專利名稱：殼聚糖納微球產(chǎn)品及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種殼聚糖納微球產(chǎn)品及其制備方法，特別是一種粒徑基本均
一、io微米以下的殼聚糖納微球產(chǎn)品及其制備方法。
背景技術(shù)：
殼聚糖是由葡糖胺和N-乙?；咸前饭簿畚锝M成的多糖，是甲殼素脫乙?；?的產(chǎn)物，殼聚糖由于分子鏈上具有游離氨基而可以溶于稀酸溶液，因此比甲殼素 具有更為廣泛的用途。殼聚糖作為一種陽離子的生物高聚物，具有生物粘附性、 生物相容性和生物降解性，殼聚糖的這種獨(dú)特性使其生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛研究 和應(yīng)用，如藥物載體、細(xì)胞培養(yǎng)載體、固定化酶載體、蛋白質(zhì)分離介質(zhì)等。
眾多研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖是制備口服納微球和微囊藥物制劑的理想材料，這主
要因為以下兩點(diǎn)
(a) 殼聚糖由于無毒，可生物降解，而且能提高人體免疫力，已作為保健品 上市，因此，該材料可用于口服類藥物的載體，具備口服安全性，有巨大的潛在 市場；
(b) 殼聚糖是帶正電荷的天然多糖，對帶負(fù)電荷的粘膜和細(xì)胞顯示很強(qiáng)的黏 附性，能夠長時間且高濃度地聚集在上皮細(xì)胞， 一方面向其傳遞藥物，另一方面， 5-6微米以下的微球可打開腸壁上皮細(xì)胞間的緊密連接，使大分子物質(zhì)能夠透過 上皮細(xì)胞順利轉(zhuǎn)運(yùn)至體內(nèi)。Peyer's小結(jié)是人和動物小腸粘膜中由多個淋巴小結(jié) 聚集形成的淋巴濾泡，約占整個腸道粘膜面積25%，特點(diǎn)是以非受體轉(zhuǎn)運(yùn)方式使 淋巴因子和一些顆粒進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，是顆粒性物質(zhì)的主要吸收途徑。國內(nèi)外研究 表明殼聚糖作為口服和粘膜給藥載體，在Peyer's小腸處的吸附和被轉(zhuǎn)運(yùn)的效果 遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于聚乳酸等其它生物可降解性高分子。
作為藥物載體，殼聚糖多以殼聚糖微球或微囊的形式使用。然而目前殼聚糖 微球或微囊的制備方法非常有限，主要采用乳化交聯(lián)法、噴霧干燥法和復(fù)凝聚法， 而這些制備方法大多采用機(jī)械攪拌法，采用這種方法在制備乳液過程中，由于粒 徑不均一，小的乳滴會被大的乳滴吸收，同時大的乳滴又會因剪切力的作用而破
3壞，這會導(dǎo)致所制得的殼聚糖微球或微囊粒徑很不均一。而且，由于乳滴的粒徑 不均一，在交聯(lián)過程中小液滴容易被大液滴吸附，大液滴又容易被剪切成小液滴， 從而會形成很多交聯(lián)凝聚物。同時，在液滴的合并和破裂過程中，內(nèi)包藥物容易 逃逸到液滴外面，導(dǎo)致藥物的包埋率降低。即使在微球形成以后，由于小微球容 易被大微球吸附，在產(chǎn)品的洗滌和干燥過程中也容易形成凝聚物。微球和微囊的 不均一還會為殼聚糖及其衍生物微球或微囊的實際應(yīng)用帶來許多困難。例如，作 為酶的固定化和蛋白質(zhì)分離介質(zhì)，由于粒徑不均一，小的微球會在柱子中聚集到 大微球之間的空隙中，使得分離壓力增大，嚴(yán)重時會導(dǎo)致分離無法進(jìn)行；作為細(xì) 胞培養(yǎng)載體，粒徑不均一會導(dǎo)致養(yǎng)分和細(xì)胞密度的不均勻，從而導(dǎo)致細(xì)胞生長的 不均勻；作為藥物緩釋載體，由于乳液不穩(wěn)定會導(dǎo)致藥物的包埋率大大降低，另 外由于微球或微囊粒徑不均一，在系統(tǒng)給藥中使藥物的耙向性差，導(dǎo)致藥物在體 內(nèi)的生物利用度大大降低。
為了克服傳統(tǒng)制備方法所制備的殼聚糖微球粒徑不均一和不可控的問題，本 實驗室發(fā)展了直接膜乳化法。由于微孔膜乳化法獲得均一乳滴的基本條件是分散 相與膜表面的界面張力足夠大，因此，雖然采用小孔徑的膜能夠制備小粒徑的粒
徑均一、可控的殼聚糖及其衍生物納微球，但采用這種方法制備粒徑較小的納微 球(如5微米以下)乳化速度非常慢，需要的乳化壓力大，不適宜大規(guī)模制備小 粒徑的殼聚糖納微球，而且采用這種方法很難制備400納米以下的殼聚糖納米 球。由于直接膜乳化法方法制備的殼聚糖微球的粒徑可控范圍還不寬，有必要研 究新型制備方法，制備出粒徑均一、可控的小粒徑的殼聚糖納微球，以進(jìn)一步拓 展殼聚糖納微球的應(yīng)用范圍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個方面提供一種殼聚糖納微球產(chǎn)品，其中該產(chǎn)品中的殼聚糖納微 球具有約幾十納米至約10微米之間的數(shù)均平均粒徑和小于約20%的粒徑分布系 數(shù)，所述粒徑分布系數(shù)按下式計算，
C.V. = {[E(di-d)2/N]l/2/d}xl00%
