專利名稱：：具有抗癌效果的蘑菇多糖體組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有抗癌功效的蘑菇多糖體組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：近年來(lái)有許多研究發(fā)現(xiàn)蘑菇菌絲體或子實(shí)體中含有相當(dāng)多的生理活性成分，如多糖體(P-Glucan)、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)、三萜類(Triterpenoids)等物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等作用。而其中多糖體是研究最深入且最具潛力的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)。已知多糖體如13-葡聚糖，是一種良好的免疫促進(jìn)劑，可有效剌激免疫細(xì)胞，不僅能增強(qiáng)生物體特異性免疫反應(yīng)，同時(shí)也提高了非特異性免疫反應(yīng)。多糖體能使生物體抵抗細(xì)菌、真菌、病毒及寄生蟲的感染，以及抑制腫瘤的生長(zhǎng)。近年來(lái)蘑菇多糖體(mushroom13-glucan)逐漸受到重視，主要原因在于蘑菇多糖體的分支度、分子量、水溶性以及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性都較酵母菌多糖體高出許多，具有較高的免疫促進(jìn)能力。具有抗腫瘤功效的多糖體，其生理活性可依多糖體的分子量大致區(qū)分為三類(A)分子量在3，0005，000左右，具有降低血糖的功能，(B)分子量在10，000100，000之間，具消炎的作用，(C)分子量在30,000以上，則具有抗腫瘤作用，且分子量越大效果越好。以往蘑菇多糖體大多萃取自子實(shí)體，但是子實(shí)體來(lái)源有限；近來(lái)研究已知約有50%蘑菇類可于液態(tài)培養(yǎng)中產(chǎn)生胞外多糖體，所以可取其培養(yǎng)液進(jìn)行多糖體純化；與子實(shí)體培養(yǎng)相比，液態(tài)培養(yǎng)較為迅速而簡(jiǎn)單。然而，蘑菇類的成分復(fù)雜，如多糖、蛋白質(zhì)、多肽類、三萜類、多種氨基酸、生物堿、酯類和有機(jī)酸等，所以萃取蘑菇多糖體需經(jīng)繁瑣的步驟，如熱萃取、堿萃取、酸萃取等方式，故易殘留有機(jī)溶劑、氨基酸與蛋白質(zhì)，這些殘留物可能對(duì)人體產(chǎn)生剌激性免疫反應(yīng)。已知蘑菇類抗腫瘤成分大部分是多糖體或是多糖體與蛋白質(zhì)的復(fù)合物，而其抗腫瘤效果與劑量、次數(shù)、時(shí)間及給予途徑有關(guān)，但是含有蛋白質(zhì)的多糖體會(huì)引起動(dòng)物體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生發(fā)燒、紅腫、腹水等不適的現(xiàn)象，因此須將蘑菇中的其他物質(zhì)除去，僅萃取并純化高分子多糖體，才能排除不利于人體的免疫反應(yīng)。為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了新穎的具抗癌效果的蘑菇多糖體組合物及其制備方法。
發(fā)明內(nèi)容鑒于上述公知方法的缺陷，本發(fā)明的主要目的是提供一種具有抗癌效果的蘑菇多糖體組合物。本發(fā)明的另一目的提供蘑菇多糖體的萃取方法，將液態(tài)發(fā)酵的蘑菇菌液，經(jīng)由乙醇萃取，再利用陶瓷膜與分離技術(shù)純化，萃取出高分子多糖體，并除去蛋白質(zhì)等物質(zhì)，以解決容易引起過(guò)敏反應(yīng)的情形。為達(dá)上述及其他目的，本發(fā)明提供具有抗癌效果的蘑菇多糖體組合物，包含3蘑菇多糖體及載體。該蘑菇多糖體可選自所有食用蘑菇類與醫(yī)藥用蘑菇類的多糖體。該蘑菇包括，舉例但非限制，裂褶菌(Schizophyllumcommue)、巴西蘑菇(Agaricsblaze)、冬蟲夏草(Cordycepssinensis)、靈芝(Ganodermalucidum)、云芝(Coriolusversicolor)、樟芝(Anthodiacamphorate)、桑黃(Phelli皿slinteus)、珊瑚燕如柳松燕(Agrocybeaegerita)、猴頭燕(Hericiumerinaceus)、杏鮑燕(Pleurotuseryngiig)、花辧葺(Sparrasiscrispa)、木葺(Auriculariaauricula)、金針燕(Flammulinavelutipes)或上述蘑燕的組合。本發(fā)明組合物的優(yōu)選實(shí)施例為含有萃取自多種蘑菇的多糖體。本發(fā)明組合物的更優(yōu)選實(shí)施例為，組合物包括20_35%萃取自裂褶菌與靈芝的多糖體；25-45%萃取自冬蟲夏草、樟芝、云芝與巴西蘑菇的多糖體；以及20-35%萃取自桑黃、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、木茸與金針菇的多糖體。根據(jù)本發(fā)明，該蘑菇多糖體組合物可以以注射或口服的方式，施用于有需要的對(duì)象。于實(shí)施例中，該組合物可單獨(dú)使用或與其他藥物結(jié)合使用。根據(jù)本發(fā)明，該蘑菇多糖體組合物的載體可為液態(tài)、固態(tài)或半固態(tài)，且為醫(yī)藥上可接受的載體。于優(yōu)選實(shí)施例中，該載體為水，且以二次蒸餾水為更優(yōu)選。根據(jù)本發(fā)明，具有抗癌效果的蘑菇多糖體組合物，可應(yīng)用于治療或預(yù)防癌癥。