專利名稱：：2’-氟-4’-取代-核苷類似物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及核苷類似物、其制備方法及其應(yīng)用，尤其涉及2'-氟-4'-取代核苷類似物、其制備方法及應(yīng)用。技術(shù)背景1981年美國(guó)發(fā)現(xiàn)第一例艾滋病患者，到1983年科學(xué)家即分離鑒定出了艾滋病病毒(HIV)，發(fā)現(xiàn)HIV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科的慢病毒亞科，僅由9749個(gè)核苷酸組成。目前對(duì)HIV復(fù)制循環(huán)過程已經(jīng)基本搞清，研究發(fā)現(xiàn)其繁殖過程大致分為以下步驟吸附、侵入和脫殼、逆轉(zhuǎn)錄、整合、病毒RNA和蛋白質(zhì)的合成、裝配、釋放和成熟，其中每個(gè)環(huán)節(jié)均可作為篩選HIV藥物的耙點(diǎn)，其中蛋白質(zhì)的合成和病毒基因組核酸復(fù)制是最關(guān)鍵的步驟。目前篩選抗HIV藥物的焦點(diǎn)集中于尋找這些特異性酶的抑制劑，包括逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)抑制劑、蛋白質(zhì)合成酶抑制劑和逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)因子抑制劑等。HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶是一種多功能酶，同時(shí)具有依賴RNA的DNA聚合酶、依賴DNA的DNA聚合酶和RhaseH活性。HIV首先以病毒基因組的RNA為模板，以宿主細(xì)胞的運(yùn)轉(zhuǎn)RNA為引物，進(jìn)行(-)鏈DNA的合成，然后以同樣的方式合成(+)鏈DNA。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束以后，HIV所攜帶的全部遺傳信息從單鏈RNA轉(zhuǎn)化為雙鏈mDNA。逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑可以阻止mDNA的延長(zhǎng)，干擾HIV的逆轉(zhuǎn)錄過程，從而成為化學(xué)治療艾滋病的藥物。根據(jù)抑制劑的作用機(jī)理不同，可以把它們分為兩類1)核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，其作用于HIVDNA逆轉(zhuǎn)錄過程中，通過嵌入到病毒DNA中，促使其成為缺陷DNA而使HIV的宿主細(xì)胞的DNA整合后無法復(fù)制，從而達(dá)到抗HIV的作用，現(xiàn)有藥物為齊多夫定(AZT)、去羥肌苷(ddl)、扎西他濱(ddC)、司他夫定(d4T)、拉米夫定(3TC)、阿巴卡韋(Abacavir);2)非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，其作用機(jī)制是阻止HIVRNA直接連接到RT，不讓其編碼成DNA?，F(xiàn)有藥物奈韋拉平(Nevirapine)、Delavirdine和Efavirenz。1987年第一個(gè)上市的抗HIV藥物齊多夫定即為核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，雖然該藥物毒性很大，并且未能治愈一例病人，但是它可以減輕癥狀，延長(zhǎng)患者的生命。隨后又有幾個(gè)核苷類似物抗HIV藥物上市，因此，核苷類似物是一類重要的可能具有抗HIV活性的化合物。目前這些藥物都存在一定的缺陷，一方面是藥效有限，另一方面是長(zhǎng)期服用有嚴(yán)重的毒副作用，并且會(huì)產(chǎn)生抗性。因此，新型核苷類似物的合成依然是一個(gè)重要的研究方向。為了發(fā)現(xiàn)更有效的核苷類抗病毒藥物，人們對(duì)核苷進(jìn)行了各種各樣的修飾，其中含有氟的核苷類似物即為其中的一類。(Clark,J,PCTPatentAppl.,WO2005003174;Ismaili,H.M.A.PCTPatentAppl.,WO0160315A22001)。研究表明該類化合物都有不同程度的抗病毒活性，是一類新型的具有抗病毒活性的化合物。但是在現(xiàn)有的文獻(xiàn)中，迄今尚未見到本發(fā)明之含2'-氟-4'-取代-D-和L-核苷類似物的合成，以及將其用于制備抗HIV和抗HBV及HCV病毒藥物的相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的在于提供一種含2'-氟-4'-取代核苷類似物；另一目的在于提供該類化合物的合成方法；又一目的在于提供該類化合物在藥物方面的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，技術(shù)方案如下實(shí)現(xiàn)該本發(fā)明2'-氟-4'-取代核苷類似物，具有通式(I)結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其可以通過活性化合物(I)或其潛藥或其5'-磷酸酯與有機(jī)酸或無機(jī)酸反應(yīng)形成鹽，以鹽的形式存在。其可以是如下化合物之一但不僅限于這些化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>本發(fā)明含2'-氟-4'-取代-核苷類似物在制備藥物中的應(yīng)用，將其應(yīng)用于制備抗HBV或抗HCV或抗HIV病毒藥物中，所述抗HBV病毒藥物為抗乙肝藥物；所述抗HCV病毒藥物為抗丙肝藥物；所述抗HIV病毒藥物為抗艾滋病藥物。本發(fā)明含2'-氟-4'-取代核苷類似物的制備反應(yīng)，當(dāng)R=N3時(shí)路徑如下<image>imageseeoriginaldocumentpage8</image>化合物ii的合成將化合物i(D-核糖或L-核糖)溶于HCl/MeOH中，在水浴下保溫密閉攪拌，加入吡啶終止反應(yīng)，減壓抽干，得淺黃色糖漿狀物質(zhì)化合物ii;化合物iii的合成將化合物ii溶于干燥的吡啶中，冰鹽浴下緩慢滴加苯甲酰氯，室溫下攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完畢后將反應(yīng)液倒入冰水中，氯仿提取。