一種組織工程骨及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開的一種組織工程骨為具有三維毛細血管網的多層細胞片疊層化物，所述的多層細胞片疊層化物由n片疊置的骨髓間充質干細胞片及填充于各骨髓間充質干細胞片層間的血管內皮細胞構成，n=3~8。其制備方法為：先在細胞培養(yǎng)器皿表面上制備光敏半導體結構層，獲得光敏的細胞培養(yǎng)皿；再用光敏的細胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)骨髓間充質干細胞，并獲取骨髓間充質干細胞片；最后構建由多層骨髓間充質干細胞片及血管內皮細胞構成的多層細胞片疊層化物，經培養(yǎng)獲得組織工程骨。本發(fā)明的組織工程骨單純由同源細胞構成，降低了免疫排斥及支架降解造成的污染，對骨缺損的修復及其早期血管化具有重要意義，且本發(fā)明的方法簡單易行，便于推廣。
【專利說明】
一種組織工程骨及其制備方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種組織工程骨及其制備方法，具體涉及一種由多層細胞片構成的組織工程骨及其制備方法，屬于組織工程領域。

【背景技術】
[0002]由于先天畸形、外傷、腫瘤等造成的骨組織缺損和缺失是臨床常見的疾病，因此對骨組織缺損的功能性重建修復一直是再生醫(yī)學的重要課題。傳統(tǒng)的治療方法常采用自體或異體骨移植，但往往因供源有限或免疫排斥反應等而限制了其臨床應用。組織工程技術作為目前人工骨替代材料中應用最為廣泛的一種，通過其生物可降解性被逐漸替換。如CN103285427A公開的《一種人工骨材料及其制備方法》，即采用適宜比例羥基磷灰石、膠原和納米纖維素合成人工骨，具有良好的強度及降解性能。CN103157138A公開的《一種組織工程骨修復材料的構建方法》，則采用可注射型殼聚糖-β -磷酸三鈣復合骨髓基質干細胞作為組織工程骨，可任意塑形且完全降解吸收，誘導成骨效應明顯。然而，常規(guī)組織工程技術的細胞粘附主要通過修復區(qū)周邊細胞的爬行或將相應細胞懸液滴定于材料表面或缺損區(qū)，細胞粘附利用率低、修復周期長，其大小、形狀及定位也很難控制；同時，滴定細胞懸液往往形成散在島狀修復區(qū)，對于大片組織缺損并不適用；另外，應用傳統(tǒng)組織工程所構建的生物骨組織植入宿主后其內毛細血管生長緩慢，不利于骨組織的生長、改建及支架材料降解，故構建具有初期血管化的新型組織工程骨對于骨組織的修復及重建具有重要的意義。
[0003]細胞薄層培養(yǎng)技術(TangZ, Akiyama Y, Yamato M, Okano T.Comb-typegrafted poly(N-1sopropylacrylamide) gel modified surfaces for rapid detachmentof cell sheet.B1materials (2010) ; 31 (29):7435-43.Nagase K, KobayashiJ, Kikuchi A, Akiyama Y, Kanazawa H, Okano T.Thermally-modulated on/off-adsorpt1n materials for pharmaceutical protein purificat1n.B1materials.(2011) ;32(2):619-27.)作為一種新型組織工程方法，具有其獨特的優(yōu)勢。其通過相應中介物質或控制貼壁細胞所生長培養(yǎng)皿底部疏水-親水轉換從而控制細胞成片粘附生長和剝離，此“細胞片”多層疊加或復合培養(yǎng)后，無需包裹材料，本身即可作為一種“生物支架”植入缺損部位。相較胰酶作用獲得的細胞，其并未破壞細胞間的蛋白連接及細胞同底部基質間的連接，細胞活性更好；同時，細胞薄層培養(yǎng)技術還可避免降低在組織修復時因使用生物降解支架材料而造成高污染的問題。CN103097518A和CN103180437A公開的《細胞片疊層化物的制造方法、由該方法得到的具有血管網的細胞片疊層化物及其利用方法》，即通過溫敏細胞培養(yǎng)皿獲得細胞片，將多層細胞片疊加形成復層細胞片疊層化物，并將其整體培養(yǎng)于含流路凝膠或動靜脈袢構成的血管床上，得到了含血管網的心肌組織。