專利名稱：一種眼眶緣組織工程骨及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組織工程化骨，具體地說(shuō)關(guān)于一種眼眶緣組織工程骨 及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
眼眶緣呈不規(guī)則的類圓形開(kāi)口狀，其作為面部最中心的部位，不僅參 與了面部輪廓的塑造，而且對(duì)保護(hù)目W求起著重要作用。先天性畸形、腫瘤 手術(shù)、外傷及炎癥均可能造成眶緣的骨缺損或發(fā)育不全，需要對(duì)骨折、缺 損、畸形的眶緣進(jìn)行修復(fù)重建。目前國(guó)內(nèi)外使用的眼眶緣修復(fù)材料包括自 體骨、異體骨及多種人工材料。
自體骨移植一直以來(lái)都是臨床各種骨修復(fù)手術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)，但是自體骨 的來(lái)源有限，而且供區(qū)存在出血、感染、慢性疼痛等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。異體
骨來(lái)源廣泛，具有良好的骨傳導(dǎo)性，但不具有骨誘導(dǎo)性，而且存在傳播HIV 和乙型肝炎等傳染性疾病及引起免疫排斥反應(yīng)的潛在危險(xiǎn)。異種異體骨移 植來(lái)源于動(dòng)物，供應(yīng)豐富，但是雖然經(jīng)過(guò)各種方法加以處理，去處其內(nèi)部 的抗原性物質(zhì)，但是仍不可完全避免發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，此外異種 骨移植存在傳播動(dòng)物源性疾病的危險(xiǎn)，并存在倫理方面的問(wèn)題。應(yīng)用于眼 眶緣修復(fù)的人工材料主要包括高分子多孔聚乙烯、羥基磷灰石和鈥金屬，這些材料均不能降解或降解4艮慢，長(zhǎng)期作為異物存在于機(jī)體內(nèi)，故存在發(fā) 生排異反應(yīng)、感染、囊腫形成和植入物移位等并發(fā)癥的危險(xiǎn)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者
嘗試了多種可吸收材料進(jìn)行眼眶緣缺損的修復(fù)，例如聚L-乳酸、聚L/DL-乳酸、聚乙醇酸等，但是這些材料降解速度不可控，在水解過(guò)程中會(huì)釋放 大量酸性物質(zhì)，刺激組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，而且材料內(nèi)部沒(méi)有細(xì)胞，成骨依 賴于宿主骨的細(xì)胞參與，導(dǎo)致其才l7v體內(nèi)后愈合速度緩慢,甚至無(wú)法愈合。 因此，目前臨床上尚缺乏理想的眼眶眶續(xù) 修復(fù)材料。
20世紀(jì)90年代以來(lái)，隨著組織工程學(xué)的迅速發(fā)展和多學(xué)科如分子生 物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物材料學(xué)、眼眶外科學(xué)的共同發(fā)展和學(xué)科交叉、融 合4吏得利用組織工程技術(shù)構(gòu)建骨組織成為可能，并被認(rèn)為是骨替代材料發(fā) 展的方向。目前應(yīng)用組織工程骨修復(fù)骨缺損的研究，主要集中在骨科和口 腔科領(lǐng)域，已經(jīng)在細(xì)胞的取材、體外培養(yǎng)、成骨誘導(dǎo)、細(xì)胞與支架材料的 復(fù)合等方面取得了較大的H并有研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了體外構(gòu)建 的組織工程骨能夠修復(fù)下頜骨、四肢骨、顱骨等缺損。但是國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn) 應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)眼眶緣缺損的相關(guān)研究。基于眶緣解剖結(jié)構(gòu)的特殊 性，應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)缺損時(shí)與四肢骨、下頜骨等承重骨存在顯著的 不同 一是眶緣形態(tài)復(fù)雜，個(gè)體差異大，所以需對(duì)支架材料進(jìn)行個(gè)體化預(yù) 制，以保證對(duì)骨缺損部位的形態(tài)學(xué)修復(fù)。二是眶緣為非承重骨，所承受應(yīng) 力較低，而我們知道骨改建與應(yīng)力有密切關(guān)系，骨組織會(huì)隨著其所受的應(yīng) 力而發(fā)生相應(yīng)的改建。所以，在低應(yīng)力的環(huán)境下，植入的材料逐步降解之 后，新生骨組織會(huì)發(fā)生怎樣的改建，是否會(huì)形成我們所期待的眶緣形態(tài)及 功能還有待研究。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN1846793^^開(kāi)了 "一種組織工程骨及其構(gòu)建與應(yīng)用，，， 所述的組織工程骨，包括載體支架和種子細(xì)胞，種子細(xì)胞附著于載體支架 上，形成具有骨組織三維結(jié)構(gòu)和生物活性的復(fù)合體，所述的載體支架為改 性的具有大孔徑和高孔隙率并經(jīng)過(guò)去酸化處理的PLGA，其上負(fù)載有細(xì)胞因 子骨形態(tài)發(fā)生蛋白，即BMP;種子細(xì)胞為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。