專利名稱：一種從面包海星提取的海星皂苷類化合物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是從海洋生物中分離有抗癌活性的化合物，具體地說(shuō)是從面包 海星中提取分離到的一種海星皂苷類化合物及其在制備TO質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)腫瘤中最常見(jiàn)的一種，致殘率和死亡率高，5年生存率為20% 30%,在所 有,瘤中占半數(shù)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者5年生存率不足5%。目前用以治療膠質(zhì)瘤的化療藥物主 要有亞裙脲類烷化劑尼莫司汀(ACNU)、卡莫司汀、洛莫司汀以及甲基節(jié)肼、甲氨喋呤、環(huán)磷酰 胺、替尼泊苷等，但這些藥物對(duì)惡性膠質(zhì)瘤的有效率較低，一般小于50%,對(duì)生存時(shí)間延長(zhǎng)不 明顯，而且很易造成嚴(yán)重的肝臟損害及骨餘抑制，往往因?yàn)樗幬锏亩靖狈磻?yīng)重而不得不放棄化 療此外，至少半數(shù)以上膠質(zhì)瘤對(duì)常用的化療藥物耐藥。因此，與對(duì)其他腫瘤的治療相比，目 蒔臨床上更缺乏對(duì)膠質(zhì)瘤有效的治療藥物，新型安全高效的化療藥物的開(kāi)發(fā)是治療該病的迫切需求。
海星(starfish偶棘皮動(dòng)物門海星綱，現(xiàn)存約1500種，為海生底棲動(dòng)物，分布廣泛。近二十 年來(lái)，國(guó)外關(guān)于海星活性化學(xué)成分特別是海星甾體皂苷的研究非?；钴S，對(duì)海星皂苷的研究已 ^Sl鄰余種結(jié)構(gòu)新穎的化合物的發(fā)現(xiàn)。這些海星皂苷具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、Na+-K+-ATP ,制、抗湊瘍、溶血等多種多樣的藥理活性。海星皂苷(asterosaponins)為海星甾體皂苷中的一 類特定的化合物，其結(jié)構(gòu)特征為具有A""鄰,6a-二羥基甾體母核，并在3位硫酸化，6位糖 ^fc。苷元僩鏈至少有1個(gè)位置被氧化，寡糖基一般由5或6個(gè)糖基構(gòu)成，并具有相似的連接 方式和連#@:點(diǎn)(湯海銀易楊華，張淑瑜，等.海星皂苷的研究進(jìn)展.中國(guó)海洋藥物，2004， 23(6): 48"57和Iorizzi M. De Marino S, Zo!k) F. Steroidal oligogJycosides from the asteroidean. Current Orgnic Chen、 2001， 5(外951)-
我國(guó)南海生物資源極為豐富，是世界上海星集中分布的海域之一，特別是面包海星(C"fcito wmHSw^w)的蘊(yùn)藏量巨大，我們從采自三亞海域的面包海星中分離鑒定了 16種具有生物活性 的海星龜苷，包括1I種新化合物，這是國(guó)內(nèi)外首次對(duì)面包海星中的海星皂苷類化合物進(jìn)行分離 和鑒定。深入的藥理研究表明，這些海星皂苷多數(shù)具有顯著的腫瘤細(xì)胞毒性。其中一種新化合 物novaeguinoside II對(duì)U87MG等多種膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有顯著細(xì)胞毒性并顯示了 一^擇性，IC 值與臨床常用于惡性腦腫瘤治療的鹽酸尼莫司汀接近，但不影響原代培養(yǎng)的人神經(jīng)膠貭細(xì)胞生 長(zhǎng)。該化合物即下述式I所示化合物EHMC。 EHMC的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及對(duì)K-562人白血病細(xì)胞和 BEL"7402人肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性已由我們報(bào)道(T油g HF(湯海峰)，Yi m Ii L， S咖P, Zh油g SQ, Zhao YP. Bioactive asterosaponins from the starfish C"for'/" nc7WK{g ^KW. / jV"/戶roJ， 2005, 68(3): 337-341),但其 質(zhì)瘤活性尚未見(jiàn)有過(guò)^報(bào)道和專利申請(qǐng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在 —種提取自面包海星的海星皂苷類化合物在制備抗膠質(zhì)瘤藥物方面 的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的， 一種從面包海星提取的海星皂皆類化合物，它的分子式為 C57HjoQa(SNa,式1所示化合物