然而，溫控的條件相對復雜，對于設備要求較高，溫度的間或改變亦影響細胞的活性，加速部分細胞老化，對于溫度更為敏感的人成骨類細胞并不適用(Fukumori K, Akiyama Y, Yamato M, KobayashiJ, Sakai K, Okano T.Temperatureresponsive glass coverslips with an ultrathinpoly(N-1sopropylacrylamide) layer.Acta B1mater 2009;5:470-476)。


【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種具有血管網狀結構的由多層細胞片構成的組織工程骨及其制備方法。
[0005]本發(fā)明的組織工程骨為具有三維毛細血管網的多層細胞片疊層化物，所述的多層細胞片疊層化物由η片疊置的骨髓間充質干細胞片及填充于各骨髓間充質干細胞片間的血管內皮細胞構成，η=3?8。
[0006]制備上述組織工程骨的方法，包括如下步驟:
1)制備光敏的細胞培養(yǎng)皿
將光響應納米顆粒分散于去離子水中配成質量濃度為1(Γ20%的分散液，再將分散液與醇和有機溶劑按摩爾比為0.02、.06:6^9:Γ3的比例配制成前驅體溶液，將前驅體溶液滴至聚苯乙烯培養(yǎng)皿至其鋪滿，烘干并消毒，得到光敏的細胞培養(yǎng)皿；所述的光響應納米顆粒為納米氧化鈦、納米氧化鋅或納米氧化鐵，醇為甲醇或乙醇，有機溶劑為四氫呋喃、三氯甲烷或二氯甲烷；
2)培養(yǎng)骨髓間充質干細胞片
取骨髓間充質干細胞，以5X 14IX 15個/cm2的密度植入步驟I)的光敏的細胞培養(yǎng)皿中，加入骨髓間充質干細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)4?10天后，采用波長32(T450nm、強度f 4mW/cm2的光從培養(yǎng)皿底部射入，照射至光敏的細胞培養(yǎng)皿中骨髓間充質干細胞成片脫落，獲得骨髓間充質干細胞片；
3)構建組織工程骨
將步驟2)得到的骨髓間充質干細胞片轉移至細胞培養(yǎng)皿中，待其貼壁后，加入骨髓間充質干細胞專用培養(yǎng)基，在37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)2?48h后，以5X 10，2X 15個/cm2的密度在其上植入血管內皮細胞，再在37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)2?48h，吸除骨髓間充質干細胞專用培養(yǎng)基后，在上述結構上再轉移一片骨髓間充質干細胞片，力口入骨髓間充質干細胞專用培養(yǎng)基，在37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)2?48h ；
在上述結構上再以5 X 10^2 X 15個/cm2的密度在其上植入血管內皮細胞，在37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)2?48h，吸除骨髓間充質干細胞專用培養(yǎng)基后，再次轉移骨髓間充質干細胞片，并加入骨髓間充質干細胞專用培養(yǎng)基，在37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)2?48h，重復上述的過程直至該結構具有η層骨髓間充質干細胞片，η=3^8,獲得多層細胞片疊層化物，向細胞培養(yǎng)皿內的骨髓間充質干細胞專用培養(yǎng)基中添加成骨細胞誘導因子及成血管細胞誘導因子，在37°C、5%C02及飽和濕度條件下再培養(yǎng)Γ10天，得到組織工程骨。
所述的成骨細胞誘導因子為抗壞血酸、β_甘油磷酸鈉和地塞米松中的一種或多種，其添加量分別可以為抗壞血酸5(Tl00Ug/ml、β -甘油磷酸鈉5?1mM及地塞米松