所述的組織工 程骨可用于構(gòu)建修復(fù)大段骨缺損的功能性組織工程化骨移植物。中國(guó)專利 文獻(xiàn)CN197391(V^開(kāi)了 "組織工程骨及其制造方法"。中國(guó)專利文獻(xiàn) CN101085374公開(kāi)了 "一種組織工程化骨復(fù)合體及應(yīng)用"。但是，關(guān)于一 種眼眶緣組織工程骨及其應(yīng)用方面未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于 (1)提供一種眼眶緣組織工程骨； (2 )提供一種眼眶緣組織工程骨的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的構(gòu)建眼眶緣組織工程 骨，其核心是建立骨種子細(xì)胞與支架材料的三維空間復(fù)合體。本發(fā)明以成 骨誘導(dǎo)的自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal cells, BMSCs )作 為種子細(xì)胞，預(yù)制三維外形的p-磷酸三鉤(p-Tricalcium Phosphate, 卩-TCP)作為支架材料，體外復(fù)合構(gòu)建個(gè)體化的眼眶緣組織工程骨。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下 一種眼眶緣組織工程骨，它由下列方法制得 (1)骨種子細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)；(2) 制備個(gè)體化的骨修復(fù)支架；(3) 骨種子細(xì)胞和骨修復(fù)支架體外復(fù)合并進(jìn)行培養(yǎng)； 其中所述的步驟(3)是將培養(yǎng)至第二代時(shí)的骨種子細(xì)胞和骨修復(fù)支架復(fù)合，形成骨種子細(xì)胞和骨修復(fù)支架復(fù)合物。所述的骨種子細(xì)胞和骨修復(fù)支架復(fù)合物在體外培養(yǎng)時(shí)間為5天。 所述的骨修復(fù)支架是根據(jù)立體光刻模型進(jìn)行翻模制作得到的，立體光刻模型所需的數(shù)據(jù)是通過(guò)下列方法得到的CT掃描、通過(guò)Medgraphics軟件和Magic. RP軟件進(jìn)行三維建模處理、得到計(jì)算機(jī)三維模型數(shù)據(jù)。 所述的計(jì)算機(jī)三維模型中眼眶緣缺損部位的數(shù)據(jù)作為支架形狀;f莫型數(shù)據(jù)。立體光刻模型是根據(jù)計(jì)算機(jī)三維模型數(shù)據(jù)的1.16倍制作。 支架材料選自珊瑚、羥基磷灰石或磷酸三鈣中的一種。 磷酸三鈣是P-磷酸三鈣。 所述的骨種子細(xì)胞是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。所述的骨種子細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)在oc-MEM培養(yǎng)液中添加入50 |iM的抗 壞血酸、10mM的P-磷酸甘油、10nM的地塞米松作為成骨誘導(dǎo)劑 組織工程化骨在眼眶多彖缺損^^復(fù)領(lǐng)域中應(yīng)用。本發(fā)明所公開(kāi)一種眼眶緣組織工程骨及其應(yīng)用，其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在(1) 本發(fā)明制造的P-TCP支架具有良好的內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)和生物相容性，適宜 BMSCs的黏附、生長(zhǎng)和增殖，達(dá)到眼眶緣骨修復(fù)的力學(xué)要求。(2)應(yīng)用 CAD/CAM技術(shù)對(duì)p-TCP三維支架進(jìn)行預(yù)制，為眶緣的修復(fù)提供了一個(gè)良好 的形態(tài)修復(fù)基礎(chǔ)，并方便了手術(shù)操作。(3)應(yīng)用成骨誘導(dǎo)的自體BMSCs作為種子細(xì)胞，創(chuàng)傷小、無(wú)免疫原性、在短期內(nèi)能夠獲得大量有成骨能力
的細(xì)胞。(4)在體外構(gòu)建并培養(yǎng)的眶緣組織工程骨，與正常眼眶緣的組織結(jié)構(gòu)和特性相似，在體內(nèi)能夠在支架材料降解的同時(shí)促進(jìn)自體骨再生，并發(fā)生合理的骨改建，最終為自體骨組織所替代，達(dá)到形態(tài)與功能的雙重》務(wù)復(fù)。(5)本發(fā)明選用培養(yǎng)至第二代時(shí)的骨種子細(xì)胞和骨^^復(fù)支架復(fù)合，形成的復(fù)合物在體外培養(yǎng)5天。優(yōu)化了本發(fā)明，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間和實(shí)驗(yàn)費(fèi)用。


圖1:應(yīng)用鏡像技術(shù)，根據(jù)CT數(shù)據(jù)重建的犬頭顱SLA三維模型，并標(biāo)記了眼眶緣缺損的部位。
