仿生化韌帶-骨組織工程連接體的體外構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于界面組織工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種仿生化韌帶-骨連接體的體外構(gòu)建方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為ACL損傷后重建韌帶-骨界面間連續(xù)的、具有異質(zhì)性移行結(jié)構(gòu)的韌帶-骨連接體提供一種新選擇。本發(fā)明的技術(shù)方案是仿生學(xué)韌帶-骨連接體的體外構(gòu)建方法，包括如下步驟：a、脫細(xì)胞跟腱的準(zhǔn)備；b、種子細(xì)胞的準(zhǔn)備：包括纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞的制備；c、種植。本發(fā)明為前交叉韌帶損傷的組織工程學(xué)再生提供了一種嶄新策略。
【專利說明】仿生化韌帶-骨組織工程連接體的體外構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于界面組織工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種仿生學(xué)韌帶-骨連接體的體外構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]前交叉韌帶(anterior cruciate ligament, ACL)是維持膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定和功能的重要結(jié)構(gòu)。然而，細(xì)胞分布和血供差的的解剖特點(diǎn)決定了交叉韌帶損傷后難以自愈，導(dǎo)致關(guān)節(jié)不穩(wěn)、軟骨損傷、骨關(guān)節(jié)炎等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響膝關(guān)節(jié)功能。Simon M等對他們國家2000年I月到2005年6月的膝關(guān)節(jié)韌帶損傷進(jìn)行了流行病學(xué)研究，結(jié)果顯示80%的膝關(guān)節(jié)韌帶手術(shù)與ACL的損傷有關(guān)，ACL的損傷機(jī)制大概可以分為由外翻應(yīng)力引起的間接損傷和由例如骨損傷引起的非接觸損傷兩種。[0003]ACL損傷常用的主流治療策略為自體骨-髕腱-骨和胭繩肌肌腱移植，然而由于取自身組織損傷(或犧牲)了原有骨-髕腱-骨和胭繩肌肌腱。近年來多采用同種異體移植物治療ACL損傷，但其來源受限且成本高昂，同時遠(yuǎn)期療效也不理想，失敗率為10%-25%。對失敗病例翻修時發(fā)現(xiàn)，胭繩肌腱重建結(jié)構(gòu)偏向于纖維特征，而髕韌帶重建結(jié)構(gòu)偏向于軟骨特征。失敗的原因多歸結(jié)為重建后的結(jié)構(gòu)沒有正常ACL-骨位點(diǎn)纖維軟骨間良好的血液供應(yīng)導(dǎo)致的愈合不良；或?yàn)椤坝晁⑿?yīng)”使骨隧道擴(kuò)大、移植物磨損進(jìn)而造成松弛乃至斷裂。另有研究觀察重建術(shù)后肌腱-骨隧道界面的組織學(xué)變化:2周可見瘢痕組織充填間隙，I月后演變?yōu)橹旅芙Y(jié)締組織，6周后可見I型膠原大量分布，但至3月仍未發(fā)現(xiàn)明顯新生骨和軟骨的形成。
[0004]研究發(fā)現(xiàn):正常韌帶-骨組織間ΙΟΟμπι-lmm厚度的空間內(nèi)存在一個復(fù)雜的、連續(xù)分布的移行帶(continuous gradients layers),或稱過渡復(fù)合體(heterogeneoustransition complex):由淺至深的結(jié)構(gòu)及其相應(yīng)組成依次為:纖維層(成纖維細(xì)胞和I型膠原)、非鈣化纖維軟骨(卵圓形軟骨細(xì)胞和II型膠原)、鈣化纖維軟骨(肥大軟骨細(xì)胞和X型膠原)、軟骨下骨。即表現(xiàn)為異質(zhì)性的細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、礦化程度的梯度分布，該緩沖結(jié)構(gòu)可使不同類型組織之間的復(fù)雜載荷和應(yīng)變重新分布、分散剪切、避免應(yīng)力集中，保證韌帶-軟骨下骨連接的解剖完整和力學(xué)穩(wěn)定。Kurosaka M等研究顯示如果外科重建移植物與骨隧道之間沒有結(jié)構(gòu)漸變的纖維軟骨過渡區(qū)形成及合適的組織整合，前交叉韌帶移植物的機(jī)械穩(wěn)定性將會受到很大影響。