根據(jù)本發(fā)明，該蘑菇多糖體組合物具有提高免疫活性的效果，包括促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬活性及自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。根據(jù)本發(fā)明，該蘑菇多糖體組合物具有促進(jìn)細(xì)胞因子生成的效果，該細(xì)胞因子包括腫瘤壞死因子_a(TNF-a)及/或干擾素-y(INF-Y)。本發(fā)明還提供制備蘑菇多糖體的方法，該方法包括(a)將蘑菇菌絲體液態(tài)發(fā)酵，得到蘑菇菌液，(b)將步驟(a)所得的蘑菇菌液均質(zhì)化并靜置沉淀，以收取上清液，(c)將步驟(b)所得的上清液用乙醇沉淀并收集沉淀物，(d)用水溶解沉淀物而形成水溶液，及(e)用陶瓷膜與分離膜系統(tǒng)透析該水溶液，以獲得蘑菇多糖體。所獲得的蘑菇多糖體可應(yīng)用于本發(fā)明的組合物。根據(jù)本發(fā)明，上述方法所使用的蘑菇可選自所有食用蘑菇類與醫(yī)藥用蘑菇類，包括，舉例但非限制，裂褶菌、巴西蘑菇、冬蟲夏草、靈芝、云芝、樟芝、桑黃、珊瑚菇、香菇、田頭菇屬如柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、木茸、金針菇，或上述蘑菇的組合。根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)行該制備方法之前，先以液態(tài)培養(yǎng)的方式，讓蘑菇產(chǎn)生大量高分子多糖體，再經(jīng)由均質(zhì)機(jī)攪拌，破壞蘑菇菌絲體，讓菌絲體中所含有效成分釋放到培養(yǎng)液中，并靜置較長(zhǎng)時(shí)間，以使有效成分完全釋放。在優(yōu)選實(shí)施例中，將該培養(yǎng)菌液均質(zhì)化后靜置18-24小時(shí)。在優(yōu)選實(shí)施例中，將靜置的培養(yǎng)液先用篩網(wǎng)過(guò)濾，去除大片段菌絲體碎片，再用乙醇萃取過(guò)濾液，將蘑菇有效物質(zhì)(多糖體或是多糖體與蛋白質(zhì)的復(fù)合物)沉淀，其中最好是乙醇為與過(guò)濾液等量(l:1)，且最好使用濃度95%的乙醇進(jìn)行萃取。在優(yōu)選實(shí)施例中，用水溶解經(jīng)乙醇萃取的沉淀物得到多糖體水溶液，最好使用二次蒸餾水。接著，使用陶瓷膜與分離技術(shù)純化該多糖體水溶液，以萃取出高分子多糖體并去除小分子的雜質(zhì)與多肽類、蛋白質(zhì)等容易引起過(guò)敏反應(yīng)的物質(zhì)，使濾液只剩下純化的蘑菇、香燕(Lentinulaedodes)、田頭燕屬(Agrocybesp.)高分子多糖體萃取液。由于蘑菇多糖體可以耐高溫高壓，所以可將純化所得的溶液高壓滅菌處理，不僅可達(dá)滅菌效果，更可促使蛋白質(zhì)與一些有機(jī)物質(zhì)失去活性，藉此避免蘑菇多糖體與蛋白質(zhì)的復(fù)合物具有活性，因而去除了剌激動(dòng)物體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生過(guò)敏性的不適現(xiàn)象。在優(yōu)選實(shí)施例中，配合無(wú)菌設(shè)備如0.22微米(ym)過(guò)濾膜，將所得的蘑菇高分子多糖體萃取液分裝制成液態(tài)劑型。該劑型可應(yīng)用為本發(fā)明之的蘑菇多糖體組合物。根據(jù)本發(fā)明，用于此制備方法的蘑菇菌液可為一種蘑菇菌液、或?yàn)閮煞N以上蘑菇菌液的混合。各蘑菇菌液亦可利用此制備方法分別萃取出高分子多糖體后，再加以混合。圖1說(shuō)明本發(fā)明用于純化蘑菇多糖體的陶瓷膜與分離膜系統(tǒng)。圖2說(shuō)明口服喂食本發(fā)明蘑菇多糖體的小鼠，其粒細(xì)胞的吞噬活性。實(shí)驗(yàn)組為每日口服本發(fā)明蘑菇多糖體O.1毫升，對(duì)照組為每日口服磷酸緩沖液(PBS)O.1毫升。*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著差異，P<0.05(ANOVA)。圖3說(shuō)明腹腔注射本發(fā)明的蘑菇多糖體的小鼠，其粒細(xì)胞的吞噬活性。實(shí)驗(yàn)組為每日腹腔注射蘑菇多糖體針劑0.05毫升，對(duì)照組為每日腹腔注射磷酸緩沖液(PBS)0.05毫升。*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著差異，P<0.05(ANOVA)。圖4說(shuō)明口服喂食本發(fā)明蘑菇多糖體的小鼠，其粒細(xì)胞的吞噬指數(shù)，以平均螢光強(qiáng)度(FI)表示。實(shí)驗(yàn)組為每日口服本發(fā)明的蘑菇多糖體O.1毫升，對(duì)照組為每日口服磷酸緩沖液(PBS)0.1毫升。*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著差異，P<0.05(ANOVA)。圖5說(shuō)明腹腔注射本發(fā)明蘑菇多糖體的小鼠，其粒細(xì)胞細(xì)胞的吞噬指數(shù)，以平均螢光強(qiáng)度(FI)表示。實(shí)驗(yàn)組為每日旗腔注射蘑菇多糖體針劑0.05毫升，對(duì)照組為每日腹腔注射磷酸緩沖液(PBS)0.05毫升。*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著差異，P<0.05(ANOVA)。圖6說(shuō)明口服喂食本發(fā)明蘑菇多糖體的小鼠，其單核細(xì)胞的吞噬指數(shù)，以平均螢光強(qiáng)度(FI)表示。