專利名稱：：一種野金柴活性提取物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，具體涉及野金柴一種活性提取物和應(yīng)用。技術(shù)背景野金柴來源主要有薔薇科野金柴、繡球花科土常山、殼斗科多穗石柯、葡萄科顯齒蛇葡萄等植物的幼嫩梢、葉。本發(fā)明所指野金柴，亦稱野金柴主要來源于江西殼斗科植物多穗石柯(LithocarpuspoIystachyus(wall)Rehd或L.litseifoIius(Hamce)Chun.)全部H株或^f壬f可部^f立，如根、根莖、莖、葉、花穗等。多穗石柯以野生狀態(tài)分布于長江以南各省區(qū)海拔400米以上的低山密林中.尤以江西、廣西、湖南、安徽等省資源豐富而集中，廣東、云南、四川、福建等省次之，以江西、福建交界的武夷山脈分布最廣，資源極為豐富。野金柴提取物主要用于制備甜味劑與著色劑，還用于清熱利尿，防治濕熱痢疾，皮膚瘙癢，癰疽惡瘡。長期飲用該茶，能滋肝養(yǎng)胃，清熱潤肺，生津止渴，提神解乏，降壓減肥，對高血壓及冠心病有療效。對于多穗柯葉的研究多集中于用作茶和提取甜味劑及色素的原料，其香氣濃郁，色澤鮮艷，味甘甜持久，風(fēng)味獨特。楊永耀等(野生野金柴的開發(fā)與利用，茶葉機械雜志，2000年02期)對野生植物多穗柯嫩葉的水浸提液進行了理化成分分析，結(jié)果表明，該浸提液營養(yǎng)豐富，富含人體所需的17種氨基酸及多種微量元素、維生素以及多種黃酮類成分。王雅茜(多穗柯的研究與應(yīng)用，中國野生植物資源，1999年第18巻第4期)報道從多穗柯提取物中分離得到三種二氫查爾酮葡萄糖甙、根皮甙、三葉甙和3-羥基根皮甙。其中以三葉甙含量最高，達95%，其甜度為蔗糖的300倍。而從湖南野金柴提取物中分離到兩種含量極高的天然甜素，總含量為12.6%，經(jīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定為二氫査爾酮-葡萄糖甙，指出多穗柯提取物中還存在八種三萜類化合物，為齊墩果烷，達瑪烷，環(huán)菠蘿蜜烷等類物質(zhì)，此類化合物可能是野金柴止咳有效成分。另外，多穗柯浸提液還含有K、Na、Ca、等常量元素及多種人體必需的微量元素，氨基酸，維生素。李晚誼等(云南野金柴過敏有效成分初步研究，云南大學(xué)學(xué)報，2001年第23巻第6期)從云南野金柴(多穗柯)的乙酸乙酯提取物中分離得到具有抑制透明質(zhì)酸酶活性的2個化合物，經(jīng)光譜分析、化學(xué)反應(yīng)和文獻對照等方法，初步鑒定證實有效成分為二氫査爾酮-2，{-0-吡喃葡萄糖甙(0^乂(^0(^3「60116-2，-(3-D-glu-copyranoside)和二氫査爾酮-4，-卩-D-P比喃葡萄糖武(dihydrocharcone4'-卩-D-glucopyranoside)。穗柯棕色素是由葉提取、分離，其產(chǎn)率可達干葉重的10%左右，屬酚酸類化合物。該色素能用于糖果、冷飲、飲料、配制酒及糕點等的著色，亦可用于藥品的糖衣著色，已由衛(wèi)生部批準實施標準為GB2760陽36。諸多關(guān)于多穗石柯葉化學(xué)成分及其藥理作用的研究，其應(yīng)用也局限于保健茶、飲料及其甜味成分的研究，具茶、糖、藥三種經(jīng)濟價值為一身的野金柴，對其"藥"方面的功效急待開發(fā)，而江西野金柴在此方面的研究報道更少，且無制劑方面的報道。本發(fā)明對江西野金柴進行藥學(xué)、藥效學(xué)的全面研究，采用現(xiàn)代先進的低溫差壓式提取技術(shù)配合膜分離濃縮技術(shù)、噴霧干燥技術(shù)制備野金柴活性提取物，利用大孔吸附樹脂、聚酰胺分離富集技術(shù)配合冷凍干燥技術(shù)制備高純度的野金柴總黃酮提取物，且其保肝降脂、抗2型糖尿病及糖尿病并發(fā)癥等藥理作用優(yōu)于常規(guī)水提物、醇提物；根據(jù)需要制成了膠囊、片劑、丸劑等劑型，方法簡單，操作簡便，利于工業(yè)生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種具有明確指標的野金柴活性提取物。本發(fā)明的另一目的是提供該種野金柴活性提取物的制備方法。本發(fā)明所指的野金柴，特指為江西殼斗科植物多穗石柯(Lithocarpuspolystachyus(wall)Rehd或L.litseifolius(Hamce)Chun.)全部植株或任何部位，如根、根莖、莖、葉、花穗等，還包括經(jīng)過各種炮制方法的炮制品。本發(fā)明所述的野金柴活性提取物，含有10%90%總黃酮，其顏色為淡黃色至棕色。定性鑒別實驗顯示鹽酸一鎂粉反應(yīng)呈陽性。更進一步地，該野金柴活性提取物，含有45%60%的總黃酮。本發(fā)明所述的野金柴活性提取物高效液相指紋圖譜285nm檢測有26個特征峰，其中6個峰為主要峰，占總峰面積的89%以上；提取物高效液相指紋圖譜345nm檢測有26個特征峰，其中14個峰為主要峰，占總峰面積的95%以上。本發(fā)明所述的野金柴活性提取物用濃度2%6%(體積比)的鹽酸水解，水解溫度90'C，水解時間為60分鐘，高效液相指紋圖譜有4個特征峰，當鹽酸濃度達到6%但低于12%時色譜圖中細小的峰明顯增多，鹽酸濃度的增高化合物被水解成的碎片越多，當濃度達到12%時，高效液相指紋圖譜中無色譜峰，化合物基本被水解氧化完全。