式中，C.V.代表粒徑分布系數(shù)；di代表各個納微球的直徑；d代表數(shù)均平均
粒徑，d=Edi/N; N代表用于計算粒徑的納微球的數(shù)量，且N》200個。 在本發(fā)明的中，殼聚糖納微球的平均粒徑為約100-500納米，優(yōu)選得到的殼米。
在本發(fā)明一些實施方案中，可以用各種分子量的殼聚糖制造該殼聚糖納微球 產(chǎn)品，例如高分子量殼聚糖(分子量上百萬)、中等分子量的殼聚糖(分子量幾 十萬)、殼寡糖(分子量低于一萬)。
在本發(fā)明的一些實施方案中，該殼聚糖納微球產(chǎn)品還含有添加劑，所述添加 劑選自電解質(zhì)如NaCl、蛋白質(zhì)如白蛋白、磷脂如卵磷脂、糖類如葡萄糖和甘露 醇等。
本發(fā)明的另一方面提供所述殼聚糖納微球產(chǎn)品的用途，例如用于蛋白質(zhì)、多 肽類藥物載體、化學(xué)藥物載體、基因載體和細(xì)胞培養(yǎng)的載體等用途。有關(guān)的例子 如上述參考文獻(xiàn)中所述，因此所有上述參考文獻(xiàn)通過引用并入本文。
在本發(fā)明的一些實施方案中，所述殼聚糖納微球產(chǎn)品中的殼聚糖納微球分散 于液體中，形成例如懸浮液。在另一些實施方案中，所述殼聚糖納微球為粉末形 式，例如經(jīng)凍干形成的凍干粉。
本發(fā)明的殼聚糖納微球的尺寸均一，納微球在水溶液中分散性好，藥物包埋 率高，藥物活性保持好。
本發(fā)明的另一方面提供一種制備殼聚糖納微球產(chǎn)品的方法，其包括以下歩驟:
(1) 提供溶解了水溶性藥物或分散了油溶性藥物的殼聚糖醋酸水溶液作為 水相W;
(2) 提供含有油溶性乳化劑且與水互不相溶的油性物質(zhì)作為油相0;
(3) 將水相W與油相O混合得到W/0型預(yù)乳液；
(4) 將所述預(yù)乳液在較高的壓力下使其通過孔徑均一的微孔膜得W/0型乳
液；
(5) 向W/0型乳液中加入一定的交聯(lián)劑使乳滴交聯(lián)固化得到殼聚糖納微球。
步驟(5)中乳滴的交聯(lián)固化優(yōu)選在加熱條件下進(jìn)行，加熱可以使乳滴迅速成 型，避免乳滴之間的凝聚發(fā)生，同時可以大大改善最終納微球的分散性；如果不 加熱，乳滴固化速度很慢，而且會有大量乳滴固化不上或固化得不好，從而會導(dǎo) 致乳滴之間的凝并，使納微球粒徑均一性變差，而固化不好的納微球之間則容易發(fā)生粘連，從而導(dǎo)致納微球產(chǎn)品的分散性不好。
上述乳滴交聯(lián)反應(yīng)中的加熱溫度為30-50°C，優(yōu)選的加熱溫度為35-45°C， 交聯(lián)反應(yīng)時間為8-10小時。
步驟(4)中所述初乳液在壓力作用下通過所述微孔膜，在約0.2 MPa至約3.0 MPa之間基本恒定的壓力下通過所述微孔膜，優(yōu)選為0.5-1.5 MPa。
步驟(4)中所述乳液過膜次數(shù)可為多次，即通過同一微孔膜至少一次得到所 述W/0型乳液，優(yōu)選為3-5次。所述微孔膜的孔徑為約0.5微米至約3微米，孔 徑分布跨距Span值為0.7以下。
步驟(4)中所述初乳液通過微孔膜的速度為0.5-15 m3m—2h—'。
在本發(fā)明方法的一些實施方案中，該方法還任選地包括步驟(6):洗滌和凍干 步驟(5)中得到的殼聚糖納微球。
在本發(fā)明方法的一些實施方案中，步驟(5)中得到的所述殼聚糖納微球具有約 幾十納米至約10微米之間的平均粒徑和小于約20%的粒徑分布系數(shù)。因此，本 發(fā)明的方法特別適合制備本發(fā)明上述的殼聚糖納微球產(chǎn)品。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是 本發(fā)明的方法也可以用于制備具有其它粒徑和粒徑分布的殼聚糖納微球產(chǎn)品。
在本發(fā)明方法的一些實施方案中，所述孔徑均一的微孔膜的平均孔徑為約 0.5微米至約20微米，其中平均孔徑為體積平均孔徑，定義如下
dv=[(Eni di3)/i:ni]1/3
上式中，dv為體積平均孔徑，di為各個微孔的直徑，Ili為孔徑為di的微孔的數(shù)目。
一般來說，殼聚糖納微球的粒徑與該微孔膜的孔徑有關(guān)和操作壓力有關(guān)，因 此可以通過選擇合適孔徑的微孔膜和操作壓力用于制備具有期望粒徑的殼聚糖 納微球，其中微孔膜的孔徑分布對殼聚糖納微球的粒徑分布的影響是孔徑分布越 窄所制備得到的殼聚糖納微球的粒徑分布越窄。在一些方案中，所述孔徑均一的 微孔膜的孔徑分布跨距Span在0.7以下?？讖椒植伎缇郤pan值的定義如下式所 見
Span=( dM-dio)/d50
上式中，d9。、 d,o和dso分別表示所有孔徑中有90%、 10%、 50%的孔其孔徑小于該值所表示的孔徑尺寸。孔徑分布跨距(Span值)越小，孔徑分布越窄， 即孔徑越均一。