實(shí)驗(yàn)組為每日口服本發(fā)明的蘑菇多糖體O.1毫升，對(duì)照組為每日口服磷酸緩沖液(PBS)0.1毫升。*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著差異，P<0.05(ANOVA)。圖7說(shuō)明腹腔注射本發(fā)明蘑菇多糖體的小鼠，其單核細(xì)胞的吞噬指數(shù)，以平均螢光強(qiáng)度(FI)表示。實(shí)驗(yàn)組為每日腹腔注射蘑菇多糖體針劑0.05毫升，對(duì)照組為每日腹腔注射磷酸緩沖液(PBS)0.05毫升。*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著差異，P<0.05(ANOVA)。圖8說(shuō)明口服喂食本發(fā)明的蘑菇多糖體四周的小鼠，其各周的脾臟自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。實(shí)驗(yàn)組為每日口服本發(fā)明的蘑菇多糖體O.1毫升，對(duì)照組為每日口服磷酸緩沖液(PBS)0.1毫升。*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著差異，P<0.05(ANOVA)。圖9說(shuō)明腹腔注射本發(fā)明的蘑菇多糖體四周的小鼠，其各周的脾臟自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。實(shí)驗(yàn)組為每日腹腔注射蘑菇多糖體針劑0.05毫升，對(duì)照組為每日腹腔注射磷酸緩沖液(PBS)0.05毫升。*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著差異，P<0.05(ANOVA)。圖lO說(shuō)明口服喂食本發(fā)明蘑菇多糖體四周的小鼠，其各周的血液中TNF-a含量(濃度pg/毫升)。實(shí)驗(yàn)組為每日口服本發(fā)明的蘑菇多糖體O.1毫升，對(duì)照組為每日口服磷酸緩沖液(PBS)0.1毫升。*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著差異，P<0.05(ANOVA)。圖11說(shuō)明腹腔注射本發(fā)明蘑菇多糖體四周的小鼠，其各周的血液中TNF-a含量(濃度pg/毫升)。實(shí)驗(yàn)組為每日腹腔注射蘑菇多糖體針劑0.05毫升，對(duì)照組為每日腹腔注射磷酸緩沖液(PBS)0.05毫升。*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著差異，P<0.05(ANOVA)。圖12說(shuō)明口服喂食本發(fā)明的蘑菇多糖體四周的小鼠，其各周的血液中IFN-Y含量(濃度pg/毫升)。實(shí)驗(yàn)組為每日口服本發(fā)明的蘑菇多糖體O.1毫升，對(duì)照組為每日口服磷酸緩沖液(PBS)0.1毫升。*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著差異，P<0.05(ANOVA)。圖13說(shuō)明腹腔注射本發(fā)明的蘑菇多糖體四周的小鼠，其各周的血液中IFN-Y含量(濃度pg/毫升)。實(shí)驗(yàn)組為每日腹腔注射蘑菇多糖體針劑0.05毫升，對(duì)照組為每日腹腔注射磷酸緩沖液(PBS)0.05毫升。*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著差異，P<0.05(ANOVA)。具體實(shí)施例方式以下通過(guò)特定的具體實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書所揭示的內(nèi)容了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。—、蘑菇菌種篩選與培養(yǎng)本發(fā)明可使用的蘑菇菌株如裂褶菌、巴西蘑菇、冬蟲夏草、靈芝、云芝、樟芝、桑黃、珊瑚菇、香菇、田頭菇屬如柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、木茸、金針菇等，但不限于上述菌株。將菌種接種于預(yù)培養(yǎng)基(預(yù)培養(yǎng)基包含O.3%(w/w)酵母菌萃取物、0.3%麥芽抽出物、0.5%蛋白胨(p印tone)、1.0%葡萄糖、1.5%瓊脂)上，于28。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-7天，待菌絲長(zhǎng)滿B1固體培養(yǎng)基。將在預(yù)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌絲體切一小塊植入20毫升預(yù)培養(yǎng)液中，在28。C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周，作為液態(tài)發(fā)酵的菌種。將培養(yǎng)完成的菌種接種至裝有800毫升培養(yǎng)基(含4%葡萄糖與0.5%酵母菌萃取物)的l公升液態(tài)發(fā)酵槽內(nèi)，于室溫條件下培養(yǎng)。約2030天后，蘑菇代謝物生成，發(fā)酵所得的培養(yǎng)液體中包含蘑菇多糖體、蛋白質(zhì)、多肽類、三萜類、多種氨基酸、生物堿、酯類和有機(jī)酸等物質(zhì)。二、蘑菇多糖體的分離與純化收集上述發(fā)酵液并經(jīng)由均質(zhì)機(jī)攪拌，把蘑菇菌絲體、代謝物充分混勻，并靜置1824小時(shí)。待發(fā)酵液沉淀后，再用100目、200目與400目的篩網(wǎng)過(guò)濾，將大片段的菌絲體除去，取得過(guò)濾液。