本發(fā)明所述的總黃酮含量檢測方法采用以柚皮苷為對照品，紫外分光光度法；總黃酮含量檢測方法參照藥典2005年版，附錄VA紫外一可見分光光度法。本發(fā)明所述的野金柴活性提取物中黃酮類成分，可以與堿氫氧化鈉、氫氧化鉀中的任一種和金屬鹽碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸鈣、醋酸鋅中的任一種，形成的金屬鹽類衍生物以及與鐵、鋁、鋅、銅、鋇、鉻、鍶中的任一種金屬離子形成的金屬離子絡(luò)合物，這些衍生物和絡(luò)合物具有與上述野金柴總黃酮提取物相同或相近的藥理活性或用途。本發(fā)明的所述的野金柴提取物制備方法溶劑提取法、低溫差壓式提取法、溶劑萃取法、大孔吸附樹脂法、柱色譜法、膜分離濃縮技術(shù)、噴霧干燥技術(shù)、冷凍干燥技術(shù)中任意一種方法或這些方法的任意組合進行制備。其中優(yōu)選為低溫差壓式提取法、大孔吸附樹脂法、聚酰胺柱色譜法、膜分離濃縮技術(shù)、噴霧干燥技術(shù)、冷凍干燥技術(shù)。優(yōu)選地，本發(fā)明開創(chuàng)性使用低溫差壓式提取法對野金柴進行提取，并發(fā)現(xiàn)獲得的提取物具有非常好的性質(zhì)。在使用這些方法進行制備時，包括以下幾個步驟(1)提取所用溶劑可以是水或任意一種醇類、酮類及酯類溶劑，或這些溶劑按一定比例組成的混合溶劑，或是由這些溶劑與酸、堿、鹽配成的酸性或堿性溶劑；提取方法可以是煎煮、加熱回流、超聲提取、冷浸、滲漉、微波提取、低溫差壓式提取等。優(yōu)選的提取工藝為野金柴藥材加095%乙醇，回流提取23次，每次提取12小時，溶劑用量為520倍量(ml/g)。野金柴藥材經(jīng)粉碎機械解碎為粒度為lOmra以下的顆粒，加入080%乙醇1050倍量，攪拌保持動態(tài)，在一35'C4(TC，"常壓一真空一加溶媒一常壓一加壓一常壓"不斷循環(huán)進行差壓提取，真空度根據(jù)需要保持在13.33Pa1.OOMPa，壓力根據(jù)需要保持在lMPa25.OOMPa,循環(huán)次數(shù)根據(jù)需要選擇48次。(2)過濾包括離心、抽濾、超濾、微濾等方法，使用或不使用以下任一種澄清劑或其組合醇沉液劑、明膠、高嶺土、硅澡土、各種樹脂、聚乙二醇、聚乙三醇、殼聚糖以及天然澄清劑成品101果汁澄清劑、ZTC+1天然澄清劑中的任一種。(3)濃縮包括常壓或減壓條件下的薄膜蒸發(fā)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、煎煮濃縮、膜濃縮技術(shù)、懸浮冷凍濃縮、漸進冷凍濃縮、自然外循環(huán)兩相流濃縮、外循環(huán)式冷凍濃縮、噴霧冷凍濃縮中的任一種。(4)干燥包括真空干燥、噴霧干燥、冷凍干燥中的任一種。當采用溶劑萃取法進行制備時，先將提取物混懸于水中，然后用低極性的酯類、醚類溶劑萃取除去脂溶性雜質(zhì)，然后用合適的溶劑，可以是氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇中的一種，或是這些溶劑的混合物，萃取獲得野金柴總黃酮類成分。當使用大孔吸附樹脂法進行制備時，所用的大孔樹脂可以是非極性、弱極性、中等極性、極性、弱堿性或弱酸性任何一種類型，可以是DIOI、X—5、NKA、S—8、NKA—9、HPD—600、ADS—7、AB—8、LSA—5B、HPD—722、ADS—17、薩130、HPD—826、DN_300、DN—603、FL一l、FL—2、FL—3中的任一種，其中優(yōu)選的為弱極性、中等極性或極性的樹脂，包括AB—8、ADS—17、HPD—600中的任一種，所用的洗脫劑可以為水、含水乙醇、甲醇、丙酮中的任一種，其中優(yōu)選為0100%乙醇。當使用柱色譜以聚酰胺為固定相時，所用的層析聚酰胺樹脂是30—60目、60—120目、100—120目，其中優(yōu)選為30—60目的樹脂，所用的洗脫劑為水、含水乙醇、甲醇、丙酮中的任一種，其中優(yōu)選為0100%乙醇。優(yōu)選野金柴總黃酮類成分純化工藝為選用包括AB—8、ADS—17、HPD—600中的任一種弱極性、中等極性或極性的大孔吸附樹脂和3060目的層析聚酰胺樹脂作為純化用樹脂，野金柴提取物以生藥量計上樣液稀釋倍數(shù)為1:51:10，吸附流速25BV/h，樹脂柱徑高比l:51:10，以生藥量計上樣量為O.1lg/ml，以14倍樹脂體積的純化水除雜，除雜流速為25BV/h，用10%95%乙醇洗脫28倍樹脂體積，洗脫流速為25BV/h。當采用柱色譜法進行制備時，其處理對象可以是上述提取步驟所獲得的產(chǎn)物，也可以是上述溶劑提取法、溶劑萃取法或大孔吸附樹脂法初步純化后的產(chǎn)物。所用的固定相可以是硅膠、聚酰胺、氧化鋁、葡聚糖、C一8、C一18、活性炭、纖維素中的任一種，所用的洗脫液因固定相的不同而不同，一般是由水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、石油醚中任一種或幾種組成的混合溶劑。當使用膜分離濃縮技術(shù)時，其微濾截留直徑大小在O.liam以上的物質(zhì)；超濾截留分子量在1000500000之間的可溶性物質(zhì)；納濾截留分子量在150以上、直徑在lnm左右的物質(zhì)。其使用的材質(zhì)可以是有機類包括醋酸纖維素、聚丙稀、聚碳酸酯、聚砜、聚酰胺和無機類包羅陶瓷、金屬、金屬氧化物、炭、多孔玻璃。