[0005]按以上論述，前交叉韌帶損傷重建的生物學(xué)目標(biāo)應(yīng)該是重建韌帶-骨界面間連續(xù)的、具有異質(zhì)性移行結(jié)構(gòu)的韌帶-骨連接體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為ACL損傷后重建韌帶-骨界面間連續(xù)的、具有異質(zhì)性移行結(jié)構(gòu)的韌帶-骨連接體提供一種新選擇。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是一種仿生學(xué)韌帶-骨連接體的體外構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0008]a、脫細(xì)胞跟腱的準(zhǔn)備；
[0009]b、種子細(xì)胞的準(zhǔn)備:包括纖維細(xì)胞、Sox-9基因增強(qiáng)的軟骨細(xì)胞、Runx-2基因增強(qiáng)的成骨細(xì)胞的制備與基因轉(zhuǎn)染；
[0010]C、種植:將脫細(xì)胞跟腱根據(jù)其縱軸和橫軸走向依次劃分為成纖維段FB-成軟骨段CH-成骨段OS三個結(jié)構(gòu)和功能區(qū)域，將纖維細(xì)胞、Runx-2基因增強(qiáng)的成骨細(xì)胞、Sox-9基因增強(qiáng)的軟骨細(xì)胞分層種植、分段種植到成纖維段、成軟骨段、成骨段，培養(yǎng)5~7天組織學(xué)驗(yàn)證后，再培養(yǎng)I周使用；所述的分層種植是指由跟腱表面向橫斷面中心移植，使纖維細(xì)胞、Runx-2基因增強(qiáng)的成骨細(xì)胞、Sox-9基因增強(qiáng)的軟骨細(xì)胞分別位于橫斷面的內(nèi)、中、外各1/3區(qū)域。
[0011]其中，步驟a中脫細(xì)胞跟腱支架是來源于兔、犬、牛的跟腱組織。
[0012]其中，步驟b中成骨細(xì)胞的制備包括如下步驟:構(gòu)建表達(dá)早期成骨標(biāo)志物RUNX-2的腺病毒載體，轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞。
[0013]其中，步驟b中軟骨細(xì)胞的制備包括如下步驟:構(gòu)建表達(dá)早期軟骨標(biāo)志物S0X-9的腺病毒載體，轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞，然后溶于膠原水凝膠中。
[0014]其中，步驟b中纖維細(xì)胞的制備包括如下步驟:將纖維細(xì)胞溶于膠原水凝膠中。
[0015]其中，步驟c中種植前，將脫細(xì)胞跟腱的成骨段用重組纖維連接蛋白/鈣粘蛋白rFN/CDH進(jìn)行處理。
[0016]本發(fā)明還提供了由上述方法制備得到的組織工程細(xì)胞-肌腱復(fù)合物。
[0017]本發(fā)明的有益效果:
[0018]本發(fā)明采用基于組織器官的脫細(xì)胞方法及細(xì)胞支架的共培養(yǎng)策略，該脫細(xì)胞方法不僅有效的清除了跟腱內(nèi)的細(xì)胞而且保留了支架的大體形態(tài)。且所得支架顯微結(jié)構(gòu)明顯，孔徑及孔隙率明顯增加，利于細(xì)胞的增值及內(nèi)向性生長。本發(fā)明在靶向性誘導(dǎo)組織工程肌腱向纖維、軟骨、骨組織方向分化，進(jìn)而形成“移行結(jié)構(gòu)”具有較高潛能和應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1示脫細(xì)胞兔跟腱支架的制備
[0020](a, b)脫細(xì)胞前后跟腱的大體形態(tài)；
[0021](c，e, d, f)脫細(xì)胞處理前后跟腱H&E染色(蘇木精一伊紅染色)(X 100);
[0022](g，i，h，j)SEM (掃描電鏡)脫細(xì)胞前后跟腱的橫、縱切面電鏡掃描結(jié)果(X 1000倍)。
[0023]圖2示基因增強(qiáng)型腺病毒載體構(gòu)建示意圖及轉(zhuǎn)染效率
[0024](a) sox-9和runx_2高表達(dá)腺病毒載體構(gòu)建示意圖；
[0025](b) DNA 電泳顯不 pAdtrack-CMV-GFP-sox-9/RunX_2 穿梭質(zhì)粒成功構(gòu)建；