式I
上述結(jié)構(gòu)其化學(xué)名稱為(2Q/ ， 22^ 235， 24^60^-{^0-吡喃巖藻糖基<1—2)Hi-L-吡喃阿拉 伯糖基"(1—4Hp"D"8lt喃奎諾糖基"(1—2)+1>吡喃奎諾糖基<1~*3)^1>"耽喃葡萄糖基卜22， 23-環(huán)氧-2(K羥基-24"甲基-5tt-膽甾-9(ll)"烯-3p"硫酸鈉(sodium 22/^ 24S>6a 0-{^l>
fiiotqjyranosyU(l2>a-Lraiabinopyranosyl"(l — 4)"lP4Xjui加vopyranosyl-(1 — 2)]_^-l>quinovO"
54^sulfete),是從面包海星中提取分離的海星皂苷類化^，以下簡(jiǎn)稱其為EHMC,其特征是 所述的式I化合物EHMC可以用于制備治療膠質(zhì)瘤的藥物。
所述的式I化合物EHMC對(duì)C6大鼠源性惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞以及U87MG、 U251MG、 BT325 和SHG44四種人源性^I4膠質(zhì)瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用，半數(shù)有效抑制濃度(IC50值>在1.45 3J2 limol/L之間并且，在高至50 U mol/L濃度時(shí)也不影響原代培養(yǎng)的人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)， 式I化合物EHMC對(duì)MKN-28人胃癌和A-549人肺癌細(xì)胞的抑制作用非常弱，表明其對(duì)膠， 具有選擇性作用。
以新鮮采集的面包海星為原料，原料經(jīng)剪碎后，按重量^5比加入3 5倍原料重的95%乙 醇，回流提取3次，每次2 4小時(shí)；合并提取液，回收溶劑，得乙醇提取物，提取物分散于按 重量^ 比3倍的水中，分別用和水等^m的石油醚萃取10次，萃取后的水相再分別用與水等 體積的正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，濃縮至l/3體積，加等體積的水洗滌l次，以除去 鹽、多糖強(qiáng)極性成分，將水洗后的正丁醇相蒸千得到總苷提取物?？傑仗崛∥飸?yīng)用硅膠柱層析， 以體積比為2:I:0 ():6:I的氯仿-水飽和的正丁醇-甲醇混合^flI洗脫，得到總海星皂苷?？偤Ｐ?龜苷應(yīng)用硅膠柱層析和Sephadex LH-20凝膠柱層析純化，分別用體積比為12:1的正丁醇-甲醇 混合溶劑和體積比為2:1的甲醇-水混合溶劑洗脫，合并含式I化合物EHMC的流份，再經(jīng)高效 液相色譜儀分離純化，體積比為46:54 47:53的甲醇-水混合溶劑為流動(dòng)相洗脫，得到式I化合 物EHMC的純品。
所述的從面包海星中提取分離式I化合物EHMC的方法，除應(yīng)用常規(guī)的^^提取、溶劑萃 取和各種色譜分離技術(shù)外，在應(yīng)用硅膠柱層析方法從總苷提取物制備總海星皂苷時(shí)，對(duì)于包含 有EHMC的總海星皂苷的確定是采用如下手段來(lái)檢査的以硅膠薄層層析檢測(cè)，采用體積比為 12:3:5的正丁醇-乙酸-水混合^"j或柳比為肌1&2的氮仿-甲醇-水混合^M展開(kāi)，收集&值 在0.1~035處顯示紫紅色斑點(diǎn)的流份，即為總海星皂苷。
所述的式I化^EHMC在作為藥物使用時(shí)，可以是^使用，也可以是與其他成分混合 娜。
在臨床應(yīng)用時(shí)，以常規(guī)的制劑工藝，單獨(dú)使用或與其他藥物配合制備成在臨床上可以《fe用
的各種不同劑型的藥物，如注射劑、或散劑、或丸劑、或膠囊劑、或片劑、或微囊劑、或軟膠 囊劑、或膜劑、或裔劑、或酊劑、或顆粒劑、或氣霧劑等。 本發(fā)明的特點(diǎn)是-
目前臨床上缺乏有效治療膠質(zhì)瘤的藥物，雖然本發(fā)明人從面包海星中分離鑒定的一種海星 龜苷類化合物EHMC同時(shí)也可以抑制K-562人白血病細(xì)胞和BEL-7402人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，但相 比于開(kāi)發(fā)為抗白血病和抗肝痛藥物，開(kāi)發(fā)其顯著的抗膠質(zhì)瘤作用并應(yīng)用于臨床治療膠質(zhì)瘤更具 有重要的現(xiàn)實(shí)意義。而且，該化合物對(duì)于MKN-28人胃癌、A-549 AJ肺痛等其他腫瘤細(xì)胞的抑 制作用非常弱，表明它對(duì)膠質(zhì)瘤的抑制作用具有一定選擇性。