該提取物可以單獨或與其它任何中西藥物或食物按任意比例配伍，用于制備藥物或功能性食品，所制得的藥物或功能性食品可以是膠囊劑、片劑、丸劑、顆粒劑、口服液、糖漿、沖劑、酒劑、注射劑、膏劑、散劑、飲料、巴布劑中的任一種。本發(fā)明所述倍數(shù)是指溶劑體積用量(ml)是藥材質(zhì)量用量(g)的倍數(shù)。本發(fā)明所述的乙醇濃度是指體積濃度(v/v)。本發(fā)明所述的野金柴活性提取物制備方法原料豐富，制作工藝簡易方便。本發(fā)明所述的野金柴活性提取物在制備治療高血脂、冠心病等心血管系統(tǒng)疾病和脂肪肝、糖尿病及糖尿病并發(fā)癥等疾病藥物中的應(yīng)用。圖1是野金柴提取物紫外掃描圖譜。圖2a、b是野金柴總提取物的HLPC指紋圖譜(285nm和345nm)。圖3a、b是野金柴提取物的2％鹽酸水解后的HPLC圖譜(285nm和345nm)。圖4a、b是野金柴提取物的4%鹽酸水解后的HPLC圖譜(285nm和345nm)。圖5a、b是野金柴提取物的6%鹽酸水解后的HPLC圖譜(285nm和345nm)。圖6是與正常組比較的模型組糖尿病大鼠血清糖化血清蛋白(GSP)、甘油三脂(TG)、膽固醇(TC)、腎組織過氧化產(chǎn)物(MDA)水平。具體實施方式所涉及的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠掌握和運用的技術(shù)手段，但以下實施示例不得理解為任何意義上的對本發(fā)明權(quán)利要求的限制。實施例1野金柴藥材5kg，經(jīng)粉碎機械解碎為粒度為10mm以下的顆粒，加入20倍量的水，攪拌保持動態(tài)，在0℃5℃的條件下，通過"常壓一真空一加溶媒一常壓一加壓一常壓"不斷循環(huán)進行差壓提取，真空度保持在14Pa，壓力保持10.OOMPa，進行4次循環(huán)提取。將提取液經(jīng)固液分離機械進行固液分離至澄清，得澄清的提取液，將澄清的提取液連續(xù)進行微濾和超濾得濃縮液，噴霧干燥得野金柴總提取物。以柚皮苷為對照品，紫外分光光度法測定野金柴活性提取物中總黃酮含量約為60%。實施例2取野金柴藥材5kg，經(jīng)粉碎機械解碎為粒度為lOmm以下的顆粒，加入20倍量的工藝用水，攪拌保持動態(tài)，在0°C5°C，"常壓一真空一加溶媒一常壓一加壓一常壓"不斷循環(huán)進行差壓提取，真空度保持在14Pa，壓力保持10.OOMPa，進行4次循環(huán)提取。將提取液經(jīng)固液分離機械進行固液分離至澄清，得提取液。取提取液200ml，加等倍量水稀釋，過AB-8型大孔吸附樹脂，水洗至無色，70%乙醇洗脫至無色，收集洗脫液，減壓濃縮至無醇味，干燥得野金柴活性提取物。以柚皮苷為對照品，紫外分光光度法測定野金柴活性提取物中總黃酮含量約為48%。實施例3取野金柴藥材5kg，經(jīng)粉碎機械解碎為粒度為lOmm以下的顆粒，加入20倍量的工藝用水，攪拌保持動態(tài)，在0°C5°C，"常壓一真空一加溶媒一常壓一加壓一常壓"不斷循環(huán)進行差壓提取，真空度保持在14Pa，壓力保持10.OOMPa，進行4次循環(huán)提取。將提取液經(jīng)固液分離機械進行固液分離至澄清，得提取液。取提取液200ml，加等倍量的水稀釋，過聚酰胺柱(3060目)，水洗至無色，80%乙醇洗脫至無色，收集洗脫液，減壓濃縮至無醇味，干燥得野金柴活性提取物。以柚皮苷為對照品，紫外分光光度法測定野金柴活性提取物中總黃酮含量約為52%。實施例4取野金柴低溫差壓式提取物的噴霧干燥藥粉15g，加蒸餾水200ml使溶解，過AB—8大孔吸附樹脂，水洗至無色，然后70%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至無醇味，過聚酰胺柱(3060目)，水洗至無色，再用70%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至無醇味，干燥得野金柴活性提取物。以柚皮苷為對照品，紫外分光光度法測定野金柴提取物中總黃酮含量約為45%。實施例5取野金柴低溫差壓式提取物的噴霧干燥藥粉100g，加等倍量羧甲基淀粉鈉，混勻，干壓制粒，裝膠囊，得膠囊劑。實施例6取野金柴低溫差壓式提取物的噴霧干燥藥粉100g，加等倍量蔗糖、等倍量糊精及適量淀粉，制成顆粒，干燥，整粒，制成1000g，分裝成10克每包。實施例7取野金柴低溫差壓式提取物的噴霧干燥藥粉100g，加蒸餾水1000ml使溶解，加乙醇至含醇量為80%，靜置過夜，取上清液濃縮至約500ml，加0.1%活性炭煮沸半小時，過濾，濾液過0.2陶微孔濾膜，得到活性提取物，其中總黃酮含量約為39%。將上述野金柴活性提取物加注射用水至1000ml，分裝(每瓶100ml)，滅菌消毒，即得野金柴注射液。實施例8取野金柴低溫差壓式提取物的噴霧干燥藥粉100g，淀粉100g,混合均勻，加滑石粉適量，壓制成1000片。實施例9取野金柴低溫差壓式提取物的噴霧干燥藥粉10g三份，分別加入2%、4%、6%鹽酸溶液200ml，90'C水浴加熱1小時進行水解，取出，放冷，用水飽和乙酸乙酯萃取5次，每次100ml，合并乙酸乙酯液，低溫減壓回收溶劑，得殘渣，用甲醇100ml溶解。其水解后產(chǎn)物的HPLC圖譜如圖4ab、5ab、6ab。實施例10取野金柴低溫差壓式提取物的噴霧干燥藥粉10g，加入蒸餾水200ml溶解，用水飽和正丁醇萃取5次，每次100ml，合并正丁醇液，低溫減壓回收溶劑，得殘渣，用甲醇100ml溶解。