在過(guò)濾液中添加等量且濃度為95%的乙醇，并靜置1824小時(shí)，等待結(jié)晶物質(zhì)沉淀。用400目的篩網(wǎng)收集沉淀物，再以無(wú)菌水將沉淀物溶解回原體積(上述過(guò)濾液的體積)，而得水溶液。而后，使用陶瓷膜與分離膜系統(tǒng)1(如圖1所示)將上述水溶液透析，以萃取多種分子量的蘑菇高分子多糖體。分離系統(tǒng)使用內(nèi)循環(huán)的管路原理，使含有蘑菇多糖體的無(wú)菌水溶液在陶瓷過(guò)濾膜管柱ll中不斷循環(huán)，小分子(如蛋白質(zhì)、多肽類、三萜類、多種氨基酸、生物堿、酯類和有機(jī)酸等物質(zhì))因而滲透出管路，以達(dá)到除去小分子的目的，用收集瓶12收取蘑菇多糖體溶液。最后再添加無(wú)菌水，使蘑菇多糖體溶液具有原過(guò)濾液的體積。由于蘑菇多糖體可以耐高溫高壓，所以可以將過(guò)濾液用高壓滅菌殺菌，并促使蛋白質(zhì)與一些有機(jī)物質(zhì)失去活性，藉以去除剌激動(dòng)物體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生過(guò)敏性的不適現(xiàn)象。6再通過(guò)0.22微米(ym)過(guò)濾膜，將滅菌后殘留在蘑菇高分子多糖體溶液中的聚集、無(wú)活性的蛋白質(zhì)與多肽等物質(zhì)過(guò)濾除去。接著在無(wú)菌室中使用滅菌過(guò)的分裝器，將蘑菇高分子多糖體溶液分裝并制備成液態(tài)劑型，即為本發(fā)明的蘑菇多糖體組合物。本發(fā)明的蘑菇多糖體組合物可包含萃取自一或多種蘑菇的多糖體。當(dāng)本發(fā)明的組合物包括兩種以上的蘑菇多糖體時(shí)，該蘑菇培養(yǎng)液可分別制備成多糖體組合物后再混合；或可將蘑菇培養(yǎng)液先行混合再進(jìn)行多糖體組合物的制備。根據(jù)本實(shí)施例所得的組合物包括約20_35%萃取自裂褶菌與靈芝的多糖體；約25-45%萃取自冬蟲夏草、樟芝、云芝與巴西蘑菇的多糖體；以及約20-35%萃取自桑黃、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、木茸與金針菇的多糖體。根據(jù)本實(shí)施例所得的蘑菇多糖體組合物，萃取自不同蘑菇的多糖體所占多糖體總量的比例如下裂褶菌為16%、靈芝為16%、冬蟲夏草為14%、樟芝為13%、云芝為8%、巴西蘑菇為6%、桑黃為3%、珊瑚菇為3%、香菇為3%、柳松菇為3%、猴頭菇為3%、杏鮑菇為3%、花瓣茸為3%、木茸為3%和金針菇為3%。將上述組合物分為口服與針劑兩組，進(jìn)一步應(yīng)用于下列實(shí)施例中。其中針劑所含的蘑燕多糖體含量，利用苯酚-硫酸法(Phenol-sulfuricacidmethod)測(cè)定，為0.036±0.002%。三、蘑菇多糖體對(duì)吞噬細(xì)胞活性影響的分析以下實(shí)施例使用五周齡的ICR品系雄性小白鼠(動(dòng)物來(lái)源臺(tái)大醫(yī)院動(dòng)物繁植及研究中心)，在溫度21±2"、濕度65±5%，光照與黑暗各12小時(shí)(D:L=12:12)的條件下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)一個(gè)星期適應(yīng)后開(kāi)始進(jìn)行蘑菇多糖體實(shí)驗(yàn)，口服組每天以胃管灌食O.1毫升的前述蘑菇多糖體組合物，腹腔注射組每天以腹腔注射O.05毫升的蘑菇多糖體針劑，對(duì)照組則以磷酸緩沖液代替蘑菇多糖體。食物及飲水正常供應(yīng)，并依照動(dòng)物房管理辦法，定期檢查小白鼠的狀況，盡量減低小白鼠受到的環(huán)境壓迫及人為傷害。以下實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean士SD)表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SAS(StatisticalAnalysisSystem,SASInstituteInc.，USA)軟件進(jìn)行單因素方差分析(OnewayA麗A)，并根據(jù)新復(fù)極差法(D皿can，s固multiplerangetest)進(jìn)行各組間的差異性分析，若組間差異達(dá)P〈0.05，則視為差異具有顯著性。吞噬細(xì)胞活性分析用于吞噬細(xì)胞活性分析的血液樣本為較少量(100150微升(PL))，且需與抗凝劑(肝素h印arin)充分混和，因考慮到可重復(fù)采樣與避免犧牲，故采用眼窩采血法，每周兩次，方法如下麻醉后，壓迫小鼠頸部?jī)蓚?cè)，阻礙靜脈血回流，使眼球充分外突，并使眼眶后靜脈叢充血。自該眼睛的前眼角或后眼角處，用管徑恰當(dāng)且內(nèi)壁有抗凝劑的毛細(xì)管，順眼球周緣向眼窩中心插入，旋轉(zhuǎn)毛細(xì)管以切開(kāi)靜脈叢，藉虹吸管原理將血液吸入毛細(xì)管中，再將血樣移至加有抗凝劑的微量離心管中，充分混和后置于冰上備用。血液中吞噬細(xì)胞活性分析使用PHAGO-TEST試劑盒(ORPEGEN，Phama，F(xiàn).R.G.)，通過(guò)單核細(xì)胞與粒細(xì)胞對(duì)帶有螢光標(biāo)記的大腸桿菌(FITC-標(biāo)記的E.coli)的吞噬，再以流式細(xì)胞儀分析其吞噬能力，實(shí)驗(yàn)步驟如下1.將IOO微升含肝素且震蕩混勻(vortexmixer)的全血放入標(biāo)示適當(dāng)?shù)?毫升試管中，注意管壁上不可留有血液，每一樣品各做兩管(一管為試驗(yàn)管，一管為陰性對(duì)照管)，而后冰浴10分鐘。2.于各試管中，加入20微升震蕩混勻的目標(biāo)細(xì)胞(FITC-labeledE.coli)。