有機(jī)層用冰水、預(yù)冷的硫酸、飽和碳酸氫鈉依次洗滌至水層呈弱堿性，再用冰水洗至水層呈中性，無水硫酸鈉干燥，減壓抽干得淺黃色糖漿狀物質(zhì)化合物iii?；衔飅v的合成將苯甲?；锘衔飅ii溶于氯仿中，加入紅磷，冰水浴攪拌下緩慢滴加溴，攪拌30min左右，緩慢滴加冰水，室溫?cái)嚢瑁缓蠹尤胨楸鶖嚾?，再將反?yīng)液倒入冰水中，氯仿提取。有機(jī)層飽和碳酸氫鈉洗至水層呈弱堿性，冰水洗至水層呈中性，無水硫酸鈉干燥，減壓抽干得深黃色糖漿，用硅膠柱分離得白色干糖漿化合物iv?；衔颲的合成將化合物iv溶解在干燥的吡啶中，冰水浴下緩慢滴加醋酐，攪拌30min左右，撤去冰水浴，室溫?cái)嚢杓s7h，升溫到4(TC保持約lh。加入碎冰攪融后，將反應(yīng)液倒入冰水中，氯仿提取。有機(jī)層用冰水、預(yù)冷的硫酸、飽和碳酸氫鈉依次洗至水層呈弱堿性，冰水洗至水層呈中性，無水硫酸鈉干燥，減壓抽干得淺黃色糖漿狀化合物v?；衔飗i的合成將化合物V溶于干燥的二氯甲烷中，冰水浴下緩慢通入干燥的HC1氣體，加入冰水洗滌，分出有機(jī)層，用飽和碳酸氫鈉洗至水層呈弱堿性，冰水洗至水層呈中性，無水硫酸鈉干燥，減壓抽干得淺黃色糖漿。重結(jié)晶得白色固體化合物vi?；衔颲ii的合成將化合物Vi溶于干燥的二氯甲垸中和干燥的DMF中，-15。C左右攪拌下緩慢加入S02C12，-15°(:攪拌301^11左右，自然升至室溫反應(yīng)，在0'C下分3次加入咪唑，混合液室溫?cái)嚢?，反?yīng)完畢后向反應(yīng)液加入CH2C12稀釋，用冰水洗滌，水層用CH2Cl2提取，有機(jī)層合并后用無水硫酸鈉干燥，減壓抽干溶劑得淺黃色糖漿。用硅膠柱分離純化得白色固體化合物vii?；衔飗iii的合成將化合物vii溶于乙酸乙酯中，攪拌下加入Et3N3HF，升溫至60'C左右攪拌約3h，7CrC攪拌約1.5h。加入冰鹽水終止反應(yīng)，然后用二氯甲垸提取，有機(jī)層合并后依次用鹽水、水、飽和碳酸氫鈉洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓抽干溶劑得深黃色糖漿。純化得淺黃色糖漿，粗品結(jié)晶得白色晶體化合物viii?；衔飅x的合成將化合物viii溶解于無水二氯甲垸中，加入HBr-AcOH的混合溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)。反應(yīng)完畢后將混合物蒸干，用二氯甲垸溶解剩余物，并用碳酸氫鈉洗滌二氯甲烷溶液，將二氯甲烷蒸去，得到糖漿狀物。同時(shí)，將保護(hù)過的胞嘧啶和(NH4)2S04在HMDS中氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流反應(yīng)，反應(yīng)完畢，減壓蒸去溶劑，得到甲硅烷基化的胞嘧啶。將上述反應(yīng)中得到的糖漿狀物溶于二氯乙垸中，加入到甲硅烷基化的胞嘧啶中，混合物在N2保護(hù)下回流反應(yīng)。用冰終止反應(yīng)，二氯甲烷萃取，二氯甲烷層依次用飽和碳酸氫鈉和鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。干燥后蒸除溶劑，得到白色固體，柱色譜分離純化，得到化合物ix?；衔飜的合成將化合物ix溶于飽和的NHrCH30H，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)。反應(yīng)完畢后將溶劑蒸干，所得剩余物通過柱色譜純化，得到化合物x?；衔飜i的合成將化合物x，咪唑、三苯基膦，溶解在四氫呋喃中，向其中緩慢加入溶解有碘的四氫呋喃溶液。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)。反應(yīng)完畢后蒸除溶劑，向剩余物中加入乙酸乙酯，過濾。蒸除乙酸乙酯，剩余物柱色譜分離得到化合物xi?；衔飜ii的合成將化合物xi溶解在四氫呋喃中，向其中加入DBU。在60'C左右攪拌反應(yīng)。反應(yīng)完畢后蒸干溶劑，剩余物柱色譜分離得到化合物xii?；衔飜iii的合成在0'C左右，將溶有IC1的DMF溶液加入到溶有NaN3的DMF溶液中，冰點(diǎn)攪拌約10分鐘，將溶有化合物xii的DMF緩慢加入到上述溶液，繼續(xù)反應(yīng)。反應(yīng)完畢后向混合溶液中加入亞硫酸鈉，直到碘的顏色完全消失。減壓蒸除溶劑，剩余物用柱色譜分離純化，得到化合物xii化合物xiv的合成將化合物xiii溶于DMF中，攪拌下加入醋酸銀，室溫反應(yīng)，反應(yīng)完畢后過濾。在減壓下移除溶劑，剩余物用柱色譜純化，得到化合物化合物XV的合成將化合物xiv溶于三乙胺甲醇溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，反應(yīng)結(jié)束后蒸除溶劑，剩余物用柱色譜純化，得到化合物XV。本發(fā)明含2'-氟-4'-取代核苷類似物的制備反應(yīng)，當(dāng)R=CH3,CN,CeCH時(shí)路徑如下化合物b的合成取化合物a，加入丙酮，攪拌條件下慢慢加入濃硫酸，室溫下攪拌反應(yīng)，TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，用濃氨水調(diào)節(jié)pH值，過濾，減壓蒸去大部分丙酮，在攪拌條件下加入0.4%稀鹽酸，在丙酮回流條件下反應(yīng)，化合物a全部水解成化合物b。用固體NaHC03中和反應(yīng)液，過濾，濾液在減壓下蒸去溶劑，剩余物用二氯甲垸溶解，用無水Na2S04干燥過夜，過濾，蒸去溶劑后，得到黃色粘稠油狀物b?；衔顲的合成將化合物b和三乙胺溶于二氯甲烷，冰鹽浴下慢慢滴加對(duì)氯苯甲酰氯，保持0'C以下機(jī)械攪拌反應(yīng)。反應(yīng)完畢后加入飽和NaHC03水溶液，二氯甲垸層用水、飽和食鹽水洗滌，無水MgS04干燥，過濾，減壓蒸去溶劑，并重結(jié)晶剩余物，得白色晶體化合物c?；衔飀的合成化合物c溶解到無水二氯甲烷中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入咪唑和叔丁基二甲基氯化硅(TBDMSC1)。室溫反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，用鹽酸中和反應(yīng)，分出兩層，有機(jī)層分別用水和飽和食鹽水洗滌后，用無水Na2S04干燥，蒸除溶劑，剩余物通過柱色譜進(jìn)行分離純化，得到化合物d。