[0026](c) DNA 電泳顯不 pAdEasy-l-sox-9/RunX_2 質(zhì)粒成功構(gòu)建；
[0027](d, f ) pAdEasy-l-sox-9質(zhì)粒對軟骨細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染；
[0028](e, g) pAdEasy-1-RunX-2對成骨細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染。
[0029]圖3示“移行結(jié)構(gòu)化”工程肌腱體外構(gòu)建原理、脫細(xì)胞支架細(xì)胞相容性檢測、膠原水凝膠及rFN/CDH的制備[0030](a) “移行結(jié)構(gòu)化”工程肌腱體外構(gòu)建示意圖；
[0031](，b) “移行結(jié)構(gòu)化”工程肌腱功能分區(qū):FB為成纖維區(qū)域、CH為成軟骨區(qū)域、OS成骨區(qū)域；
[0032](c)凝膠固化前后的膠原水凝膠細(xì)胞混合物外觀；
[0033](d) MTT法行脫細(xì)胞支架的細(xì)胞相容性檢測，橫坐標(biāo)代表培養(yǎng)時間(天)，縱坐標(biāo)表示光密度(OD)值(control和scaffold分別代表脫細(xì)胞前后肌腱組織。)
[0034](e) XPS (X光電子能譜分析)證實(shí)rFN/⑶H成功與脫細(xì)胞肌腱支架表面交聯(lián)；
[0035](f) SEM證實(shí)通過rFN/⑶H的介導(dǎo)細(xì)胞成功在支架表面粘附。
[0036]圖4示各組組織工程肌腱在不同時期相應(yīng)標(biāo)志物的基因蛋白表達(dá)統(tǒng)計圖(*Ρ〈0.05、# Ρ〈0.01)
[0037](a)各實(shí)驗(yàn)分組在5天時的RunX2及10天時的成骨標(biāo)志物(OCN，OPN和BSP)的mRNA表達(dá)情況；
[0038](b)各實(shí)驗(yàn)分組在5天及10天時的sox-9及10天時軟骨標(biāo)志物(C0L2A1，COMP和Aggrecan)的mRNA表達(dá)情況；
[0039](c)各實(shí)驗(yàn)分組在2周時成骨標(biāo)志物(OCN, OPN和BSP)及軟骨(C0L2A1，COMP和Aggrecan)標(biāo)志物的蛋白表達(dá)情況。
[0040]組I，單純脫細(xì)胞支架組；組II，脫細(xì)胞支架+成纖維細(xì)胞+軟骨細(xì)胞+成骨細(xì)胞組；組111，脫細(xì)胞支架+成纖維細(xì)胞+S0X-9基因增強(qiáng)軟骨細(xì)胞+成骨細(xì)胞組；組1￥，脫細(xì)胞支架+成纖維細(xì)胞+軟骨細(xì)胞+RUNX-2基因增強(qiáng)成骨細(xì)胞組；組V，脫細(xì)胞支架+成纖維細(xì)胞+S0X-9基因增強(qiáng)軟骨細(xì)胞+RUNX-2基因增強(qiáng)成骨細(xì)胞組。
[0041]圖5示骨/軟骨/纖維組織特異染色(橫切面，200倍):(a-e)組織工程肌腱OS段茜素紅染色分析:分別代表組1- V (具體同圖4c) ； (f-j)組織工程肌腱CH段阿利辛藍(lán)染色:分別代表組1- V (具體同圖4c));(k-o)組織工程肌腱FB段H&E染色分析，分別代表組1- V (具體同圖4c))。
[0042]圖6示骨/軟骨標(biāo)志物免疫熒光學(xué)分析(橫切面，400倍):(a-e) OS段骨鈣素免疫熒光，分別代表組1- V (具體同圖4c)) ;CH段II型膠原免疫熒光，分別代表組1- V (具體同圖4c))。
[0043]圖7示組織工程肌腱OS段成骨礦化結(jié)果:(a-e) OS段礦化結(jié)節(jié)分布，僅在組I1、IV、V有陽性發(fā)現(xiàn)，箭頭所示為OS段表面的球狀分布的鈣磷組織工程肌腱；(f-j)C、N、O、Ca、P的相對含量百分比:分別代表組1- V (具體同圖4c)，圖中橫坐標(biāo)代表元素電子伏，縱坐標(biāo)代表相對含量。
【具體實(shí)施方式】
[0044]本發(fā)明的組織工程細(xì)胞-肌腱組織工程肌腱，以脫細(xì)胞跟腱為支架，模擬前交叉韌帶-骨連接位點(diǎn)的纖維-軟骨-骨生理結(jié)構(gòu)，種植纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞形成。