圖2:應(yīng)用CAD/CAM技術(shù)制作的眶緣缺損部位的SLA樹(shù)脂沖莫型。圖3:根據(jù)SLA模型預(yù)制的p-TCP支架材料。
圖4: BMSCs與卩-TCP支架在體外復(fù)合5天時(shí)，掃描電鏡觀察材料表面已經(jīng)完全被細(xì)胞所覆蓋，細(xì)胞增殖旺盛、并分泌膠原纖維。
圖5: BMSCs與(3-TCP支架在體外復(fù)合5天時(shí)，掃描電4竟觀察細(xì)胞在材料內(nèi)部帖壁生長(zhǎng)，并相互交聯(lián)形成網(wǎng)狀。
圖6:組織工程骨植入犬皮下1月即見(jiàn)新生骨組織和血管形成(50X )。
圖7:組織工程骨檔入犬皮下3月時(shí)新生骨明顯增多，并可見(jiàn)豐富的新生血管和骨髓脂肪組織(50X )。
圖8:術(shù)中應(yīng)用體外構(gòu)建的眶緣組織工程骨修復(fù)犬眶下緣骨缺損，植入物與骨斷端吻合良好。
圖9:眶緣組織工程骨修復(fù)犬眶下緣缺損3月后，CT影像示修復(fù)后的眶下緣外形良好。圖10A:大體觀察可見(jiàn)眶下緣缺損得到良好修復(fù)，具備正常生理形態(tài)， 斷端處為骨樣連接，骨質(zhì)豐^l"。圖10B:大體觀察可見(jiàn)眶下緣缺損得到良好修復(fù)，具備正常生理形態(tài)， 斷端處為骨樣連接，骨質(zhì)較厚。(外側(cè)面)圖10C:大體觀察可見(jiàn)眶下緣缺損得到良好修復(fù)，具備正常生理形態(tài)， 斷端處為骨樣連接，骨質(zhì)較厚。(內(nèi)側(cè)面)圖11:眶緣組織工程骨修復(fù)犬眶下緣缺損3月后，Micro-CT顯示植 入物與骨斷端已形成骨性連接，新生骨小梁逐步替代支架材料。圖12:眶緣組織工程骨修復(fù)犬眶下緣缺損3月后，硬組織切片熒光顯微鏡下觀察材料內(nèi)部可見(jiàn)廣泛分布的條帶狀熒光標(biāo)記區(qū)域，相互交聯(lián) 呈網(wǎng)狀(50x)。圖13A:眶緣組織工程骨修復(fù)犬眶下緣缺損3月后，硬組織切片VAN GIESON-苦味酸品紅染色觀察有較多深紅色編織骨結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)成熟的4反 層骨，材料兩端與正常骨之間為緊密的骨性連接。圖13B:眶緣組織工程骨修復(fù)犬眶下緣缺損3月后，硬組織切片VAN GIESON -苦^^未酸品紅染色觀察可見(jiàn)新生的成熟板層骨(50 x )。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。 實(shí)施例1體外構(gòu)建犬眼眶緣組織工程骨一、 BMSCs體外成骨i秀導(dǎo)培養(yǎng)及4全測(cè)
BMSCs在應(yīng)用添加了 P -磷酸甘油、地塞米松及抗壞血酸的oc -MEM培 養(yǎng)液進(jìn)行體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，以未誘導(dǎo)BMSCs為對(duì)照，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)及 成骨活性檢測(cè)。結(jié)果顯示犬BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后細(xì)胞生長(zhǎng)周期以及 細(xì)胞增殖不受影響，可傳至10代以上，細(xì)胞形態(tài)和增殖率仍與原代基本 相似，足夠數(shù)量作為種子細(xì)胞種植載體；ALP、鈣結(jié)節(jié)染色呈強(qiáng)陽(yáng)性；表 達(dá)成骨標(biāo)志性蛋白(0CN， 0PN， BSP， Cbfal、 I型膠原等)及成骨相關(guān)基 因(0CN， 0PN， BSP)。而未誘導(dǎo)BMSCs的ALP染色呈弱陽(yáng)性、鉤結(jié)節(jié)染色 陰性，成骨標(biāo)志性蛋白及相關(guān)基因的表達(dá)量低于誘導(dǎo)組。
二、 犬眼眶緣P-TCP三維支架材料的制造 建立犬眼眶緣缺損才莫型眶下緣長(zhǎng)25mm的截?cái)嘈匀睋p。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
犬頭顱進(jìn)行螺旋CT掃描，層厚為0. 625mm，螺距為1. 375mm,KV值為200mA; 然后進(jìn)行容積重建，重建厚度為1.25mm，間隔0.4mm。將CT資料以 DIC0M(Digital Imaging and Communications in Medicine)格式輸出, 通過(guò)Medgraphics軟件和Magic. RP (Magic Rapid Prototyping)軟件進(jìn)行 三維建模處理，得到犬頭顱的三維模型。釆用鏡像技術(shù)對(duì)犬頭顱三維才莫型 進(jìn)行處理，得到眼眶緣缺損區(qū)域的三維模型，然后通過(guò)立體光刻
(Stereolithography， SLA)快速原型的制作，得到眶緣骨缺損的樹(shù)脂模 型?？紤]到后續(xù)加工，需對(duì)材料進(jìn)行拋光處理，會(huì)損失一部分體積，故本 研究采用的SLA模型是根據(jù)真實(shí)犬頭顱CT數(shù)據(jù)的1. 16倍制作，已預(yù)留了 體積作為后續(xù)加工所需要的損耗。使用該樹(shù)脂模型進(jìn)行硅橡膠取陰模，將