化合物e的合成化合物d加入到甲醇鈉-甲醇的混合物液中，室溫反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后用稀醋酸中和，過濾，用甲醇洗滌，減壓蒸除溶劑，剩余物用柱色譜分離純化，得化合物e?；衔飂的合成在約-60'C條件下向草酰氯的二氯甲垸溶液中逐滴滴加DMSO,在相同的溫度下，攪拌約15分鐘后，滴加化合物e的二氯甲垸溶液。在約-65。C攪拌反應(yīng)約30分鐘，加入三乙胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)。反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)液中加入水，分出有機(jī)層，有機(jī)層用無水硫酸鎂干燥。蒸除溶劑，剩余物用柱色譜分離純化得化合物f?；衔飃的合成在反應(yīng)瓶中放入氫氧化鈉和水，攪拌均勻后，加入甲醛水溶液、95%乙醇，然后再加入化合物f。約35'C下攪拌反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，邊攪拌邊用冰水冷卻反應(yīng)瓶，直至產(chǎn)物完全析出。抽濾，固體用水洗滌至中性并烘干，所得固體溶解到無水甲醇中，再加入硼氫化鈉，回流反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用稀鹽酸中和反應(yīng)液，用二氯甲垸萃取反應(yīng)液，無水Na2S04干燥后蒸除溶劑，得化合物化合物h的合成化合物g溶解到甲醇中，加入DowexH+(事先用甲醇洗滌)，室溫反應(yīng)，反應(yīng)完畢后將樹脂過濾除去，并用甲醇反復(fù)洗滌樹脂，溶液蒸干得固體。將所得固體溶于丙酮中，攪拌條件下慢慢加入濃硫酸(催化量)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，用濃氨水調(diào)節(jié)pH值，過濾，減壓蒸去丙酮，得到化合物h?；衔飅的合成在約-6(TC下向草酰氯的二氯甲垸溶液中逐滴滴加DMSO，滴完后攪拌約15分鐘，滴加化合物h的二氯甲烷溶液，滴完后約-6(TC反應(yīng)約30分鐘，加入三乙胺，室溫反應(yīng)約30分鐘后加入水終止反應(yīng)，分出有機(jī)層，有機(jī)層用無水Na2S04干燥。蒸除溶劑，剩余物用柱色譜分離純化得固體。將CICH2P(C6H5)3C1加入到無水四氫呋喃中，冷卻到約-78。C，加入n-BuLi的正己烷溶液攪拌反應(yīng)約lh，然后加入所得固體的干燥四氫呋喃溶液。溫度逐漸升高到0。C左右，繼續(xù)反應(yīng)。反應(yīng)完畢后小心滴加飽和的NH4C1溶液，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用鹽水洗滌兩次，最后用無水MgS04干燥，減壓蒸除溶劑，得到的剩余物溶解到無水四氫呋喃中，冷卻到-78'C左右，慢慢滴加n-BuLi的正己垸溶液。攪拌反應(yīng)2h左右，小心地用飽和NH4C1溶液終止反應(yīng)。有機(jī)層用飽和食鹽水洗滌，無水MgS04干燥，減壓蒸除溶劑，剩余物用快速硅膠柱分離純化，得化合物i。化合物j的合成將化合物i加入到稀鹽酸溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，反應(yīng)完畢后用固體NaHC03中和，過濾，濾液在減壓條件下蒸去溶劑，剩余物用二氯甲烷溶解，并用無水Na2S04干燥后過濾，蒸去溶劑，得化合物j?；衔飇的合成將化合物j溶解到吡啶中，滴加BzCl，室溫反應(yīng)，反應(yīng)完畢后蒸干溶劑，剩余物純化后得化合物k?；衔?的合成將化合物k和2，2,6，6-四甲基哌啶-N-氧溶于二氯甲烷中，冷至0'C左右，將混合的次氯酸鈉溶液、NaHC03和水混合溶液加入到反應(yīng)液，0'C左右反應(yīng)約30分鐘，加入異丙醇，室溫?cái)嚢?。分出的二氯甲烷層用水洗?次，無水MgS04干燥，過濾，蒸去溶劑得到的剩余物進(jìn)行重結(jié)晶，得到化合物1。化合物m的合成將化合物k加入到無水乙醇和乙酸乙酯的混合液中，冷至0。C左右，分批加入硼氫化鈉，攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完畢后用稀醋酸中和，過濾，濾液蒸干，剩余物再用二氯甲烷溶解，然后水洗，二氯甲垸層用無水MgS04干燥，過濾，減壓蒸去二氯甲烷，剩余物用二氯甲烷和石油醚的混合溶劑重結(jié)晶，得到固體物。將所得固體物溶于吡啶中，在O'C左右滴加BzCl,滴加完畢后，室溫反應(yīng)，反應(yīng)完畢后蒸除溶劑，剩余物用乙酸乙酯萃取，飽和NaHC03溶液洗滌，無水Na2S04干燥，過濾，蒸去溶劑，剩余物柱色譜分離純化得化合物m。化合物n的合成將化合物m溶于甲醇中，加入濃鹽酸/二氧六環(huán)的混合溶液，室溫反應(yīng)，反應(yīng)完畢后用NaHC03中和反應(yīng)液，過濾，濾液減壓蒸餾除去溶劑，剩余物溶于適量二氯甲烷中，用無水Na2S04干燥過夜，濾液蒸干，用柱色譜分離純化得化合物n?；衔颫的合成化合物n溶解在二氯甲垸中，室溫條件下加入DAST攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完畢后將混合物倒入飽和NaHC03溶液中，分出有機(jī)層，并用飽和NaHC03溶液洗滌，無水Na2S04干燥，柱色譜分離純化得到化合物o?；衔飌的合成將化合物o加入到甲酸溶液中，在室溫下攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完畢后減壓蒸去溶劑，剩余物與甲苯共蒸得固體物，將所得固體物溶于干燥吡啶和醋酸酐溶液，室溫反應(yīng)，反應(yīng)完畢后將反應(yīng)液濃縮，然后與甲苯共蒸，得到化合物p。化合物q的合成化合物p溶于無水二氯甲垸中，將其冷至0'C左右，然后慢慢通HC1氣體至飽和，室溫下真空蒸去溶劑，剩余物真空干燥得到化合物q?；衔飏的合成2,6-二氨基嘌呤與六甲基硅氮垸(HMDS)在(NHU)2S04存在下加熱回流至得到透明溶液，真空下蒸去溶劑得到白色固體，將該固體溶于1,2-二氯乙垸中，再加入化合物q的1,2-二氯乙烷溶液及分子篩，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，在反應(yīng)液中加入二氯甲垸，并用硅藻土過濾，濾液分別用飽和NaHC03和食鹽水洗滌，有機(jī)層用無水Na2S04干燥過夜，蒸去溶劑得到的剩余物用減壓硅膠柱分離得到化合物r?