專利名稱：一種檢測(cè)禽流感病毒抗原的裝置及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及禽流感病毒抗原快速檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是基于抗原抗體反應(yīng) 檢測(cè)禽流感病毒抗原的電化學(xué)傳感器及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
禽流感病毒(Avian Influenza virus, AIV)是源于禽類，能在極短的時(shí)間 內(nèi)造成大量禽畜死亡，并可致人類死亡的烈性傳染病毒。近幾年來(lái)，很多國(guó)家 和地區(qū)相繼爆發(fā)了高致病性禽流感，不但給相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也 嚴(yán)重威脅到人類健康與安全。禽流感快速檢測(cè)是疫病診斷，早期監(jiān)控，防止疫情擴(kuò)散，保證食品安全的 最關(guān)鍵措施之一。目前，禽流感病毒檢測(cè)主要有以下方法瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)，免疫熒 光技術(shù)(IFTr)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),酶免疫測(cè)定(EIA)技術(shù)，PCR及RT-PCR 技術(shù)，核酸探針技術(shù)，RT-PCR-ELISA技術(shù)，熒光RT-PCR技術(shù)。瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法取材方便，操作簡(jiǎn)單，但檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，敏感度低； 免疫熒光技術(shù)和ELISA都需要特殊的儀器設(shè)備，檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜、費(fèi)用高、檢測(cè)時(shí) 間長(zhǎng)，并且易出現(xiàn)假陽(yáng)性；PCR檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜、時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)操作人員專業(yè)技術(shù)要 求較高、所使用的試劑對(duì)人體和環(huán)境均有較大的危害。因此，建立一種靈敏、快速、特異性高且經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)禽流感病毒抗原的技 術(shù)成為疫情診斷、早期監(jiān)控的迫切需要。在病毒檢測(cè)領(lǐng)域中，免疫傳感器因其快速、簡(jiǎn)便、靈敏受到越來(lái)越廣泛的 應(yīng)用。免疫傳感器是在傳感界面固定抗原或抗體，通過(guò)測(cè)量由抗原、抗體特異 性結(jié)合引起的物理、化學(xué)信號(hào)的變化，對(duì)樣品中抗原或抗體進(jìn)行定性或定量判定?？乖?抗體結(jié)合前后可導(dǎo)致多種信號(hào)的改變，如重量、光學(xué)、熱學(xué)、電化學(xué) 等。電化學(xué)分析具有能現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，不受樣品顏色、濁度的影響，樣品可以不經(jīng) 處理，無(wú)需分離，所用儀器設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，使得電化學(xué)免疫傳感檢測(cè)成 為一種使用較為廣泛的檢測(cè)方法。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏、快速、特異性高且經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)禽流感病 毒抗原的裝置及檢測(cè)方法。本發(fā)明的裝置是基于抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)禽流感病毒抗原的電化學(xué)檢測(cè)裝 置，具有靈敏、快速、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，并且價(jià)格低，適用于基層或現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè) 禽流感病毒。本發(fā)明的上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種檢測(cè)禽流感病毒抗原的裝置，包括免疫傳感器、電解池和數(shù)據(jù)采集與 處理系統(tǒng)；免疫傳感器包括印刷在絕緣基板上的工作電極、參比電極和輔助電 極所構(gòu)成的電極系統(tǒng)；電解池包括檢測(cè)底液、攪拌器和溫控器；數(shù)據(jù)采集與處 理系統(tǒng)包括電化學(xué)工作站、計(jì)算機(jī)和軟件系統(tǒng)；免疫傳感器通過(guò)導(dǎo)線與電化學(xué) 工作站相連，其特征在于免疫傳感器的工作電極為碳電極，其上涂布有包埋酶 標(biāo)禽流感抗體的感應(yīng)膜。本發(fā)明裝置的免疫傳感器中，電極系統(tǒng)通過(guò)絲網(wǎng)印刷方法印在絕緣基板上， 輔助電極為石墨電極，參比電極為Ag/AgCl電極，工作電極以碳電極為支持電 極，其上修飾有包埋酶標(biāo)禽流感抗體的感應(yīng)膜。工作電極可以是多個(gè)，能同時(shí)