式化合物EHMC的結(jié)構(gòu)為本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，但它的抗膠質(zhì)瘤作用未見(jiàn)任何文獻(xiàn)報(bào) 道和專利申請(qǐng)，它對(duì)多種人和鼠惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的顯著抑制作用以及不抑制正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì) 胞生長(zhǎng)的作用考明其可以作為新的高效低毒的WJK質(zhì)瘤藥物進(jìn)行研究開(kāi)發(fā)。
具體實(shí)施例方式
以新鮮采集的面包海星為原料，原料經(jīng)剪碎后，按重量體積比加入3~5倍原料重的95%乙 醇，回流提取，共提取3次，每次2 4小時(shí)。合并提取液，回收溶劑，得乙醇提取物，提取物 分散于按重量體積比3倍的水中，分別用和水等體積的石油酵萃取10次，萃取后的水相再分別 用與水等柳的正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，濃縮至1/3體積，加等^R的水洗滌
次，以除去鹽、多糖等強(qiáng)極性成分，將水洗后的正丁醇相蒸千得到總苷提取物?？傑仗崛∥飸?yīng) 用硅膠柱層析，以^**1比為2丄0~0:6:1的氯仿-水飽和的正丁醇-甲醇混合溶劑洗脫，硅膠薄層 層析檢溯，細(xì)柳比為12:3:5的正丁醇-乙酸-水混合溶劑或體積比為80:18:2的氯仿-甲醇-水 混合^W展開(kāi)，收集Rr值在0.1 035處顯示紫紅色斑點(diǎn)的流份，即為總海星皂苷?？偤Ｐ窃?苷^ffl硅膠柱層析和Sephadex LH-20 柱層析純化，分別用體積比為12:1的正丁醇-甲醇混 合溶劑和體積比為2:I的甲醇-水混合溶劑洗脫，合并含式I化合物EHMC的流份，再經(jīng)高效液 枏色譜儀分離純化，體積比為46:54 47:53的甲醇-水混合溶劑為流動(dòng)相洗脫，得到式I化合物 EHMC的純品。
下面絡(luò)合具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)。應(yīng)理解，這些實(shí)施例使本發(fā)明所說(shuō)的式I化合 物EHMC的用途得以證實(shí)，而不用于限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
^jl樹(shù)l:化會(huì)對(duì)的提取和分離l
制備實(shí)施例化合物的原料為采用潛水和拖網(wǎng)手段采集自海南三亞海域的面包海星，原料重
68公斤，共85個(gè)面包海星，經(jīng)剪碎后，加入210升濃度為95%的乙醇進(jìn)行回流提取，共提取3 次，每次2小時(shí)。合并提取液，減壓回收^W(減壓回收即本行業(yè)通常所采用的袖濾方法，下同)， 得乙醇提取物3.1公斤。提取物分散于10升水中，用石油醚萃取10次，每次10升。萃取后的 水相再用正丁醇萃取3次，每次10升，合并正丁醇萃取液，濃縮至約3升，加3升的水洗滌1 次，將水洗后的正丁酵相蒸干得到總苷提取物145克。將總苷提取物進(jìn)行硅膠柱層析，以氯仿-水飽和的正丁l^甲醇混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液的體積比分別為2:1:0(取下層作為洗脫 銜，0:1:0和0:6:1，按500 mL為一個(gè)流份接收，并用硅膠薄層層析檢測(cè)(薄層展開(kāi)溶劑采用 體積比為12-15的正丁,乙膝水混合溶劑，顯色劑為體積比為1:4的硫酸-甲醇溶液，噴顯色 劑后于105 r加熱顯色)，收集Rf值在0.1M)35處顯示紫紅色斑點(diǎn)的流份，即為總海星皂苷， 共5.9克?？偤Ｐ窃韋fit行硅膠柱層析，用體積比為12:1的正丁醇-甲醇混合溶劑洗脫，按100 毫升為1個(gè)流份接收，薄層層析檢測(cè)，合并含如下式I化合物EHMC的第19 25流份，減壓蒸千l^劑后再采用Sephad戰(zhàn)LH-20自柱(Phaimacia公司)進(jìn)行柱層析，用體積比為2:1的甲醇-水混合^^,，按10毫升為一個(gè)流份接收，薄層層析檢測(cè)，合并含如下式I化合物EHMC的 第35 40流份和第41 44流份，分別SlSffi蒸干溶劑后得到0.32克樣品C和024克樣品D。樣 品C經(jīng)高效液相色譜儀(安捷倫公司份離純化(高效液相色譜條件為杜邦Zorbax300 SB"C,g色 譜柱250mmX9.4mm， 47%甲醇為流動(dòng)相，流速13 mL/min，室溫，示，光檢測(cè)器檢測(cè)), 得到如下式I化合物EHMC的純品33.0毫克；樣品D經(jīng)高效液相色譜儀(安捷倫公司份離純化 (高效液相色譜條件為杜邦Zorbax300SB"Cw色譜柱250mmX9.4mm， 46%甲醇為流動(dòng)相， 自1.9 mL/min，室溫，示^F^fe檢溯l&檢劂)，得到如下式I化合物EHMC的純品9.1毫克。