；衔飐的合成將化合物r溶解在NHrCH30H飽和的溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，反應(yīng)完畢后蒸除溶劑，剩余物通過柱色譜分離純化得到化合物s。本發(fā)明有益效果在于，通過對(duì)糖基和堿基的修飾，使該D-和L-核苷類似物含氟基團(tuán)、炔基、疊氮、氰基等特殊結(jié)構(gòu)彌補(bǔ)目前D-和L-核苷類似物毒副作用大、活性較小的不足；且該合成方法簡(jiǎn)便可行，收率較高，將其應(yīng)用于制備抗HBV或抗HCV或抗HIV病毒藥物，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。具體實(shí)施例方式根據(jù)本發(fā)明通式化合物I的合成路線并結(jié)合實(shí)施例對(duì)發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，但并非限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1當(dāng)堿基為胞嘧啶時(shí)化合物15的合成化合物ii的合成將化合物i(D-核糖或L-核糖)(8.66mmo1)溶于31.2mlHCl/MeOH(0.2mmol/L)中，在27'C水浴下保溫密閉攪拌3h，加入7.8ml吡啶終止反應(yīng)，減壓抽干，得淺黃色糖漿狀物質(zhì)化合物ii(96%);化合物iii的合成將化合物ii(7.92mmo1)溶于21ml干燥的吡啶中，冰鹽浴下緩慢滴加5.2ml苯甲酰氯(0.0447mo1)，室溫下攪拌17h后將反應(yīng)液倒入39ml冰水中，氯仿提取。有機(jī)層用冰水、預(yù)冷的3mol/L硫酸、飽和碳酸氫鈉依次洗滌至水層呈弱堿性，再用冰水洗至水層呈中性，無水硫酸鈉干燥4h以上，減壓13抽干得淺黃色糖漿狀物質(zhì)化合物iii(80.0%)。&NMR(CDC13)5ppm:7.28~8.10(m，15H,OBz)，5.87(m,1H,H隱3),5.68(d,1H,H-2),5.16(s,1H,H-l),4.72(m,2H，H-5),4.52(q,1H,H-4),3.42(s,3H,OCH3)?；衔飅v的合成將苯甲?；锘衔飅ii(0.0027mmol)溶于13mol氯仿中，加入紅磷(390mg，0.0126mol)冰水浴攪拌下緩慢滴加溴(1.3ml，0.025mmol)，攪拌30min后，緩慢滴加冰水1.3ml，室溫?cái)嚢?h，然后加入7g碎冰攪融，再將反應(yīng)液倒入14ml冰水中，氯仿提取。有機(jī)層飽和碳酸氫鈉洗至水層呈弱堿性，冰水洗至水層呈中性，無水硫酸鈉干燥4h以上，減壓抽干得深黃色糖漿，用硅膠柱分離(石油醚丙酮梯度洗脫)得白色干糖漿化合物iv(64.2%)。'HNMR(CDC13)Sppm:7.328.10(m,15H,OBz)，5.90(m,1H,H-3)，5.70(d,1H,H-2),5.63(s，1H，H-l),4.55~4,79(m,3H,H-5，H-4)?；衔飗的合成將化合物iv(2.73mmol)溶解在5ml干燥的吡啶中，冰水浴下緩慢滴加醋酐(0.0276mol)，攪拌30min后，撤去冰水浴，室溫?cái)嚢?h，升溫到40'C保持lh。加入6.5g碎冰攪融后，將反應(yīng)液倒入13ml冰水中，氯仿提取。有機(jī)層用冰水、預(yù)冷的3mol/L硫酸、飽和碳酸氫鈉依次洗至水層呈弱堿性，冰水洗至水層呈中性，無水硫酸鈉干燥4h以上，減壓抽干得淺黃色糖槳狀化合物v(92.1%)。iHNMR(CDCl3)Sppm:7.30~8.10(m，15H,OBz),6.43(s，1H,H-l),5.卯(m,1H,H-3),5.80(d，1H,H-2)，4.50~4.80(m,2H,H-5),2.00(s,3H,CH3COO-)。化合物vi的合成將化合物v(2.57mmol)溶于26ml干燥的二氯甲烷中，冰水浴下緩慢通入干燥的HCl氣體2.5h，加入冰水19.5ml洗滌，分出有機(jī)層，用飽和碳酸氫鈉洗至水層呈弱堿性，冰水洗至水層呈中性，無水硫酸鈉干燥4h以上，減壓抽千得淺黃色糖漿。用正己垸、二氯甲烷混合溶劑重結(jié)晶得白色固體化合物vi(65.1%)。'HNMR(CDC13)Sppm:7.36~8.14(m,15H,OBz)，6.68(d,聲4.4Hz，1H,H陽l),5.59(dd,1H,H-3),4.64~4.80(m,4H,H-2,H-4andH-5)。M,p.l3914(TC?；衔飗ii的合成將化合物vi(2.81mmol)溶于13ml干燥的二氯甲烷中和3.5ml干燥的DMF中，-15。C攪拌下緩慢加入S02C12(0.0079mmol)，-15。C攪拌30min后，自然升至室溫，反應(yīng)3h，在0。C下分3次加入咪唑(0.0407mmol)，混合液室溫?cái)嚢?5h，反應(yīng)液加入CH2Cl2(26ml)稀釋，用冰水(35ml)洗滌，水層用CH2Cl2提取，有機(jī)層合并后用無水硫酸鈉干燥4h以上，減壓抽干溶劑得淺黃色糖漿。用硅膠柱分離純化(石油醚丙酮梯度洗脫)得白色固體化合物vii(76.0%)。！HNMR(CDCI3)Sppm:7.00~8.10(m，15H，OBz),6.71(d，^4.4Hz，1H，H-1),5.59(dd,IH,H-3),5.25(dd,IH,H-2),4.56~4.81(m,3H,H-4,H-5)。M.p.l28129。C?；衔飗iii的合成將化合物vii(2.2mmol)溶于乙酸乙酯(54ml)中，攪拌下加入Et3N'3HF(2.08ml，0.013mmol)，升溫至60。C攪拌3h，70。C攪拌1.5h。加入冰鹽水(10ml)終止反應(yīng)，然后用二氯甲烷提取，有機(jī)層合并后依次用鹽水、水、飽和碳酸氫鈉洗滌，無水硫酸鈉干燥4h以上，減壓抽干溶劑得深黃色糖漿。用硅膠漏斗(5cmX5cm)純化(二氯甲烷洗脫)得淺黃色糖漿(86.8%)，粗品在95%的乙醇溶液中結(jié)晶得白色晶體化合物viii(66.4%)。'HNMR(CDC13)Sppm:7.31~8.10(m,15H,OBz),6.71(d,^9.0Hz,1H,H-l),5.68(dd,戶19.44Hz,1H,H-3),5.32(d,聲48.2Hz,1H，H誦2),4,65~4.77(m，3H,H-4,H國(guó)5)。M.p,8082。C?；衔飅x的合成將化合物viii(6.0mmo1)溶解于無水二氯甲烷(20ml)中，加入HBr-AcOH(45%，V/V，4.6ml，25mmo1)的混合溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)20h。將混合物蒸干，用二氯甲垸(50ml)溶解剩余物，并用碳酸氫鈉(3X30ml)洗滌二氯甲烷溶液，將二氯甲烷蒸去，得到糖漿狀物。