檢測(cè)多份樣品。酶標(biāo)禽流感抗體可以是辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氧酶、葡萄 糖氧化酶、青霉素酰化酶或尿素水解酶標(biāo)記的H5N1型禽流感抗體或其它禽流感抗體；包埋酶標(biāo)禽流感抗體的膜材料可以是殼聚糖、醋酸纖維素、PVB、 Nafion、 明膠或瓊脂糖的一種或它們的混合物。本發(fā)明還包括一種檢測(cè)禽流感病毒抗原的方法，包括以下步驟1) 待測(cè)樣本滴于本發(fā)明裝置的免疫傳感器工作電極表面，2(TC孵育10分 鐘；2) 免疫傳感器置于電解池中，電解池的檢測(cè)底液為含有0.4 mmol/LH202 的1 mmol/L硫堇(Thionine，俗稱勞氏紫)醋酸鹽緩沖液，PH值為6.5;3) 設(shè)定適宜的掃描參數(shù)，對(duì)工作電極施加電壓，檢測(cè)輔助電極與工作電 極間的電流值；4) 測(cè)定獲得的電流信息輸入數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)；5) 信息處理結(jié)果輸出。檢測(cè)樣本可以是死禽樣本或活禽樣本。死禽樣本一般采集腸內(nèi)容物或泄殖 腔拭子、鼻拭子、咽喉拭子以及內(nèi)臟組織(氣管、肺、氣囊、腸、脾臟、腎、 腦、肝臟和心臟等)；活禽樣本可采集氣管拭子、泄殖腔拭子。由于采集棉拭子 時(shí)幼禽容易受傷，所以還可取糞便。對(duì)于泄殖腔拭子和糞便，用過(guò)濾器過(guò)濾除菌，上清液作為樣本。內(nèi)臟樣本 應(yīng)無(wú)菌取樣。
本發(fā)明中檢測(cè)方法原理在電化學(xué)反應(yīng)體系中，酶催化底物H202生成相應(yīng) 的酶促反應(yīng)物H20，酶由還原態(tài)變?yōu)檠趸瘧B(tài)；此時(shí)氧化態(tài)的酶催化電子媒介體 硫堇由還原態(tài)變?yōu)檠趸瘧B(tài)，而酶自身則由氧化態(tài)變?yōu)檫€原態(tài)；氧化態(tài)的電子媒 介體在電極表面得到電子后又變?yōu)檫€原態(tài)，同時(shí)產(chǎn)生響應(yīng)電流。采用常用的循環(huán)伏安法(Cyclic voltammetry， CV)作為免疫傳感器表征和定 性判定的方法。當(dāng)被檢測(cè)物中含有禽流感病毒抗原時(shí)，抗原與包埋在工作電極 上的酶標(biāo)禽流感病毒抗體發(fā)生反應(yīng)，生成抗原抗體復(fù)合物；當(dāng)免疫傳感器放置 于電解池中時(shí)，抗原抗體復(fù)合物在空間上阻礙了硫堇向酶的活性中心靠近，導(dǎo) 致酶的催化能力下降，使響應(yīng)曲線中還原峰電流較免疫反應(yīng)前顯著降低。根據(jù) 響應(yīng)曲線峰值的變化即可判斷待測(cè)物是否含有禽流感病毒抗原。本發(fā)明中檢測(cè)禽流感病毒抗原的免疫傳感器，將免疫技術(shù)與電化學(xué)檢測(cè) 相結(jié)合，是一種電流型的酶免疫傳感器。它將酶的化學(xué)放大功能與免疫傳感器 的特異性相結(jié)合，融合二者的優(yōu)點(diǎn)，使其同時(shí)具備免疫反應(yīng)的特異性和電化學(xué) 分析的靈敏性，能準(zhǔn)確地進(jìn)行低含量物質(zhì)的檢測(cè)。本發(fā)明的檢測(cè)方法是一種新的快速檢測(cè)禽流感病毒的方法，具有靈敏、快 速、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，并且價(jià)格低，適用于基層或現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)禽流感病毒。為進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的特點(diǎn)和效果，以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。


圖1是本發(fā)明裝置的免疫傳感器一種實(shí)施方式的正面示意圖；圖2是本發(fā)明裝置的免疫傳感器在不同溶液中的電流響應(yīng)曲線；其中，1——橡膠樹(shù)脂板；2——工作電極；3——一輔助電極；4--一參比電極