<formula>formula see original document page 6</formula>
i^結(jié)構(gòu)其化學(xué)名稱為(20/ ， 22/ ， 235， 24SV6a"-^D"吡喃巖藻糖基^1—2> 丄-吡喃阿拉 伯糖基"(l ,4)"[P"D"吡喃奎諾糖基^1 —2)1+1>吡喃奎諾糖基<1 —3)>^>吡喃葡萄糖基卜22, 23-環(huán)氧-20"徑基-24^甲基-5et-膽甾-9(Il)-烯-3^琉酸鈉(sodium (20凡22/^ 24S>6okHP"l> fijcopyranosyl"< 1 — 2^a-L-arabinopyranosyH 1 ~* 4HP"D-quinovopyranosyH 1 — 2)]~p-I>quinovO" pymnosj^Kl ~* 3)"p"D"glucopyranosyl)-22^"epoxy-2(Miydroxy-24"咖thyl-5a-cholest"9(IJI)"en-3P" yl^ulfiite),是從面包海星中提取分離的海星龜苷類化合物，簡(jiǎn)稱其為EHMC。
ifeK例2:化^Rl的提取和分離2
M潛水和拖網(wǎng)手段采集自海南三亞海域的面包海星作為原料，原料重100公斤，共129 個(gè)面包海星，經(jīng)剪碎后，加入400升濃度為95%的乙醇進(jìn)行回流提取，共提取3次，每次4小 時(shí)》合并提取液，減壓回收i^劑，得乙醇提取物4.8公斤。提取物分散于15升水中，用石油醚 10次，每次15升。萃取后的水相再用正丁醇萃取3次，每次15升，合并正丁醇萃取液， ifc縮至約5升，加5升的水t5fe滌l次，將水汰后的正丁醇相蒸干得到總苷提取物220克，將總 苷提取物迸行M柱層析，以氯仿-水飽和的正丁醇-甲醇混合溶劑進(jìn)行梯度皿， 液的柳 比分別為2:1:0(取下層作為洗脫液)，0:1:0和0:6:1，按750 mL為一個(gè)流份接收，并用硅膠 薄層層析檢測(cè)(薄層展開(kāi)^M^ffl體積比為幼:8:2的氯仿-甲醇-水混合齢W，顯色劑為體積比為 l:4的琉酸-甲醇溶液，噴顯色劑后于I05 r加熱顯色)，收集Rf值在(U 035處顯示紫紅頓 點(diǎn)的流份，即為總海星皇苷，共9.1克-總海星龜苷迸行硅膠柱層析，用體積比為12:1的正丁 醇-甲醇混合溶審欣脫，按I50毫升為I個(gè)流份接收，薄層層析檢測(cè)，合并含實(shí)施例1式I化合 物EHMC的第20 26流份，減壓蒸千溶劑后再采用Sephadex LH-20 TO掛Phan鵬cia公司)進(jìn) 行柱層析，用體積比為2:I的甲醇-水混合^M,，按I5毫升為一個(gè)流份接收，薄層層析檢湖， 合并含實(shí)施例1式I化合物EHMC的第35~41流份和第42 45流份，分別減壓蒸干溶劑后得 到O.鄰克樣品C和0.37克樣品D。樣品C經(jīng)商效液相色譜儀(安捷倫公司)分離純化(高效液相 色譜條件為杜邦Zorbax300SB《!8色譜柱250mniX9.4mm， 47%甲醇為流動(dòng)相，流速1.7
niL/miii,室溫，示差折光檢測(cè)器檢獮)，得到實(shí)施例1式I化合物EHMC的純品50.2毫克； 樣品D經(jīng)高效液相色譜儀(安捷倫公司份離純化(高效液相色譜條件為杜邦Zorbax300 SB^CJ8 色譜柱250 mmX9.4 mm， 46%甲醉為流動(dòng)相，流速2.0 mL/min，室溫，示差，檢測(cè)器檢 獮)，得到實(shí)施例1式I化合物EHMC的純品14.1毫克。 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定
實(shí)施例1式I化合物EHMC為白色結(jié)晶性粉末,分子式為C57Hw03gSNa,熔點(diǎn)為215~216 °C,ajj +3° (c 0.132 MeOH),, Liebermann-Burehatd和Mofoh反應(yīng)均為陽(yáng)性。