同時(shí)，將保護(hù)過的胞嘧啶(15mmo1)和(NH4)2S04(O.lg)在HMDSG0ml)中氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流反應(yīng)17h,減壓蒸去溶劑，得到甲硅烷基化的胞嘧啶。將上述反應(yīng)中得到的糖漿狀物溶于二氯乙垸(25ml)中，加入到甲硅垸基化的胞嘧啶中，混合物在N2保護(hù)下回流反應(yīng)15h。用冰終止反應(yīng)，用二氯甲烷(3X45ml)萃取，二氯甲垸層依次用飽和碳酸氫鈉和鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。干燥后蒸除溶劑，得到白色固體，柱色譜分離(l%MeOH-CHCl3)純化，得到化合物ix(71%)。'HNMR(CDC13)Sppm:8.07(d,J=9.86Hz,1H),7.45(d,J=9.82Hz,1H),7.26~8.10(m,10H,OBz),6.03(d,J=9.0Hz,1H,H-l),5.64(dd,聲19.44Hz,1H,H-3),5.26(d,J=48.2Hz,1H,H-2),4.65~4.77(m,3H,H隱4，H-5)?；衔飜的合成將化合物ix(3.60mmo1)溶于飽和的NH3-CH3OH(30ml)室溫?cái)嚢璺磻?yīng)15h。將溶劑蒸干，所得剩余物通過柱色譜(15:lCHCl3-MeOH)純化，得到化合物x(80。/。)。^NMR(CDC13)Sppm:8.10(d,J=9.86Hz,1H),7.40(d,J=9.82Hz,1H)，6.03(d,〉9.0Hz,IH,H-1),5,64(dd,^19.44Hz,IH,H-3),5.26(d,J:48,2Hz,IH,H-2),4.50(m,IH,H-4),3.70~3.77(m，2H,H-5)?；衔飜i的合成將化合物x(9.46腿ol)'咪唑(18,93mmoD、三苯基膦(14.19mmol)，溶解在四氫呋喃(50ml)中，向其中緩慢加入溶解有碘(14.18mmo1)的四氫呋喃溶液15ml。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3h。蒸除溶劑，向剩余物中加入乙酸乙酯(100ml)，過濾。蒸除乙酸乙酯，剩余物柱色譜分離得到化合物xi(83.9%)。&NMR(CDC13)Sppm:8.06(d,J=9.86Hz,1H),7.43(d,J=9.82Hz,1H),6.01(d，^9.0Hz，1H，H-l)，5.66(dd,J=19.44Hz,1H,H-3)，5.22(d,J=48.2Hz,1H,H-2)，4.57(m,1H,H-4),3.583.69(m，2H,H-5)?；衔飜ii的合成將化合物xi(5.88mmo1)溶解在四氫呋喃(50ml)中，向其中加入DBU(6.44mmo1)。在60。C攪拌3h。蒸干溶劑，剩余物柱色譜分離得到化合物xii(75.1%)。直接用于下一步反應(yīng)。化合物xiii的合成在0°C,將溶有ICl(13.9mmol)的15mlDMF溶液加入到溶有NaN3(9.75mmol)的DMF(15ml)溶液中，0。C攪拌10分鐘，將溶有化合物xii(6.8mmol)的DMF(20ml)緩慢加入到上述溶液。O'C反應(yīng)1小時(shí)。向混合溶液中加入亞硫酸鈉，直到碘的顏色完全消失。減壓蒸除溶劑，剩余物用柱色譜分離純化，得到化合物xii(77.6%)。直接用于下一步反應(yīng)?；衔飜iv的合成將化合物xiii(5mmo1)溶于DMF(15ml)中，攪拌下加入醋酸銀(6mmo1)，室溫反應(yīng)8h，過濾。在減壓下移除溶劑(50'C以下)，剩余物用柱色譜純化，得到化合物xiv(71.3%)。^NMR(DMSO國(guó)^，300MHz)S:8.12(d,1H),7.40(d,1H),7.26(br,2H),6.12(dd,1H),5.87(d,1H)，5.09(t，1H),4.90(dt,1H),4.18(dt,1H),3.74-3.87(m,2H),2.12(s,3H,CH3)?；衔飜v的合成將化合物xiv(5mmol)溶于5%的三乙胺甲醇溶液(100ml)中，室溫?cái)嚢?2h，蒸除溶劑，剩余物用柱色譜純化，得到化合物xv(89.0%)。ESI-MS:287[M+H]。'HNMR(DMSO-^，300MHz)S:8.14(d,1H)，7.32(d,1H),7.21(br,2H)，6.08(dd，1H),5.82(d,1H)，5.11(t,1H),4.92(dt,1H),4.16(dt,1H),3.62-3.69(m,2H)。實(shí)施例2當(dāng)4'-位取代基為炔基，堿基為1,6-二氨基嘌呤時(shí)化合物25的合成化合物b的合成取化合物a(60g)，加入丙酮(2L)，攪拌條件下慢慢加入濃硫酸(40ml)，室溫下攪拌反應(yīng)40分鐘，TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束，用濃氨水調(diào)節(jié)pH=7~8，過濾，減壓蒸去大部分丙酮，剩余丙酮和水約150ml，在攪拌條件下加入0.4%稀鹽酸(150ml)，在丙酮回流條件下反應(yīng)20分鐘，化合物a全部水解成化合物b。用固體NaHC03中和反應(yīng)液至pH=7~8,過濾，濾液在減壓下蒸去溶劑，剩余物用二氯甲垸溶解(200ml)，用無水Na2S04干燥過夜，過濾，蒸去溶劑后，得到黃色粘稠油狀物b(73g，95%)，ESI-MS:191[M+H]?；衔颿的合成將化合物b(154g,O.81mol)和三乙胺(339ml,2.43mol)溶于二氯甲烷(1.50L)中，冰鹽浴冷至0。C,慢慢滴加對(duì)氯苯甲酰氯(113ml，0.891mol)，保持0'C以下機(jī)械攪拌反應(yīng)4h，加入飽和NaHC03水溶液(500ml)，二氯甲垸層用水、飽和食鹽水洗滌，無水MgS04干燥，過濾，減壓蒸去溶劑，并重結(jié)晶剩余物，得白色晶體化合物c(196g，74.6%)，ESI-MS:330[M+H]?；衔飀的合成化合物c(0.114mol)溶解到無水二氯甲烷(600ml)中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入咪唑(15.5g，0.228mol)和叔丁基二甲基氯化硅(TBDMSCl)U8.9g，0.125mol)。室溫反應(yīng)3h后，用1N鹽酸中和反應(yīng)，分出兩層，有機(jī)層分別用水和飽和食鹽水洗滌后，用無水Na2S04干燥，蒸除溶劑，剩余物通過柱色譜進(jìn)行分離純化，得到化合物d，產(chǎn)率69.2%，ESI-MS:444[M+H]?