[0045]以下結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的構(gòu)建過程:
[0046]實(shí)施例1脫細(xì)胞兔跟腱支架的制備
[0047](I)步驟:無菌切取兔四肢跟腱5~6cm，機(jī)械去除附著組織，無菌PBS反復(fù)清洗。在深低溫冰箱冷凍IOmin (_70°C )后置于恒溫水浴箱內(nèi)處理IOmin (37°C)，如此反復(fù)5次，PBS充分漂洗后在37°C下依次進(jìn)行如下處理:0.5%胰蛋白酶振蕩2h，PBS充分漂洗3次(30min/次)去除殘留的胰蛋白酶，10%曲拉通X-100振蕩12h，PBS充分漂洗3次(30min/次)去除殘留的曲拉通X-100，5%十二烷基磺酸鈉振蕩2h，PBS充分漂洗3次(30min/次)以去除殘留的十二烷基磺酸鈉，最后用IX的磷酸鹽緩沖鹽水處理后即為本實(shí)驗(yàn)所需的脫細(xì)胞兔跟腱支架。分別觀察新鮮跟腱與脫細(xì)胞跟腱的外觀、硬度及彈性等大體性狀，并留取標(biāo)本行組織學(xué)及電鏡檢查。
[0048](2)結(jié)果:如圖1所示，脫細(xì)胞前跟腱質(zhì)地較硬(a);脫細(xì)胞處理后跟腱腱膜完整、質(zhì)柔軟、韌性好(b) ;H&E染色:脫細(xì)胞處理前跟腱內(nèi)細(xì)胞核深染成藍(lán)色，清晰可見(c，e, X 100倍)；脫細(xì)胞后跟腱內(nèi)未見細(xì)胞成分存在，膠原纖維排列疏松，有較多孔隙存在(d, f, X 100倍);SEM:脫細(xì)胞前跟腱的橫、縱切面電鏡掃描結(jié)果，可見膠原纖維排列致密，孔隙較少(g，i, X 1000倍)；脫細(xì)胞后的橫、縱切面電鏡掃描結(jié)果，膠原纖維排列疏松，腱束間三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)明顯(h，j，X 1000倍)。
[0049]實(shí)施例2脫細(xì)胞支架細(xì)胞相容性檢測
[0050]采用CCK-8方法評估成纖維細(xì)胞在脫細(xì)胞跟腱表面的細(xì)胞增值率及活力。
[0051](I)步驟:首先將脫細(xì)胞兔跟腱支架用70%乙醇浸泡一天后用無菌PBS漂洗過夜。然后將支架沿橫切面剪切成若干小片，平鋪于96孔板內(nèi)，接下來將人來源成纖維細(xì)胞株(3T3，上海博谷)轉(zhuǎn)移到96孔板中的支架表面。在37°C，5%C02條件下培養(yǎng)。在0，1，2，3，5，7，9天分別將10%的CCK-8被添加到96孔內(nèi)繼續(xù)孵育2h后，觀察液體的顏色(黃色)變化并在450nm波長的BeckmanDU_70分光光度計下檢測OD值(n=6),并繪制細(xì)胞增值曲線。結(jié)果見圖3。在0，1，2，3，4，5，7，9天，細(xì)胞擴(kuò)增及活力分析，結(jié)果顯示加入CCK-8后液體的顏色(黃色)及OD值逐漸增加，說明該脫細(xì)胞支架適合異質(zhì)性細(xì)胞的增殖及內(nèi)向性生長。
[0052](2)統(tǒng)計學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)中每組樣本n=6，所有數(shù)據(jù)用平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組數(shù)據(jù)之間的差異用SPSS1`0.0軟件進(jìn)行t分布檢驗(yàn)分析。P〈0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0053](3)結(jié)果:細(xì)胞增殖及活力分析結(jié)果顯示，在0，1，2，3，5，7，9天用CCK-8檢測，液體的顏色(黃色)及光密度OD值都逐漸增加，在7~9天趨于平穩(wěn)(圖4)，說明該脫細(xì)胞跟腱支架與細(xì)胞生物相容性較好，適合細(xì)胞在脫細(xì)胞跟腱支架內(nèi)的內(nèi)向生長及擴(kuò)增。
[0054]實(shí)施例3腺病毒載體構(gòu)建及分別對種子細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
