有與之等物質(zhì)的量的Et3N的DMF，加入 活化的二肽溶液，室溫?cái)嚢瑁颐演腿》磻?yīng)產(chǎn)物，萃取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 制得阿霉素-二肽復(fù)合物；(3) 采用柱層析法對(duì)阿霉素-二肽復(fù)合物進(jìn)行純化。步驟(1)所述氯甲酸乙酯與N-芐氧羰基甘氨酰脯氨酸摩爾比為 1:1.2。步驟(l)所述所述加入氯甲酸乙酯后室溫下攪拌時(shí)間為10分鐘； 所述加入三乙胺后室溫?cái)嚢钑r(shí)間為40分鐘。步驟(2)所述活化的二肽溶液的加入量為與鹽酸阿霉素的DMF 溶液等摩爾比。步驟(2)所述室溫?cái)嚢钑r(shí)間為5 6小時(shí)。步驟(3)所述柱層析法的色譜條件為常規(guī)柱2.5X30 cm;固定 相為柱層析硅膠；流動(dòng)相為7.5:1和5:1的乙酸乙酯-甲醇。產(chǎn)品通過(guò)薄層層析鑒定后，用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)純度。本發(fā)明通過(guò)肽修飾技術(shù)，將含有脯氨酸殘基的二肽或多肽通過(guò)酰 化反應(yīng)連接到阿霉素的氨基上，可以使阿霉素的毒性降低，同時(shí)這種 前體藥物在腫瘤間質(zhì)細(xì)胞的作用下能釋放阿霉素，使阿霉素能富集到 腫瘤組織周?chē)?，提高阿霉素?duì)腫瘤組織的選擇性。本發(fā)明的有益效果是(1) 本發(fā)明提供的制備方法制備出的阿霉素-二肽復(fù)合物具有兩 方面的特點(diǎn) 一方面由于阿霉素氨基的封閉，阿霉素-二肽復(fù)合物比 其母藥阿霉素的毒性降低；另一方面，阿霉素-二肽復(fù)合物在腫瘤間質(zhì)細(xì)胞的蛋白水解酶的作用下釋放出阿霉素，從而達(dá)到阿霉素被選擇 性釋放的富集功能，賦予了阿霉素-二肽復(fù)合物對(duì)正常組織低毒，對(duì) 腫瘤組織具有殺傷性作用的治療效果。(2) 本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單易行，反應(yīng)速率高，耗時(shí)短，產(chǎn)物的純 度和產(chǎn)率比較高。


圖1血槳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 圖2腫瘤生長(zhǎng)曲線圖3藥物毒性實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重變化曲線具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1芐氧羰基甘氨酰脯氨酰阿霉素的合成(1) N-芐氧羰基甘氨酰脯氨酸的活化稱(chēng)取26. 4 mg (86. 2 u inol)的N-芐氧羰基甘氨酰脯氨酸溶于1. 5 ml的N， N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入9. 8 ul (86.2X1.2 = 103.4 umol)氯甲酸乙酯，室溫下攪拌10分鐘，加入14.5 ul (103.4 umol) 三乙胺，室溫?cái)嚢?0分鐘。(2) N-芐氧羰基甘氨酰脯氨酰阿霉素的制備稱(chēng)取40mg (86.2 u mol)鹽酸阿霉素溶于1. 5 mL DMF中，向其 中加入12.5 ul (86.2 ymol)三乙胺并混勻。將溶解好的鹽酸阿 霉素溶液加入經(jīng)上述活化的Z-GP溶液，室溫?cái)嚢? 6小時(shí)；產(chǎn)物用 30 ml的乙醚(5倍于反應(yīng)液體積)進(jìn)行萃取，減壓抽濾棄去沉淀， 乙醚萃取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即得粗品。(3) N-芐氧羰基甘氨酰脯氨酰阿霉素的純化 采用柱層析法對(duì)粗產(chǎn)品進(jìn)行純化。色譜條件常規(guī)柱(2.5X30cm)。固定相柱層析硅膠；流動(dòng)相乙酸乙酯-甲醇(7. 