以柚皮苷為對照品，紫外分光光度法測定野金柴活性提取物水解物總黃酮含量約為55%。實施例11取野金柴藥材5kg，經(jīng)粉碎機械解碎為粒度為10咖以下的顆粒，加入30倍量的工藝用水，攪拌保持動態(tài)，在5"1(TC，"常壓一真空一加溶媒一常壓一加壓一常壓"不斷循環(huán)進行差壓提取，真空度保持在0.4MPa，壓力保持15.OOMPa，進行4次循環(huán)提取。將提取液經(jīng)固液分離機械進行固液分離至澄清，得提取液，提取液進行微濾和超濾得濃縮液，噴霧千燥得野金柴提取物。以柚皮苷為對照品，紫外分光光度法測定野金柴活性提取物中總黃酮含量約為62%。實施例12取野金柴藥材5kg，經(jīng)粉碎機械解碎為粒度為10咖以下的顆粒，加入40倍量的工藝用水，攪拌保持動態(tài)，在1(TC15t:，"常壓一真空一加溶媒一常壓一加壓一常壓"不斷循環(huán)進行差壓提取，真空度保持在0.8MPa，壓力保持20.OOMPa,進行4次循環(huán)提取。將提取液經(jīng)固液分離機械進行固液分離至澄清，得提取液，提取液進行微濾和超濾得濃縮液，噴霧干燥得野金柴提取物。以柚皮苷為對照品，紫外分光光度法測定野金柴活性提取物中總黃酮含量約為55%。藥效學(xué)資料一、實驗材料1、受試藥物與對照藥物實施例1的方法制得的野金柴低溫差壓式提取物(簡稱"活性提取物")，野金柴常規(guī)水提物(簡稱"常規(guī)水提物")，野金柴常規(guī)醇提物(簡稱"常規(guī)醇提物")，均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心提供。陽性對照藥達美康，天津華津制藥廠，批號070813。諾和靈，批號SVG0426，丹麥諾和諾德公司生產(chǎn)。氯化鈉注射液(500ml，湖南科倫制藥有限公司，041221)。2、實驗動物SD大鼠，SPF級，雌雄各半，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，正常飼養(yǎng)3天后供試。3、主要儀器與試劑BS110S電子天平，Sartorius公司生產(chǎn)；722光柵分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；SN-695B型智能放免r測量儀，上海原子核研究所R環(huán)一廠生產(chǎn)。血清生化試劑盒(AST,ALT,TG，TC，BUN、CREA)，由北京中生北控生物科技有限公司提供；MDA試劑盒，由南京建成生物有限公司提供。鏈脲佐菌素(str印tozotocin，STZ)，Sigma公司，臨用前用檸檬酸緩沖液配成濃度為3%的STZ溶液。羅康全血糖儀、血糖試紙(批號449497)，均瑞士羅氏制藥公司提供。胰島素試劑盒，北京科美東雅生物技術(shù)有限公司提供，批號20071025。鹽酸氨基胍(批號:396494)，sigma公司提供。糖化血清蛋白測定試劑盒(批號20070621)，由南京建成生物工程研究所提供。葡萄糖試劑盒(批號20070804),上海利欣生物技術(shù)研究所提供。尿糖試紙(批號20070410)，廣州巿花都高爾寶生物技術(shù)有限公司提供。4、統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS12.0進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差6±"表示。各指標采用單因素方差分析及t檢驗；對方差不齊的數(shù)據(jù)采用Kruskal-WallisH檢驗及q檢驗二、方法和結(jié)果1.對酒精性脂肪肝的保護作用取SD雌性大鼠160200g，隨機分成正常對照組、模型組、水飛薊素陽性對照組、聯(lián)本雙酯陽性對照組、野金柴活性提取物、野金柴常規(guī)水提物、野金柴常規(guī)醇提物。正常組每天上、下午分別灌服10ml/kg、20ml/kg飲用水；模型組上午灌服55°乙醇溶液10ml/kg，下午灌服20ml/kg飲用水；各給藥組每天上午灌服55°乙醇溶液10ml/kg，下午灌服不同濃度的藥液20ml/kg。正常組詞以普通飼料，自由飲水；模型組、各給藥組飼以自制20%的高脂低營養(yǎng)飼料，自由飲水。4周后，動物禁食12h后，眼眶取血，分離血清測定總膽固醇(TG)、總甘油三酯(TC)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，麻醉處死各組動物。測體重，取肝臟稱重，計算臟器系數(shù)。結(jié)果見表l。表l野金柴提取物對酒精性脂肪肝大鼠的治療作用(;c士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注模型組與正常組比較#p<0.05,卿〈0.01;給藥組與模型組比較，*p<0.05，林p〈0.01。結(jié)果顯示與正常組比較，灌服灑精及飼以高脂飼料后，模型組肝臟明顯腫脹，肝系數(shù)極顯著升高(p〈0.01)，同時血脂總膽固醇、總甘油三酯、谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平顯著升高(P〈0.05或p<0.01)。