P-TCP粉末攪拌成糊狀后注入模具，放入干燥箱8(TC中12小時(shí)，然后進(jìn)行4鼓波燒結(jié)一次成型。其中CT數(shù)據(jù)重建犬頭顱三維模型(圖1),根據(jù)鏡
像技術(shù)得到眶緣缺損部位的三維模型，并制造SLA樹(shù)脂模型(圖2)，根 據(jù)SLA模型對(duì)P -TCP支架進(jìn)行個(gè)性化預(yù)制(圖3 )，并對(duì)材料進(jìn)行內(nèi)部結(jié) 構(gòu)及力學(xué)性能的檢測(cè)。結(jié)果顯示制備的P-TCP支架為多孔、較為致密， 5ml注射器針尖不能輕易刺入，材料親水性良好?？粝戮壷Ъ懿牧吓c犬真 實(shí)解剖結(jié)構(gòu)符合，為不身見(jiàn)則形，長(zhǎng)約25mm,寬約10mm。內(nèi)部呈均勻的多 孔三維結(jié)構(gòu)，平均孔徑406. 3 jam,孔隙率約為84. 63%,力學(xué)強(qiáng)度〉2Mpa, 達(dá)到眼眶緣組織工程支架的要求。
三、BMSCs與p -TCP支架復(fù)合體外構(gòu)建眶纟彖組織工程骨
成骨誘導(dǎo)BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)至第二代時(shí)，胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)離心，制 備細(xì)胞懸液并調(diào)整密度為2 x 107 cells/ml。以單細(xì)胞懸液滴滲法接種到 無(wú)菌培^jnL中的預(yù)制P-TCP支架上，得到細(xì)胞/支架復(fù)合體。將該復(fù)合體 在37。C培養(yǎng)箱(5°/。C02, 95°/。02， 100%飽和濕度)中靜置4小時(shí),以利于細(xì) 胞貼壁。之后緩慢加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，充分浸沒(méi)材料，于上述條件繼續(xù) 培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液。分別于復(fù)合4小時(shí)、1天、3天、5天和7天， 分別取2個(gè)細(xì)胞材料復(fù)合體進(jìn)行電鏡觀察。以銳利刀片將其中一個(gè)標(biāo)本切 為兩個(gè)半圓部分，以了解細(xì)胞在支架內(nèi)部的分布增殖情況。結(jié)果顯示P -TCP具有良好的多孔三維結(jié)構(gòu)，與BMSCs在體外復(fù)合4小時(shí)就完成了黏 附，較適宜的體外復(fù)合培養(yǎng)時(shí)間為5天(圖4，圖5 )。 實(shí)施例2
體外構(gòu)建的眼眶緣組織工程骨異位成骨能力的實(shí)—驗(yàn) 按實(shí)施例l的方法體外復(fù)合自體誘導(dǎo)BMSCs和(3 -TCP支架材料構(gòu)建組織工程骨。
每只犬背部皮下植入3塊材料自體誘導(dǎo)BMSCs復(fù)合TCP l塊，自體未 誘導(dǎo)BMSCs復(fù)合TCP l塊，單純TCP材料1塊。手術(shù)方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物犬麻醉后， 于其背部3個(gè)獨(dú)立分開(kāi)區(qū)域各切開(kāi)1. 5cm的小口，充分游離周圍的皮下組織 后將材料植入，用l號(hào)線間斷縫合切口 。
分別于材料植入后l月、2月、3月取出標(biāo)本，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3只犬 的背部皮下標(biāo)本9塊(即自體誘導(dǎo)BMSCs復(fù)合TCP、自體無(wú)誘導(dǎo)BMSCs復(fù) 合TCP、單純TCP材料各3塊)。標(biāo)本經(jīng)4%多聚曱醛固定后用10y。EDTA溶 液脫鈣，行HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察新骨形成和血管化情況。
結(jié)果顯示自體誘導(dǎo)BMSCs復(fù)合TCP支架材料構(gòu)建的組織工程骨植入 犬皮下1月即見(jiàn)新生骨組織和血管形成，3月時(shí)新生骨明顯增多，并可見(jiàn) 豐富的新生血管和骨髓脂肪組織(圖6,圖7 )。未誘導(dǎo)BMSCs/ P -TCP復(fù) 合物僅見(jiàn)少量成骨，而單純P-TCP不具備異位成骨能力。
實(shí)施例3
眼眶緣組織工程骨原位修復(fù)犬眼眶緣骨缺損的實(shí)驗(yàn) 按實(shí)施例l的方法體外復(fù)合自體誘導(dǎo)BMSCs和P -TCP支架材料構(gòu)建組 織工程骨。
犬眶下緣骨缺損模型的建立作下眼瞼皮膚切口，頓性分離皮下組織 及肌肉，充分暴露眼眶下緣及顴弓，切開(kāi)骨膜并用剝離子進(jìn)行剝離。根據(jù) 計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的缺損的部位及大小，使用電鋸自眶下緣內(nèi)側(cè)至顴弓，制 造一長(zhǎng)約25mm的節(jié)段性骨缺損，去除缺損處骨膜。植入自體誘導(dǎo)BMSCs和眶下緣及顴弓兩斷端用電鉆各鉆一小 孑L,用l號(hào)絲線穿過(guò)該孔及支架材料上預(yù)制的小孔，結(jié)扎固定材料(圖8)。 隨后逐層關(guān)閉創(chuàng)口 。以自體無(wú)誘導(dǎo)BMSCs/ P -TCP復(fù)合物、單純P -TCP材料 作為對(duì)照。術(shù)后第一天起青霉素80萬(wàn)單位肌注(每天2次x 3天)，預(yù)防感 染。在處死動(dòng)物取材前2天采用四環(huán)素靜脈滴注，對(duì)新生骨進(jìn)行熒光標(biāo)記。
