專利名稱：慢性排斥反應抑制劑的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及含有IL-6抑制劑作為有效成分的慢性排斥反應的抑制 劑及其應用。還涉及抑制慢性排斥反應的方法，該方法包含將IL-6抑制 劑給予對象的步驟。
背景技術(shù)：
IL-6是被稱為B細胞刺激因子2 (BSF2)或干擾素卩2的細胞因子。 IL-6作為與參與B淋巴細胞系細胞的活化的分化因子被發(fā)現(xiàn)(非專利文 獻1)，之后了解到它是對各種細胞功能產(chǎn)具有影響的多功能細胞因子(非 專利文獻2)。有報道稱IL-6誘導T淋巴細胞系細胞的成熟(非專利文獻3)。IL-6在細胞上經(jīng)由兩種蛋白傳遞其生物學活性。 一種是IL-6所結(jié)合 的分子量約80 kD的配體結(jié)合性蛋白質(zhì)一IL-6受體(非專利文獻4、 5)。 IL-6受體除跨細胞膜、在細胞膜上表達的膜結(jié)合型之外，還以主要含有 由其胞外區(qū)的可溶性IL-6受體的形式存在。另一種是與非配體結(jié)合性的信號傳遞相關(guān)的分子量約130 kD的膜 蛋白gpl30。 IL-6和IL-6受體形成IL-6/IL-6受體復合物，接著與gpl30 結(jié)合，由此，IL-6的生物學活性在細胞內(nèi)傳遞(非專利文獻6)。IL-6抑制劑是抑制IL-6的生物學活性傳遞的物質(zhì)。目前已知有IL-6 的抗體(抗il-6抗體)、IL-6受體的抗體(抗IL-6受體抗體)、gpl30的抗 體(抗gpl30抗體)、IL-6變異體、IL-6或IL-6受體部分肽等。關(guān)于抗IL-6受體抗體已經(jīng)有幾種報道(非專利文獻7、 8、專利文獻 1-3),已知其中之一是將小鼠抗體PM-1 (非專利文獻9)的互補決定區(qū) (CDR; complementarity determining region)移才直到人抗體中得到的人源 化PM-1抗體(專利文獻4)。由于各種免疫抑制劑的臨床應用和多劑聯(lián)合療法的發(fā)展，器官移植 后急性排斥反應的治療方針目前基本確立，各種器官移植后的一年存活 率得到顯著改善。但是，移植一年以后出現(xiàn)的慢性排斥反應即使在通過持續(xù)免疫抑制療法的病 例中也可見發(fā)病，有效的預防方法和治療方法尚未確立。并且，其病態(tài) 機理的全部情況尚未清楚，與急性排斥反應相比較難診斷等，因此，作 為左右受體長期預后的并發(fā)癥而為人廣泛已知(非專利文獻10、 11)。慢性排斥反應中特征性的病理組織現(xiàn)象是移植器官間質(zhì)的纖維化 和管腔組織內(nèi)膜肥厚導致的內(nèi)腔狹窄。特別是血管狹窄是重要的病理現(xiàn) 象，表現(xiàn)為移植后血管病變或移植后動脈硬化。該病態(tài)的進展中，細胞 性免疫和體液免疫兩種導致的排斥反應的遷延、器官的缺血再灌流損 傷、血管內(nèi)皮功能損傷、受體中的常規(guī)動脈硬化危險因子(糖尿病、高血 脂、高血壓等)、免疫抑制劑的副作用、遺傳性因素、移植后巨細胞病毒 感染癥等多種因素產(chǎn)生復雜的影響(非專利文獻12、 13)。以往的藥物中，特別是環(huán)孢菌素或他克莫司等神經(jīng)鉤蛋白抑制藥對 慢性排斥反應無效，高血壓、高血脂、糖尿病等副作用出現(xiàn)問題，特別 是兒童受體中，移植后必須進行長時間的免疫抑制療法，因此，人們期 待副作用少、對慢性排斥反應有效的藥物的開發(fā)(非專利文獻13、 14)。如上所述，抑制慢性排斥反應的新型免疫抑制療法開發(fā)的必要性成 為本研究的重要背景。本申請的發(fā)明相關(guān)的先行技術(shù)文獻信息如下。 專利文獻1:國際專利申請7>開號WO95-09873 專利文獻2:法國專利申請公開號FR2694767 專利文獻3:美國專利編號US 5216128 專利文獻4:國際專利申請公開號WO 92-19759 非專利文獻1: Hirano, T.等人.，Nature (1986) 324, 73-76 非專利文獻2: Akira, S.等人.,Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78 非專利文獻3: Lotz, M.