[0055](I)步驟:取穩(wěn)定培養(yǎng)至4~5代、融合率80%的軟骨細(xì)胞(RAT-CELL-0096，武漢原生原代)和成骨細(xì)胞(RAT-CELL-0055，武漢原生原代)，酚-氯仿法提取總RNA (TaKaRa總RNA提取試劑盒，大連)，以表1所列上下游引物克隆Sox-9 (軟骨調(diào)控基因)和RunX-2 (成骨調(diào)控基因)全長Cds0選擇P1-Sce I和1-Ceu I酶切位點(diǎn)，將Sox-9和RunX-2目的基因的cDNA片段插入穿梭質(zhì)粒pshuttle-CMV質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)(基因序列詳見表2)。形成重組質(zhì)粒采用酶切鑒定或測序鑒定。重組質(zhì)粒擴(kuò)增，純化并準(zhǔn)備足量含目的基因的穿梭質(zhì)粒pshuttle-CMV。用PmeI單酶切線性化重組穿梭質(zhì)粒，電泳鑒定質(zhì)粒完全被切開。膠回收線性化質(zhì)粒，以備共轉(zhuǎn)化使用。構(gòu)建的載體的示意圖和檢測圖見圖2a、2b、2c。將上述線性化的穿梭質(zhì)粒(約I P g)及病毒骨架質(zhì)粒(pAdEasy-Ι,約IOOng, Stratagene,美國)加入至含大腸桿菌BJ5183電轉(zhuǎn)感受態(tài)EP管中混勻，轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯電擊(1250~1500V/mm，5ms)。加入SOC或LB培養(yǎng)液復(fù)蘇。取適當(dāng)體積的電擊轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞液涂于若干個卡那霉素抗性平板內(nèi)培養(yǎng)。次日挑取平板上長出的菌落(最小的菌落)，接種LB培養(yǎng)基(卡那霉素抗性)擴(kuò)大培養(yǎng)。用堿裂解細(xì)菌的方法法提取質(zhì)粒后，使用凝膠電泳篩選陽性克隆。取陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5 α大腸桿菌細(xì)胞擴(kuò)增細(xì)菌并純化質(zhì)粒。使用PacI酶切重組病毒質(zhì)粒，完全線性化后乙醇沉淀，ddH20溶解。脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒(每4yg PacI約需20yL Lipofectamine )。將Lipofectamine-DNA混合物加入生長密度約50~70%的2 X IO6的轉(zhuǎn)染腺病毒ElA基因的人腎上皮細(xì)胞(293T細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)室自存)于25cm2方瓶培養(yǎng)瓶，轉(zhuǎn)導(dǎo)后加入含10%胎牛血清(FBS，Hyclone，美國)的DMEM完全培養(yǎng)基(Hyclone，美國)常規(guī)培養(yǎng)，過程中觀察細(xì)胞生長情況，約2周后可見細(xì)胞病變(CPE)出現(xiàn)，并可觀察到綠色熒光(pAdTrack-CMV質(zhì)粒含GFP報告基因，Stratagene,美國)。轉(zhuǎn)導(dǎo)10~14天后，收集細(xì)胞沉淀,PBS混懸、反復(fù)凍融細(xì)胞，離心后收集上清，感染50~70%融合度的293T細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)室自存)。2~3天后出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變。感染后3~5天，當(dāng)1/3~1/2細(xì)胞漂浮時收集病毒。收集細(xì)胞并制備病毒上清。通過Western-blot鑒定重組腺病毒產(chǎn)生。將適量病毒上清加入感染生長密度達(dá)到90%的293T細(xì)胞，3~4天后收集所有細(xì)胞，PBS重懸、反復(fù)凍融4次，提取擴(kuò)大病毒上清后行CsCl連續(xù)梯度離心純化。連續(xù)3次透析(IOmM Tris, pH8.0+2mM MgC+5%鹿糖)可基本去除CsCl,病毒保存于_80°C。將293T細(xì)胞準(zhǔn)備于96孔板中(IO4個/每孔)，用2%DMEM培養(yǎng)基將病毒液稀釋為8組較高的濃度(10_3~10_1CI)，每個孔內(nèi)加入稀釋后的病毒液lOOyL。另外留取兩排孔不加病毒稀釋液，作為陰性對照。在37°C條件下，放入孵箱內(nèi)培養(yǎng)10天后觀察細(xì)胞的形態(tài)變化情況，記數(shù)96孔板上出現(xiàn)CPE的孔的個數(shù)，計算細(xì)胞的病變率。