在本發(fā)明方法的一些實施方案中，所述孔徑均一的微孔膜為表面親水或疏水 的微孔膜。 一般來說，當(dāng)操作壓力較大時，微孔膜的表面親、疏水性對所制備得 到的殼聚糖納微球粒徑和粒徑均一性影響不大；當(dāng)操作壓力較小時，疏水性微孔 膜較親水性微孔膜所制備得到的殼聚糖納微球粒徑小且粒徑均一性好。所述孔徑 均一的微孔膜的表面疏水性可以通過本領(lǐng)域中已知的方法改變。在一些方案中， 所述孔徑均一的微孔膜為經(jīng)過化學(xué)修飾的表面疏水的玻璃微孔膜，例如經(jīng)過化學(xué) 修飾的表面疏水的SPG (Shirasu-porous glass)膜，25°〇下該膜表面與純水之間 的接觸角在100-140°之間。
在本發(fā)明方法的一些實施方案中，步驟(4)中所述預(yù)乳液通過至少一個，優(yōu) 選至少兩個孔徑均一的微孔膜以得到所述W/0型乳液。在另一些實施方案中， 步驟(4)中所述預(yù)乳液通過同一孔徑均一的微孔膜至少一次，優(yōu)選至少兩次以得 到所述W/0型乳液。例如，所述預(yù)乳液可以連續(xù)或間歇地在相同壓力條件下通 過兩個或更多個孔徑均一的微孔膜，這些孔徑均一的微孔膜具有相同或不同的孔 徑?；蛘?，所述預(yù)乳液可以通過同一孔徑均一的微孔膜兩次或更多次，每次通過 在相同或不同的壓力條件下進(jìn)行。通過選擇具有合適孔徑的微孔膜，將預(yù)乳液通 過所述孔徑均一的微孔膜一次或多次或者通過一個或多個微孔膜后，所得W/0 型乳液中的水相液滴的粒徑分布C.V.值會逐漸變小，直至小于20%，因此在步驟 (5)中交聯(lián)固化后即可得到本發(fā)明的平均粒徑為約幾十納米至約10微米和C.V.值 小于20%的殼聚糖納微球產(chǎn)品。
在本發(fā)明方法的一些實施方案中，步驟(4)中所述初乳液是在壓力作用下通 過所述孔徑均一的微孔膜的。在一些實施方案中，所述壓力為基本恒定的壓力， 其與所用膜孔徑、操作壓力和水相中殼聚糖含量有關(guān)。例如所述基本恒定的壓力 可以為約0.5 MPa至約3.0 MPa。還例如以孔徑為1.4微米的膜、殼聚糖的醋酸 水溶液濃度為0.5%制備納微球時，所用壓力可以為0.95MPa;在65'C下，以孔 徑為5.7微米的膜、殼聚糖的醋酸水溶液濃度為0.5%制備納微球時，所用壓力可 以為0.5MPa。在一些實施方案中，所述基本恒定的壓力是指壓力的波動不超過
710%，優(yōu)選不超過5%，更優(yōu)選不超過1%。
在本發(fā)明方法的一些實施方案中，步驟(4)中所述預(yù)乳液通過孔徑均一的微 孔膜的速度與膜孔徑、水相中殼聚糖分子量和含量、油水相比和壓力有關(guān)。在一 些實施方案中，該速度可以為約0.5 MPa至約1.5 MPa。例如以孔徑為1.4微米 的膜、殼聚糖分子量為50000Da、其醋酸水溶液濃度為0.5%、水油相體積比30:1 制備殼聚糖納微球時，所用壓力可以為0.95MPa，乳液生成速度可以為0.5 m3m—2h"，乳化過程在瞬間完成。
在本發(fā)明方法的一些實施方案中，步驟(5)中W/0型乳液中水相液滴可以通 過加入化學(xué)交聯(lián)劑如戊二醛飽和的甲苯溶液固化得到殼聚糖納微球。在另一些實 施方案中，所述水相液滴可以通過加入沉淀劑如三聚磷酸鹽等、高分子膠凝劑如 海藻酸鹽、加熱等方式使液滴固化得到殼聚糖納微球。
在本發(fā)明方法的一些實施方案中，步驟(l)中所述水相溶液中的殼聚糖分子 量為50000Da，所述殼聚糖的濃度范圍可以為約0.05wty。至約5.0wt%。
在本發(fā)明方法的一些實施方案中，步驟(l)中所述溶液還含有添加劑，所述 添加劑選自電解質(zhì)、白蛋白、卵磷脂、葡萄糖、甘露醇等。
在本發(fā)明方法的一些實施方案中，步驟(2)中所述油性物質(zhì)選自液體石蠟、 石油醚、橄欖油、棉子油、豆油、葵花子油、其它垸類碳?xì)浠衔铩?br> 在本發(fā)明方法的一些實施方案中，步驟(2)中所述油溶性乳化劑其親水親油 平衡值HLB可以在3-6之間，具體的例子可以是失水山梨醇倍半油酸酯、甘油 醚的聚合物、聚氧乙烯氫化蓖麻油、失水山梨醇三油酸酯、失水山梨醇單油酸酯、 失水山梨醇三硬脂酸酯、親油-親水嵌段共聚物，PO-500、 PO-310?；谟拖郞 的質(zhì)量，油相中油溶性乳化劑的濃度為約0.5wt。/。至約10wt%。
在本發(fā)明方法的一些實施方案中，水相與油相的體積比在約1:1至約1:1000 之間，例如1:20至1:60。
本發(fā)明的在另一方面提供一種用于生產(chǎn)上述殼聚糖納微球產(chǎn)品的裝置，如圖 2所示。
8除非特別說明，在本發(fā)明中使用的術(shù)語具有以下含義。
在本發(fā)明中使用的術(shù)語"殼聚糖"是指現(xiàn)有技術(shù)中命名為"殼聚糖"(Chitosan) 的產(chǎn)品，包括天然殼聚糖、改性殼聚糖及其衍生物。例如，從蟲下殼、蟹殼等海產(chǎn) 品廢棄物中提取的天然多糖，是由葡糖胺和N-乙酰基葡糖胺 (N-acetyl-D-glucosamine)共聚物組成的多糖，是甲殼素(Chitin)脫乙?；漠a(chǎn)物。
在本發(fā)明中使用的術(shù)語"殼聚糖納微球"是指由殼聚糖乳滴通過固化形成的 納米至微米級的納微球，可以具有實心、多孔、中空、中空多孔等結(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明中使用的術(shù)語"均勻乳液"或"均一乳液"是指粒徑均一殼聚糖納 微球固化前的乳液。
