專利名稱：可注射用的組織修補材料及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于組織工程的醫(yī)用材料技術領域，具體涉及一種可注射的組 織修補材料及其制備方法。
背景技術：
目前在組織缺損的修復中，非手術性治療的增長迅速，所占比例已經(jīng)超
過80%;其中，軟組織充填劑注射是非手術治療的重要手段。隨著科學技術的 不斷發(fā)展，軟組織填充材料也越來越多，例如硅膠、膠原蛋白、聚丙稀酰胺、 水凝膠等。但是這些充填材料存在有生物相容性不高、植入體內后容易降解、 難以保持長期充填效果的缺點。
機體內的細胞可以合成并分泌細胞外基質，能促進膠原蛋白分子的合成、 交聯(lián)，恢復缺損的組織。因此釆用細胞注射治療是極具應用前景的治療方法， 可彌補上述材料的不足，達到比較持久的修復效果。
目前已應用的含有細胞的注射產(chǎn)品，例如自體成纖維細胞產(chǎn)品艾斯麗質 (Isolagen)，是將自體皮膚的成纖維細胞在體外進行傳代培養(yǎng)后形成的制 劑；其將傳代培養(yǎng)的細胞于24小時,內注射到軟組織凹陷區(qū)的真皮淺層，用于 填充真皮和皮下凹陷性缺損(如口周皺紋及鼻唇溝過深)、凹陷性痤瘡瘢痕、 光化性及老化性皮膚瘢痕等；其主要缺點是產(chǎn)品為液態(tài)，注射到局部組織后
難以控制其分布，不能塑型，并存在有注射不均勻的情況；另外此類產(chǎn)品中
缺乏能夠長期控制釋放的生長因子，使植入的細胞達不到理想生存的微環(huán) 境，影響其功能功效的發(fā)揮。
理想的可注射的組織修補材料是包含組織修復所需的活性細胞，其生物 相容性高、能夠快速任意塑型，充填后具有三維形態(tài)的修復作用。
經(jīng)檢索，未見有關此類產(chǎn)品的應用和文獻的報道。

發(fā)明內容
針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種可注射用的組織修 補材料及其制備方法，所制備的修補材料含有活性細胞，能主動修補組織器 官缺損并促進損傷愈合，具有生物相容性高、無毒害、可快速塑型的優(yōu)點。
本發(fā)明所提出可注射用的組織修補材料，其組成包含有活細胞和含有藥 物緩釋微球的凝膠溶液，在混合后注射到組織損傷區(qū)，可快速塑型充填軟組
織缺損，并能促進組織愈合；所述的活細胞為成體細胞、或是成體干細胞， 包括皮膚細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、脂肪細胞、骨髓間充質干細胞、造血 干細胞、皮膚干細胞、間充質干細胞、肌肉干細胞、脂肪干細胞的任一種或 是幾種，其選擇是根據(jù)所修復組織受區(qū)的需求確定；所述的藥物緩釋微球是 由機體可接受的生物可降解材料制備而成，微球的材質包括膠原蛋白、明膠、 聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸聚羥基乙酸共聚物、多糖的任一種或是幾種的 混合，微球粒徑為50~ 200,，其內結合有生長因子、抗菌藥物、麻醉藥物的 任一種或是幾種，其選擇是根據(jù)所修復組織的需求確定；所述的凝膠是機體 可接受的生物膠，包括纖維蛋白原、纖維蛋白、海藻酸鹽、膠原蛋白、透明 質酸、硫酸軟骨素、水凝膠、骨膠、明膠、果膠的任一種或是幾種的混合。 本發(fā)明可注射用的組織修補材料的特征還在于，為便于保存和使用，可
