專利名稱：用于預(yù)防和/或治療禽流感的抗原抗體復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫調(diào)節(jié)領(lǐng)域，涉及一種抗原抗體復(fù)合物和包含該抗原抗體復(fù)合物的
制劑以及它們的制備方法，還涉及了它們?cè)谥苽漕A(yù)防和/或治療禽流感的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
禽流感的流行給全世界造成了巨大的損失，而目前對(duì)其主要采取預(yù)防措施，我國(guó)政府為了全面掌握禽流感疫情的發(fā)生情況還采用衛(wèi)星監(jiān)控候鳥(niǎo)的遷徙路線。全世界研制的禽流感疫苗大致分為全病毒滅活疫苗(inactivated influenza virusvaccines)、基因工程亞單位疫苗(sub皿itvaccines) 、 DNA疫苗(DNA vaccines)、重組活載體疫苗(recombine liveinf luenza virus vaccines)、流感病毒基因工程活疫苗(genetically engineeredlive influenza virus vaccines)、復(fù)制缺陷型流感病毒疫苗(r印licationincompetent influenza virus vaccines)，而實(shí)際使用的大都是滅活苗。我國(guó)目前使用的高致病性禽流感疫苗主要包括4種禽流感滅活疫苗(H5亞型，N28株)、重組禽流感病毒滅活疫苗(H5N1亞型，Re-l株)、禽流感雞痘病毒基因工程疫苗(H5亞型)和禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗。這些疫苗可以預(yù)防機(jī)體免受病毒的侵害，但對(duì)于已經(jīng)發(fā)病的個(gè)體無(wú)效。目前，達(dá)菲(Tamiflu)、扎那米韋(Zanamivir)、金剛烷胺(Amantadine)和金剛乙胺(Rimantadine)具有一定的療效。臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析表明，金剛烷胺對(duì)流感樣疾病(influenza-like illness, ILI)和甲型流感的保護(hù)率分別為25 %和61 % ，并且能夠使發(fā)熱持續(xù)時(shí)間減少1天。金剛乙胺有相似的療效，但其預(yù)防作用與安慰劑或其它方法相比并無(wú)顯著性差異。同時(shí)，有研究結(jié)果顯示，金剛烷胺和金剛乙胺均可引起明顯的胃腸道不良反應(yīng)；金剛烷胺與金剛乙胺相比，造成中樞神經(jīng)毒副作用和學(xué)習(xí)能力減退更為常見(jiàn)。另外，此類(lèi)藥物容易產(chǎn)生耐藥和交叉耐藥，這與基質(zhì)蛋白基因序列中單個(gè)核苷酸發(fā)生突變有關(guān)。雖然還有離子通道阻斷劑和神經(jīng)氨酸酶抑制劑兩大類(lèi)中的四種藥物已經(jīng)在國(guó)外正式上市。但是，由于現(xiàn)有藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，使得流感病毒發(fā)生變異，對(duì)這些藥物都產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，離子通道阻斷劑更是存在對(duì)B型流感病毒無(wú)效和神經(jīng)毒性等缺陷，因此尋找新的治療方法是今后的主要發(fā)展方向。 為了調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫機(jī)能，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)外界不利因素的免疫應(yīng)答能力，國(guó)內(nèi)外都采用了增強(qiáng)機(jī)體免疫力的制劑，它們包括A、疫苗；B、天然合成的免疫增強(qiáng)劑；C、非特異性的免疫促進(jìn)劑；D、激素；E、特異性抗體或特異性免疫核糖核酸。Whitfill(專利號(hào)US5397568，US5397569)采用雞傳染性法氏囊抗原抗體復(fù)合物作為疫苗，有效地預(yù)防法氏囊病，其制劑現(xiàn)已在市場(chǎng)上普遍應(yīng)用，但該制劑只能用于法氏囊病的預(yù)防，且缺少對(duì)其治療作用的進(jìn)一步研究；聞?dòng)衩?