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l:本發(fā)明檢測(cè)禽流感病毒抗原的裝置，由免疫傳感器、電解池和數(shù) 據(jù)采集與處理系統(tǒng)組成。免疫傳感器包括工作電極2、參比電極4和輔助電極3，各電極采用絲網(wǎng)印 刷方法印在橡膠樹(shù)脂板1上，輔助電極3為石墨電極，參比電極4為Ag/AgCl 電極，工作電極2以碳電極為支持電極，其上涂布有包埋標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶 的抗H5N1型禽流感病毒抗體(HRP-anti-AIV)的殼聚糖感應(yīng)膜。電解池包括檢測(cè)底液、攪拌器和溫控器，檢測(cè)底液為含有0.4 mmol/LH202 的1 mmol/L硫堇醋酸鹽緩沖液，PH值為6,5。數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)包括電化學(xué)工作站、計(jì)算機(jī)和軟件系統(tǒng)。免疫傳感器通過(guò)導(dǎo)線與電化學(xué)工作站相連，電化學(xué)工作站將電流信號(hào)傳送 至計(jì)算機(jī)。免疫傳感器的制備1) 采用絲網(wǎng)印刷在橡膠樹(shù)脂板1上印刷出如圖1所示的參比電極4、輔 助電極3和工作電極2的支持電極。輔助電極為石墨電極，參比電極為Ag/AgCl 電極，工作電極的支持電極為碳電極。工作電極為4個(gè)，兩邊對(duì)稱排列；2) 將1%殼聚糖凝膠與標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶的抗H5N1型禽流感病毒抗體溶液等體積充分混合；混合液4 'C放置12小時(shí)；取3pL混合液滴涂于工作 電極2表面，并于室溫下放置5 6小時(shí)，使之干燥成膜；3) 將干燥后的傳感器浸泡于4 'C下的PBS溶液，用二次蒸餾水沖洗傳感器表面，除去物理吸附的多余抗體;制得的傳感器于PBS溶液(O.Ol mol/LpH 7.4)中在4。C下保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2:檢測(cè)禽流感病毒抗原的方法1) 樣本采集和處理無(wú)菌條件下取死禽肝臟，放入滅菌的玻璃研磨器，用PBS配成100 g/L的懸液，加入1/10體積的抗生素，將處理過(guò)的樣本移至離心管內(nèi)，3 000r/min離 心10分鐘，取上清液作為樣本。檢測(cè)前將樣品用0.3 0.5%福爾馬林滅活。采集或處理的樣本在2"C 8i:條件下保存應(yīng)不超過(guò)24 h;如果需長(zhǎng)期保 存，需放置-7(TC條件，但應(yīng)避免反復(fù)凍融(最多凍融3次)。2) 將實(shí)施例1中所述的免疫傳感器放入電解池，電解池的檢測(cè)底液為含有 0.4mmol/LH202的1 mmol/L硫堇醋酸鹽緩沖液，PH值為6.5。3) 設(shè)定掃描速率為O.l V/s，對(duì)工作電極施加電壓，測(cè)得輔助電極與工作電 極間的電流值Ipl。4) 將待測(cè)樣本滴于本發(fā)明免疫傳感器的工作電極2表面，2(TC下孵育 10分鐘，使樣本中的抗原與免疫傳感器工作電極2表面的抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。5) 將免疫傳感器放入電解池，電解池的檢測(cè)底液為含有0.4 mmol/L H202 的1 mmol/L硫堇醋酸鹽緩沖液，PH值為6.5。6) 設(shè)定掃描速率為0.1 V/s，對(duì)工作電極施加電壓，檢測(cè)輔助電極和工作電 極間的電流值Ip2。6) 將上述測(cè)定獲得的電流信息輸入數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)；采用常用 的循環(huán)伏安法作為免疫傳感器表征和定性判定的方法。7) 處理信息結(jié)果輸出。為了更好的說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果，樣品檢測(cè)前，先將同一免疫傳感器分別于0.1 mol/L pH 6.5醋酸緩沖溶液，1.0 mmol/L硫堇+ 0.1 mol/L pH 6.5醋酸緩沖溶液，0.4 mmol/L H202 + 1.0 mmol/L硫堇+ 0.1 mol/L pH 6.5醋酸緩沖溶液中檢測(cè)響應(yīng) 電流，以比較免疫傳感器在不同溶液中產(chǎn)生的響應(yīng)電流變化。如圖2所示，為本發(fā)明裝置的免疫傳感器在不同溶液中的電流響應(yīng)曲線圖。其中曲線a為免疫傳感器在0.1 mol/L pH 6.5醋酸緩沖溶液中的電流響應(yīng)曲 線；可以看出免疫傳感器無(wú)明顯的電流響應(yīng)，只顯示出一個(gè)較小的背景電流；曲線b為免疫傳感器在1.0 mmol/L硫堇+ 0.1 mol/L pH 6.5醋酸緩沖溶液中 的電流響應(yīng)曲線；免疫傳感器出現(xiàn)一對(duì)穩(wěn)定的硫堇氧化還原峰。曲線c為免疫傳感器在0.4 mmol/L H202 + 1.0 mmol/L硫堇+ 0.1 mol/L pH 6.5醋酸緩沖溶液中的電流響應(yīng)曲線；當(dāng)醋酸硫堇溶液中加入底物^02后，免 疫傳感器還原峰電流顯著增大，氧化峰電流明顯減小，且還原峰電位略微負(fù)移。曲線d為免疫傳感器與檢測(cè)樣本反應(yīng)后在0.4 mmol/L H202 + 1.0 mmol/L硫 堇+ 0.1 mol/L pH 6.5醋酸緩沖溶液中的電流響應(yīng)曲線。涂布有包埋HRP-anti-AIV的殼聚糖膜的工作電極與含有AIV抗原的樣本溶 液溫育后，電流響應(yīng)曲線中還原峰電流顯著降低，表明溶液中的AIV抗原與固 定在工作電極表面的HRP-anti-AIV發(fā)生特異性的抗原抗體免疫反應(yīng)，生成的 AIV免疫復(fù)合物在空間上阻礙了硫堇向辣根過(guò)氧化物酶的活性中心靠近，導(dǎo)致 辣根過(guò)氧化物酶的催化能力下降，從而使得響應(yīng)曲線中還原峰電流顯著降低。