；衔飁的合成化合物d(0.64mmo1)加入到0.2N甲醇鈉-甲醇(15ml)的混合物液中，室溫反應(yīng)4h，用稀醋酸中和，過濾，用甲醇洗滌，減壓蒸除溶劑，剩余物用柱色譜分離純化，得化合物e，產(chǎn)率75%，ESI-MS:305[M+H]?；衔飂的合成-60匸下向草酰氯(3.41111，38.7mmo1)的二氯甲烷(80.0ml)溶液中逐滴滴加DMSO(5.5ml，77.5mmoD，在相同的溫度下，攪拌15分鐘后，滴加化合物e(25.7mmo1)的二氯甲烷(100ml)溶液。在-65'C攪拌反應(yīng)30分鐘，加入三乙胺(10.9ml，78.2mmo1)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30分鐘。反應(yīng)混合物中加入水，分出有機(jī)層，有機(jī)層用無水硫酸鎂干燥。蒸除溶劑，剩余物用柱色譜分離醇化得化合物f，產(chǎn)率94.6%，ESI-MS:303[M+H]?；衔飃的合成在反應(yīng)瓶中放入氫氧化鈉(1.3g)和水(11.5ml)，攪拌均勻后加入30%的甲醛水溶液、7.2ml95。/。乙醇，然后加入化合物f(25mmo1)?？刂品磻?yīng)溫度在3035'C下攪拌2h。反應(yīng)結(jié)束后，邊攪拌邊用冰水冷卻反應(yīng)瓶，直至產(chǎn)物完全析出。抽濾，固體用水洗滌至中性并烘干，所得固體溶解到無水甲醇中，再加入硼氫化鈉(0.925g，25mmo1)，回流反應(yīng)lh，用稀鹽酸中和反應(yīng)液，二氯甲烷萃取(3X50ml)，加入無水Na2S04干燥，蒸除溶劑，得化合物g，產(chǎn)率90.5°/。，ESI-MS:335[M+H]?；衔飄的合成化合物g(9.7mmo1)溶解到甲醇(260ml)中，加入DowexH+(40ml，事先用甲醇洗滌)，室溫反應(yīng)4h，將樹脂過濾除去，并用甲醇反復(fù)洗滌樹脂，溶液蒸干得固體。將所得固體溶于丙酮(200ml)中，攪拌條件下慢慢加入濃硫酸(催化量，2ml)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)約0.5h，用濃氨水調(diào)節(jié)pH-7-8，過濾，減壓蒸去大部分丙酮，再加入0.4%稀鹽酸(40ml)，丙酮回流條件下反應(yīng)20分鐘，用NaHC03中和反應(yīng)液至pH-7-8，過濾，減壓下蒸除溶劑，剩余物用適量二氯甲烷溶解，用無水Na2S04干燥后，蒸去溶劑，得到化合物h，產(chǎn)率80.2%,ESI-MS:261[M+H]?；衔飅的合成-60°。向草酰氯G.4ml，38,7mmo1)的二氯甲烷(80ml)溶液中逐滴滴加DMSO(5.5ml，77.5mmo1)，滴完攪拌15分鐘后，滴加化合物h(25.7mmo1)的二氯甲垸(100ml)溶液，滴完后-60。C反應(yīng)30分鐘，加入三乙胺(10.9ml，78.2mmo1)，室溫反應(yīng)30分鐘后加入水終止反應(yīng)，分出有機(jī)層，有機(jī)層用無水Na2S04干燥。蒸除溶劑，剩余物用柱色譜分離純化得固體。將C1CH2P(C6H5)3C1(2.15g，6.19mmo1)加入到無水四氫呋喃(50ml)中，冷卻到-78°C,加入n-BuLi的正己烷溶液(1.6M，4.0ml)攪拌反應(yīng)lh，然后加入所得固體(1.51mmo1)的干燥四氫呋喃溶液(50ml)。冷卻溫度逐漸升高到0°C,繼續(xù)反應(yīng)3h。小心滴加飽和的NH4C1溶液(10ml)，用乙酸乙酯萃取(2X100ml)，有機(jī)層用鹽水洗滌兩次(2X75ml)，最后用無水MgS04干燥，減壓蒸除溶劑，得到的剩余物溶解到無水四氫呋喃(40ml)中，冷卻到-78'C,慢慢滴加n-BuLi的正己烷溶液(1.6M，20ml)。攪拌反應(yīng)2h，小心地用飽和NH4C1溶液(20ml)終止反應(yīng)。有機(jī)層用飽和食鹽水洗滌，無水MgS04干燥，減壓蒸除溶劑，剩余物用快速硅膠柱分離純化，得化合物i，產(chǎn)率48.5%，ESI-MS:255[M+H]。化合物j的合成將化合物i(lOmmol)加入到0.2%的鹽酸溶液(50ml)中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6h，用固體NaHC03中和反應(yīng)至p1^78，過濾，濾液在減壓條件下蒸去溶劑，剩余物用二氯甲烷溶解，并用無水Na2S04干燥后過濾，蒸去溶劑，得化合物j，產(chǎn)率99.0%，ESI-MS:215[M+H]?；衔飇的合成將化合物j(5mmo1)溶解到吡啶(20ml)中，滴加BzCl(5mmo1)，室溫反應(yīng)6h，蒸干，剩余物純化后得化合物k，產(chǎn)率85.3%，ESI-MS:319[M+H]?；衔?的合成將化合物k(59.3mmo1)和2,2,6,6-四甲基哌啶-N-氧(0.059mmoD溶于二氯甲烷(99ml)中，冷至0。C，將次氯酸鈉溶液G3.6ml，8.513.5%有效氯)、NaHC03(11.2g)和水(190ml)混合溶液加入到反應(yīng)液，0r反應(yīng)30分鐘，加入異丙醇(1.95ml)，室溫反應(yīng)10分鐘，分出的二氯甲垸層用水洗滌2次，無水MgS04干燥，過濾，蒸去溶劑得到的剩余物進(jìn)行重結(jié)晶，得到化合物l，產(chǎn)率87.8%，ESI-MS:317[M+H]?；衔飉的合成將化合物k(0.05mol)加入到無水乙醇(60ml)和乙酸乙酯(30ml)的混合液中，冷至0°C，分批加入硼氫化鈉(23.3g，612mmol)，然后在0'C攪拌反應(yīng)lh，用稀醋酸中和至pH-7-8，過濾，濾液蒸干，剩余物再用二氯甲烷溶解，然后水洗，二氯甲烷層用無水MgS04干燥，過濾，減壓蒸去二氯甲烷，剩余物用二氯甲烷和石油醚的混合溶劑重結(jié)晶，得到固體物。將所得固體物溶于吡啶中，在0。C條件下，滴加BzCl(50mmol)，滴加完畢后，室溫反應(yīng)3h，蒸除溶劑，剩余物用乙酸乙酯萃取，飽和NaHC03溶液洗滌，無水Na2S04干燥，過濾，蒸去溶劑，剩余物柱色譜分離純化得化合物m，產(chǎn)率89.7%，ESI-MS:423[M+H]?；衔飊的合成將化合物m(4mmo1)溶于甲醇(22ml)中，加入4.0M的鹽酸/二氧六環(huán)混合溶液(20ml)，室溫反應(yīng)10h，用NaHC03中和反應(yīng)液至pH=7~8，過濾，濾液減壓蒸餾除去溶劑，剩余物溶于適量二氯甲烷中，用無水Na2S04干燥過夜，濾液蒸干，用柱色譜分離純化得化合物n，產(chǎn)率89.5%，ESI-MS:397[M+H]。