等人.，J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258 非專利文獻4: Taga, T,等人.，J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981 非專利文獻5: Yamasaki, K.等人.,Science (1988) 241, 825-828 非專利文獻6: Taga, T.等人.，Cell (1989) 58, 573-581 非專利文獻7: Novick, D.等人.，Hybridoma(1991) 10, 137-146 非專利文獻8: Huang, Y. W.等人.，Hybridoma (1993) 12, 621-630 非專利文獻9: Hirata, Y.等人.，J. Immunol, (1989) 143, 2900-2906 非專利文獻10: Wong, B. W.等人.，Cardiovasc. Pathol. (2005) 14,176-80非專利文獻ll: Hornick, P.等人.，Methods Mol. Biol. (2006) 333, 131-44非專利文獻12: Ramzy, D.等人.，Can. J. Surg. (2005) 48, 319-327 非專利文獻13: Valantine, H., J. Heart Lung Transplant (2004) 23(5 Suppl), SI87-93非專利文獻14: Webber, S. A.等人.，Lancet (2006) 368, 53-69 非專利文獻15: Izawa, A.,等人.,Circ. J. (2007) 71(Suppl I), 392(Annual Scientific Meeting of the Japanese Circulation Society, Kobe, Mar15-Mar 17, 2007; Abstract PE-269)非專利文獻16: Izawa， A.,等人.,Am. J. Transplant. (2007) 7(Suppl11), 426 (American Transplant Congress, San Francisco, CA, Mar 5-Mar 9，2007; Abstract 1084)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對上述狀況而設，其目的在于提供含有IL-6抑制劑作為有 效成分的慢性排斥反應的抑制劑。本發(fā)明的又一課題在于提供抑制慢性排斥反應的方法，該方法包含 將IL-6抑制劑給予對象的步驟。本發(fā)明人為解決上述課題，對于抗IL-6受體抗體抑制慢性排斥反應 的效果進行了研究。發(fā)明人使用小鼠心臟移植慢性排斥模型，對于給予抗小鼠IL-6受體 抗體(MR 16-1)帶來的抑制慢性排斥反應的效果進行了研究。對于移植后 60天摘除的移植心臟進行病理組織學分析，結(jié)果，在MR16-1治療組中，慢性排斥反應特征性病態(tài)--^肌的纖維化和血管狹窄病變與對照組相比得到顯著抑制，由此確認給予MR16-1帶來的抑制慢性排斥反應的 效果。即，本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)通過給予抗IL-6受體抗體，可抑制器官移 植后慢性期的排斥反應，由此完成了本發(fā)明。 更具體地說，本發(fā)明提供以下的[1]-[23]。[1]慢性排斥反應的抑制劑，該抑制劑含有IL-6抑制劑作為有效成6[2] [l]所述的慢性排斥反應的抑制劑，其特征在于IL-6抑制劑是 識別IL-6的抗體。 [l]所述的慢性排斥反應的抑制劑，其特征在于IL-6抑制劑是 識別IL-6受體的抗體。 [2]或[3]所述的慢性排斥反應的抑制劑，其中，抗體是單克隆抗體。 [2]或[3]所述的慢性排斥反應的抑制劑，其中，抗體是識別人IL-6 或人IL-6受體的抗體。 [2]或[3]所述的慢性排斥反應的抑制劑，其中，抗體是重組型抗體。 [2]-[6]中任一項所述的慢性排斥反應的抑制劑，其特征在于抗 體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。 [1]-[7]中任一項所述的慢性排斥反應的抑制劑，其中，該抑制劑 用于抑制心臟移植中的慢性排斥反應。抑制慢性排斥反應的方法，該方法包含將IL-6抑制劑給予對象 的步驟。 [9]所述的方法，其特征在于IL-6抑制劑是識別IL-6的抗體。 [11] [9]所述的方法，其特征在于IL-6抑制劑是識別IL-6受體的抗體。 [10]或[11]所述的抑制慢性排斥反應的方法，其中，抗體是單克 隆抗體。 [10]或[11]所述的方法，其中，抗體是識別人IL-6或人IL-6受