專利號(hào)ZL93112409. 3)制備了一種免疫原性的抗原抗體復(fù)合物制劑，用于治療乙肝病毒的持續(xù)感染，現(xiàn)在已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，但制劑中采用的是乙肝病毒表面抗原，而不是全病毒。Fisher(專利號(hào)W088/08429)提供的治療艾滋病的免疫治療法采用了病毒的保護(hù)性抗原或其相應(yīng)的肽段，以及金色葡萄球菌等，也不是抗原抗體復(fù)合物。綜上所述，抗原抗體復(fù)合物作為預(yù)防和治療手段已經(jīng)在某些領(lǐng)域取得顯著療效。
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目前，禽流感給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)毀滅性打擊，還能引起人類(lèi)和珍稀動(dòng)物發(fā)病，至今沒(méi)有特效治療藥物。禽流感是由禽流感病毒引起的急性呼吸道疾病。禽流感病毒是8段RNA編碼的IO個(gè)蛋白組成，其中血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)為主要表面抗原，但是它們的基因容易發(fā)生抗原漂移和抗原變異，所以上述的幾種方法均不適用。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種使用方便快捷、安全有效地預(yù)防和/或治療禽流感的抗原抗體復(fù)合物及其制劑、制備方法。這種抗原抗體復(fù)合物通過(guò)改變抗原的提呈路徑，在短時(shí)間內(nèi)剌激機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫力，抵抗流行病毒的入侵。同時(shí)在感染初期，該抗原抗體復(fù)合物還能起到一定的治療效用。
用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的的技術(shù)方案如下 —種用于治療和/或預(yù)防禽流感的抗原抗體復(fù)合物，其中該抗原抗體復(fù)合物包含作為抗原的滅活禽流感全病毒及其抗體，且抗原與抗體的質(zhì)量濃度比大于1。
在上述抗原抗體復(fù)合物中，所述禽流感全病毒為H5N1亞型禽流感病毒；所述抗體為多價(jià)抗體IgY，例如禽流感H5亞型滅活苗多次免疫健康蛋雞后制備的高免卵黃抗體。所述抗原與抗體的質(zhì)量濃度比優(yōu)選為1 : 0.67。 —種上述抗原抗體復(fù)合物的制備方法，其中包括以下步驟 (1)將禽流感病毒滅活； (2)血源純化禽流感病毒作為抗原； (3)將稀釋的抗原及其抗體按比例混合，37t:下放置1 2小時(shí)后4t:下過(guò)夜；離心得到沉淀即可。
上述制備方法具體包括以下步驟 (1)以禽流感H5N1亞型病毒株接種9日齡無(wú)特異性病原微生物(SPF)的雞胚，增殖后無(wú)菌條件下收取病毒尿囊液，加入0. 4%甲醛溶液，37t:下滅活72小時(shí)；
(2)以含甲醛的生理鹽水處理過(guò)的健康雞紅細(xì)胞純化禽流感病毒作為抗原，抗原稀釋20倍后濃度為1. 38mg/ml，抗體稀釋20倍后濃度為1. 22mg/ml ; (3)將上述濃度的抗原再稀釋100倍，抗體再稀釋150倍，然后按照體積比1 : 1的比例混勻，37t:下放置1 2小時(shí)后4t:下過(guò)夜，次日取出后經(jīng)12000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，棄上清，沉淀重懸于1000倍無(wú)菌生理鹽水中。 本發(fā)明還提供了包含上述抗原抗體復(fù)合物的制劑及其制備方法。該制備方法包括以下步驟將上述抗原抗體復(fù)合物重懸于無(wú)菌生理鹽水中。 本發(fā)明還提供了上述抗原抗體復(fù)合物在制備預(yù)防和/或治療禽流感的藥物中的用途。 本發(fā)明提供的抗原抗體復(fù)合物作為載體攜帶過(guò)量的抗原，改變了抗原的提呈路
徑，從而有效地促進(jìn)了機(jī)體的免疫功能。同時(shí)，包含該抗原抗體復(fù)合物的制劑無(wú)需使用固體
載體，因此不會(huì)對(duì)機(jī)體造成強(qiáng)烈剌激或者引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生炎癥、潰瘍等不良反應(yīng)。