術(shù)后1周、4周、8周、12周分別進(jìn)行螺旋CW企查和三維重建觀察。術(shù) 后12周取材，進(jìn)行大體觀察、骨密度檢測(cè)、Micro-CT檢查及組織學(xué)觀察， 對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，評(píng)價(jià)修復(fù)效果。
結(jié)果顯示成骨誘導(dǎo)BMSCs/ P-TCP復(fù)合物修復(fù)眶緣缺損。3月后， CT影像示眶下緣外形良好(圖9 );大體觀察可見(jiàn)眶下緣缺損得到良好修 復(fù)，具備正常生理形態(tài)，斷端處為骨樣連接，骨質(zhì)較厚(圖10A，圖10B, 圖10C );骨密度為0. 30 ± 0. 03g/cm2，與正常骨(0. 36 ± 0. 04g/cm2)無(wú)顯 著區(qū)別(P> 0. 05 ); Micro-CT (圖11)和組織學(xué)(圖12,圖13A，圖13B) 檢查表明該復(fù)合物與骨斷端已形成骨性連接，大部分材料已發(fā)生降解并被 新生的骨組織所替代。未誘導(dǎo)BMSCs/ P -TCP復(fù)合物才直入后3月，失去正 常形態(tài)，與骨斷端只形成部分骨連接，甚至表現(xiàn)為骨不連，其骨密度(0. 23 ± 0. 07g/cm2)顯著低于正常組(P < 0. 05 )。單純0 -TCP材料組才lA后3
月形成骨不連。 實(shí)施例4
BMSCs與P -TCP支架的體外復(fù)合的合適時(shí)間實(shí)驗(yàn) 一、 復(fù)合方法
BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)至第二代時(shí)，胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)離心，制備細(xì)胞懸液并調(diào)整密度為2 x 107cells/ml。以單細(xì)胞懸液滴滲法接種到無(wú)菌培一 中的圓片狀P-TCP支架上，細(xì)胞/支架復(fù)合體在37。C培養(yǎng)箱(5。/。C02, 95%02, 100%飽和濕度)中靜置4小時(shí)，以利于細(xì)胞貼壁。之后將細(xì)胞/支架復(fù)合體 轉(zhuǎn)移至6孔板中，每孔緩慢加入成骨"^秀導(dǎo)培養(yǎng)液約4ml，充分浸沒(méi)材料，于 上述條件繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。
BMSCs與P-TCP體外復(fù)合后，分別于復(fù)合4小時(shí)、1天、3天、5天 和7天，分別取2個(gè)細(xì)胞材料復(fù)合體進(jìn)行電鏡觀察。以銳利刀片將其中一 個(gè)標(biāo)本切為兩個(gè)半圓部分，以了解細(xì)胞在支架內(nèi)部的分布增殖情況。
二、電鏡觀察細(xì)胞-材料復(fù)合體的體外培養(yǎng)情況
1. 細(xì)胞在材料表面的生長(zhǎng)情況
BMSCs接種于P -TCP上4小時(shí)后可見(jiàn)細(xì)胞單層復(fù)著于材料表面，分布均 勻，大部分細(xì)胞向周圍伸展而成多角形；小部分細(xì)胞呈圓形，尚未伸展。 接種l天后細(xì)胞基本均已向外伸展呈多角形，細(xì)胞緊密貼附于材料表面， 可見(jiàn)多個(gè)細(xì)胞相互形成網(wǎng)狀或團(tuán)塊狀，細(xì)胞進(jìn)入孔與孔的孔內(nèi)連接中。接 種3天后，細(xì)胞增殖迅速、重疊生長(zhǎng)，呈規(guī)則排列的長(zhǎng)+灰狀，材料表面的 孔隙基本被細(xì)胞覆蓋填充。接種5天后，可見(jiàn)細(xì)胞繼續(xù)快速增殖，呈多層 重疊生長(zhǎng)，材料的表面及孔隙已被完全覆蓋，細(xì)胞之間可見(jiàn)分泌的膠原纖 維。接種7天后，材料表面的細(xì)胞形態(tài)與接種5天時(shí)相似，也完全覆蓋材料 表面。
2. 細(xì)胞在材料內(nèi)部的生長(zhǎng)情況
BMSCs接種于P -TCP上4小時(shí)后可見(jiàn)細(xì)胞單層復(fù)著于材料內(nèi)部的孔隙表面，細(xì)胞呈圓形，尚未向周圍伸展；靠近材料表面的孔隙內(nèi)細(xì)胞較多， 而越靠近材料中心部，細(xì)胞的數(shù)量越少。接種l天后細(xì)胞開(kāi)始向外伸展呈 多角形，細(xì)胞緊密貼附于材津+表面，并開(kāi)始增殖。^接種3天后，細(xì)胞增殖 迅速，可見(jiàn)多個(gè)細(xì)胞相互形成網(wǎng)狀或團(tuán)塊狀，細(xì)胞通過(guò)孔內(nèi)連接相互溝通。 接種5天后，可見(jiàn)細(xì)胞繼續(xù)增殖，細(xì)胞形態(tài)和分布于第3天相似，更多的細(xì) 胞間相互形成網(wǎng)狀或團(tuán)塊狀。接種7天后，材料表面的細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)老化， 細(xì)胞數(shù)量較前反而減少，考慮為隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，材料表面被增生的 細(xì)胞所覆蓋，影響了材料中間細(xì)胞與外界的氣體和營(yíng)養(yǎng)交換，所以細(xì)胞的 生長(zhǎng)受到影響。根據(jù)觀察結(jié)果顯示，BMSCs與TCP復(fù)合后體外培養(yǎng)的適 宜時(shí)間為5天。 三、討論