化合物o的合成化合物n(1.76mmo1)溶解在二氯甲垸中，室溫條件下加入DAST(0.4ml,3.03mmol)攪拌12h，將混合物倒入10ml飽和NaHC03溶液中，分出有機(jī)層，并用飽和NaHC03溶液洗滌，無水Na2S04干燥，柱色譜分離純化得到化合物o，產(chǎn)率11.5%，ESI-MS:399[M+H]。化合物p的合成將化合物o(lOmmol)加入到20ml濃度為80%的甲酸溶液中，在室溫下攪拌反應(yīng)12h，減壓蒸去溶劑，剩余物與甲苯共蒸得固體物，將所得固體物溶于干燥吡啶和醋酸酐溶液，室溫反應(yīng)4h，反應(yīng)液濃縮后與甲苯共蒸，得到化合物p，產(chǎn)率90.3%，ESI-MS:427[M+H]。HNMR(CDCl3，300MHz)S:2.07(s,3H)，2.85(s,1H)，4.62-4.77(m，2H)，4.89-5.07(m,3H),7.32-8.17(m,IOH)。化合物q的合成化合物p(4.76mmoD溶于無水二氯甲烷(40ml)中，將其冷至0X:，然后慢慢通HC1氣體至飽和(約3h)，室溫下真空蒸去溶劑，剩余物真空干燥2小時(shí)得到化合物q，產(chǎn)率87.1%，化合物q直接用于下一步反應(yīng)?；衔飏的合成2,6-二氨基嘌呤(4.78mmo1)與六甲基硅氮垸(HMDS,9ml)在(NH4)2S04(50mg)存在下加熱回流至得到透明溶液(約5h)，真空下蒸去溶劑得到白色固體，將該固體溶于l，2-二氯乙垸G5ml)中，再加入化合物q的1,2-二氯乙烷溶液(4.56mmol，30ml)及0.4nm分子篩(2.6g)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢?天，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，在反應(yīng)液中加入二氯甲烷(80ml)，并且用硅藻土過濾，濾液分別用飽和NaHC03和食鹽水洗滌，有機(jī)層用無水Na2S04干燥過夜，蒸去溶劑得到的剩余物用減壓硅膠柱分離得到化合物r，產(chǎn)率78.5%，ESI-MS:517[M+H]。'HNMR(CDC13，300MHz)S:2.85(s,1H),4.67-4.79(m,2H)，4.92-5.13(m,3H),5.79(br,1H),7.32-8.17(m，9H),8.35(s,IH)?；衔?5的合成將化合物r(3.60mmol)溶解在飽和的NH3-甲醇溶液(30ml)中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)15h，蒸除溶劑，剩余物通過柱色譜分離純化得到化合物25，產(chǎn)率78.9%，ESI-MS:309[M+H]。'HNMR(CDC13，300MHz)S:2.85(s,1H),3.69-3.79(m,2H),4.79-5,07(m,3H),5.60(br,1H),5.79(br，1H),7,32-8.17(m,4H),8.35(s,IH)。本發(fā)明體外抗HIV活性實(shí)驗(yàn)化合物l、15、19、36、39、46、50、52在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)的抗HIV-1活性1.材料和方法1.1材料1.1.1藥物待試藥物化合物l、9、15、19、36、39、46、50、52，無批號(hào)，水不溶，DMSO可溶解，實(shí)驗(yàn)時(shí)用DMSO溶解配成適當(dāng)濃度后用培養(yǎng)基稀釋，立即加入細(xì)胞培養(yǎng)。陽性對(duì)照藥(1)齊多夫定(Zidovudine,AZT)為臨床應(yīng)用的已知核苷類HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，為白色粉末，購(gòu)自上海迪賽諾化學(xué)制藥有限公司，批號(hào)040201b,(2)奈韋拉平(nevirapine，NVP)購(gòu)自南京澤眾醫(yī)化信息研究中心(批號(hào)0301001)，為臨床應(yīng)用的已知非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。1.1.2病毒HIV-1IIIB實(shí)驗(yàn)病毒株，為美國(guó)MountSinaiMedicalCenter蔣建東博士贈(zèng)予，在H9細(xì)胞中擴(kuò)增，-196'C凍存。1.1.3細(xì)胞傳代人T淋巴細(xì)胞MT-4，為美國(guó)科羅拉多大學(xué)醫(yī)學(xué)研究中心張興權(quán)教授贈(zèng)送，本室傳代，-196。C保存。細(xì)胞培養(yǎng)基RPMIMedium1640培養(yǎng)基，加10%胎牛血清、lOOIU/ml青霉素、100嗎/ml鏈霉素和卡那霉素及含L-谷氨酰胺。37°C，5%(302培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每三天傳代一次。1.1.4主要試劑RPMIMedium1640培養(yǎng)基為美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品；胎牛血清(FetalBovineSerum)為天津市川頁生化制品有限公司產(chǎn)品；青霉素和鏈霉素為華北制藥廠產(chǎn)品；卡那霉素為上海旭東海普藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；四氮唑藍(lán)(Thiazolylblue,MTT),檸檬酸為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；TritonX-100為瑞典KEBOABSTOCKHOLM公司產(chǎn)品；N,N二甲基甲酰胺(N,N-DimethylFormamide)為北京化工廠產(chǎn)品；HIV-1P24抗原檢測(cè)試劑盒用荷蘭BioMerieux公司產(chǎn)品。1.1.5主要儀器EmaxTM酶標(biāo)儀為美國(guó)MolICularDevices公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)在3級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。