將試驗(yàn)管置于37t:預(yù)熱的水浴槽中，進(jìn)行水浴作用10分鐘；陰性對(duì)照組則留置冰浴10分鐘。時(shí)間及溫度需準(zhǔn)確控制，且水浴槽需預(yù)熱且加蓋。3.將試管置于冰上以終止吞噬作用，并于各管加入IOO微升冰冷的驟冷液(quenchingsolution)(錐蟲藍(lán)，trypanblue)，震蕩混勻后進(jìn)行冰浴2分鐘，目的是排除未被細(xì)胞吞入的目標(biāo)細(xì)胞的螢光干擾。其原理為錐蟲藍(lán)的吸收光譜與FITC的發(fā)散光譜重疊，而吞噬細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，故可避免被錐蟲藍(lán)染色，同時(shí)保護(hù)被吞入的大腸桿菌不被染色，未被吞噬的大腸桿菌則會(huì)被錐蟲藍(lán)染色而無(wú)法發(fā)光(Sahlinetal.，1983)。4.用3毫升的沖洗液清洗細(xì)胞，在4°C以250Xg離心5分鐘，小心去除上清液，避免碰到細(xì)胞團(tuán)塊，且重復(fù)清洗步驟一次。5.于各管中，加入2毫升的裂解液(lysingsolution)溶解及固定血液，混和均勻，于室溫下作用20分鐘，在4°C以250Xg離心5分鐘，吸除上清液。6.于各管中，加入200微升DNA染色液(stainingsolution)，混和冰浴且避光10分鐘，以染出白細(xì)胞。7.利用流式細(xì)胞儀，分析粒細(xì)胞與單核細(xì)胞的吞噬能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2至圖7所示。吞噬活性用表現(xiàn)出吞噬作用的細(xì)胞的百分比(％)表示，亦即具有吞噬能力的單核細(xì)胞或粒細(xì)胞的比例。經(jīng)口服喂食蘑菇多糖體的結(jié)果如圖2所示，實(shí)驗(yàn)組在第5天的測(cè)量值達(dá)到最高(32.93%)，是對(duì)照組(13.74%)的2.4倍，并且差異具有顯著性(P<0.05)，與前一個(gè)時(shí)間點(diǎn)(第2天)相比提高了53.99%;實(shí)驗(yàn)組的吞噬活性于第9天下降(23.68%)，但與對(duì)照組相比仍有顯著差異(P〈0.05)，實(shí)驗(yàn)組于第12天的吞噬活性(17.2%)雖仍比對(duì)照組高，但未達(dá)顯著差異，接著在第16、19、23天實(shí)驗(yàn)組的吞噬活性呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)，并與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.05)。整體而言，口服蘑菇多糖體可使細(xì)胞吞噬活性快速而顯著提高，且口服一周即可獲得明顯差異。經(jīng)腹腔注射蘑菇多糖體的結(jié)果如圖3所示，實(shí)驗(yàn)組在第9天之后的測(cè)量值與對(duì)照組相比都具有顯著性差異(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組的吞噬活性高峰出現(xiàn)在第12天(28.02%)，是對(duì)照組(10.16%)的2.76倍。比較口服與腹腔注射的結(jié)果，口服蘑菇多糖體會(huì)較注射蘑菇多糖體早產(chǎn)生顯著差異(P<0.05，口服組在第5天達(dá)到，而腹腔注射組在第9天達(dá)到)，比較吞噬活性最高值也是出現(xiàn)在口服組(32.93%)，高于腹腔注射組(28.02%)。吞噬細(xì)胞的平均螢光強(qiáng)度(FI)代表每個(gè)細(xì)胞吞噬量的多少?？诜⒐蕉嗵求w的結(jié)果如圖4所示，實(shí)驗(yàn)組粒細(xì)胞的平均螢光強(qiáng)度呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，第12天(7.76)開(kāi)始與對(duì)照組相比具有顯著差異(P<0.05)，第16天以后漸漸穩(wěn)定。最高值出現(xiàn)在第16天(9.92);與處理前的第0天(4.06)相比，提高了2.44倍。單核細(xì)胞的螢光強(qiáng)度如第6圖所示，口服蘑菇多糖體的實(shí)驗(yàn)組在第12天出現(xiàn)高峰(5.71)，是同時(shí)間對(duì)照組的2.30倍；12天以后至實(shí)驗(yàn)結(jié)束的測(cè)量值，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均在95%的可信區(qū)間具有顯著差異。以上結(jié)果證實(shí)，口服蘑菇多糖體確能提高粒細(xì)胞及單核細(xì)胞吞噬外來(lái)物的量。如圖5所示，腹腔注射蘑菇多糖體的小鼠的粒細(xì)胞的平均螢光強(qiáng)度顯著提高，注射第2天所測(cè)量的平均值5.95已高于對(duì)照組平均值3.8，但尚未達(dá)顯著差異；第5天以后至8實(shí)驗(yàn)結(jié)束的測(cè)量值，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均具有顯著差異(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組于第0天(2.65)到第2天(5.95)活性提高最顯著，增加了2.25倍，第9天以后實(shí)驗(yàn)組的FI值皆為對(duì)照組的兩倍以上。圖7表示腹腔注射蘑菇多糖體的小鼠的單核細(xì)胞平均螢光強(qiáng)度，與粒細(xì)胞的結(jié)果相似，實(shí)驗(yàn)組于第5天以后的測(cè)量值均與對(duì)照組具有顯著差異(P<0.05)，也是在第0天(1.73)到第2天(5.13)活性提高最顯著，增加2.97倍。