對(duì)化合物進(jìn)行酸水解和糖衍生物的分析，具體方法為取1.0 mg樣品，溶于2 mol/L CF3COOHltnL，置2mL安瓿中，充氮?dú)?，封管，于烘箱?20 t:加熱反應(yīng)2h, 40 1c減壓蒸 干，反復(fù)加MeOH (1 mLX3)后減壓抽干以除去CFjCOOH,殘?jiān)訡HaClj/HsO (5 mL/5 mL)分 配，水層以5 mLCHjOj洗滌1次，蒸干，0.8 mL無(wú)水吡啶溶解至10 mL反應(yīng)瓶中，加入2 mg NHiOH.Ha, 90 1c水浴振蕩反應(yīng)30min,冷卻至室溫后加入醋酐0.8 mL,再于90 r振搖反應(yīng) lh,減壓蒸干，反復(fù)加CH2Cl2(lmLX3)后減壓蒸干，溶于CHCl3 0.3mL,取ljiL進(jìn)行GC/MS 分析。單糖對(duì)照品U5f拉伯糖，1>巖藻糖、D^奎諾糖、D"葡萄糖各10mg,分別溶于lmL無(wú)水 吡接，按相同衍生方法制備糖腈乙酸酯，作為GC分析時(shí)的對(duì)照。GC/MS分析采用Fitmigan AfeyagerGC/MS聯(lián)用儀，配D&5石英毛細(xì)管色譜柱(30mX0.25 m取(L25 nm)。柱溫150 tc, 保持2min;升溫至300 "(15 tVnrin),保持10min。汽化溫度250 進(jìn)樣量1 ^L。載氣(流 量)N2(l luL/min)，分流比30:1,延遲2 mia。 MS檢測(cè)器El電離源，電離電壓70eV, 源溫200 t:。 MS標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)NBS， MST庫(kù)。GC/MS對(duì)比分析表明實(shí)施例1式I化合物EHMC 含有4種糖基IX葡萄糖ttt- 8.010 minX D"巖藻糖(Ir^.351 minX L"阿拉伯糖(1r^6.260 minX 1> 奎娜(^=6_251 min),組成比約為1:1:1:2。
對(duì)化合物進(jìn)行甲基化、酸水解和糖基分析，具體方法為取真空干燥4h的樣品(2.2mg)加 入lmLDMSO中，快速加入剛磨好的NaOH粉40mg,充氮?dú)夂蠹由w密封，并在超聲波作用下 溶解20mia,再加入(h3mLCHj1,避光室溫放置30miii后，加入4mL水中止反應(yīng)，以CHCl3 5祖L萃取，CHCb層用H20洗銜3mlXJ),減壓蒸干，溶于2 mol/LCF}COOH0.75 mL中，充 氮?dú)猓?c水解2h。水解液加入CHa3/H20(2miy2mL份配，水層用1.5mLCHCl3洗 滌后JftE蒸干，殘?jiān)磸?fù)加入HjQ (0.7 mLX2辦MeOH (1 mL)后減壓蒸干以除去CF3COOH。 然后加入0.5 mol/L氨水0.5 mL和HaBH^ 4 mg, 25 1c反應(yīng)4 h，滴加1 mol/L酸酸至無(wú)氣泡產(chǎn) 生，60 "以下鵬蒸干，再反復(fù)加入O.P/o鹽酸甲醇《2mLX3辨甲斷2mL)后艦蒸干，以除 J^fll酸根離子。殘?jiān)?05 1c加熱20miii以除盡水分，加入醋酐0.5mL和吡啶0.5mL,封管， 100 t:加熱45 乙酰化。乙酰化物以CHCiyHjQ(1.5 ml71.5 inL份配，CHCl3層相繼以HaQ 1 mL,飽和NaHCQj溶液1 mL, HsO 1 mL洗滌，然后減壓濃縮至干，加0.3 mL CHC13溶解后取 1 pL進(jìn)行GC/MS分析。GC/MS分析條件與檢測(cè)前述糖衍生物的條件相同?？梢詸z測(cè)到5種部 分甲基化糖酵乙,，分別對(duì)應(yīng)于實(shí)施例1式I化合物EHMC的寡糖鏈中的不同連接位置的糖 基Mkked glucme (l"-tri"0-acetyl-2,4，6"tri-0"nK^hylglucito1^ V=7.430 233， l粉，161，
129， 117,101， 87， 43X 24inked araWnose (l，2，5"tri O"acctyl-3，4"di-0-methylarabinitot V= 6.976 aiin^
l粉，129， 117， 101， 87, 43)> 2，44kiked quimwose (1，2，4,5-tetra-Oacetyl-3-0-methylquinovitoL V=6J18 mii^ 203,189， 143, 129， 117， 101， 87,43X terminal fiicose (l,5"di"0-acetyl-2，3,4^tri"0-nK^Mot tR=5.743 nri^ 175， 161， 131， 117， 115， 101， 89， 72， 43)^ terminal qutaovose (1,5-d^O-acetyl-2，3，4otiiCMnetl^k]ninDvitoL V=5.484 min^ wfc 175， 161， 131,117,115,101， 89,72， 43)。
通過(guò)離分辨質(zhì)譜和核磁共振譜特別是二維核磁共振譜的綜合解析，確定了該化合物的結(jié)構(gòu)。 其波譜數(shù)據(jù)如下
ESI-MS (正離子模式)1304 [M+Na+Hf, 1303 [M+Na+， 755 px 146+132+162+ Naf，