組織工程的核心是構(gòu)建細(xì)胞與生物支架復(fù)合物。在形成細(xì)胞-材料復(fù) 合物的過(guò)程中，細(xì)胞與材料的粘附^i^出，細(xì)胞必須與材料發(fā)生適當(dāng)?shù)恼?附才能進(jìn)行遷移、分化和增殖，而接種密度與細(xì)胞在材料上的粘附生長(zhǎng)密 切相關(guān)。Goshima等發(fā)現(xiàn)磷酸三鈣和羥基磷灰石復(fù)合物BMSCs接種密度為 5 x 107ml時(shí)，僅1/12標(biāo)本有皮下成骨現(xiàn)象。Haynesworth等以磷酸三鉤 和羥基磷灰石復(fù)合物為支架進(jìn)行研究，認(rèn)為0. 7-20xl07ml是較佳的初 始接種細(xì)胞濃度范圍。Bruder認(rèn)為過(guò)高的接種濃度(大于50 x i06/ml ) 不利于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞粘附生長(zhǎng)，并造成細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足。為此我們?cè)?本實(shí)驗(yàn)中選擇20 x 10Vml作為初始接種細(xì)胞密度。
體外構(gòu)建組織工程骨的另外一個(gè)重要因素是復(fù)合時(shí)間。目前對(duì)于細(xì) 胞和材料在體外需復(fù)合多少時(shí)間再回植尚無(wú)定論，不同的細(xì)胞和不同的材料所需的復(fù)合時(shí)間不盡相同。目前主要有兩種觀點(diǎn)， 一種意見(jiàn)提倡較長(zhǎng)的
體外培養(yǎng)時(shí)間，其優(yōu)點(diǎn)是體外的恒定環(huán)境能為細(xì)胞在材料表面附著和生
長(zhǎng)4是供一個(gè)穩(wěn)定的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境并利于觀察，尤其當(dāng)利用生物反應(yīng)器時(shí)，既能 模擬體內(nèi)的血液動(dòng)力學(xué)、物理機(jī)械環(huán)境，又能保持穩(wěn)定的適合細(xì)胞生長(zhǎng)的
環(huán)境。Mauney將BMSCs和支架材料在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)16天，并給予一 定的機(jī)械刺激和一定濃度的地塞米松進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)0PN及礦化基質(zhì)都有 較高的分泌表達(dá)。另一種觀點(diǎn)是盡可能的縮短體外培養(yǎng)時(shí)間，盡早回植， 其依據(jù)為體內(nèi)的各種營(yíng)養(yǎng)、動(dòng)力學(xué)和物理機(jī)械環(huán)境對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)非常重 要，尤其是成骨細(xì)胞在骨形成的過(guò)程中需要一定的力學(xué)刺激，而體外無(wú)法 完全模擬體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)掃描電鏡觀察了細(xì)胞-材料體外復(fù) 合后的在不同時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)、增殖情況，以期為細(xì)胞-材料 體外構(gòu)建的培養(yǎng)時(shí)間選擇提供參考。掃描電鏡照片顯示BMSCs與p-TCP 復(fù)合4小時(shí)時(shí)就完成了黏附，有部分細(xì)胞伸展為多角形，在材料表面和內(nèi) 部均有細(xì)胞分布；l天后，細(xì)胞與材料表面完全貼附、伸展，開(kāi)始分化和 增殖，材料內(nèi)部的細(xì)胞也開(kāi)始增殖；至第5天，細(xì)胞進(jìn)一步分化和增殖， 形成復(fù)合細(xì)胞層完全覆蓋TCP材料的表面，材料內(nèi)部的細(xì)胞也進(jìn)一步連成 網(wǎng)狀或團(tuán)塊狀，可見(jiàn)分泌細(xì)胞外基質(zhì)及膠原纖維；但是第7天時(shí)，材料內(nèi) 部的細(xì)胞開(kāi)始老化，形態(tài)發(fā)生改變，數(shù)量也較前減少。由于靜態(tài)培養(yǎng)條件 下支架表面的細(xì)胞優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，在培養(yǎng)5天后，細(xì)胞-支架復(fù)合體的表面均 形成了復(fù)合細(xì)胞層，加劇了支架內(nèi)部由彌散限制導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足。因 此，在靜態(tài)培養(yǎng)條件下BMSCs與P-TCP體外復(fù)合培養(yǎng)的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)， 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，體外培養(yǎng)5天較為合適。實(shí)施例5