上述結(jié)果可證實(shí)，腹腔注射蘑菇多糖體能有效促進(jìn)粒細(xì)胞與單核細(xì)胞吞噬外來(lái)物的能力，且于注射后一星期內(nèi)獲得明顯效果。顯然，本發(fā)明的蘑菇多糖體可顯著提高吞噬細(xì)胞的吞噬活性與吞噬數(shù)量。四、蘑菇多糖體對(duì)自然殺傷細(xì)胞活性的影響自然殺傷細(xì)胞在細(xì)胞免疫中扮演重要的角色，其活性的提高可直接幫助清除體內(nèi)病變及癌變的細(xì)胞。利用對(duì)自然殺傷細(xì)胞敏感的YAC-1細(xì)胞進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)，即YAC-1細(xì)胞的死亡率可表示自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。臟器收集將前述實(shí)驗(yàn)小鼠腹面，以乙醇消毒后，剪開(kāi)腹腔皮膚，取下脾臟、肝臟以及腎臟，肝臟與腎臟用PBS將臟器洗凈后吸干，稱重并計(jì)算器官相對(duì)重量(relativeorganweight)。器官相對(duì)重量(％)={器官重量(g)/體重(g)}X100%。脾臟淋巴細(xì)胞收集將脾臟置于含適量RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone)的20毫米(mm)培養(yǎng)皿中，用鑷子將脾臟撕碎，利用Ficoll-Hypaque以1000rpm離心30分鐘，吸取培養(yǎng)液和Ficoll-Hypaque間淡黃色的液體，此層即為小鼠脾臟淋巴細(xì)胞。YAC-1細(xì)胞的培養(yǎng)YAC-1細(xì)胞培養(yǎng)于具有2毫摩爾濃度(mM)谷氨酰胺(L-glutamine)，并調(diào)整至含有1.5g/L碳酸鈉、10mMHEPES、1.0mM丙酮酸鈉及含10%小牛血清的90XRPMI1640培養(yǎng)基中，每2到3天傳代培養(yǎng)一次。傳代培養(yǎng)時(shí)直接加入新鮮培養(yǎng)基稀釋，再分裝至新的培養(yǎng)瓶。細(xì)胞毒活性測(cè)試根據(jù)Kiessling等的方法加以修改(Kiesslingetal.，1975)，使用LIVE/DEADCell-MediatedCytotoxicity試劑盒(MolecularProbes)，實(shí)驗(yàn)步驟如下用PBS將YAC-1細(xì)胞濃度調(diào)成IX106細(xì)胞/毫升(cell/毫升)。按照每毫升YAC-1細(xì)胞懸浮液加入10iiLDI0C18的量，將DI0C18加入15ml離心管底部，再加入YAC-1細(xì)胞懸浮液并混和均勻。于37t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20分鐘。用PBS沖洗兩次后，用培養(yǎng)基溶散細(xì)胞并將細(xì)胞濃度調(diào)成1X106cel1/毫升，置于37t:培養(yǎng)箱中，保持細(xì)胞存活率95%以上。用RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone)將小鼠脾臟淋巴細(xì)胞調(diào)成細(xì)胞濃度為2X106cel1/毫升的細(xì)胞懸浮液。將20微升染色后的YAC-1細(xì)胞加入到200微升脾臟淋巴細(xì)胞懸浮液中，并加入220微升的PI溶液(40微克/毫升)染色，1000Xg離心30秒后，再于37t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)二小時(shí)。用流式細(xì)胞儀計(jì)算脾臟淋巴細(xì)胞活性，計(jì)算綠色螢光的YAC-1細(xì)胞數(shù)，再計(jì)算綠色細(xì)胞中有多少細(xì)胞因?yàn)楸涣馨图?xì)胞破壞，使其細(xì)胞膜不完整，而為綠中帶紅的細(xì)胞；脾臟淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒活性的計(jì)算方式為具有綠色與紅色螢光的細(xì)胞數(shù)/綠色螢光細(xì)胞數(shù)。小鼠的自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒活性如圖8與圖9所示?？诜⒐蕉嗵求w的結(jié)果如圖8所示，口服PBS的對(duì)照組變化不大，口服蘑菇多糖體的實(shí)驗(yàn)組于第2周(16.09%)與第l周(9.10%)相比顯著提高了1.76倍，且第2周(16.09%)、第3周(17.96%)和第4周(17.17%)的細(xì)胞毒活性與對(duì)照組相比具有顯著差異(P<0.05)。腹腔注射蘑菇多糖體的結(jié)果如圖9所示，實(shí)驗(yàn)組在第0周(7.7%)至第1周(17.75%)的變化最大，活性提高130.48%，第2周(22.99%)、第3周(30.3%)與第4周(29.91%)與注射PBS的對(duì)照組相比皆具有顯著差異(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明的蘑菇多糖體無(wú)論是通過(guò)口服還是腹腔注射的給藥途徑，皆可促進(jìn)生物體內(nèi)自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。五、蘑菇多糖體對(duì)細(xì)胞因子含量影響的分析用于細(xì)胞因子(cytokine)含量分析的血液量約需1毫升，以心臟采血法收集血樣，方法如下小鼠麻醉后，從胸腔后端1/3處，自胸骨左側(cè)緣垂直剌入肋骨間而達(dá)心臟。