663 [1/2M+Naf, 609 [2XI46+I32+I62+NaI+， 463 [132+146+ 162+Na+; MS/MS (iwfe 1303) w*fc
1303 [M+NaJ*, 1183 [M+Na^NaHSCM4, 1038 [1183-147r，卿[1183-2XI46["， 725 [I脅FuoAra-
QiriH-2XI6r， 593 px 146+132+NaI+, 442XI46"32+Nar。 ESI-MS (負(fù)離子模式)wfc 1257; 1157 [M-Na-IOOr (cleavage of Ca^), 1111 [M
-N"46r, 979 IM-Ma-1格132L 9M"Nar2 X H6]-， 81157-2X146]"， 83M-Na-2X
l格132]-， 68M-Na-3 X 146>132]"， 52M-Na-3 X l格132-162]'， 507 [525- Hjpr。 HRES1-MS (正
離子模式)iwfc 1304.5416 [M+他+Hr (計(jì)算值C57HM02sSNa2:1304.5438X 1303.5353 [M+Nal* (計(jì)
算值C^HMOasSNaz: 1303.5369)。 IR (KBr) cm": 3441(OHX 1641(C=CX 1242, 1213(sulfete),
1063(00)。其^和UC核磁共振數(shù)據(jù)以及重要的HMBC相關(guān)信號(hào)見(jiàn)表1 。
表1實(shí)施例1式I化合物EHMC的和UC核磁共振數(shù)據(jù)a以及重要的HMBC相關(guān)信號(hào)(測(cè)試
__j^劑氘代吡啶) _
T5S! SHinuit6 Sc鵬lT No- SH咖lt11 ^ HMBC
=1.24 vp=1.50m
4.74 m
P=1.55m 1.37 m 3.67
p=2.57bni(n.6) 1.92 m
5.11m tt-l鄰叫
p=2.16dd (15.6,3.9) 1.03 m
a=l-70叫p=2.01 in
0Fl.47叫p-1.01m
1.53 m
0.87 s
O.抑s
1.29 s 2.72 tas 2.81 hrd (8.2)
1.57 m 0.82 d (6.8) 0.75 d (6.2)
0.74 d (63)
36.01 GkT 29.51 1
77.7 d 2 30-81 3
49.4 d 4 幼,9d 5 41.61 6
35.3 d QuiT 145.7 s 1 38.3 s 2
116.6d 3 4231 4
41.8 s 5 53.7 d 6
It Qufll*
2t 1
2
q 3
}q 4
71.3 s 5
23.5 q 6
64.4 d Am" 57.4 d 1
41.9 d 2 31.7 d 3 20.4 q 4
19.2 q 5
12.9q FW*
1
2
3
4
6
4.783 d (6.3) 3.S5m 3-69 m
3.88 m 3.71m
4.32叫4.15 m
4,773 d (8.0) 3.92 m
3.94 m 3,44t(8J0)
3.67 m 1.50 d (5.7)
105.4 C-6
73.8 GIc C-l
91.8 QuiIC-1
69.7 77.5 62.3
103.9 GlcC-3
82.6 QuiIIC-1 QuiIC-1
75.2 QuiI02
84.7 QuilC-3，AraCM
71.8 QuiI(M
18.3 Qua CM,-5
4.761 d (7.3) 102.6 QuilC4
4.31m 81.8 Fuc<M，Ara<M，-3
4.13 m 73.5
4.16 m 68.1
3.59d (11.4)> 4.20 d秘.O AraC-l
(12.3)
5.11 d (7.1) 3.91 m
3.93 m 3.52 tn 1.61 d (5.9)
4.745 d (8.0) 4.231(8.2) 3.86 m 3.83 m 3.53 m 1.30 d (6.1)
QidIC-2 Quill C-l
AraC-2 Fuc<M，-3
FucC-l，4，4
1234 567 89s =s 22s5eE:ssss加？s8 is :l加"認(rèn)
力2 7 4 SO力
o 7 7 7 丁 1
1
o 7 7 7 7- 1"核磁數(shù)據(jù)經(jīng)由tH-lH COSY, TOCSY， HSQC和HMBC譜的分析得以確定。b括號(hào)內(nèi)為偶合常數(shù) (他)。e多重性由DEPT譜確定^在HMBC譜中可以檢測(cè)到frfl和Gh;C-l的相關(guān)信號(hào)。幼<::葡 萄糖，Ara:阿拉伯糖，Qui:奎諾糖(其中，Qui I連接于Gfc的3位，Qui II連接于QuU的2位), Fuc:巖藻糖.