IX ΙΟΛΓ?ιιΜ ;所述的成血管細胞誘導因子為血管內皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子中的一種或兩種，其添加量分別可以為堿性成纖維細胞生長因子5?10ng/ml及血管內皮生長因子l(T20ng/ml。
[0007]本發(fā)明中所涉及的骨髓間充質干細胞可由胚胎干細胞定向誘導分化或提取于骨髓、脂肪組織、外周血、胎兒血液或肝臟，血管內皮細胞可由胚胎干細胞定向誘導分化或提取于骨髓、外周血或臍帶血。由于骨髓間充質干細胞來源不同，其所需的基礎培養(yǎng)基也不相同，因此本發(fā)明中所述的骨髓間充質干細胞專用培養(yǎng)基是指與骨髓間充質干細胞的來源相對應的培養(yǎng)基，具體可參考如下文獻:Small diameter vascular graft engineered usinghuman embryonic stem cell-derived mesenchymal cells (Tissue Eng Part A.2014Feb;20(3-4):740-50)^Differentiat1n of human embryonic stem cells into bipotentmesenchymal stem cells (Olivier E, et al., Stem Cells 2006 24: 1914-1922)及人骨髓間質干細胞的優(yōu)化培養(yǎng)(龐永剛陳文弦崔鵬程，《中國修復重建外科雜志》2004 (3)220-224)。
[0008]與現有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果:
1.本發(fā)明通過光敏細胞培養(yǎng)皿獲取骨髓間充質干細胞片，即通過紫外光或可見光照射引起光響應薄膜表面帶電性及基團發(fā)生變化，從而使生長于其上的細胞從相應器皿表面整體脫附得到細胞片，相較于現有的細胞薄層技術，本發(fā)明的方法更為便捷，效率更高，同時，避免了對溫度更為敏感的人成骨類細胞因溫度改變而產生的老化、壞死等現象。
[0009]2.本發(fā)明的具有血管網狀結構由多層骨髓間充質干細胞片疊層化物構成的組織工程骨，相較于現有的人工骨材料，無需生物材料作為支架承載，單純由同源細胞構成，降低了免疫排斥及支架降解造成的污染，并于體外形成了具有三維血管網狀結構的新型組織工程骨，對骨缺損的修復及其早期血管化具有重要意義。
[0010]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是多層骨髓間充質干細胞片疊層化物的宏觀圖
圖2是多層骨髓間充質干細胞片疊層化物的倒置顯微鏡下圖其中a:多片細胞片周邊區(qū)域b:多片細胞片中間區(qū)域圖3是組織工程骨中血管內皮細胞的特異性熒光標記圖其中a:血管內皮細胞表面特異性標志物CD31 b:血管內皮細胞特異標志物UEA-1 c:細胞核標記物。

【具體實施方式】
[0012]下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步地說明，但本發(fā)明的實現方式并不局限于此。
[0013]實施例一
1)制備光敏細胞培養(yǎng)皿
將氧化鈦納米顆粒均勻分散于水中形成質量濃度為20%的分散液，將分散液與甲醇和四氫呋喃按0.06:9:3的比例配成前驅體溶液；再將上述前驅體溶液按48 μ L/cm2均勻滴加到聚苯乙烯培養(yǎng)皿上，放入65°C烘箱中干燥，干燥后即可獲得包含晶粒尺寸為2(T30nm，厚度為60nm?10nm的光響應納米氧化鈦薄膜的細胞培養(yǎng)皿；
2)培養(yǎng)骨髓間充質干細胞片
取3飛代人骨髓間充質干細胞，以2X 15個/cm2的密度植入直徑為5cm的含納米氧化鈦的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)10天后，采用波長450nm、強度4mW/cm2的紫外照射5min，即得成片脫落的人骨髓間充質干細胞片；
3)構建組織工程骨