5: 1， 5:1)。 產(chǎn)品通過(guò)薄層層析鑒定，質(zhì)譜確證(ES-MS : [M+K]+= 870)，用高效液 相色譜法(HPLC)檢測(cè)純度，純度達(dá)98%。實(shí)施例2芐氧羰基甘氨酰脯氨酰阿霉素(Z-GP-Dox)體外細(xì)胞毒性 實(shí)驗(yàn)將K562， MOLT-4細(xì)胞接種在96孔板中，密度為10， 000/孔，將 含有0nM - 2nM的游離阿霉素或等摩爾濃度的Z-GP-Dox (溶劑是 DMS0)加到細(xì)胞中，或者將K562， MOLT-4細(xì)胞培養(yǎng)基替換成與上述游離阿霉素等摩爾濃度的Z-GP-Dox孵育過(guò)24小時(shí)和48小時(shí)的mEF 細(xì)胞培養(yǎng)基，分別于24小時(shí)和48小時(shí)后，通過(guò)MTT法檢測(cè)K562， M0LT-4的細(xì)胞存活率。從結(jié)果可得，Z-GP-Dox細(xì)胞毒性比Dox的IC50 分別減少4 7倍(K562細(xì)胞)和9 24倍(M0LT-4細(xì)胞)。而Z-GP-Dox 經(jīng)與mEF細(xì)胞孵育后可恢復(fù)到與母體藥物相似的細(xì)胞毒性IC50，見(jiàn) 表l。表1 mEF細(xì)胞孵育前后Z-GP-Dox和Dox的細(xì)胞毒性比較(IC50)細(xì)胞株Dox (IC50)Z-GP-Dox (mEF細(xì)胞孵育前IC50)Z"GP-Dox (mEF細(xì)胞孵育后IC50)K56224小時(shí)0.22394 pM0.960753 pM0.355691 mM48小時(shí)0.04469 pM0.305835 mM0.09653 mMMOLT424小時(shí)0.04665 nM0.460327 nM0.05098 mM48小時(shí)0.01795 |iM0.440791 mM0.03879 nM實(shí)施例3芐氧羰基甘氨酰脯氨酰阿霉素(Z-GP-Dox)血漿穩(wěn)定性實(shí) 驗(yàn)含有0. 675 u M Z-GP-Dox分別在含有20%肝癌細(xì)胞，乳腺癌患者 血清和正常人血漿中6小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)后，取上清作用于K562 細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，在24小時(shí)后，細(xì)胞存活 率仍達(dá)70%以上，表明Z-GP-Dox在血清中裂解成細(xì)胞毒性母藥阿霉 素較少，在肝癌患者，乳腺癌患者和正常人的血清中是穩(wěn)定的。見(jiàn)附 圖1所示。實(shí)施例4芐氧羰基甘氨酰脯氨酰阿霉素(Z-GP-Dox)體內(nèi)抗腫瘤活 性實(shí)驗(yàn)Balb/C小鼠每只皮下接種106個(gè)4T1細(xì)胞，腫瘤移植荷瘤小鼠 隨機(jī)分為生理鹽水組，Dox組和Z-GP-Dox組，小鼠分別給與Dox (5mg/kg)和等摩爾的Z-GP-Dox (7. 164 mg/kg)，連續(xù)12天觀察腫瘤 大小，結(jié)果證明二肽修飾后的阿霉素與母藥阿霉素相比抗腫瘤活性變 化不大，仍與母藥有相似的療效，見(jiàn)附圖2所示腫瘤生長(zhǎng)曲線。實(shí)施例5芐氧羰基甘氨酰脯氨酰阿霉素(Z-GP-Dox)體內(nèi)毒性實(shí)驗(yàn)按實(shí)施例4方法，分別在l， 2， 3， 4， 8， 12， 17， 20天測(cè)量小 鼠體重。結(jié)果發(fā)現(xiàn)二肽修飾后的阿霉素的體重變化不大，而阿霉素在 第八天體重開(kāi)始下降，說(shuō)明修飾后的阿霉素比母藥阿霉素毒性降低。 見(jiàn)附圖3所示藥物毒性實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體中變化曲線。綜上所述，本發(fā)明所述的制備方法制備出的阿霉素-二肽復(fù)合物 母藥阿霉素相比，毒性降低；阿霉素-二肽復(fù)合物能被與腫瘤間質(zhì)細(xì) 胞具有相似特性的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Mouse Embryo Fibroblast, mEF)所表達(dá)的酶催化裂解出具有細(xì)胞毒性的阿霉素；阿 霉素-二肽復(fù)合物在肝癌患者，乳腺癌患者和正常人血清是穩(wěn)定的； 通過(guò)4T1乳腺癌移植小鼠模型證實(shí)用本發(fā)明制備方法制備出的阿霉 素-二肽復(fù)合物與母藥阿霉素相比，毒性降低，抗腫瘤療效不變。