體的抗體。 [10]或[11]所述的方法，其中，抗體是重組型抗體。 [10]-[14]中任一項所述的方法，其特征在于抗體是嵌合抗體、
人源化抗體或人抗體。 [9]-[15]中任一項所述的方法，其特征在于其中，該方法是抑
制心臟移植中的慢性排斥反應。 IL-6抑制劑在制備慢性排斥反應抑制劑中的應用。 [17]所述的應用，其特征在于IL-6抑制劑是識別IL-6的抗體。 [17]所述的應用，其特征在于IL-6抑制劑是識別IL-6受體的抗體。[20] [18]或[19]所述的應用，其中，抗體是單克隆抗體。 [18]或[19]所述的應用，其中，抗體是識別人IL-6或人IL-6受
體的抗體。 [18]或[19]所述的應用，其中，抗體是重組型抗體。 [23] [18]-[22]中任一項所述的應用，其特征在于抗體是嵌合抗體、 人源化抗體或人抗體。: IL-6抑制劑，該抑制劑用于抑制慢性排斥反應。
具體實施例方式
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過給予抗IL-6受體抗體，可以抑制慢性排斥反應。 本發(fā)明才艮據(jù)該認識完成。
本發(fā)明涉及慢性排斥反應的抑制劑，該抑制劑含有IL-6抑制劑作為 有效成分。
本發(fā)明中，"IL-6抑制劑"是阻斷IL-6的信號傳遞、抑制IL-6的生物 學活性的物質(zhì)。IL-6抑制劑優(yōu)選為對于IL-6、 IL-6受體和gpl30之間的 結(jié)合具有抑制作用的物質(zhì)。
本發(fā)明的IL-6抑制劑例如有抗IL-6抗體、抗IL-6受體抗體、抗 gpl30抗體、IL-6變異體、可溶性IL-6受體變異體或者IL-6或IL-6受體 的部分肽、以及與它們顯示同樣的活性的蛋白質(zhì)(例如C326 Avimer (Nature Biotechnology (200》2人1556-61))或低分子物質(zhì)等，沒有特別限 定。本發(fā)明的IL-6抑制劑優(yōu)選例舉識別IL-6受體的抗體。
本發(fā)明的抗體的來源沒有特別限定，優(yōu)選來自哺乳動物，更優(yōu)選來 自人的抗體。
本發(fā)明中使用的抗IL-6抗體可以采用公知的方法制成多克隆或單 克隆抗體獲得。本發(fā)明使用的抗IL-6抗體特別優(yōu)選來自哺乳動物的單克 隆抗體。來自哺乳動物的單克隆抗體有在雜交瘤生成的單克隆抗體， 以及在通過基因工程方法、用含有抗體基因的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主中生 成的單克隆抗體。該抗體通過與IL-6結(jié)合，可抑制IL-6與IL-6受體的 結(jié)合，阻斷IL-6的生物學活性向細胞內(nèi)的傳遞。
上述抗體有MH166 (Matsuda, T.等人.，Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956)、或SK2抗體(Sato, K.等人.,第21回日本免疫學會總會，學術(shù) 記錄(1991) 21, 166)等。生成抗IL-6抗體的雜交瘤基本上可采用公知技術(shù)，如下制備。即， 使用IL-6作為致敏抗原，將其按照常規(guī)的免疫方法進行免疫，將所得免 疫細胞通過通常的細胞融合法與公知的母細胞融合，通過通常的篩選法 篩選單克隆的抗體生成細胞。
具體來說，制備抗IL-6抗體的方法可如下進行。例如，作為獲得抗 體的致壽丈抗原使用的人IL-6可通過^f吏用Eur. J. Biochem. (1987) 168， 543-550、 J. Immunol. (1988) 140, 1534-1541或Agr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685-2688中公開的IL-6基因/氨基酸序列來獲得。