將細胞懸液作為組分A;藥物緩釋微球與凝膠溶液混合均勻作為組分B;使 用前將組分A與組分B快速混勻；所形成混合物中細胞的終濃度為106~108 個/ml，藥物緩釋微球的終濃度為10 50mg/ml，凝膠的終濃度為5~50mg/ml。 為使凝膠溶液有效凝固，在混合物中可按凝膠的特性加有促凝劑，促凝劑可
以是凝血酶、第八因子、氯化鈣的任一種或是幾種；其中凝血酶的終濃度為
100~ 500國際單位/ml,第八因子的終濃度為5 50單位/ml，氯化鉤的終濃 度為10 100mM。所制備的修補材料混勻后應迅速填補或注射到組織損傷區(qū)， 根據(jù)需要塑型。
本發(fā)明所述可注射用的組織修補材料的制備方法，包括有細胞的獲取和 藥物緩釋微球的獲得以及組織修補材料的制備，具體步驟如下
根據(jù)所修復組織受區(qū)的需求選擇細'胞的類型，按常規(guī)的細胞培養(yǎng)技術進 行體外培養(yǎng)，細胞的大規(guī)模擴增可釆用細胞工廠、生物反應器的方法進行， 將獲取的細胞懸液作為組分A;通過巿購或是釆用已有的技術方法獲得藥物 緩釋微球，冷凍干燥后滅菌消毒備用。
可注射用的組織修補材料的制備將藥物緩釋微球與凝膠溶液充分混勻 后作為組分B;使用前將組分A與組分B快速混勻，所形成的混合物中細胞 的終濃度為106~108個/1111;藥物緩釋微球的終濃度為10~50mg/ml;凝膠的 終濃度為5~50mg/ml。為使凝膠有效凝固，在混合物中可按凝膠的特性加有 促凝劑，促凝劑可以是凝血酶、第八因子、氯化鈣的任一種或是幾種；其中 凝血酶的終濃度為100~ 500國際單位/ml;第八因子的終濃度為5 ~ 50單位 /ml;氯化鉤的終濃度為10~100mM。所制備的修補材料混勻后應迅速修補或 注射到組織損傷區(qū)，在2 ~ 5分鐘內根據(jù)需要完成塑型。
本發(fā)明制備的可注射用的組織修補材料，具有以下優(yōu)點含有能夠主動 修補組織器官缺損的活細胞，可以是自.體/異體來源，來源廣泛，生物相容 性高、無毒害，能夠快速任意塑型；并能促進成纖維細胞長入、新生的毛細 血管形成、肉芽組織生成、促進損傷愈合；所含長期持續(xù)釋放的生長因子及 促進愈合的藥物，能促進機體和植入的細胞發(fā)揮更大的修復功能，具有在分 子水平引導細胞分化、增殖、構架、形成組織，加速組織修復的作用。
本發(fā)明制備的可注射用的組織修補材料在臨床應用的作用有(1)可作
為軟組織缺損的充填物，用于機體凹陷畸形的修復；(2)可修復機體深部和 不規(guī)則形態(tài)組織的缺損；(3)用于先天性軟組織缺陷、骨/軟骨缺損修復、 腭咽閉合不全、聲帶閉合不全及壓力性尿失禁等整形外科手術；(4)還可以 使面貌年輕化治療、組織輪廓增大隆起、非特異性調整及塑型。
具體實施例方式
以下結合實例對本發(fā)明技術方案做進 一步的詳細說明。 實例l:可注射用的皮膚組織修補材料
步驟l).成纖維細胞的擴增培養(yǎng)無菌獲取異體皮膚組織，去除脂肪層， 切成5隱xl0mm大小，中性蛋白酶消化后，分離表皮和真皮組織，用600U/ml 膠原酶消化真皮組織1小時；消化完成后將真皮組織吹散收集細胞液，離心 后棄上清獲取成纖維細胞；加入成纖維細胞培養(yǎng)液后吹懸細胞，接種入培養(yǎng) 瓶補足培養(yǎng)液，培養(yǎng)至所需數(shù)量，收集細胞懸液作為組分A。