在見(jiàn)針筒有回血后，以一手固定針頭的方向與深度，另一手則輕拉針筒內(nèi)筒。將所得血樣靜置，待血清析出后，12000Xg離心20分鐘，將血清收集于離心管中，用于細(xì)胞因子含量的測(cè)定。細(xì)胞因子含量分析利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，使用ELISA試劑盒(Biosource)，測(cè)量血清中細(xì)胞因子(IFN-y、TNF-a)的含量，詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟如下所述。于孔板中加入培養(yǎng)緩沖液(IncubationBuffer)、(50微升/孔)，空白組則不加。分別加入標(biāo)準(zhǔn)品及樣品(50微升/孔)，并使試劑均勻混和。加入生物素鍵結(jié)體(BiotinConjugate)、(50微升/孔)，空白組則不加；均勻混和后，于37。C培養(yǎng)1.5小時(shí)。清洗4次。加入鏈霉抗生物素-HR工作液(Str印tavidin-HRPWorkingSolution)、(100微升/孔)，空白組則不加；于室溫下培養(yǎng)30分鐘。清洗4次。加入穩(wěn)定色原體(StabilizedChromogen)、(100微升/孔)，于黑暗中室溫培養(yǎng)20分鐘。加入終止液(StopSolution)、(100微升/孔)，均勻混和后，利用分光光度計(jì)(Ultrospec1000，PHARMACIABIOTECH)(A=450nm)測(cè)量吸光值，所得數(shù)值均需扣除僅含穩(wěn)定色原體和終止液的空白組的數(shù)值。加入終止液后，需在2小時(shí)內(nèi)測(cè)量吸光值。利用TNF-a及IFN-y標(biāo)準(zhǔn)品與其吸光值繪制吸光值與細(xì)胞因子濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可用以計(jì)算出待測(cè)樣品中細(xì)胞因子的濃度。TNF-a含量的測(cè)量結(jié)果如圖10與圖11所示。口服蘑菇多糖體的結(jié)果如圖10所示，實(shí)驗(yàn)組在每個(gè)采樣點(diǎn)的平均值皆高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組于第l周的測(cè)量值達(dá)到最高(28.8pg/毫升)，第2周(27.4pg/毫升)及第3周(26.2pg/毫升)TNF-a濃度下降，到第4周濃度回升(27pg/毫升)，第0周(24.4pg/毫升)到第l周增加率最大，為18.03%。第1、2、4周，口服蘑菇多糖體的實(shí)驗(yàn)組與口服PBS的對(duì)照組具有顯著差異(P<0.05)。腹腔注射蘑菇多糖體的結(jié)果如圖9所示，實(shí)驗(yàn)組于第2周出現(xiàn)高峰(27.3pg/毫升)，最大增加率出現(xiàn)在第1周到第2周(8%)之間。第2周及第4周的測(cè)量值，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比具有顯著差異(P<0.05)。IFN-y含量的測(cè)量結(jié)果如圖12與圖13所示?？诜⒐蕉嗵求w的結(jié)果如圖12所示，實(shí)驗(yàn)組在第l周與第4周出現(xiàn)相對(duì)高點(diǎn)，其中，第4周的IFN-y測(cè)量值最高(28.lpg/毫升)。且實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果在第l周(27.0pg/毫升)與第4周，比較對(duì)照組的結(jié)果具有顯著差異(P<0.05)。腹腔注射蘑菇多糖體的結(jié)果如圖13所示，實(shí)驗(yàn)組的IFN-Y濃度逐漸增加，在第3周達(dá)到最高濃度(28.3pg/毫升)，而第4周又降低，最大增加率出現(xiàn)在第0周到第1周之間，為7.88%;關(guān)于第2、3、4周的測(cè)量值，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比具有顯著差異(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明的蘑菇多糖體無(wú)論是通過(guò)口服或是腹腔注射的給藥途徑，皆可促進(jìn)生物體內(nèi)細(xì)胞因子含量增加。六、蘑菇多糖體的抗癌效果1蘑菇多糖體的腫瘤抑制試驗(yàn)以皮下注射的方式將1X106/50微升的路易氏肺癌細(xì)胞(Lewislungcarcinomacells)植入C57BL/6JNarl小鼠的背上。小鼠植入腫瘤24小時(shí)后開(kāi)始給予蘑菇多糖體，口服組每天以胃管灌食O.l毫升，腹腔注射組每天以腹腔注射0.05毫升的多糖針劑。處死實(shí)驗(yàn)小鼠時(shí)取出腫瘤秤重，并計(jì)算腫瘤抑制率。處死前小鼠的活力以口服多糖體組最好，腹腔注射組次之，對(duì)照組最差。觀察腫瘤的外觀，對(duì)照組的腫瘤最大，腹腔注射組次之，兩者的腫瘤都在小鼠的背部形成明顯的橢圓狀突起；口服多糖體組的腫瘤則明顯地較對(duì)照組及腹腔注射組小，只在植入處形成一圓形硬塊。解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的腫瘤周圍與內(nèi)部有明顯的血液與膿聚集，腫瘤向下浸潤(rùn)到肌肉組織，需以剪刀才能分開(kāi)；口服多糖體組的腫瘤則是一實(shí)心硬塊，僅存在于皮膚與肌肉之間，沒(méi)有浸潤(rùn)到肌肉，也沒(méi)有觀察到顯著的血液或膿聚集。