將IL-6的基因序列插入到公知的表達載體系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗?細胞，然后通過^^知的方法，從該宿主細胞中或培養(yǎng)上清中純化目標IL-6 蛋白，可以使用該純化IL-6蛋白作為致敏抗原。還可以使用IL-6蛋白 與其它蛋白質(zhì)的融合蛋白作為致敏抗原。
本發(fā)明中使用的抗IL-6受體抗體可使用公知的方法制成多克隆或 單克隆抗體獲得。本發(fā)明使用的抗IL-6受體抗體特別優(yōu)選來自哺乳動物 的單克隆抗體。來自哺乳動物的單克隆抗體可以是雜交瘤生成的單克隆 抗體，以及在通過基因工程的方法、用含有抗體基因的表達載體轉(zhuǎn)化的 宿主中生成的單克隆抗體。該抗體與IL-6受體結(jié)合，由此可以抑制IL-6 與IL-6受體的結(jié)合，阻斷IL-6的生物學活性向細胞內(nèi)的傳遞。
上述抗體有MR16-1抗體(Tamura, T.等人.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928)、 PM曙l抗體(Hirata, Y.等人.，J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906)、 AUK12-20抗體、AUK64-7抗體或AUK146-15 抗體(國際專利申請公開號W092_19759號)等。其中，人IL"受體的優(yōu) 選的單克隆抗體可例舉PM-1抗體，而小鼠IL-6受體的優(yōu)選的單克隆抗 體則有MR16-1抗體。
生成抗IL-6受體單克隆抗體的雜交瘤基本上可釆用公知技術(shù)如下 制備。即，使用IL-6受體作為致敏抗原，按照通常的免疫方法用其免疫， 將所得免疫細胞按照通常的細胞融合方法與公知的母細胞融合，按照通 常的篩選方法篩選單克隆的抗體生成細胞。
具體來說，制備抗IL-6受體抗體可如下進行。例如，作為獲得抗體 的致敏抗原使用的人IL-6受體可使用歐洲專利申請公開號EP 325474、 小鼠IL-6受體可使用日本專利申請公開號日本特開平3-155795中公開 的IL-6受體基因/氨基酸序列獲得。IL-6受體蛋白有在細胞膜上表達的、和從細胞膜上脫離的(可溶性 IL-6受體)(Yasukawa, K.等人.,J. Biochem. (1990) 108, 673-676)兩種。可 溶性IL-6受體由與細胞膜結(jié)合的IL-6受體的實質(zhì)性的胞外區(qū)構(gòu)成，跨 細胞膜區(qū)或者跨細胞膜區(qū)域和胞內(nèi)區(qū)缺損，這一點與膜結(jié)合型IL-6受體 不同。IL-6受體蛋白只要是可作為制備本發(fā)明中使用的抗IL-6受體抗體 的致敏抗原使用即可，可使用任何IL-6受體。
將IL-6受體的基因序列插入到公知的表達載體中，轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗?細胞，然后按照公知的方法，從該宿主細胞中或培養(yǎng)上清中純化目標IL-6 受體蛋白，可使用該純化IL-6受體蛋白作為致敏抗原。還可以使用表達 IL-6受體的細胞或IL-6受體蛋白與其它蛋白的融合蛋白作為致敏抗原。
本發(fā)明中使用的抗gpl30抗體可使用公知的方法制成多克隆或單克 隆抗體獲得。本發(fā)明使用的抗gpl30抗體特別優(yōu)選來自哺乳動物的單克 隆抗體。來自哺乳動物的單克隆抗體可以是雜交瘤生成的單克隆抗體， 以及在通過基因工程的方法、用含有抗體基因的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主中 生成的單克隆抗體。該抗體與gpl30結(jié)合，由此可以抑制IL-6/IL-6受體 復合體與gpl30的結(jié)合，阻斷IL-6的生物學活性向細胞內(nèi)的傳遞。
上述抗體有AM64抗體(日本特開平3-219894)、 4B11抗體和2H4 抗體(US5571513)、 B-S12抗體以及B-P8抗體(日本特開平8-291199)等。