BMSCs體外誘導(dǎo)培養(yǎng)代數(shù)實(shí)驗(yàn) 在oc -MEM培養(yǎng)液中添加P -磷酸甘油、地塞米松及抗壞血酸作為成骨誘 導(dǎo)劑，能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的犬BMSCs向成骨細(xì)胞分化，并顯示良好的成骨 活性及增殖能力。犬BMSCs體外誘導(dǎo)培養(yǎng)至第二代即可表達(dá)成骨細(xì)胞表型 (ALP， 4丐結(jié)節(jié)，0CN， 0PN， BSP, Cbfal和I型膠原的表達(dá)等)，可作為 理想的骨種子細(xì)胞。
一、 BMSCs成骨功能的生化;險(xiǎn)測(cè)
1、 ^M"生磷酸酶(ALP)染色
ALP定性染色結(jié)果表明，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7天的第二代BMSCs AKP染色 為強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞胞漿呈紫藍(lán)色，局部細(xì)胞染色較深；而未誘導(dǎo) BMSCs則顯色弱，提示AKP無(wú)明顯表達(dá)。
2、 萏素紅(ARS)染色
第二代BMSCs成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)28天，茜素紅染色在大體及鏡下觀察均見(jiàn) 紅色的結(jié)節(jié)，而未誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下BMSCs茜素紅染色為陰性，說(shuō)明BMSCs 在成骨誘導(dǎo)條件下可形成礦化結(jié)節(jié)。
3、 Von Kossa染色
第二代BMSCs成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)28天，形成的白色結(jié)節(jié)經(jīng)Von Kossa 染色呈棕褐色至棕黑色，未誘導(dǎo)的細(xì)胞因成骨分化較弱顯淡褐色。
二、 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)BMSCs成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)情況
誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMSCs能表達(dá)0CN、 0PN、 BSP、 I型膠原和Cbfal:免疫 細(xì)胞化學(xué)染色可見(jiàn)大部分細(xì)胞胞漿中有棕色顆粒，免疫萸光觀察大部分細(xì)胞胞漿見(jiàn)綠色熒光。未誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSCs可表達(dá)0CN、 BSP， OPN和I型膠原 染色見(jiàn)部分細(xì)胞胞漿內(nèi)有棕色顆粒，免疫熒光見(jiàn)部分細(xì)胞胞漿呈綠色熒 光，但表達(dá)較誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMSCs弱，且未見(jiàn)有Cbfal的陽(yáng)性表達(dá)。人成纖 維細(xì)胞的染色除I型膠原陽(yáng)性外其余均為陰性，空白對(duì)照均為陰性。
三、 Western-blot才全測(cè)BMSCs細(xì)月包0CN、 OPN蛋白表達(dá)情況 才企測(cè)結(jié)果顯示誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMSCs和未誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMSCs組在1 5 KD
和3 6KD處均有條帶形成，說(shuō)明兩組細(xì)胞中均有OCN、 OPN蛋白的分泌 表達(dá)。但是誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMSCs的0CN和OPN蛋白條帶比未"i秀導(dǎo)組深，提示 BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后的骨基質(zhì)蛋白的分泌增加。
四、 RT-PCR沖企測(cè)細(xì)胞中OCN、 OPN和BSP的mRNA表達(dá)情況 檢測(cè)結(jié)果顯示誘導(dǎo)培養(yǎng)的第二代BMSCs和未誘導(dǎo)培養(yǎng)的第二代BMSCs
組均有OCN、 OPN和BSP的mRNA表達(dá)。提示BMSCs中存在確定性骨祖細(xì)胞 (不需要任何^秀導(dǎo)因子的參與就可以適應(yīng)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育和再生修復(fù)的需 要，并能自動(dòng)分化為成骨細(xì)胞)。
五、 熒光定量PCR 4企測(cè)細(xì)胞中OCN、 OPN和BSP的mRNA表達(dá)差異