相對(duì)于已有技術(shù)，本發(fā)明提供的抗原抗體復(fù)合物優(yōu)勢(shì)在于(l)抗原過(guò)量的抗原
抗體復(fù)合物進(jìn)入機(jī)體后，在符合機(jī)體生理?xiàng)l件下進(jìn)行初次免疫后再次剌激機(jī)體引起免疫反
應(yīng)，因此免疫應(yīng)答速度快，反應(yīng)強(qiáng)；(2)抗原抗體復(fù)合物作為載體，更有利于抗原提呈細(xì)胞
4的捕獲與提呈；(3)免疫復(fù)合物作為載體還能夠有效地增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖反應(yīng)；(4)純化的
全病毒作為抗原增加了復(fù)合物的分子量，更有利于機(jī)體免疫細(xì)胞對(duì)抗原的攝取，快速引起
免疫反應(yīng)；(5)以純化的禽流感全病毒為抗原，較HA蛋白等單一蛋白作為抗原，能剌激機(jī)體
產(chǎn)生更廣泛的免疫反應(yīng)，這一措施對(duì)于預(yù)防抗原容易發(fā)生變異的禽流感病毒更具有意義。 本發(fā)明提供一種禽流感全病毒與其相應(yīng)的多價(jià)抗體的復(fù)合制劑，其制作簡(jiǎn)單快
捷，使用安全方便，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，有效地剌激機(jī)體作出較快、較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，
在禽流感的預(yù)防與初期治療中具有較好的效果。


以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，其中 圖1 :抗原抗體復(fù)合物疫苗與常規(guī)疫苗免疫后各組雞群的抗體水平比較情況；常規(guī)疫苗組是指重組禽流感病毒滅活疫苗(H5Nl亞型，Re-l株)；復(fù)合物制劑l組由純化的禽流感病毒抗原與等體積的抗體混合制成，兩者的質(zhì)量濃度比為1 : 0.67;復(fù)合物制劑2組由禽流感HA蛋白為抗原與等體積的抗體混合制成，兩者的質(zhì)量濃度比1 : 0.65。
圖2 :抗原抗體復(fù)合物疫苗與常規(guī)疫苗免疫雞群后的發(fā)病率、死亡率以及保護(hù)率的比較；常規(guī)疫苗組是指重組禽流感病毒滅活疫苗(H5N1亞型，Re-l株)；復(fù)合物制劑1組由純化的禽流感病毒抗原與等體積的抗體混合制成，兩者的質(zhì)量濃度比為1 : 0.67;復(fù)合物制劑2組由禽流感HA蛋白為抗原與等體積的抗體混合制成，兩者的質(zhì)量濃度比1 : 0.65。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 :禽流感抗原抗體復(fù)合物制劑的制備
具體制備方法按以下步驟操作 (1)以禽流感H5N1亞型病毒株接種9日齡SPF雞胚，增殖后無(wú)菌條件下收取病毒尿囊液，加入0.4%甲醛，37"下滅活72小時(shí)。 (2)血源(含甲醛的生理鹽水處理過(guò)的健康雞紅細(xì)胞)純化禽流感病毒，經(jīng)測(cè)定抗原稀釋20倍后濃度為1. 38mg/ml，抗體稀釋20倍后濃度為1. 22mg/ml。所述抗體為用常規(guī)的重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活疫苗(H5Nl，Re-l株+Re-4株)多次免疫健康蛋雞后制備的IgY ; (3)將上述濃度的抗原再稀釋100倍，抗體再稀釋150倍，然后按照體積比1 : 1的比例混勻，37t:下放置1 2小時(shí)后fC下過(guò)夜。次日取出后經(jīng)12000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，棄去上清液。 (4)將得到的沉淀重懸于生理鹽水中，進(jìn)行無(wú)菌、安全、毒性試驗(yàn)，各項(xiàng)檢驗(yàn)合格后-2(TC下保存?zhèn)溆谩?實(shí)施例2 :禽流感抗原抗體復(fù)合物制劑引起的免疫應(yīng)答和療效
(1)材料與方法 A.抗原甲醛滅活，甲醛生理鹽水純化的禽流感H5N1病毒株的全病毒為抗原。
B.抗體給健康蛋雞多次免疫禽流感H5亞型滅活苗產(chǎn)出的蛋制備的多價(jià)抗體IgY作為抗體。