權(quán)利要求
1、一種阿霉素-二肽復(fù)合物的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)稱(chēng)取N-芐氧羰基甘氨酰脯氨酸溶于N，N-二甲基甲酰胺，加入氯甲酸乙酯，室溫下攪拌，加入三乙胺，室溫?cái)嚢?，得到活化的二肽的溶液?2)鹽酸阿霉素溶于含有與之等物質(zhì)的量的Et3N的DMF，加入活化的二肽溶液，室溫?cái)嚢?，乙醚萃取反?yīng)產(chǎn)物，萃取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)制得阿霉素-二肽復(fù)合物；(3)采用柱層析法對(duì)阿霉素-二肽復(fù)合物進(jìn)行純化。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述阿霉素-二肽復(fù)合物的制備方法，其特征 在于步驟(1)所述氯甲酸乙酯與N-芐氧羰基甘氨酰脯氨酸摩爾比為 1:1.2。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述阿霉素-二肽復(fù)合物的制備方法，其特征 在于步驟(l)所述所述加入氯甲酸乙酯后室溫下攪拌時(shí)間為10分鐘； 所述加入三乙胺后室溫?cái)嚢钑r(shí)間為40分鐘。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述阿霉素-二肽復(fù)合物的制備方法，其特征 在于步驟(2)所述活化的二肽溶液的加入量為與鹽酸阿霉素的DMF 溶液等摩爾比。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述阿霉素-二肽復(fù)合物的制備方法，其特征 在于步驟(2)所述室溫?cái)嚢钑r(shí)間為5 6小時(shí)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述阿霉素-二肽復(fù)合物的制備方法，其特征在于步驟(2)所述乙醚用量為5倍于反應(yīng)液體積。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述阿霉素-二肽復(fù)合物的制備方法，其特征 在于步驟(3)所述柱層析法的色譜條件為常規(guī)柱2.5X30 cm;固定 相為柱層析硅膠；流動(dòng)相為7.5:1和5:l的乙酸乙酯-甲醇。
8、 一種權(quán)利要求1所述制備方法制備得到的阿霉素-二肽復(fù)合物 在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種阿霉素-二肽復(fù)合物的制備方法，通過(guò)肽修飾技術(shù)，將含有脯氨酸殘基的二肽或多肽通過(guò)?；磻?yīng)連接到阿霉素的氨基上，可以使阿霉素的毒性降低，同時(shí)這種前體藥物在腫瘤間質(zhì)細(xì)胞的作用下能釋放阿霉素，使阿霉素能富集到腫瘤組織周?chē)?，提高阿霉素?duì)腫瘤組織的選擇性。本發(fā)明反應(yīng)速率快，耗時(shí)短，產(chǎn)物產(chǎn)率和純度較高。
文檔編號(hào)A61K31/704GK101274100SQ20081002638
公開(kāi)日2008年10月1日 申請(qǐng)日期2008年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月20日
發(fā)明者鵬 劉, 卜憲章, 軍 杜, 謝白露 申請(qǐng)人:中山大學(xué)