采用新型細胞片轉移聯動儀將步驟2)制得的單層人骨髓間充質干細胞片轉移至常規(guī)細胞培養(yǎng)皿中，待其貼壁后，加入干細胞專用培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，L-谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100U/ml，鏈霉素100mg/ml)，置于37°C、5%C02飽和濕度條件下培養(yǎng)48h后，以
2X 15個/cm2的密度在其上植入人臍靜脈血管內皮細胞，在上述培養(yǎng)條件下放置2h，吸除培養(yǎng)基后，用新型細胞片轉移聯動儀將第二層人骨髓間充質干細胞片轉移至其上，相同條件下靜置培養(yǎng)2h。隨后，再以2X 15個/cm2的密度在其上植入一層人臍靜脈血管內皮細胞，并相同條件下培養(yǎng)2h，最后將第三層人骨髓間充質干細胞片轉移至其上，即得包含三層人骨髓間充質干細胞片及雙層夾心人臍靜脈血管內皮細胞的多層細胞片疊層化物，圖一即為多層細胞片疊層化物的宏觀圖，圖二則為相應多層細胞片疊層化物的倒置顯微鏡圖(a、b分別表示多層細胞片的周邊及中間區(qū)域)，顯示多層細胞間粘附良好，未見明顯漂浮死細胞。于上述干細胞專用培養(yǎng)基中額外添加堿性成纖維細胞生長因子10ng/ml及血管內皮生長因子20ng/ml,并添加成骨細胞誘導因子抗壞血酸100ug/ml、β-甘油磷酸鈉1mM及地塞米松luM，體外培養(yǎng)4天后即得具有血管網狀結構的組織工程骨，圖三即為組織工程骨中血管內皮細胞特異性熒光標記圖(a、b分別表示血管內皮細胞表面特異性標志物CD31及UEA-1染色)，顯示疊層化物間血管內皮細胞已逐漸形成血管網狀結構。
[0014]對本例中使用的人骨髓間充質干細胞的具體來源說明:
征得年輕植骨患者同意，髂骨取骨，用注射器吸取1ml骨髓液，注射器內含稀釋的肝素鈉2500U/ml約0.5ml，將細胞懸液貼壁緩慢注入到預置有等體積密度為1.077kg/L的人淋巴細胞分離液的試管內，使兩者間形成清晰的界面。以2500r/min離心20min，吸取中間的乳白色云霧狀單核細胞層，PBS漂洗，1500r/min離心lOmin，棄上清，加入含10%小牛血清的人骨髓間充質干細胞專用培養(yǎng)液(江蘇賽揚生物)10ml，制成單細胞懸液，以適當密度接種于底面積為25cm2培養(yǎng)瓶內，置入37°C、5%C02飽和濕度條件下培養(yǎng)，4天后首次半量換液，將未貼壁的細胞全部棄掉，以后每2?3天全量換液一次。待細胞匯合成單層后，以0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化，即得到原代骨髓間充質干細胞懸液。待細胞融合達80%以上，按1: 3或1: 4傳代培養(yǎng)，取第3代生長達80%融合的貼壁細胞，用胰蛋白酶消化，計數后取2 X 16個細胞，分裝6管，每管加入10 μ I熒光標記抗體CD45-FITC、CD34-PE、CD73-PE、CD105-FITC、CD166-PE，另設I管為空白對照，室溫避光30min，用PBS反復洗2_3次，加入200 μ I PBS混勻細胞，并以1%多聚甲醛固定，4°C保存，24h內上流式細胞儀檢測，正常人骨髓間充質干細胞高表達⑶73、⑶105及⑶166，⑶34及⑶45則呈陰性。
[0015]對本例中使用的人臍靜脈血管內皮細胞的具體來源說明:
無菌獲取新生J L臍帶,立即用生理鹽水沖洗血跡,剪去鉗痕和血腫部位,找出臍靜脈(2根管腔較小的是臍動脈，I根管腔較粗的是臍靜脈)，用帶平針頭的注射器從一段插入臍靜脈，用血管鉗固定，再用PBS液沖凈臍靜脈內血跡，為防止臍動脈殘留的血液混入，可將動脈分離少許用消毒線結扎，用血管鉗鉗夾另一端，從沖洗的針頭中注入0.1%的膠原酶液使其充盈，放入37°C水浴鍋內孵育15min。取出臍帶松開血管鉗釋放酶細胞混合液于離心管中，再用PBS液沖洗臍靜脈后一并收集于離心管中，1000r/min,離心5min，棄上清，加DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，L-谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100U/ml，鏈霉素100mg/ml，堿性成纖維細胞生長因子10ng/ml，血管內皮生長因子20ng/ml)，置于37°C、5%C02飽和濕度條件下培養(yǎng)，24h后首次換液，以后每2?3天換液一次。待細胞融合達80%以上，按1: 3或I: 4傳代培養(yǎng)，取第3代生長達80%融合的貼壁細胞，用0.25%胰蛋白酶(含0.0296EDTA)消化，經PBS清洗數次后，加入20 μ I熒光標記抗體⑶31-ΡΕ，另設空白對照，室溫避光30min后行流式細胞儀鑒定，正常人臍靜脈血管內皮細胞高表達CD31。