步驟2).堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)緩釋微球的制備方法，可參 照文獻(《復合bFGF緩釋微球的制備及其對成纖維細胞增殖作用的實驗研究》 生物醫(yī)學工程研究.2004 23 (2): 108-110.)進行。步驟如下將含有乳化劑 斯潘(Span-80) ly。的液體石蠟30ml預熱至55 。C，攪拌下滴加同樣溫度的 明膠水溶液4ml ,調節(jié)攪拌速度至450r/min攪拌8 ~ 9min;形成油包水乳劑 后迅速改冰浴，繼續(xù)攪拌使其固化；加入25%戊二醛0. lml，攪拌下預固化， 再于4'C固化一天，洗滌后干燥，得淡黃色粉末狀微球，取干燥微球O.lg 溶脹于含有5Mg bFGF的10 ml雙蒸水中浸泡一天，冷凍干燥后，鈷60照 射滅菌備用。
步驟3).可注射用的皮膚組織修補材料的制備用生理鹽水溶解纖維蛋 白原制備凝膠溶液，混勻后加入bFGF緩釋微球形成組分B;再將凝血酶、第
八因子和氯化鉤溶解于生理鹽水配制促凝劑；使用前將組分A與組分B迅速
混勻，同時加入促凝劑，形成可注射用的皮膚組織修補材料；其中成纖維細
胞的終濃度為5xl()7個/m1,纖維蛋白原的終濃度為25mg/ml， bFGF緩釋微球 的終濃度為30mg/ml，凝血酶的終濃度為300國際單位/ml，第八因子的終濃 度為20單位/ml，氯化鈣的終濃度為100mM。其應在1分鐘內完成皮下注射， 并按設計要求在3分鐘內塑型為所需外形。該修補材料在凝血酶的作用下， 纖維蛋白原裂解，形成纖維蛋白單體，.單體自動聚合，形成不穩(wěn)定的纖維蛋 白，在第八因子的參與下進一步交聯(lián)形成穩(wěn)定的纖維蛋白凝固體。
本實例制備的可注射用皮膚組織修補材料適用于皮膚組織缺損的充填， 和體表凹陷畸形的修復，以及面部除皺、組織輪廓增大和塑型等方面的整形。 實例2:可注射用的脂肪組織修補材料的制備
步驟l).脂肪細胞的擴增培養(yǎng)無菌獲取自體脂肪組織，切成1腿3大小， 用300U/ml膠原酶液消化1小時后，將脂肪組織吹散，收集細胞液，離心 后棄去上清獲取脂肪細胞；加入脂肪細胞培養(yǎng)液后吹懸細胞，接種入培養(yǎng) 瓶補足培養(yǎng)液，培養(yǎng)至所需數(shù)量，收集細胞懸液作為組分A。
步驟2).選用氟比洛芬酯脂微球(北京泰德制藥公司生產(chǎn)，具有抗炎、 止痛及解熱作用，臨床用于疼痛或炎癥疾病的治療)備用。
步驟3).可注射用的脂肪組織修補材料的制備用生理鹽水溶解纖維蛋 白、膠原蛋白和透明質酸制備凝膠溶液，混勻后加入氟比洛芬酯脂緩釋微球 形成組分B;使用前將組分A與組分B迅速混合，形成可注射用的脂肪組織 修補材料；其中脂肪細胞的終濃度為10'個/ml，纖維蛋白、膠原蛋白和透明 質酸混合物的終濃度為10mg/ml,緩釋微球的終濃度為50mg/ml。其應迅速 完成皮下注射，并按設計要求在3 5分鐘內完成塑形。
本實例制備的可注射用脂肪組織修補材料適用于(1)脂肪組織缺損的充填；(2)用于先天性乳房發(fā)育不良，哺乳后乳房萎縮，雙側乳房大小不對
稱，乳頭凹陷畸形；(3)用于充填面部皮下凹陷性缺損或畸形；(4)用于吸
脂術后的凹陷，身體臀部、大腿、小腿彎曲等部位軟組織凹陷的充填；(5)
先天或后天性(外傷、燒傷、藥物使用)身體軟組織發(fā)育不良者(乳房等)；(6)