與模型組比較，陽性對照藥水飛薊素能顯著減輕肝臟腫大程度及抑制血脂總膽固醇、總甘油三酯的升高(p〈0.05或p〈0.01);陽性對照藥聯(lián)苯雙酯亦能極顯著抑制血脂總膽固醇、總甘油三酯的升高(p〈0.01);野金柴活性提取物能著抑制血脂總膽固醇、總甘油三酯的升高(p<0.05或p〈0.01);野金柴常規(guī)提取物能著抑制血脂總膽固醇、總甘油三酯的升高(p〈0.05),但效果弱于活性提取物。各治療組除聯(lián)苯雙酯外，均減輕肝臟系數(shù)及降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平作用，但無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果提示野金柴活性提取物對酒精加高脂飼料所致的慢性肝損傷有治療作用，能明顯降低血脂，改善肝功能，效果優(yōu)于常規(guī)水、醇提物。2.對2型糖尿病大鼠的治療作用2.1對2型糖尿病大鼠的治療作用隨機抽取9只大鼠作為正常對照組給普通飼料喂養(yǎng)。其余大鼠作為模型組，模型組大鼠給予高脂詞料(1%膽固醇，10°/。豬油，10%蛋黃粉，2%蔗糖，77%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)，喂養(yǎng)4周后將模型組的動物禁食(不禁水)12小時后，靜脈注射檸檬酸緩沖液(PH4.6)配置的4%STZ溶液30mg/kg，溶液先用微孔濾膜過濾。正常對照組腹腔注射同體積的檸檬酸緩沖液。3d后，尾靜脈用采血針取血測血糖，同時測尿糖。全血血糖^11臓ol/L，尿糖+++~++++,維持1周以上確定為造模成功。將造模成功的糖尿病大鼠分為4個組，分別為模型組(9只)、野金柴活性提取物飲料組(9只)、野金柴常規(guī)水提物灌胃組(9只)、野金柴常規(guī)醇提物灌胃組(9只)，組間及組內(nèi)動物分別作標記。正常對照組給予正常詞料、飲用自來水。模型組給予高脂伺料、飲用自來水。其它各給藥組均給予高脂飼料、相應(yīng)的野金柴提取物，每天換/給藥l次，連續(xù)給藥4周。給藥后每周檢測各組動物的尿糖、尿蛋白和體重一次并作記錄。形體枯痩、體重增長緩慢、尿糖、尿蛋白強陽性動物每周皮下注射胰島素5u/kg以防止動物死亡。藥液飲用配制取10ml藥液用蒸餾水稀釋至250mL大鼠直接飲用。連續(xù)給藥4周后，動物禁食12h,烏拉坦腹腔注射麻醉，稱體重并記錄，腹主動脈采血后，3000轉(zhuǎn)/min離心10min分離血清(取血的同時用血糖儀測空腹血糖值)。取部分血清測S0D、MDA、GSP水平；其余血清測胰島素(FNS)、甘油三脂(TG)、膽固醇(TC)水平。解剖大鼠取肝和腎，稱重，計算臟器系數(shù)；取一側(cè)腎和肝大葉，5%的甲醛溶液固定，作常規(guī)病理組織學(xué)檢查。結(jié)果見表2、3、4及圖i。表11各組大鼠治療4周后FBG、FNS、Ln(ISI)結(jié)果比較(x士s)組別給藥劑量(g生藥/kg)FBG(mmol.L—')FNS(咖oLL—')Ln(ISI)正常組一10.6±1.794±12.7-6.91±0.15模型組—28.6±5.卿134±50,7-8.05±0.61##活性提取物522.8±4.7*U3±53.5-7.64±0.53林<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注與空白組比較，#p<0.05,,<0,01;與模型組比較*p<0.05，**P<0.01。注射STZ后,模型大鼠毛色枯燥松散，無光澤，自發(fā)活動減少,對外界刺激性的敏感性下降,大便較正常組動物稀溏，明顯出現(xiàn)多尿,多飲，多食癥狀。各治療組大鼠給藥后三多癥狀均有一定程度改善，毛色較造模組潤澤，自發(fā)活動增多，對外界的刺激較敏感。每周對尿葡萄糖進行檢測時，未治療組大鼠顯著呈強陽性。從表2可以看出，與空白組比較，模型組治療4周后，空腹血糖極顯著高于空內(nèi)組(P〈0.01)，空腹胰島素血清水平升高,但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，而胰島素敏感指數(shù)明顯下降，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P〈0.01);與模型組比較，野金柴活性提取物組治療4周后，空腹血糖降低，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，空腹胰島素血清水平降低，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，胰島素敏感指數(shù)明顯升高，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P〈0.01);與模型組比較，野金柴常規(guī)水提物、醇提物組治療4周后，空腹血糖降低，胰島素敏感指數(shù)略有所升高，但空腹胰島素血清水平升高，均無統(tǒng)計學(xué)差異(p〉0.05)。提示野金柴活性提取物一定程度上能降低血糖的同時又能升高2型糖尿病大鼠胰島素敏感指數(shù)，即改善胰島素抵抗；效果優(yōu)于常規(guī)水、醇提物。表3各組大鼠治療4周后骯臟、腎臟系數(shù)結(jié)果比較(x士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注與空白組比較，#p<0.05，##p〈0.01;與模型組比較*p<0.05,**p<0.01。