由SYBR Green法進(jìn)行的Real-time PCR結(jié)果表明在進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培 養(yǎng)后的BMSCs的OCN表達(dá)量為未誘導(dǎo)時(shí)的3. 32倍，OPN的表達(dá)為未誘導(dǎo)時(shí) 的2. 68倍，而B(niǎo)SP的基因表達(dá)為未誘導(dǎo)的0. 77。
無(wú)需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信閱讀了本發(fā)明上述公開(kāi)的內(nèi)容后，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明，可作各種改動(dòng)或修改，因此，前面的 實(shí)施方案應(yīng)理解為僅是舉例說(shuō)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1、一種眼眶緣組織工程骨，它由下列方法制得(1)骨種子細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)；(2)制備個(gè)體化的骨修復(fù)支架；(3)骨種子細(xì)胞和骨修復(fù)支架體外復(fù)合并進(jìn)行培養(yǎng)；其特征在于所述的步驟(3)是將培養(yǎng)至第二代時(shí)的骨種子細(xì)胞和骨修復(fù)支架復(fù)合，形成骨種子細(xì)胞和骨修復(fù)支架復(fù)合物。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化骨，其特征在于所述的骨種子細(xì) 胞和骨修復(fù)支架復(fù)合物在體外培養(yǎng)時(shí)間為5天。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化骨，其特征在于所述的骨修復(fù)支 架是根據(jù)立體光刻模型進(jìn)行翻模制作得到的，立體光刻模型所需的數(shù)據(jù)是通 過(guò)下列方法得到的CT掃描、通過(guò)Medgraphics軟件和Magic. RP軟件進(jìn)4亍三 維建模處理、得到計(jì)算機(jī)三維模型數(shù)據(jù)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的組織工程化骨，其特征在于所述的計(jì)算機(jī)三 維模型中眼眶緣缺損部位的數(shù)據(jù)作為支架形狀模型數(shù)據(jù)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的組織工程化骨，其特征在于立體光刻模型是 根據(jù)計(jì)算機(jī)三維模型數(shù)據(jù)的1. 16倍制作。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化骨，其特征在于支架材料選自珊 瑚、羥基磷灰石或磷酸三4丐中的一種。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的組織工程化骨，其特征在于所述的磷酸三4丐
8、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的組織工程化骨，其特征在于所述的骨種子細(xì) 胞是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。
9、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的組織工程化骨，其特征在于骨種子細(xì)胞體外 培養(yǎng)時(shí)在a -MEM培養(yǎng)液中添加入5 G jii M的抗壞血酸、1 OmM的P -磷酸甘油、 10nM的地塞米杠Mt為成骨誘導(dǎo)劑。
10、 權(quán)利要求1-9任一所述的組織工程化骨在眼眶緣缺損修復(fù)領(lǐng)域中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種眼眶緣組織工程骨及其應(yīng)用。一種眼眶緣組織工程骨由下列方法制得(1)骨種子細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)；(2)制備個(gè)體化的骨修復(fù)支架；(3)骨種子細(xì)胞和骨修復(fù)支架體外復(fù)合并進(jìn)行培養(yǎng)；其中所述的步驟(3)是將培養(yǎng)至第二代時(shí)的骨種子細(xì)胞和骨修復(fù)支架復(fù)合，形成骨種子細(xì)胞和骨修復(fù)支架復(fù)合物。在體外構(gòu)建并培養(yǎng)的眶緣組織工程骨，與正常眼眶緣的組織結(jié)構(gòu)和特性相似，在體內(nèi)能夠在支架材料降解的同時(shí)促進(jìn)自體骨再生，并發(fā)生合理的骨改建，最終為自體骨組織所替代，達(dá)到形態(tài)與功能的雙重修復(fù)。
文檔編號(hào)A61L27/00GK101628127SQ200810040539
公開(kāi)日2010年1月20日 申請(qǐng)日期2008年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月14日
發(fā)明者周慧芳, 范先群 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院