各組取出腫瘤秤重的結(jié)果如表l，對(duì)照組的腫瘤最重(0.46g)，腹腔注射多糖體組次之(0.36g)，口服多糖體組最輕(0.27g)，與對(duì)照組相比，口服多糖體組達(dá)到顯著差異(P<0.05)。將各組的腫瘤重量與對(duì)照組相比計(jì)算腫瘤抑制率，口服多糖體組達(dá)40.58%，腹腔注射多糖體組為21.01%。表1、多糖體組合物對(duì)腫瘤的抑制效果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2.蘑菇多糖體的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制試驗(yàn)將路易氏肺癌細(xì)胞植入C57BL/6品系的小鼠后腿，七天后腿部癌細(xì)胞會(huì)增生而腫大(原發(fā)性癌)；進(jìn)行癌細(xì)胞接種后三天起，每天喂食蘑菇多糖體組合物兩次，各組在癌細(xì)胞注射后七天起，以鈷60處理原發(fā)癌5天進(jìn)行治療，經(jīng)治療后2星期觀察各組小鼠的后腿腫瘤，并處死小鼠以觀察其肺臟發(fā)生腫瘤顆粒的情形。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，對(duì)照組(未服用多糖體組合物、未進(jìn)行放射治療)的小鼠100%發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，肺部腫瘤顆粒數(shù)平均為12.3;未服用多糖體組合物、但進(jìn)行放射治療的小鼠，則100%皆會(huì)發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，肺部腫瘤數(shù)為13.7;服用多糖體組合物、但未進(jìn)行放射治療的小鼠，腫瘤轉(zhuǎn)移比率降低且肺部腫瘤數(shù)亦減少；服用多糖體組合物、且進(jìn)行放射治療的小鼠，腫瘤轉(zhuǎn)移比率顯著降低至12.5%，而肺部腫瘤數(shù)降低為0.85。表2、多糖體組合物對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制效果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>上述結(jié)果證實(shí)了本發(fā)明的蘑菇多糖體組合物無(wú)論是口服或注射方式，皆具有抗癌的功效，包括抑制腫瘤生長(zhǎng)與降低腫瘤轉(zhuǎn)移。而且，同時(shí)使用本發(fā)明的蘑菇多糖體組合物強(qiáng)化體內(nèi)免疫細(xì)胞的抗癌活性，并配合其他癌癥控制方法(如放射治療或藥物治療)，可使抗癌功效更為提高。上述實(shí)施例僅示例性說(shuō)明本發(fā)明的組合物及其制備方法，而非用于限制本發(fā)明。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員均可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾與改變。因此，本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍如前述權(quán)利要求的范圍所述。權(quán)利要求一種具有抗癌效果的蘑菇多糖體組合物，該組合物包括載體；及蘑菇多糖體，其中，該蘑菇選自裂褶菌、巴西蘑菇、冬蟲夏草、靈芝、云芝、樟芝、桑黃、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、木茸、金針菇或上述蘑菇的組合。2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，該蘑菇多糖體包括20至35%萃取自裂褶菌與靈芝的多糖體；25至45%萃取自冬蟲夏草、樟芝、云芝與巴西蘑菇的多糖體；以及20至35%萃取自桑黃、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、木茸與金針菇的多糖體。3.如權(quán)利要求1所述的組合物，可以注射或口服的方式，施用于有需要的對(duì)象。4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中載體為液態(tài)、固態(tài)或半固態(tài)。5.如權(quán)利要求l所述的組合物，其中載體為水。6.—種如權(quán)利要求1的蘑菇多糖體的制備方法，包括(a)將蘑菇菌絲體液態(tài)發(fā)酵，而得蘑菇菌液；(b)將步驟(a)所得的蘑菇菌液均質(zhì)化并靜置沉淀，以取得上清液；(c)用乙醇沉淀上清液并收集沉淀物；(d)用水溶解沉淀物，而得水溶液；及(e)用陶瓷膜與分離膜系統(tǒng)透析水溶液，以獲得蘑菇多糖體。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中蘑菇菌液均質(zhì)化后靜置18至24小時(shí)。8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中乙醇為與上清液等量且濃度為95%的乙醇。全文摘要本發(fā)明涉及一種具有抗癌效果的蘑菇多糖體組合物及其制備方法，該組合物包括載體；及蘑菇多糖體，其中，蘑菇選自裂褶菌、巴西蘑菇、冬蟲夏草、靈芝、云芝、樟芝、桑黃、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴頭菇、杏鮑菇、花瓣茸、木茸、金針菇或上述蘑菇的組合。文檔編號(hào)A61P35/00GK101766644SQ20081018774公開(kāi)日2010年7月7日申請(qǐng)日期2008年12月31日優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日發(fā)明者陳秀男申請(qǐng)人:陳秀男