(如果在某一濃度條件下各孔內(nèi)的細(xì)胞全部病變，則比率記為1，如果無細(xì)胞病變，則比率記為0)。計算公式如下:T=101X10+(S-0.5)d/mL，(d=Logl0稀釋度，S=各濃度細(xì)胞病變比率之和)。同上法分別實(shí)現(xiàn)對傳代培養(yǎng)3-5代、形態(tài)穩(wěn)定的軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 [0056](2)結(jié)果:重組穿梭質(zhì)粒 pAdtrack-CMV-GFP-sox_9/RunX-2 經(jīng) KpnIII, HindIII 及PAdEasy-l-sox-9/RunX-2經(jīng)PacI酶切后行SDS-PAGE分析，結(jié)果均顯示了與預(yù)期目標(biāo)一致的產(chǎn)物，大小均在30.0kbp,證明重組成功(圖2(a-c))。病毒滴度測定為IX 109PFU/mL。pAdEasy-l-sox-9和pAdEasy-1-RunX_2質(zhì)粒經(jīng)PacI酶切后被分別轉(zhuǎn)染到軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞內(nèi)，培養(yǎng)24h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率分別為83%和87%左右(圖 2 (d-g))。
[0057]表1用于Sox-9和RunX-2基因克隆的引物設(shè)計
[0058]
【權(quán)利要求】
1.仿生學(xué)韌帶-骨連接體的體外構(gòu)建方法，其特征在于:包括如下步驟: a、脫細(xì)胞跟腱的準(zhǔn)備； b、種子細(xì)胞的準(zhǔn)備:包括纖維細(xì)胞、Sox-9基因增強(qiáng)的軟骨細(xì)胞、Runx-2基因增強(qiáng)的成骨細(xì)胞的制備與基因轉(zhuǎn)染； C、種植:將脫細(xì)胞跟腱根據(jù)其縱軸和橫軸走向依次劃分為成纖維段FB-成軟骨段CH-成骨段OS三個結(jié)構(gòu)和功能區(qū)域，將纖維細(xì)胞、Runx-2基因增強(qiáng)的成骨細(xì)胞、Sox-9基因增強(qiáng)的軟骨細(xì)胞分層種植、分段種植到成纖維段、成軟骨段、成骨段，培養(yǎng)5~7天組織學(xué)驗(yàn)證后，再培養(yǎng)I周使用；所述的分層種植是指由跟腱表面向橫斷面中心移植，使纖維細(xì)胞、Runx-2基因增強(qiáng)的成骨細(xì)胞、Sox-9基因增強(qiáng)的軟骨細(xì)胞分別位于橫斷面的內(nèi)、中、外各1/3區(qū)域。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟a中脫細(xì)胞跟腱支架是來源于兔、犬、牛的跟腱組織。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟b中成骨細(xì)胞的制備包括如下步驟:構(gòu)建表達(dá)早期成骨標(biāo)志物RUNX-2的腺病毒載體，轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:步驟b中軟骨細(xì)胞的制備包括如下步驟:構(gòu)建表達(dá)早期軟骨標(biāo)志物S0X-9的腺病毒載體，轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞，然后溶于膠原水凝膠中。
5.如權(quán)利要求1~4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:步驟b中纖維細(xì)胞的制備包括如下步驟:將纖維細(xì)胞溶于膠原水凝膠中。
6.如權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:步驟c中種植前，將脫細(xì)胞跟腱的成骨段用重組纖維連接蛋白/鈣粘蛋白rFN/CDH進(jìn)行處理。
7.由上述方法制備得到的組織工程細(xì)胞-肌腱復(fù)合物。
【文檔編號】A61L27/36GK103638558SQ201310462274
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】張瑗, 王直兵, 張峽, 張玉梅, 周躍 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院