正常組大鼠肝臟、腎臟肉眼觀察顏色鮮紅、表面光滑；高脂飼料飼養(yǎng)8周后，模型組糖尿病大鼠肝臟有點呈赭黃色、表面粗糙無光澤，腎臟體積增大；野金柴各給藥組肝臟、腎臟的顏色、表面光澤程度較模型組稍有改善。從表12亦可以看出模型組肝、腎系數(shù)均大于正常組，有顯著性差異(P〈0.01)，提示模型組大鼠造模喂以高脂飼料飼養(yǎng)后可引起肝、腎損傷，致其腫大。與模型組比較，野金柴活性提取物組具有不同程度抑制肝、腎腫大的作用，效果優(yōu)于常規(guī)水、醇提物，但均無統(tǒng)計學(xué)差異。提示野金柴活性提取物一定程度上能改善2型糖尿病大鼠肝腎的損傷程度，可能與其活血化瘀、增加機體對胰島素敏感性的作用有關(guān)。表4各組大鼠治療4周后GSP、TG、TC及腎組織MDA、S0D結(jié)果比較(x±<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注與空白組比較，#p<0.05，ttttp〈0.01;與模型組比較*p<0.05,**p<0.01。表4顯示與正常組比較，模型組糖尿病大鼠血清糖化血清蛋白(GSP)、甘油三脂(TG)、膽固醇(TC)、腎組織過氧化產(chǎn)物(MDA)水平極顯著升高(P〈0.01)，而腎組織超氧化物歧化酶(S0D)極顯著下降(P〈0.01)，提示用鏈脲佐菌素及高脂飼料造模的糖尿病大鼠血脂水平較高、高血糖誘發(fā)糖基化產(chǎn)物及過氧化產(chǎn)物增多。與模型組比較，野金柴活性提取物組大鼠血清GSP、TG及MDA水平下降，S0D升高，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05或P〈0.01)，膽固醇(TC)水平有一定程度的下降，但無統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05);常規(guī)水、醇提物組GSP、TG、TC、MDA、S0D水平無統(tǒng)計學(xué)差異，效果弱于活性提取物。結(jié)果提示野金柴活性提取物飲用能夠降低2型糖尿病大鼠高血脂程度、糖基化產(chǎn)物、組織過氧化物的產(chǎn)生，提高組織抗高血糖所致過氧化損傷的能力，具有防治制糖尿病并發(fā)癥產(chǎn)生或加重的作用。圖1不同給藥組糖尿病大鼠肝臟、腎臟病理組織學(xué)改變病理組織學(xué)檢査結(jié)果模型組大鼠9例出現(xiàn)肝細胞嚴重水腫，胞漿疏松化，5例出現(xiàn)明顯脂肪變；部分動物腎小管上皮組織分布不均勻；野金柴活性提取物飲用9例出現(xiàn)肝細胞輕微水腫，l例脂肪變，腎臟未發(fā)現(xiàn)明典型病變；野金柴提取物水提物組出現(xiàn)6例肝細胞水腫，3例輕微水腫，2例脂肪變，程度均輕于模型組，腎臟未發(fā)現(xiàn)明典型病變；野金柴提取物醇提物組出現(xiàn)5例肝細胞水腫，4例輕微水腫，l例脂肪變，程度均輕于模型組，腎臟未發(fā)現(xiàn)明典型病變。26.2對糖尿病大鼠糖代謝的影響隨機抽取6只大鼠作為正常對照組給普通飼料喂養(yǎng)。其余大鼠作為模型組，模型組大鼠給予高脂詞料(1%膽固醇，10%豬油，10%蛋黃粉，10%蔗糖，69%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)，4周后將模型組的動物禁食(不禁水)過夜，腹腔注射檸檬酸緩沖液(PH4.4)配置的STZ溶液30mg/kg。正常對照組腹腔注射同體積的檸檬酸緩沖液。3d后禁食過夜，尾靜脈用采血針采血測血糖。全血血糖>11ramol/L,尿糖+++++++,維持1周以上確定為糖尿病模型。將糖尿病大鼠分為3個組，分別為模型組、達美康給藥組、野金柴活性提取物組、野金柴常規(guī)水提物組、野金柴常規(guī)醇提物組，每組10只，組間及組內(nèi)動物分別作標記。正常對照組給予正常飼料，其余各組均給予高脂高糖飼料。各給藥組給藥劑量見下表，模型對照組與正常對照組每天灌服等容量的蒸餾水，每天給藥l次，連續(xù)給藥5周。于給藥前、給藥后2周，動物禁食12h，烏拉坦腹腔注射麻醉，眼球采血，分離血清，測定給藥前后血糖(FBG)及胰島素水平(INS),計算胰島素敏感指數(shù)(ISI)，結(jié)果見表5。于給藥第21天，動物禁食3h，采Omin血后，灌服葡萄糖溶液2.Og/kg,于灌服后30rain、丄h、2h分別測定血糖。于給藥第25天，未禁食狀態(tài)下取血測定Omin血糖值，立即皮下注射諾和靈(40倍生理鹽水稀釋)0.5u/kg，于注射后40min、80min、120min測定血糖，結(jié)果見表6。表5野金柴提取物對糖尿病大鼠胰島素敏感指數(shù)的影響(S±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注模型組與正常組比較#p<0.05，flttp〈0.01;給藥前與給藥后比較，*p<0.05，林p〈0.01表5結(jié)果顯示與正常組大鼠比較，模型組大鼠給藥前后胰島素敏感指數(shù)均極顯著低于正常大鼠，提示糖尿病大鼠胰島素敏感指數(shù)下降。與給藥前比較，正常組的胰島素敏感指數(shù)給藥前后無變化，模型組的胰島素敏感指數(shù)略有下降但無統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)，陽性對照達美康、野金柴活性提取物組的胰島素敏感指數(shù)均有顯著提高(P〈0.05);野金柴常規(guī)水、醇提物組的胰島素敏感指數(shù)均有提高，但無統(tǒng)計學(xué)差異。