[0016]實施例二
I)制備光敏細胞培養(yǎng)皿的
將氧化鋅納米顆粒均勻分散于水中形成質量濃度為10%的分散液，將分散液與乙醇和三氯甲烷按0.02:6:1的比例配成前驅體溶液，再將上述前驅體溶液按25 μ L/cm2均勻滴加到聚苯乙烯培養(yǎng)皿上，放入65°C烘箱中干燥，干燥后即可獲得包含晶粒尺寸為l(T20nm，厚度為40nm?80nm的光響應納米氧化鋅薄膜的細胞培養(yǎng)皿。
[0017]2)培養(yǎng)骨髓間充質干細胞
取培養(yǎng)數代后的同源人骨髓間充質干細胞，以5X 14個/cm2的密度植入直徑為5cm的含納米氧化鋅的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)4天后，采用波長320nm、強度lmW/cm2的紫外照射30min，即得成片脫落的人骨髓間充質干細胞片。
[0018]3)構建組織工程骨
采用新型細胞片轉移聯動儀將單層同源人骨髓間充質干細胞片轉移至常規(guī)細胞培養(yǎng)皿中，待其貼壁后，加入干細胞專用培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，L-谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100U/ml，鏈霉素100mg/ml)，置于37°C、5%C02飽和濕度條件下培養(yǎng)2h后，以5 X 14個/cm2的密度在其上植入同源人血管內皮細胞，在上述培養(yǎng)條件下放置48h，吸除培養(yǎng)基后，用新型細胞片轉移聯動儀將第二層同源人骨髓間充質干細胞片轉移至其上，相同條件下靜置培養(yǎng)48h。隨后，重復依次植入同源人血管內皮細胞并培養(yǎng)及轉移人骨髓間充質干細胞片并培養(yǎng)，直至該結構具有8層骨髓間充質干細胞片，獲得多層細胞片疊層化物，在上述培養(yǎng)基中額外添加5ng/ml堿性成纖維細胞生長因子及10ng/ml血管內皮生長因子，并添加成骨細胞誘導因子抗壞血酸50ug/ml、β -甘油磷酸鈉5mM及地塞米松I X 10_8M,體外培養(yǎng)10天后即得組織工程骨。
[0019]對本例中使用的骨髓間充質干細胞的具體來源說明:
將人胚胎干細胞定植培養(yǎng)于失活鼠成纖維細胞飼養(yǎng)層之上，加DMEM/F12培養(yǎng)液(含20%血清替代物，ImM L-谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，10mM^-巰基乙醇，4ng/ml堿性成纖維細胞生長因子)，待其周邊出現呈碎屑狀的自分化細胞團，取此零碎細胞片于含10%小牛血清的人骨髓間充質干細胞專用培養(yǎng)液(江蘇賽揚生物)中培養(yǎng)數周，用包含胰酶、IV型膠原酶及中性蛋白酶的混合液解離、再培養(yǎng),并通過流式細胞儀分選出CD45、CD34陰性，而SH2、SH3、SH4呈陽性的同源人骨髓間充質干細胞。(人胚胎干細胞受贈于新加坡國立大學)對本例中使用的血管內皮細胞的具體來源說明:
將人胚胎干細胞定植培養(yǎng)于失活鼠成纖維細胞飼養(yǎng)層之上，加DMEM/F12培養(yǎng)液(含20%血清替代物，ImM L-谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，10mM β -巰基乙醇，4ng/ml堿性成纖維細胞生長因子)，并通過20ng/ml BMP-4促分化作用2天后，形成擬胚體。隨后，將其定植于基質膠表面，加DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，L-谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100U/ml，鏈霉素100mg/ml,堿性成纖維細胞生長因子5ng/ml,血管內皮生長因子10ng/ml)另促分化10余日后，以CD31為標志物篩選出人胚干細胞來源的血管內皮細胞。(人胚胎干細胞受贈于新加坡國立大學)