在本發(fā)明中使用的術(shù)語"粒徑"是指以激光粒度儀測得的微球的數(shù)均或體積 平均粒徑。粒徑分布系數(shù)C.V.是由Zeta電位及粒度分析儀ZetaPlus(Brookhaven Instruments Cooperation, USA)測得的數(shù)據(jù)根據(jù)下式
C.V. = {E(di-d)2/N]l/2/d}xl00%
計算得到的，其中N為用于計算粒徑的納微球的數(shù)量，且N^200個，di為各個 納微球的直徑，d為數(shù)均平均粒徑。
在本發(fā)明中使用的術(shù)語"膜孔徑"是指微孔膜的體積平均孔徑。


圖l是制備殼聚糖納微球的原理及流程示意圖。
圖2是制備用于形成殼聚糖納微球的均一乳液的裝置示意圖。
圖3是實施例1制備的殼聚糖納微球的掃描電鏡照片。
圖4是比較例1制備的殼聚糖納微球的掃描電鏡照片。
圖5是比較例2制備的殼聚糖納微球的掃描電鏡照片。
圖6是比較例3制備的殼聚糖納微球的掃描電鏡照片。
圖7是比較例1、比較例2、比較例3和實施例1制備的殼聚糖納微球的粒 徑分布比較圖。圖8是實施例2制備的殼聚糖納微球的掃描電鏡照片。
圖9是實施例5制備的殼聚糖納微球的掃描電鏡照片。
圖10是不同操作壓力下制備的殼聚糖納微球的平均粒徑與操作壓力之間的 關(guān)系圖。
圖11是采用不同孔徑的SPG膜制備的殼聚糖納微球的平均粒徑與SPG膜 孔徑之間的關(guān)系圖。
具體實施例方式
如果沒有特別指明，本發(fā)明中所有濃度單位均為wt%。 下面對本發(fā)明進(jìn)行更為詳盡的描述。
總體上講，本發(fā)明采用了快速膜乳化法制備出了粒徑為幾十納米至約10微 米的殼聚糖納微球。
根據(jù)本發(fā)明的某些的實施方案，采用未經(jīng)或經(jīng)過化學(xué)修飾的表面親水或疏水 性的玻璃膜作為微孔膜，先將油水兩相混合，通過均質(zhì)乳化或者攪拌制得W/O 的預(yù)乳液，之后在較高的壓力下使預(yù)乳液快速通過微孔膜降低乳液中液滴的尺 寸，經(jīng)過反復(fù)幾次膜乳化可以得到粒徑均一的乳液，之后將乳液交聯(lián)固化得到粒 徑均一的殼聚糖納微球。
在一些實施方案中，采用這種新型的膜乳化法可以制備尺寸均一、粒徑小于 10微米的殼聚糖納微球，而且納微球的分散性很好。另外，除了能制備得到尺 寸小于IO微米、粒徑均一的殼聚糖納微球，還可以通過選擇不同的膜孔徑和操 作壓力控制所得納微球的平均粒徑。
在一些實施方案中，本發(fā)明的制備方法包括如下步驟將一定量的殼聚糖溶
解于1%的醋酸水溶液中，所得溶液作為水相；取一定量的油溶性乳化劑溶于與
水不相溶的有機(jī)相中作為油相；將水相與油相迅速混合后，通過均質(zhì)乳化或機(jī)械 攪拌制備得到W/O型預(yù)乳液；在較高壓力下將預(yù)乳液迅速壓過經(jīng)過或未經(jīng)疏水 處理的玻璃微孔膜得到粒徑均一的W/O型乳液；為使粒徑更均一可將每次得到 的乳液作為預(yù)乳液，在較高壓力下反復(fù)通過膜孔壓出；向此乳液中加入一定量的 交聯(lián)劑或沉淀劑，或通過加熱使乳滴固化，得到尺寸均一的殼聚糖納微球。殼聚
糖納微球的粒徑分布系數(shù)可以控制在20%以內(nèi)，粒徑可以在IO微米以下或更大的范圍內(nèi)通過膜孔徑和操作壓力進(jìn)行控制。
所述微孔膜可以是本身為親水性的玻璃膜，或經(jīng)過化學(xué)修飾后變成疏水性， 膜孔徑本身可以不發(fā)生變化。所使用的微孔膜孔徑可以為0.5-5微米，更優(yōu)選為 1-3微米。所制備的納微球的平均粒徑可能與所用的膜孔徑存在線性關(guān)系，可通 過選擇膜孔徑來制備所需粒徑的殼聚糖納微球。
在本發(fā)明的一些實施方案中，乳化過程可以在不同的操作壓力下進(jìn)行。所使 用的操作壓力可以為0.5-3.0MPa，優(yōu)選為0.7-1.5MPa。由于不同操作壓力所制備 的殼聚糖納微球粒徑不同，所制備的納微球的平均粒徑可能與操作壓力存在某種 線性關(guān)系，在膜孔徑確定的情況下，可通過控制操作壓力制備所需粒徑的殼聚糖 納微球。
在本發(fā)明的一些實施方案中，所用壓力和所制備的殼聚糖納微球粒徑與所用 膜孔徑、水相殼聚糖分子量和含量、油相種類或粘度、油水比有關(guān)。以孔徑為 5.2微米的膜、殼聚糖分子量為50000Da、殼聚糖含量為0.5%、油相為石油醚與 液體石蠟的體積比為7:5、油水相的體積比為30:1為條件制備殼聚糖納微球為例， 所用壓力可以為0.95MPa,所得殼聚糖納微球粒徑為200-300nm。
根據(jù)本發(fā)明方法制備的殼聚糖納微球產(chǎn)品，可以用于化學(xué)藥物、生物活性藥 物、DNA、菌類、細(xì)胞等的包埋載體，其中納微球的尺寸在幾十納米至10微米 可控，而且粒徑均一、分散性好。該技術(shù)解決了傳統(tǒng)乳化法難以制備粒徑均一可 控、傳統(tǒng)膜乳化法難以制備小粒徑殼聚糖納微球的問題，在保證粒徑均一的前提
下能快速制備粒徑小于io微米的殼聚糖納微球。
本發(fā)明提供的瓊脂糖凝膠微球及其制備方法還能夠帶來下列效果