提示野金柴活性提取物與達美康一樣能提高糖尿病大鼠的胰島素敏感指數(shù)，改善糖代謝。表6野金柴提取物對糖尿病大鼠胰島素耐量、糖耐量的影響(^±^)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>在胰島素耐量試驗中，大鼠皮下注射胰島素后，血糖開始下降，不同給藥組大鼠血糖達到最低值時間各有不同。表6結(jié)果顯示注射胰島素40min時，正常大鼠、野金柴活性提取物、野金柴常規(guī)水提物、野金柴常規(guī)醇提物組動物的血糖降到最低，而模型組、陽性對照藥達美康組血糖則在80min時才達到最低值，提示正常組、野金柴各提取物給藥組大鼠較模型組與達美康給藥組大鼠對外源性胰島素的敏感性大，野金柴提取物能增強糖尿病大鼠對外源性胰島素的敏感性，其中以活性提取物的效果最佳。在糖耐量試驗中，大鼠灌服一定劑量的葡萄糖后，血糖開始上升，不同給藥組大鼠血糖達到峰值時間不同正常組、達美康給藥組、野金柴常規(guī)水提物、野金柴常規(guī)醇提物組組血糖出現(xiàn)峰值的時間為30min，隨后血糖開始下降，而模型組血糖持續(xù)提高，在60min時達到高峰，隨后才開始下降，提示模型組大鼠糖耐量比正常組及給藥組差，野金柴各提取物能改善糖尿病大鼠的糖耐量、改善糖代謝，其中活性提取物組的血糖升高幅度小于常規(guī)水、醇提物組。綜合以上兩個試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)野金柴活性提取物不僅能增強糖尿病大鼠對外源性胰島素的敏感性，同時能改善糖耐量、促進血糖代謝，抑制攝糖后血糖持續(xù)升高，表明野金柴活性提取物對2型糖尿病大鼠有良好的治療作用。本發(fā)明人進一步用實施例2-4制得的提取物以及其余實施例制得的制劑進行各種藥效學(xué)試驗和對照試驗，獲得與用實施例1制得的提取物相類似的效果，這里不再重復(fù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當可以理解本發(fā)明的提取方法獲得的提取物均能達到"提取物含有1090質(zhì)量％總黃酮，以及提取物顏色為淡黃色至棕色"的效果，并且由此推斷得知這些提取物相對于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)制得的常規(guī)水提物或醇提物具有更好的藥效性質(zhì)。這些提取方法均是本發(fā)明人通過大量試驗獲得的并首次提出的，在現(xiàn)有技術(shù)中均未見記載，并且這些提取方法由于能獲得相接近的效果而使得這些提取方法之間具有單一性。權(quán)利要求1、一種野金柴活性提取物，其特征在于采用大孔吸附樹脂法、柱色譜法、膜分離濃縮技術(shù)、噴霧干燥技術(shù)、冷凍干燥技術(shù)中任意一種或多種方法和低溫差壓式提取法的組合進行制備獲得，該提取物含有10～90質(zhì)量％總黃酮，提取物顏色為淡黃色至棕色。2、如權(quán)利要求1所述的野金柴活性提取物，其特征在于該提取物高效液相指紋圖譜285nm檢測有26個特征峰，其中6個峰為主要峰，占總峰面積的89%以上；提取物高效液相指紋圖譜345nm檢測有26個特征峰，其中14個峰為主要峰，占總峰面積的95%以上。3、如權(quán)利要求1所述的野金柴活性提取物，其特征在于該提取物用體積比為濃度2%6%的鹽酸水解，水解溫度9(TC,水解時間60分鐘，高效液相指紋圖譜有4個特征峰，當鹽酸濃度達到6%但低于12%時色譜圖中細小的峰明顯增多，鹽酸濃度的增高化合物被水解成的碎片越多，當濃度達到12%時，高效液相指紋圖譜中無色譜峰，化合物基本被水解氧化完全。4、權(quán)利要求l所述的野金柴活性提取物，其特征在于野金柴為江西殼斗科植物多穗石柯(Lithocarpuspolystachyus(wall)Rehd或L.litseifolius(Hamce)Chun.)整個植株或任何部位以及其經(jīng)過各種炮制方法制得的炮制品。5、權(quán)利要求1所述的野金柴活性提取物，其特征在于所述黃酮類成分包括與堿和金屬鹽形成的金屬鹽類衍生物以及與金屬離子形成的金屬離子絡(luò)合物。6、權(quán)利要求1所述的野金柴活性提取物的制備方法，其特征在于包括以下一個或幾個步驟提取所用溶劑是水或任意一種醇類、酮類及酯類溶劑，或這些溶劑按一定比例組成的混合溶劑，或是由這些溶劑與酸、堿、鹽配成的酸性或堿性溶劑；提取方法是低溫差壓式提取、超聲提取、冷浸、滲漉、微波提取中的一種或多種；過濾包括離心、抽濾、超濾、微濾，使用或不使用以下任一種澄清劑或其組合醇沉液劑、明膠、高嶺土、硅澡土、各種樹脂、聚乙二醇、聚乙三醇、殼聚糖以及天然澄清劑成口叩；濃縮包括常壓或減壓條件下的薄膜蒸發(fā)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、煎煮濃縮、膜分離濃縮技術(shù)、懸浮冷凍濃縮、漸進冷凍濃縮、自然外循環(huán)兩相流濃縮、外循環(huán)式冷凍濃縮、噴霧冷凍濃縮；干燥包括真空干燥、噴霧干燥、冷凍干燥。