C.在ELISA方陣滴定試驗(yàn)中，以純化的流感病毒為抗原，IgY為抗體，聯(lián)苯二銨(OPD)為底物在490nm處讀數(shù)，取吸光值為0.4為最佳配比，抗原稀釋20倍后濃度為1. 38mg/ml，抗體稀釋20倍后濃度為1. 22mg/ml，用于抗原抗體復(fù)合物的制備。將上述濃度的抗原再稀釋100倍，抗體再稀釋150倍，然后按體積比1 : l的比例混勻，37t:下放置1 2小時(shí)后fC下過(guò)夜。次日取出后經(jīng)12000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，棄上清，將得到的沉淀1000倍重懸于無(wú)菌生理鹽水中。 D.分別通過(guò)頸靜脈、翅下靜脈和腹腔注射給藥，第一針免疫后分別在第9、15、21和28天采血。 E、空白對(duì)照組采用滅菌生理鹽水，試驗(yàn)對(duì)照組用常規(guī)的重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活疫苗(H5N1， Re-l株+Re-4株)免疫。 實(shí)施例3 :禽流感亞單位復(fù)合物制劑引起的免疫應(yīng)答和療效
(1)材料與方法 A.抗原從禽流感病毒的雞胚尿囊液中提取RNA，進(jìn)行RT-PCR，回收HA目的基因，連接pET-21b載體，轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞中克隆表達(dá)。超聲裂解菌體，SDS-PAGE電泳檢測(cè)HA蛋白。鎳柱純化蛋白。 B.抗體給健康蛋雞多次免疫禽流感H5亞型滅活苗產(chǎn)出的蛋制備的多價(jià)抗體IgY作為抗體。 C.在ELISA方陣滴定試驗(yàn)中，以純化的HA蛋白為抗原，IgY為抗體，聯(lián)苯二銨(OPD)為底物在490nm處，取吸光值為0. 4為最佳配比，抗原稀釋20倍后濃度為1. 38mg/ml，抗體稀釋20倍后濃度為1.22mg/ml，用于抗原抗體復(fù)合物的制備。將上述濃度的抗原再稀釋100倍，抗體再稀釋150倍，然后按體積比1 : 1的比例混勻，37t:下放置1 2小時(shí)后4t:下過(guò)夜。次日取出后經(jīng)12000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，棄上清，將沉淀1000倍重懸于無(wú)菌生理鹽水中。 D.分別通過(guò)頸靜脈、翅下靜脈和腹腔注射給藥，第一針免疫后分別在第9、15、21和28天采血。 E、空白對(duì)照組采用滅菌生理鹽水，試驗(yàn)對(duì)照組用常規(guī)的重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活疫苗(H5N1， Re-l株+Re-4株)免疫。 實(shí)施例2制備的禽流感抗原抗體復(fù)合物制劑以及實(shí)施例3制備禽流感亞單位復(fù)合物制劑引起的免疫應(yīng)答和療效結(jié)果見(jiàn)于圖1和圖2。圖1為兩種抗原抗體復(fù)合物疫苗與常規(guī)疫苗免疫后各組雞群的抗體水平比較情況，利用SPSS 11. 5軟件分析，結(jié)果表明常規(guī)疫苗組和復(fù)合物制劑I組的抗體水平與空白對(duì)照組相比差異性極其顯著(P < 0. 01)，復(fù)合物制劑II組與空白對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異(P > 0. 05)。圖2為兩種抗原抗體復(fù)合物疫苗與常規(guī)疫苗免疫雞群后的發(fā)病率、死亡率及保護(hù)率的比較；利用SPSS 11. 5軟件分析，常規(guī)疫苗組，復(fù)合物制劑I組和復(fù)合物制劑II組與空白對(duì)照組相比在發(fā)病率、死亡率、保護(hù)率方面差異性極其顯著(P < 0. 01)，復(fù)合物制劑I組與復(fù)合物制劑II組有顯著性差異(P < 0. 05)。
權(quán)利要求