化^體mftJR5US作用的研究
對(duì)實(shí)施例1式I化合物EHMC進(jìn)行了體外 質(zhì)瘤#，試驗(yàn)所采用的細(xì)胞株分別為C6 大鼠源性惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞以及U87MG、 U251MG、 BT325和SHG44等4種人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞。 為獮it實(shí)施例I式I化合物EHMC對(duì)膠質(zhì)瘤的選擇性以及對(duì)正常神經(jīng)細(xì)胞的毒性，另取MKN-28 人胃痛和A-549 AfJf痛細(xì)胞株以及原代培養(yǎng)的人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞同時(shí)測(cè)定實(shí)施例I式I化合物 EHMC的細(xì)胞毒性。采用常規(guī)的MTT法潲試。
具體方法為根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速率，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以4000個(gè)細(xì)flS/孔接種于鄰孔 培養(yǎng)板，貼壁生長(zhǎng)24小時(shí)后，棄去原培養(yǎng)液，加入用DMEM培養(yǎng)液配制好的含不同濃度本發(fā) 明化合物的溶液200!iL，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)鹽酸尼莫司 丁(ACNU)陽(yáng)性對(duì)照、生理鹽水 對(duì)照和無(wú)細(xì)胞調(diào)零孔。細(xì)胞在37t;、 5%CQ!-95%02條件下培養(yǎng)48小時(shí)，然后加入PBS溶解 的濃度為10mg/mL的MTT(Sigma公司)20nL,在同樣條件下孵育4小時(shí)。最后，每孔加入200 (iL的二甲基亞砜，混勻'將96孔板置酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔在4鄰鵬處的吸光度(OD難。按下式 計(jì)算被潲物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率
細(xì)胞抑制率-(l 一治療組OD值/對(duì)照組OD值)X 100%
半數(shù)有效抑制濃度IC5o值采用LogH法計(jì)算。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。 表2實(shí)施例I式I化合物EHMC對(duì)5種惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞、2種其他腫瘤細(xì)胞以及原代培養(yǎng)的人
神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的抑制作用(IC5Q值，funol/L)
C^7MGSHG44神經(jīng)膠威細(xì)胞
EHMC183:1:0.863-2" 0.741,45 ±010>鄰
0.42 ±0觀未湖未糖>鄰
可見(jiàn)，實(shí)施例1式I化合物EHMC對(duì)4種人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞和1種大鼠源性惡性膠質(zhì)瘤細(xì) 胞均有顯著抑制作用，ICso值與臨床常用于惡性腦腫瘤治療的鹽酸尼莫司汀接近，但對(duì)其他2 種腫瘤細(xì)胞的抑制作用非常弱，表明其對(duì)膠質(zhì)癍具有選擇性作用。實(shí)施例I式I化合物EHMC 不影響原代培養(yǎng)的人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)(1C50值::50 jimol/L)，具體試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，既使在實(shí)施例1 式I化^fe EHMC為50 pmol/L濃度時(shí)，對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的抑制率也只有9.0% (ZM).05)，但陽(yáng) 性對(duì)照鹽酸尼莫司汀在50| 110^濃度時(shí)的抑制率可達(dá)26.8%(戶<0.05),可見(jiàn)，實(shí)施例1式I化 合物EHMC對(duì)正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞基本無(wú)毒性，可用于制備治療膠質(zhì)瘤的藥物。
，的制備
注射劑配方2mgEHMC, 50 mmol/L磷酸緩沖液，pH7.0，總體積1 mL。制法取實(shí)施 例I式[化合物EHMC 10 mg,加50 mrad/L磷酸緩沖液(pH 7.0) 5 mL,在無(wú)菌條件下完全溶解， 分別經(jīng)過(guò)G3和G6玻砂過(guò)濾器過(guò)濾，灌封于1 mL安瓿中,100 T滅菌30分鐘，得5支。
口服制審版方5毫克EHMC, 50毫克甘露醇，100毫克可溶性淀粉。制法取實(shí)施例1 式I化合物EHMC 5毫克，加50毫克甘露醇和100毫克可溶性淀粉，充分混勻后制粒，所制顆 粒包裝即得顆粒劑；所制顆粒裝于空膠囊殼中，即得膠囊劑所制顆粒直接壓片，包薄膜農(nóng)， 即得片劑。
權(quán)利要求