(1) 本發(fā)明提供了一種尺寸均一、粒徑可控的殼聚糖納微球產(chǎn)品，此納微球產(chǎn)品 分散性好，可以可用于包埋化學(xué)藥物、生物活性藥物等，還可用制備用于作 為活細(xì)胞、基因等載體。
(2) 本發(fā)明提供了一種制備(l)中所述的殼聚糖納微球產(chǎn)品的制備方法，即快速膜 乳化法，該方法所制備的納微球粒徑從幾百納米至幾微米可控，粒徑均一性 好，其粒徑分布的C.V.值在20X以下，這種方法易于放大和規(guī)?；a(chǎn)；這 種方法除了可以制備殼聚糖納微球外，還可以拓展到其它納微球產(chǎn)品的制備， 如聚乳酸納微球、海藻酸鹽納微球等。
11(3) 本發(fā)明提供了殼聚糖納微球的交聯(lián)固化方式，即在加熱條件下進(jìn)行，這種交 聯(lián)固化方式使得最終得納微球產(chǎn)品粒徑均一性更好、分散性好。
(4) 采用本發(fā)明的制備方法，能夠很容易的制備出傳統(tǒng)乳化法很難制備的小粒徑
(納米級)的殼聚糖納微球，從而可以進(jìn)一步拓展殼聚糖納微球的應(yīng)用范圍 和途徑。
(5) 本發(fā)明所使用的試驗設(shè)備簡單，不需要使連續(xù)相流動的泵或攪拌裝置，容易
實現(xiàn)工藝的放大，而且制備工藝比較簡單，操作易于控制，乳液的生成速率 比較快，效率高。
實施例
下面，對本發(fā)明的殼聚糖納微球的制備方法舉例加以說明。但是，應(yīng)當(dāng)理解， 這些舉例說明僅僅是為了便于更好地理解本發(fā)明，而決非對本發(fā)明范圍的限制。
在實施例中所用的"殼聚糖"分子量為50000Da;可用的"親水性的微孔膜" 或"疏水處理的微孔膜"是未經(jīng)或經(jīng)疏水修飾方法處理后的SPG玻璃膜(SPG TECHNOLOGY Co.， Ltd生產(chǎn)，型號為PJN06L)。例如，化學(xué)修飾的表面疏水微 孔膜可經(jīng)如下疏水處理得到將親水性的玻璃膜在純凈水中常溫下超聲30分鐘， 然后放入3% (V/V)的修飾劑KP-18 (產(chǎn)地日本)的水溶液中，之后減壓(真空度 為0.5MPa)超聲2h，再在12(TC下加熱4h?？捎玫奈⒖啄み€包括Ise Chemical Co.， Ltd(日本)生產(chǎn)的SPG (Shirasu-porous glass)膜。
殼聚糖納微球的制備按圖1所示的歩驟制備，具體方法和步驟說明如下 1) W/0型乳液的制備
將一定量的殼聚糖、NaCl以及其它添加劑加入到一定量的醋酸或擰檬酸等 酸性水溶液中，并在磁力攪拌條件下充分溶解作為水相；將一種以上的油溶性乳
化劑溶于油性液體作為油相。將水相與油相迅速混合后通過均質(zhì)乳化、攪拌或超
聲等方法制備得到W/0型預(yù)乳液，在一定壓力下迅速通過未經(jīng)或經(jīng)疏水處理的
微孔膜得到粒徑均一的W/0型乳液；該過程在圖2所示的裝置中完成。
殼聚糖的濃度可根據(jù)需要進(jìn)行配制，通常情況下，其濃度為0.2wt%-2.0wt%，
不同濃度的殼聚糖溶液所需的操作壓力也不盡相同，其制備所得到的納微球粒徑 也有所差別。水相添加劑可包括白蛋白、卵磷脂、葡萄糖、甘露醇等對人體無害 的水溶性物質(zhì)。油相為在常溫下呈液體狀且與水不互溶的油性物質(zhì)，可使用液體石蠟和石油醚、橄欖油、棉子油、豆油、葵花子油、其它烷類碳?xì)浠衔锏?，?可使用其混合物。 一般所選擇的油相沸點(diǎn)要比較高，揮發(fā)性弱較好。油性乳化劑 可以溶解于所使用的油相，可使用失水山梨醇倍半油酸酯(Arlacel83)、甘油醚 的聚合物(如PO-500、 PO-310)、聚氧乙烯氫化蓖麻油、失水山梨醇三油酸酯(司 班85)、失水山梨醇單油酸酯(司班80)、失水山梨醇三硬脂酸酯(司班65)、 親油-親水嵌段共聚物等。油相中乳化劑的濃度為0.5-10wt%，水相與油相的體積 比為1: l-h 1000。 2)殼聚糖納微球的制備
向上述步驟1)所得到的乳液中加入交聯(lián)劑或沉淀劑或采用加熱的方式使乳 滴固化，并進(jìn)行洗滌、凍干，得到粒徑均一的殼聚糖納微球。
交聯(lián)劑或沉淀劑的加入方式可以為緩慢滴加或迅速加入，交聯(lián)劑或沉淀劑可 以為水溶液也可以為油溶性溶液，交聯(lián)劑或沉淀劑的溶液可以直接加入到上述步 驟l)所得到的乳液中，也可以在與制備乳液相同的油相中超聲制備成細(xì)乳液后 加入到上述步驟l)所得到的乳液中，固化在室溫或4(TC以下進(jìn)行，固化在磁力 攪拌或機(jī)械攪拌下進(jìn)行，攪拌速率可以為100-500 rpm，例如300rpm;固化時間 為1-10小時，例如3小時。
乳液滴固化后，將所得凝膠微球依次用石油醚、乙醇、蒸餾水等洗滌(用作 細(xì)胞載體時不得用丙酮或乙醇洗滌)，并將所得殼聚糖納微球凍干，低溫保存； 或不凍干直接將納微球在常溫或低溫下保存于蒸餾水或細(xì)胞培養(yǎng)液中。 實施例1