1.2實(shí)驗(yàn)方法96孔培養(yǎng)板，設(shè)藥物及陽性對(duì)照藥抑制病毒實(shí)驗(yàn)組，每孔加入待測(cè)藥物的不同濃度DMSO溶液lOOul或陽性對(duì)照藥AZT和NVP或大鼠口服藥物不同劑量組后不同時(shí)間取血不同稀釋組，每孔lOOul，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照組陽性藥AZT和NVP對(duì)照組。MT-4細(xì)胞用100TCID50HIV-1IIIB感染1.5小時(shí)后，用培養(yǎng)基洗滌1次后，配成2"05細(xì)胞/1111'接種于藥物抑制病毒實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照藥物組及病毒對(duì)照組的96孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞對(duì)照組加等量培養(yǎng)液，培養(yǎng)4天后。用顯微鏡觀察細(xì)胞病變，同時(shí)用MTT染色測(cè)定毒性，上清液按說明書方法測(cè)定P24抗原。分別計(jì)算抑制率、半數(shù)有毒濃度(CC5Q)和半數(shù)有效濃度(IC50)及SI。2結(jié)果2.1化合物1，9,15，19,36，39，46，50，52在MT-4細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)HIV-1的抑制作用用MTT法測(cè)定化合物1，9，15，19，36,39，46，50，52對(duì)細(xì)胞的毒性和抗HIV-1活性，并比較藥物用HIV-1感染細(xì)胞和未感染細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞毒性對(duì)CC5o和SI的影響。結(jié)果見表l。表1化合物1，9，15,19，36，39，46，50，52及陽性藥物AZT和NVP在MT-4細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抗HIV-l活性<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>由表1和表2可知，新型2'-氟-4'-取代-核苷均具有良好的抗HIV活性，尤其化合物1、化合物15和化合物19具有很好的應(yīng)用開發(fā)前景。該類化合物的開發(fā)，將為艾滋病患者帶來福音。本發(fā)明體外抗HCV活性實(shí)驗(yàn)1.材料及方法1.1細(xì)胞培養(yǎng)HCV復(fù)制細(xì)胞(Avva,5)在Dulbecco，s改進(jìn)的包含10%牛胎兒血清和lmg/mL的G418的Eagle介質(zhì)中培養(yǎng)。293-Sip-L細(xì)胞在Dulbecco's改進(jìn)的含10%牛胎兒血清和250ug/mL的G418及150yg/mL的潮霉素B的Eagle介質(zhì)中培養(yǎng)。1.2HCV感染測(cè)定方法(RT-PCR方法)用60mm直徑的Petri培養(yǎng)皿中的細(xì)胞在包含100uL的HCV陽性的培養(yǎng)基中培育12小時(shí)。然后細(xì)胞在不包含HCV的新鮮介質(zhì)中培育并且每天更換一次。細(xì)胞在感染7天后檢測(cè)HCV-RNA時(shí)，細(xì)胞需要胰蛋白酶化并用離心法用Dulbecco's改進(jìn)的Eagle介質(zhì)清洗兩次。第二次洗滌的上層部分(作為對(duì)照)和洗過的細(xì)胞成對(duì)收集來進(jìn)行RNA提取和RT-PCR檢測(cè)。e-肌動(dòng)蛋白mRNA同時(shí)測(cè)定以做對(duì)照。1.3HCV-RNA的定量檢測(cè)采用全自動(dòng)PCR酶聯(lián)免疫法來定量測(cè)定HCV-RNA(2.0版，RocheDiagnostics:Branchburg,NJ)。2.結(jié)果化合物17在6，0.6和0.06ug/mL時(shí)有抑制效果(見下表)。HCV-RNA水平用全自動(dòng)PCR酶聯(lián)免疫法來測(cè)定。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>由此看來，化合物17對(duì)HCV有較強(qiáng)的抑制作用。權(quán)利要求1.具有通式(I)結(jié)構(gòu)的2’-氟-4’-取代-核苷類似物，或其與有機(jī)酸或無機(jī)酸反應(yīng)形成的鹽，或其5’-磷酸酯，特征在于，通式(I)具有如下結(jié)構(gòu)其中id="icf0002"file="A2008101774980002C2.tif"wi="43"he="21"top="100"left="91"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>R＝CH3，CN，N3，C≡CH；R′＝H，F(xiàn)；X＝F，OH，NH2；Y＝H，CH3，F(xiàn)，OH，NH2。2、如權(quán)利要求1所述的2'-氟-4'-取代核苷類似物，其特征在于，所述化合物是以下化合物之一<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>3、如權(quán)利要求1或2所述的2'-氟-4'-取代核苷類似物在制備藥物中的應(yīng)用，其特征在于，將其應(yīng)用于制備抗HBV病毒藥物或抗HCV病毒藥物或抗HIV病毒藥物。4、如權(quán)利要求3中所述的2'-氟-4'-取代-核苷類似物在制備藥物中的應(yīng)用，其特征在于，HBV病毒藥物為抗乙肝藥物，HCV病毒藥物為抗丙肝藥物，HIV病毒藥物為抗艾滋病藥物。全文摘要本發(fā)明公開了核苷類似物、其制備方法及其應(yīng)用，具體涉及含2’-氟-4’-取代核苷類似物或其鹽或其5’-磷酸酯、其制備方法及其應(yīng)用，該化合物有如右式(I)，其中見右式(II)，R＝CH₃，CN，N₃，C≡CH；R′＝H，F(xiàn)；X＝F，OH，NH₂；Y＝H，CH₃，F(xiàn)，OH，NH₂。將其應(yīng)用于治療病毒感染，尤其是HBV，HCV或HIV的感染，具有較好的活性。文檔編號(hào)A61P31/12GK101407534SQ200810177498公開日2009年4月15日申請(qǐng)日期2007年8月7日優(yōu)先權(quán)日2007年7月16日發(fā)明者包新洪,?？?biāo),威王,強(qiáng)王,祁秀香,郭曉河申請(qǐng)人:鄭州大學(xué)