以K-(Ipl-Ip2)/Iplxl00。/。(既免疫反應(yīng)前后催化電流的降低率)作為判 斷樣品中是否含有AIV抗原的依據(jù)。當(dāng)K》25。/。時(shí)為陽(yáng)性，表示被測(cè)樣本中含 有AIV抗原；當(dāng)K〈25。/。時(shí)為陰性，表示被測(cè)樣本中不含AIV抗原。本實(shí)施例中，K=(0.6609uA—0.3264 uA)/0.6609uAxl00°/。 =50.62o/o， >25%， 表明被測(cè)樣本中含有AIV抗原。 當(dāng)認(rèn)識(shí)到，以上的實(shí)施例僅是用來(lái) 說(shuō)明本發(fā)明，而并非作為對(duì)本發(fā)明的限定，只要在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)，對(duì)以 上所述實(shí)施例的變化、變型都將落在本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)禽流感病毒抗原的裝置，包括免疫傳感器、電解池和數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)；免疫傳感器包括印刷在絕緣基板上的工作電極、參比電極和輔助電極所構(gòu)成的電極系統(tǒng)；電解池包括檢測(cè)底液、攪拌器和溫控器；數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)包括電化學(xué)工作站、計(jì)算機(jī)和軟件系統(tǒng)；免疫傳感器通過(guò)導(dǎo)線與電化學(xué)工作站相連，其特征在于免疫傳感器的工作電極為碳電極，其上涂布有包埋酶標(biāo)禽流感抗體的感應(yīng)膜。
2. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)禽流感病毒抗原的裝置，其特征在于所述的禽流 感抗體為H5N1型禽流感抗體。
3. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)禽流感病毒抗原的裝置，其特征在于所述的酶標(biāo) 禽流感抗體為辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氧酶、葡萄糖氧化酶、青 霉素?；富蚰蛩厮饷笜?biāo)記的禽流感抗體。
4. 如權(quán)利要求l所述的檢測(cè)禽流感病毒抗原的裝置，其特征在于所述的包埋 酶標(biāo)禽流感抗體的膜材料為殼聚糖、醋酸纖維素、PVB、 Nafion、明膠或瓊脂糖。
5. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)禽流感病毒抗原的裝置，其特征在于所述的工作 電極為4 10個(gè)。
6. —種檢測(cè)禽流感病毒抗原的方法，包括以下步驟1) 待測(cè)樣本滴于如權(quán)利要求1所述免疫傳感器的工作電極表面，2(TC孵育10分鐘；2) 免疫傳感器置于電解池中，電解池的檢測(cè)底液為含有0.4 mmol/LH202 的1 mmol/L硫堇醋酸鹽緩沖液，PH值為6.5;3) 設(shè)定適宜的掃描參數(shù)，對(duì)工作電極施加電壓，檢測(cè)輔助電極與工作電 極間的電流值；4) 測(cè)定獲得的電流信息輸入數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)；5) 信息處理結(jié)果輸出。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)禽流感病毒抗原的方法，其特征在于數(shù)據(jù)采集與 處理系統(tǒng)采用循環(huán)伏安法作為免疫電極表征和定性判定的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種靈敏、快速、特異性高且經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)禽流感病毒抗原的裝置。本發(fā)明裝置包括免疫傳感器、電解池和數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)；免疫傳感器包括印刷在絕緣基板上的工作電極、參比電極和輔助電極所構(gòu)成的電極系統(tǒng)；電解池包括檢測(cè)底液、攪拌器和溫控器；數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)包括電化學(xué)工作站、計(jì)算機(jī)和軟件系統(tǒng)；免疫傳感器通過(guò)導(dǎo)線與電化學(xué)工作站相連；免疫傳感器的工作電極為碳電極，其上涂布有包埋酶標(biāo)禽流感抗體的感應(yīng)膜。本發(fā)明還公開(kāi)了一種使用該裝置檢測(cè)禽流感病毒抗原的方法。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101149384SQ20071007154
公開(kāi)日2008年3月26日 申請(qǐng)日期2007年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月30日
發(fā)明者吳淑春, 趙廣英 申請(qǐng)人:浙江工商大學(xué)