一種用于治療和/或預(yù)防禽流感的抗原抗體復(fù)合物，其中該抗原抗體復(fù)合物包含作為抗原的滅活禽流感全病毒及其抗體，且抗原與抗體的質(zhì)量濃度比大于1。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗原抗體復(fù)合物，其特征在于，所述禽流感全病毒為H5N1亞型禽流感病毒。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗原抗體復(fù)合物，其特征在于，所述抗體為多價(jià)抗體IgY。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3中所述的抗原抗體復(fù)合物，其特征在于，所述多價(jià)抗體IgY為禽流感H5亞型滅活苗多次免疫健康蛋雞后制備的高免卵黃抗體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的抗原抗體復(fù)合物，其特征在于，所述抗原與抗體的質(zhì)量濃度比為1 : 0.67。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的抗原抗體復(fù)合物的制備方法，其中包括以下步驟(1) 將禽流感病毒滅活；(2) 血源純化禽流感病毒作為抗原；(3) 將稀釋的抗原及其抗體按比例混合，37t:下放置1 2小時(shí)后fC下過(guò)夜；離心得到的沉淀即可。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1) 以禽流感H5N1亞型病毒株接種9日齡無(wú)特異性病原微生物的雞胚，增殖后無(wú)菌條件下收取病毒尿囊液，加入0.4X甲醛溶液，37t:下滅活72小時(shí)；(2) 以含甲醛的生理鹽水處理過(guò)的健康雞紅細(xì)胞純化禽流感病毒作為抗原，抗原稀釋20倍后濃度為1138mg/ml，抗體稀釋20倍后濃度為1. 22mg/ml ;(3) 將上述濃度的抗原再稀釋100倍，抗體再稀釋150倍，然后按照體積比1 : 1的比例混勻，37t:下放置1 2小時(shí)后4t:下過(guò)夜，次日取出后經(jīng)12000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，棄上清，沉淀重懸于1000倍無(wú)菌生理鹽水中。
8. —種包含根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的抗原抗體復(fù)合物的制劑。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制劑的制備方法，其中包括以下步驟將根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的抗原抗體復(fù)合物重懸于生理鹽水中。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的抗原抗體復(fù)合物在制備預(yù)防和/或治療禽流感的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于治療和/或預(yù)防禽流感的抗原抗體復(fù)合物，該抗原抗體復(fù)合物包含作為抗原的滅活禽流感全病毒及其抗體，且抗原與抗體的質(zhì)量濃度比大于1。該抗原抗體復(fù)合物進(jìn)入機(jī)體進(jìn)行初次免疫后再次刺激機(jī)體引起免疫反應(yīng)，免疫應(yīng)答速度快，反應(yīng)強(qiáng)；抗原抗體復(fù)合物作為載體，更有利于抗原提呈細(xì)胞的捕獲與提呈，還能夠有效地增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖反應(yīng)；純化的全病毒作為抗原增加了復(fù)合物的分子量，更有利于機(jī)體免疫細(xì)胞對(duì)抗原的攝取，快速引起更廣泛的免疫反應(yīng)，對(duì)于預(yù)防抗原容易發(fā)生變異的禽流感病毒更具有意義。該抗原抗體復(fù)合物的制劑無(wú)需使用固體載體，不會(huì)對(duì)機(jī)體造成強(qiáng)烈刺激或者引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生不良反應(yīng)，制作簡(jiǎn)單，使用安全方便。
文檔編號(hào)A61K39/145GK101732716SQ20081022602
公開(kāi)日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2008年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月4日
發(fā)明者何宏軒, 吳艷云, 孫瑞芹, 王承民, 王新衛(wèi) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所