7、權(quán)利要求1所述的野金柴活性提取物的制備方法，其特征在于當使用大孔吸附樹脂法時，所用的大孔樹脂是非極性、弱極性、中等極性、極性、弱堿性或弱酸性中的任何一種類型，如D101、X_5、NKA、S_8、NKA—9、HPD—600、ADS—7、AB—8、LSA—5B、HPD—722、ADS—17、DM130、HPD—826、DN—300、DN—603、FL—1、FL—2、FL—3等，其中優(yōu)選的為弱極性、中等極性或極性的樹脂，如AB—8、ADS—17、HPD—600等，所用的洗脫劑為水、含水乙醇、甲醇、丙酮等。8、權(quán)利要求1所述的野金柴活性提取物的制備方法，其特征在于當使用柱色譜以聚酰胺為固定相時，所用的層析聚酰胺樹脂是30-60目、60—120目、100—120目，其中優(yōu)選為30—60目的樹脂，所用的洗脫劑為水、含水乙醇、甲醇、丙酮。9、權(quán)利要求1所述的野金柴活性提取物的制備方法，其特征在于當使用低溫差壓式提取法時，同時聯(lián)合使用膜分離濃縮技術(shù)、噴霧干燥技術(shù)制備野金柴活性提取物，該方法是在一35'C4(TC的溫度條件，通過"常壓一真空一加溶媒一常壓一加壓一常壓"不斷循環(huán)的壓力變化來提取化學(xué)成分，真空度根據(jù)需要在13.33Pa0.99MPa范圍選擇，壓力根據(jù)需要在0.99MPa25.OOMPa范圍選擇，循環(huán)次數(shù)根據(jù)需要在1100次范圍選擇；溶媒根據(jù)需要選取水、有機溶劑或它們的混合物，加入量根據(jù)需要按被提取物與溶媒的重量體積比在1:11.-500的范圍選擇。10、權(quán)利要求1所述的野金柴活性提取物的制備方法，其特征在于當使用膜分離濃縮技術(shù)時，可采用微濾截留直徑大小在0.lpm以上的物質(zhì)、超濾截留分子量在1000500000之間的可溶性物質(zhì)、納濾截留分子量在150以上及直徑在lnm左右的物質(zhì)中的任兩種方式的組合進行分離濃縮，使用的材質(zhì)是有機類醋酸纖維素、聚丙稀、聚碳酸酯、聚砜、聚酰胺或無機類陶瓷、金屬、金屬氧化物、炭、多孔玻璃中的任一種。11、權(quán)利要求7和8任一項所述的野金柴活性提取物的制備方法，其特征在于選用AB一8、ADS—17、HPD—600的弱極性、中等極性或極性的大孔吸附樹脂和3060目的層析聚酰胺樹脂作為純化用樹脂，野金柴提取物上樣液以生藥量計稀釋倍數(shù)為1:11:20，吸附流速O.510BV/h，樹脂柱徑高比l:11:15，以生藥量計上樣量為0.1lg/ml，以110倍樹脂體積的純化水除雜，除雜流速為110BV/h，用10%95%乙醇洗脫110倍樹脂體積，洗脫流速為110BV/h。12、權(quán)利要求1所述的野金柴活性提取物的制備方法，其特征在于取野金柴干品，粉碎成100目粉，加10倍量水常溫浸泡1.5小時后用低溫差壓式提取，溫度2(TC，壓力lO.OOMPa，循環(huán)次數(shù)30次，使用聚碳酸酯膜分離濃縮技術(shù)進行濃縮，可采用微濾截留直徑大小在0.lpm以上的物質(zhì)、超濾截留分子量在1000500000之間的可溶性物質(zhì)、納濾截留分子量在150以上及直徑在lnm左右的物質(zhì)中的任兩種方式的組合進行分離濃縮，將所得濃縮提取液用AB—8中等極性大孔吸附樹脂純化，以生藥量計上樣液稀釋倍數(shù)為1:10，吸附流速6BV/h，樹脂柱徑高比l:12，以生藥量計上樣量為0.5g/ml，以6倍樹脂體積的純化水除雜，除雜流速為8BV/h，用10%95%乙醇洗脫5倍樹脂體積，洗脫流速為6BV/h，提取液經(jīng)真空干燥，所得浸膏即為野金柴提取物。13、權(quán)利要求1所述的野金柴活性提取物的應(yīng)用，其特征在于該提取物可以單獨或與其它任何中西藥物或食物按任意比例配伍，用于制備藥物或功能性食品。14、權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其特征在于所制得的藥物或功能性食品是膠囊劑、片劑、丸劑、顆粒劑、口服液、糖漿、沖劑、酒劑、注射劑、膏劑、散劑、飲料、巴布劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種野金柴提取物及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明所述的野金柴活性提取物以江西野金柴殼斗科植物多穗石柯(Lithocarpuspolystachyus(wall)Rehd或L.litseifolius(Hamce)Chun.)藥材為原料，采用低溫差壓式提取法、溶劑萃取法、大孔吸附樹脂法、柱色譜法、膜分離濃縮技術(shù)、噴霧干燥技術(shù)、冷凍干燥技術(shù)中任意一種方法，或這些方法的任意組合進行制備。其特征在于采用現(xiàn)代先進的低溫差壓式提取技術(shù)配合膜分離濃縮技術(shù)、噴霧干燥技術(shù)制備野金柴活性提取物，利用大孔吸附樹脂、聚酰胺分離富集技術(shù)配合冷凍干燥技術(shù)制備高純度的野金柴總黃酮提取物。本發(fā)明野金柴活性提取物含有10～90％總黃酮，該活性提取物保肝降脂、抗2型糖尿病及糖尿病并發(fā)癥等藥理活性高于常規(guī)水提物、醇提物。文檔編號A61K9/00GK101401829SQ200810026428公開日2009年4月8日申請日期2008年2月25日優(yōu)先權(quán)日2008年2月25日發(fā)明者侯少貞,冼小敏,曾峰宇,蔣東旭,謝友良,賴小平,陳吉航,陳建南,艷陶,松黃申請人:東莞廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院