1.一種從面包海星提取的海星皂苷類化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下上述式I結(jié)構(gòu)的化學(xué)名稱為(20R，22R，23S，24S)-6α-O-{β-D-吡喃巖藻糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基-(1→4)-[β-D-吡喃奎諾糖基-(1→2)]-β-D-吡喃奎諾糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基}-22，23-環(huán)氧-20-羥基-24-甲基-5α-膽甾-9(11)-烯-3β-硫酸鈉(sodium(20R，22R，23S，24S)-6α-O-{β-D-fucopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl-(1→4)-[β-D-quinovopyranosyl-(1→2)]-β-D-quinovo-pyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl}-22，23-epoxy-20-hydroxy-24-methyl-5α-cholest-9(11)-en-3β-yl-sulfate)，以下簡(jiǎn)稱其為EHMC，其特征在于它在制備抗膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。
2. —種從面包海星中提取分離海星皂苷類化合物EHMC的方法，其特征在于以新鮮采集 的面包海星為原料，原料經(jīng)剪碎后，按重量體積比加入3~5倍原料重的95%乙醇，回流提取3 次，每次2 4小時(shí)合并提取液，回收溶劑，得乙醇提取物，提取物分散于按重量體積比3倍 的水中，分別用和水等體積的石油醚萃取IO次，萃取后的水相再分別用與水等體枳的正丁醇萃 取3次，合并正丁醇萃取液，濃縮至l/3柳，加等^^的水洗滌1次，以除去鹽、多糖強(qiáng)極性 成分，將水洗后的正丁醇相蒸千得到總苷提取物總苷提取物應(yīng)用硅膠柱層析，以體積比為 2:1:0 0眾1的氯仿-水飽和的正丁l甲醇混合溶劑洗脫，得到總海星皂苷；總海星皂苷應(yīng)用硅 膠柱層析和Sephadex LH-20 ^^f柱層析純化，分別用體積比為12:1的正丁,甲醇混合溶劑和 體積比為2:I的甲醇-水潘合溶劑洗脫，合并含式I化合物EHMC的流份，再經(jīng)高效液相色譜儀 分離純化，體積比為46:54 47:53的甲醇-水混合溶劑為流動(dòng)相洗脫，得到式I化合物EHMC的純品。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種從面包海星中提取分離海星皂苷類化合物EHMC的方法，其 特征在于除應(yīng)用常規(guī)的溶劑提取、^^萃取和各種色譜分離技術(shù)外，在應(yīng)用硅膠柱層析方法 從總苷提取物制備總海星皂苷時(shí)，對(duì)包含有EHMC的總海星皂苷的確定是采用如下手段來(lái)檢査 的以硅膠薄層層析檢瀾，細(xì)柳比為12:3:5的正丁醇-乙酸-水混合溶劑或^!R比為抑:18:2 的氯仿-甲 "水混合溶劑展開(kāi)，收集Rf值在0.1 035處顯示紫紅色斑點(diǎn)的流份，即為總海星皂 苷》
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從面包海星提取的海星皂苷類化合物EHMC在制S^t膠質(zhì)瘤 藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的從面包海星提取的海星皂苷類化合物可以單獨(dú)使用或與其 他藥物配合制備成在臨床上可以使用的各種不同劑型的藥物，如注射劑、或散劑、或丸劑、或 膠囊劑、或片劑、或微囊劑、或軟膠囊劑、或膜劑、或奢劑、或酊劑、或顆粒劑、或氣霧劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種海星皂苷類化合物，分子式為C₅₇H₉₃O₂₈SNa，化學(xué)名稱為(20R，22R 23S，24S)-6α-O-{β-D-吡喃巖藻糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基-(1→4)-[β-D-吡喃奎諾糖基-(1→2)]-β-D-吡喃奎諾糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基}-22，23-環(huán)氧-20-羥基-24-甲基-5α-膽甾-9(11)-烯-3β-硫酸鈉(sodium(20R，22R，23S 24S)-6α-O-{β-D-fucopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl-(1→4)-[β-D-quinovopyranosyl-(1→2)]-β-D-quinovo-pyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl}-22，23-epoxy-20-hydroxy-24-methyl-5α-cholest-9(11)-en-3β-yl-sulfate)，以下簡(jiǎn)稱其為EHMC，它是從海洋生物面包海星中提取得到的抗腫瘤化合物單體，其特征在于它在制備抗膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。體外抗腫瘤試驗(yàn)表明，該化合物對(duì)C6大鼠惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞以及U87MG、U251MG、BT325和SHG44四種人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用，而不影響原代培養(yǎng)的人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)。該化合物可望用于制備治療膠質(zhì)瘤的藥物。
文檔編號(hào)A61K31/7028GK101348514SQ20081015084
公開(kāi)日2009年1月21日 申請(qǐng)日期2008年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月8日
發(fā)明者文愛(ài)東, 易楊華, 楊志福, 湯海峰, 光 程, 軍 贠 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)