【權利要求】
1.一種組織工程骨，其特征在于所述的組織工程骨為具有三維毛細血管網的多層細胞片疊層化物，所述的多層細胞片疊層化物由η片疊置的骨髓間充質干細胞片及填充于各骨髓間充質干細胞片間的血管內皮細胞構成，η=3?8。
2.制備如權利要求1所述的組織工程骨的方法，其特征在于包括如下步驟: 1)制備光敏的細胞培養(yǎng)皿 將光響應納米顆粒分散于去離子水中配成質量濃度為1(Γ20%的分散液，再將分散液與醇和有機溶劑按摩爾比為0.02、.06:6^9:Γ3的比例配制成前驅體溶液，將前驅體溶液滴至聚苯乙烯培養(yǎng)皿至其鋪滿，烘干并消毒，得到光敏的細胞培養(yǎng)皿；所述的光響應納米顆粒為納米氧化鈦、納米氧化鋅或納米氧化鐵，醇為甲醇或乙醇，有機溶劑為四氫呋喃、三氯甲烷或二氯甲烷； 2)培養(yǎng)骨髓間充質干細胞片 取骨髓間充質干細胞，以5X 14IX 15個/cm2的密度植入步驟I)的光敏的細胞培養(yǎng)皿中，加入骨髓間充質干細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)4?10天后，采用波長32(T450nm、強度f 4mW/cm2的光從培養(yǎng)皿底部射入，照射至光敏的細胞培養(yǎng)皿中骨髓間充質干細胞成片脫落，獲得骨髓間充質干細胞片； 3)構建組織工程骨 將步驟2)得到的骨髓間充質干細胞片轉移至細胞培養(yǎng)皿中，待其貼壁后，加入骨髓間充質干細胞專用培養(yǎng)基，在37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)2?48h后，以5X 10，2X 15個/cm2的密度在其上植入血管內皮細胞，再在37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)2?48h，吸除骨髓間充質干細胞專用培養(yǎng)基后，在上述結構上再轉移一片骨髓間充質干細胞片，力口入骨髓間充質干細胞專用培養(yǎng)基，在37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)2?48h ； 在上述結構上再以5 X 10^2 X 15個/cm2的密度在其上植入血管內皮細胞，在37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)2?48h，吸除骨髓間充質干細胞專用培養(yǎng)基后，再次轉移骨髓間充質干細胞片，并加入骨髓間充質干細胞專用培養(yǎng)基，在37°C、5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)2?48h，重復上述的過程直至該結構具有η層骨髓間充質干細胞片，η=3^8,獲得多層細胞片疊層化物，向細胞培養(yǎng)皿內的骨髓間充質干細胞專用培養(yǎng)基中添加成骨細胞誘導因子及成血管細胞誘導因子，在37°C、5%C02及飽和濕度條件下再培養(yǎng)Γ10天，得到組織工程骨。
3.根據權利要求2所述的組織工程骨的制備方法，其特征在于所述的成骨細胞誘導因子為抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉和地塞米松中的一種或多種，所述的成血管細胞誘導因子為血管內皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子中的一種或兩種。
【文檔編號】A61L27/58GK104225681SQ201410480554
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月19日 優(yōu)先權日:2014年9月19日
【發(fā)明者】王慧明, 俞夢飛, 洪逸, 董靈慶 申請人:浙江大學