將孔徑為1.4微米的親水性SPG玻璃膜置于液體石蠟與石油醚按體積比5:7 的混合油相中浸泡過夜或超聲半小時使膜孔充分濕潤。準(zhǔn)確稱取一定量的殼聚糖 溶于1%醋酸水溶液中，磁力攪拌下使其充分溶解得到殼聚糖醋酸水溶液，其濃 度為0.5wtM,將此溶液在2000rpm下離心除去不溶性雜質(zhì)，保留上清夜作為水 相備用。將油溶性乳化劑PO-500加入到60 ml的液體石蠟和石油醚的混合物(體 積比為5:7)中，其濃度為4wt。/。，攪拌至完全溶解作為油相。將2ml的上述殼 聚糖醋酸水溶液與油相混合并用均質(zhì)乳化器在三檔(6000 rpm)下乳化1分鐘，形 成預(yù)乳液。然后，將所得乳液迅速倒入如圖2所示的膜乳化裝置中，在0.95MPa 的氮?dú)鈮毫ο?，使其快速通過孔徑均一的SPG微孔膜，得到粒徑比較均一的W/0型乳液，將所得乳液作為預(yù)乳液在0.95 MPa的氮?dú)鈮毫ο略俅瓮ㄟ^SPG微孔膜， 反復(fù)乳化五次，最終得到粒徑均一的W/0型；乳化完畢，向乳液中加入一定量 戊二醛飽和的甲苯溶液，其中戊二醛的用量依據(jù)如下比例計算得到，即戊二醛上 的酸基與殼聚糖上氨基的摩爾比為2:1，在加熱條件下(35卩下)交聯(lián)反應(yīng)10 小時，交聯(lián)反應(yīng)的攪拌速率為500rpm。交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，在10000 rpm下離心， 傾去上清夜將殼聚糖納微球從油相中分離出來，依次用石油醚、丙酮、乙醇和蒸 餾水洗滌，并將其保存在蒸餾水中。微球的平均粒徑和粒徑分布采用Zeta電位 及粒度分析儀ZetaPlus測量，在水中微球的平均直徑為360.0納米，C.V.值為 13.8%，掃描電鏡照片如圖3所示，結(jié)果表明所制備的殼聚糖納微球粒徑均一。 比較例l (機(jī)械攪拌法)
采用與實例1相同的配方，準(zhǔn)確稱取一定量的殼聚糖加入到一定量的1%醋 酸水溶液中，使殼聚糖的濃度為0.5 wt%，在磁力攪拌條件下使其充分溶解，將 此溶液在2000 rpm下離心除去不溶性雜質(zhì)，保留上清夜作為水相備用。將油溶 性乳化劑PO-500加入到60 ml的液體石蠟和石油醚的混合物(體積比為5:7)中， 濃度為4 wt%，攪拌至完全溶解作為油相。將2 ml的上述殼聚糖醋酸水溶液倒 入到油相中，1000rpm下磁力攪拌30min，得到W/0型乳液；乳化完畢，向乳 液中加入一定量戊二醛飽和的甲苯溶液，其中戊二醛的用量依據(jù)如下比例計算得 到，即戊二醛上的醛基與殼聚糖上氨基的摩爾比為2:1，在35'C下交聯(lián)反應(yīng)10 小時，交聯(lián)反應(yīng)的攪拌速率為500rpm。交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，在10000 rpm下離心， 傾去上清夜將殼聚糖納微球從油相中分離出來，依次用石油醚、丙酮、乙醇和蒸 餾水洗滌，并將其保存在蒸餾水中。微球的平均粒徑和粒徑分布采用Zeta電位 及粒度分析儀ZetaPlus測量，在水中微球的平均直徑為10.54微米，C.V.值為 115.97%，所得微球的掃描電鏡照片如圖4所示，結(jié)果表明所制備得到的殼聚糖 微球粒徑很不均一。 比較例2 (均質(zhì)乳化法)
采用與實例1相同的配方，準(zhǔn)確稱取一定量的殼聚糖加入到一定量的1%醋 酸水溶液中，使殼聚糖的濃度為0.5 wt%，在磁力攪拌條件下使其充分溶解，將 此溶液在2000 rpm下離心除去不溶性雜質(zhì)，保留上清夜作為水相備用。將油溶 性乳化劑PO-500加入到60 ml的液體石蠟和石油醚的混合物(體積比為5:7)中，濃度為4 wt%，攪拌至完全溶解作為油相。將2 ml的上述殼聚糖醋酸水溶液倒 入到油相中，在6000 rpm下均質(zhì)乳化60秒，得到W/0型乳液；乳化完畢，向 乳液中加入一定量戊二酸飽和的甲苯溶液，其中戊二酸的用量依據(jù)如下比例計算 得到，即戊二醛上的醛基與殼聚糖上氨基的摩爾比為2:1，在35。C下交聯(lián)反應(yīng)10 小時，交聯(lián)反應(yīng)的攪拌速率為500rpm。交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，在10000rpm下離心， 傾去上清夜將殼聚糖納微球從油相中分離出來，依次用石油醚、丙酮、乙醇和蒸 餾水洗滌，并將其保存在蒸餾水中。微球的平均粒徑和粒徑分布采用Zeta電位 及粒度分析儀ZetaPlus測量，在水中微球的平均直徑為763.6納米，C.V.值為 65.34%，所得微球的掃描電鏡照片如圖5所示，結(jié)果表明所制備得到的殼聚糖微 球粒徑很不均一。 比較例3 (超聲法)