身體某部位在周徑和體形上不對稱。
實例3:可注射用軟骨組織修補材料的制備
步驟1).軟骨細胞的擴增培養(yǎng)無菌獲取異體軟骨組織，切成小米粒 大小，用400U/ml膠原酶液消化軟骨組織后，將軟骨組織吹散收集細胞液， 離心后棄去上清獲取軟骨細胞；加入軟骨細胞培養(yǎng)液后吹懸細胞，接種入 培養(yǎng)瓶補足培養(yǎng)液，培養(yǎng)至所需數(shù)量，收集細胞懸液作為組分A。
步驟2).胰島素樣生長因子1 ( IGF-1 )緩釋微球的制備緩釋微球的制 備按實例1進行；取干燥微球0. lg溶脹于含有10jug IGF-1的10 ml雙蒸 水中浸泡一天，冷凍干燥后，，o照射滅菌備用。
步驟3).可注射用軟骨組織修補材料的制備使用生理鹽水溶解海藻酸 鈉制備凝膠溶液，加入IGF-1緩釋微球充分混勻后形成組分B;使用前將組 分A與組分B迅速混合，同時加入氯化鈣促凝劑，形成可注射用軟骨組織修 補材料；其中軟骨細胞的終濃度為1()6個/ml; IGF-1緩釋微球的終濃度為 10mg/ml;海藻酸鈉的終濃度為40mg/ml，氯化輛的終濃度為40mM;其應在1 分鐘內完成組織內注射，并按設計要求在2 5分鐘內完成塑型。
本實例制備的可注射用的軟骨組織修補材料，適用于軟骨組織缺損的充 填，用于修復關節(jié)軟骨損傷，還可用于鼻、耳等面部整形方面。
權利要求
1、一種可注射用的組織修補材料，其特征在于，其組成包含有活細胞和含有藥物緩釋微球的凝膠溶液；所述的活細胞為成體細胞、或是成體干細胞；所述的藥物緩釋微球是由機體可接受的生物可降解材料制備，微球粒徑為50～200μm，其內結合有藥物；所述的凝膠是機體可接受的生物膠。
2、 根據(jù)權利要求1所述的組織修補材料，其特征在于，將細胞懸液作 為組分A;藥物緩釋微球與凝膠溶液混合均勻后作為組分B;使用前將組分 A與組分B混句；所形成混合物中細胞的終濃度為106~108個/1111，藥物緩釋 微球的終濃度為10~50 mg/ml，凝膠的終濃度為5~50mg/ml。
3、 根據(jù)權利要求2所述的組織修補材料，其特征在于，在混合物中添加 有凝血酶、第八因子、氯化鉤的任一種或是幾種；凝血酶的終濃度為100 ~ 500國際單位/ml，第八因子的終濃度為5 50單位/ml，氯化鉤的終濃度為 10~ 100mM。
4、 制備權利要求1~3所述組織修補材料的任一種方法，包括有細胞獲取和藥物緩釋微球獲得的步驟，其特征在于，將藥物緩釋微球與凝膠溶液充 分混勻后作為組分B,細胞懸液為組分A;用前將組分A與組分B快速混勻。
全文摘要
一種可注射用的組織修補材料，其特點是將活細胞、藥物緩釋微球與凝膠溶液混合，注射到受區(qū)后可快速成型，充填軟組織缺損并能促進損傷愈合；本發(fā)明所制備的可注射用的組織修補材料與已有技術相比，具有生物相容性高、能夠快速任意塑型、能快速充填組織器官缺損的優(yōu)點，并能促進成纖維細胞長入，新生的毛細血管形成，肉芽組織生成，促進損傷愈合；所含長期持續(xù)釋放的生長因子或促進愈合的藥物，能促進機體內或植入的細胞發(fā)揮更大的修復功能。
文檔編號A61L27/00GK101347638SQ20081015079
公開日2009年1月21日 申請日期2008年9月3日 優(yōu)先權日2008年9月3日
發(fā)明者黃馨慧 申請人:西安組織工程工程技術研究中心