采用與實例1相同的配方，準(zhǔn)確稱取一定量的殼聚糖加入到一定量的1%醋 酸水溶液中，使殼聚糖的濃度為0.5 wt%，在磁力攪拌條件下使其充分溶解，將 此溶液在2000 rpm下離心除去不溶性雜質(zhì)，保留上清夜作為水相備用。將油溶 性乳化劑PO-500加入到60 ml的液體石蠟和石油醚的混合物(體積比為5:7)中， 濃度為4 wt%，攪拌至完全溶解作為油相。將2 ml的上述殼聚糖醋酸水溶液倒 入到油相中，在80W的功率下下超聲乳化3min，得到W/0型乳液；乳化完畢， 向乳液中加入一定量戊二醛飽和的甲苯溶液，其中戊二醛的用量依據(jù)如下比例計 算得到，即戊二醛上的醛基與殼聚糖上氨基的摩爾比為2:1，在35'C下交聯(lián)反應(yīng) IO小時，交聯(lián)反應(yīng)的攪拌速率為500rpm。交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，在10000 rpm下離 心，傾去上清夜將殼聚糖納微球從油相中分離出來，依次用石油醚、丙酮、乙醇 和蒸餾水洗滌，并將其保存在蒸餾水中。微球的平均粒徑和粒徑分布采用Zeta 電位及粒度分析儀ZetaPlus測量，(微球的平均粒徑和粒徑分布采用激光粒度儀 Masterrizer 2000E進(jìn)行測量，)在水中微球的平均直徑為550.9納米，C.V.值為 46.55%,所得微球的掃描電鏡照片如圖6所示，結(jié)果表明所制備得到的殼聚糖微 球粒徑很不均一。
將實施例1與比較例1、比較例2、比較例3所制備得殼聚糖納微球進(jìn)行粒 徑分布的比較，如圖7所示，其中快速膜乳化法代表實施例1所得殼聚糖納微球 的粒徑分布、機(jī)械攪拌法代表比較例1所得殼聚糖納微球的粒徑分布、均質(zhì)乳化法代表比較例2所得殼聚糖納微球的粒徑分布、超聲乳化法代表比較例3所得殼聚糖納微球的粒徑分布?？梢姡瑢嵤├?中的快速膜乳化法得到的微球粒徑最均
實施例2
采用與實施例1相同的裝置和方法制備殼聚糖納微球，其中不同的是所用孔徑為1.4微米的SPG膜經(jīng)過疏水處理，乳滴的交聯(lián)固化反應(yīng)在加熱條件下進(jìn)行，加熱的溫度為45'C，所得殼聚糖納微球的平均粒徑為350.0納米，C.V.為14.18%，所得微球的掃描電鏡照片如圖8所示，結(jié)果表明所制備得到的殼聚糖微球粒徑比較均一。實施例3
采用與實施例1相同的裝置和方法制備殼聚糖納微球，所不同的是乳滴固化反應(yīng)的交聯(lián)時間為8小時，所得殼聚糖納微球的平均粒徑為370.2納米，C.V.為13.98%。實施例4
采用與實施例1相同的裝置和方法制備殼聚糖納微球，所不同的是乳滴固化反應(yīng)的交聯(lián)時間為4小時，所得殼聚糖納微球的平均粒徑為390.2納米，C.V.為15.96%。實施例5
采用與實施例1相同的裝置和方法制備殼聚糖納微球，其中不同的是交聯(lián)反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，所得殼聚糖納微球的平均粒徑為420納米，C.V.為23.16%，所得的掃描電鏡照片如圖9所示，結(jié)果表明所制備得到的殼聚糖納微球粒徑均一性稍差。實施例6
采用與實施例1相同的裝置和方法制備殼聚糖納微球，其中不同的是交聯(lián)反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，所用的SPG膜孔徑為2.8微米，所得殼聚糖納微球的平均粒徑為520納米，C.V.為28.16%，結(jié)果表明所制備得到的殼聚糖納微球粒徑均一性稍差。
實施例7
采用與實施例1相同的裝置和方法制備殼聚糖納微球，其中不同的是過膜次數(shù)為2次。所得殼聚糖納微球的平均粒徑為390.0納米，C.V.為16.36%。實施例8
采用與實施例1相同的裝置和方法制備殼聚糖納微球，其中不同的是過膜次數(shù)為3次。所得殼聚糖納微球的平均粒徑為370.0納米，C.V.為15.20%。實施例9
采用與實施例1相同的裝置和方法制備殼聚糖納微球，其中不同的是所用操作壓力為0.85 MPa。所得殼聚糖納微球的平均粒徑為370.0納米，C.V.為14.22%。實施例10
采用與實施例1相同的裝置和方法制備殼聚糖納微球，其中不同的是所用操作壓力為0.65 MPa。所得殼聚糖納微球的平均粒徑為398.5納米，C.V.為15.66%。實施例11
采用與實施例1相同的裝置和方法制備殼聚糖納微球，其中不同的是所用操作壓力為0.50 MPa。所得殼聚糖納微球的平均粒徑為459.4納米，C.V.為16.88%。
實施例l、實施例9、實施例IO和實施例11所制備的殼聚糖納微球平均粒徑與操作壓力之間的關(guān)系如圖IO所示。由圖上可以看出殼聚糖納微球平均粒徑與操作壓力之間基本呈線性關(guān)系。實施例12
釆用與實施例1相同的裝置和方法制備殼聚糖納微球，其中不同的是所使用的SPG微孔膜的孔徑為2.8微米，所得殼聚糖納微球的平均粒徑為420.5納米，C.V.值15.66%。實施例13
采用與實施例1相同的裝置和方法制備殼聚糖納微球，其中不同的是所使用的SPG微孔膜的孔徑為5.2微米，所得殼聚糖納微球的平均粒徑為608.5納米，C.V.值17.66%。實施例14
采用與實施例1相同的裝置和方法制備殼聚糖納微球，其中不同的是所使用的SPG微孔膜的孔徑為7.0微米，所得殼聚糖納微球的平均粒徑為840納米，C.V.值16.68%。實施例15采用與實施例1相同的裝置和方法制備殼聚糖納微球，其中不同的是所使用的SPG微孔膜的孔徑為9.2微米，所得殼聚糖納微球的平均粒徑為1180納米，C.V.值17.28%。
實施例1、實施例10、實施例11、實施例12和實施例13所制備的殼聚糖納微球平均粒徑與SPG膜孔徑之間的關(guān)系如圖11所示。由圖上可以看出殼聚糖納微球平均粒徑與SPG膜孔徑之間基本呈線性關(guān)系。實施例16
采用與實施例1相同的裝置和方法制備殼聚糖納微球，其中不同的是殼聚糖濃度為0.2 wt%,所得殼聚糖納微球的平均粒徑為340.5納米，C.V.值15.22%。實施例17
采用與實施例1相同的裝置和方法制備殼聚糖納微球，其中不同的是瓊脂糖的濃度為1.0 wt%。所得殼聚糖納微球的平均粒徑為520納米，C.V.值為17.46%。實施例18
采用與實施例1相同的裝置和方法制備殼聚糖納微球，其中不同的是油水相體積比為20:1，所得殼聚糖納微球的平均粒徑為400納米，C.V.值為15.22%。實施例19
采用與實施例1相同的裝置和方法制備殼聚糖納微球，其中不同的是油水相體積比為60:1，所得殼聚糖納微球的平均粒徑為320納米，C.V.值為14.62%。實施例20
采用與實施例1相同的裝置和方法制備殼聚糖納微球，其中不同的是作為油相的石油醚和液體石蠟之間的體積比1:1，所得殼聚糖納微球的平均粒徑為406納米，C.V.值為16.62%。實施例21
采用與實施例1相同的裝置和方法制備殼聚糖納微球，其中不同的是油相為純石油醚，所得殼聚糖納微球的平均粒徑為346納米，C.V.值為15.72%。實施例22
采用與實施例1相同的裝置和方法制備殼聚糖納微球，所不同的是水相中添加了多肽藥物胰島素，所得殼聚糖納微球的平均粒徑為375.50納米，C.V.值為14.62%，藥物包埋率為85%，藥物活性保持為90%。通過閱讀本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員將想到本發(fā)明的許多改動和其它實施方 案，并根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)預(yù)知其益處。因此，應(yīng)當(dāng)理解，以上實施方案和實施例并 未限制本發(fā)明，并且對其進(jìn)行的改動和其它的實施方案也包括在所附權(quán)利要求的 范圍內(nèi)。雖然本文使用特定術(shù)語，但是它們僅僅以其一般的和描述性意義使用， 并不是為了限制權(quán)利要求中定義的本發(fā)明的范圍。
19
權(quán)利要求
1、一種尺寸均一、可控的殼聚糖納微球產(chǎn)品及其制備方法，所制備得到的殼聚糖納微球產(chǎn)品粒徑為幾十納米至10微米，其粒徑分布系數(shù)小于約20％，其中所述粒徑分布系數(shù)按下式計算，C.V.＝{[∑(di-d)2/N]1/2/d}×100％式中，C.V.代表粒徑分布系數(shù)；di代表各個納微球的直徑；d代表納微球的數(shù)均平均粒徑，d＝∑di/N；N為用于計算粒徑的納微球數(shù)量，且N≥200個。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1的殼聚糖納微球產(chǎn)品，其中殼聚糖納微球的平均粒徑優(yōu)選為100-500 納米，更優(yōu)選為150-350納米。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1的殼聚糖納微球產(chǎn)品，其中的殼聚糖包括不同分子量和脫乙酰度 的殼聚糖及其衍生物產(chǎn)品。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l的殼聚糖納微球產(chǎn)品的制備方法，包括如下具體步驟(1) 提供溶解了水溶性藥物或分散了油溶性藥物的殼聚糖醋酸水溶液或水溶液作 為水相；(2) 提供含有油溶性乳化劑且與水互不相溶的油性物質(zhì)作為油相；(3) 將水相與油相混合得到W/0型預(yù)乳液；(4) 將所述預(yù)乳液在較高的壓力下使其通過孔徑均一的微孔膜得W/0型乳液；(5) 向W/0型乳液中加入一定的交聯(lián)剤使乳滴交聯(lián)固化得到殼聚糖納微球。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中步驟(5)中的乳滴交聯(lián)需要在加熱條件下進(jìn)行， 交聯(lián)反應(yīng)時間為2-12小時，乳滴固化后得到殼聚糖納微球。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1的殼聚糖納微產(chǎn)品作為藥物載體的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種殼聚糖納微球產(chǎn)品，其中所述殼聚糖納微球產(chǎn)品中殼聚糖納微球的平均粒徑為幾十納米至10微米，粒徑分布系數(shù)C.V.小于20％。本發(fā)明還提供了制備所述殼聚糖納微球的制備方法和用途。
文檔編號A61J3/00GK101675996SQ20081022263
公開日2010年3月24日 申請日期2008年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月19日
發(fā)明者強(qiáng) 衛(wèi), 呂丕平, 張岳玲, 王連艷, 蘇志國, 馬光輝, 煒 魏 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所