生成抗gpl30單克隆抗體的雜交瘤基本上可采用公知技術(shù)如下制 備。即，使用gpl30作為致敏抗原，按照通常的免疫方法用其免疫，將 所得免疫細胞按照通常的細胞融合方法與公知的母細胞融合，按照通常 的篩選方法篩選生成單克隆抗體的細胞。
具體來說，制備單克隆抗體可如下進行。例如，作為獲得抗體的致 敏抗原使用的gpl30可使用歐洲專利申請公開號EP 411946中爿>開的 gp 13 0基因/氨基酸序列獲得。
將gp 130的基因序列插入到公知的表達載體系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)化適當?shù)乃?主細胞，然后按照公知的方法，從該宿主細胞中或培養(yǎng)上清中純化目標 gpl30蛋白，可使用該純化gpl30蛋白作為致每丈抗原。還可以使用表達 gpl30的細胞或gpl30蛋白與其它蛋白的融合蛋白作為致敏抗原。
用致敏抗原免疫的哺乳動物沒有特別限定，優(yōu)選考慮與細胞融合時 所使用的母細胞的相容性進行選擇，通常使用嚙齒類動物，例如小鼠、 大鼠、倉鼠等。將致敏抗原免疫動物時可按照公知的方法進行，例如通常的方法是 將致敏抗原注射到哺乳動物的腹腔內(nèi)或皮下進行。具體來說，將致敏抗
原用PBS(磷酸緩沖鹽)或生理鹽水等稀釋成適當量，并使其懸浮，將其
根據(jù)需要與通常的佐劑、例如弗氏完全佐劑適當混合，乳化，然后每隔
4-21天分數(shù)次給予哺乳動物。致敏抗原免疫時可使用適當?shù)妮d體。
進行上述免疫，確認血清中所需抗體水平升高，然后由哺乳動物中 取得免疫細胞，進行細胞融合。細胞融合所優(yōu)選的免疫細胞特別可列舉 出脾細胞。
作為與上述免疫細胞融合的另一種母細胞是哺乳動物的骨髓瘤細 胞，可以使用已公知的各種細胞抹，例如P3X63Ag8.653 (Kearney， J. F. 等人.，J. Immunol (1979) 123, 1548-1550)、 P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7)、 NS-1 (Kohler, G.和 Milstein, C,, Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519)、 MPC國ll (Margulies, D. H.等人.,Cell (1976) 8, 405-415)、 SP2/0 (Shulman, M.等人.,Nature (1978) 276, 269-270)、 FO (de St. Groth, S. F.等人.,J. Immunol. Methods (1980) 35: 1-21)、 S194 (Trowbridge, I. S., J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323)、 R210 (Galfre, G.等人.，Nature (1979) 277, 131陽133)等。
上述免疫細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合基本上可按照公知方法、例 如Milstein等人(Kohler, G.和Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46)的方法等進行。
更具體地說，上述細胞融合例如可在細胞融合促進劑的存在下，在 通常的營養(yǎng)培養(yǎng)液中實施。融合促進劑例如可使用聚乙二醇(PEG)、仙 臺病毒(HVJ)等，還可以根據(jù)需要，為了提高融合效率而進一步添加二 曱基亞砜等輔助劑使用。
免疫細胞與骨髓瘤細胞的使用比例例如優(yōu)選相對于骨髓瘤細胞，使 免疫細胞為1-10倍。上述細胞融合中使用的培養(yǎng)液例如可使用上述骨髓 瘤細胞抹增殖所優(yōu)選的RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液、其它該種細 胞培養(yǎng)中使用的通常的培養(yǎng)液，并且可以結(jié)合使用胎牛血清(FCS)等的 血清補充液。
細胞融合是將上述免疫細胞與骨髓瘤細胞的規(guī)定量在上述培養(yǎng)液 中充分混合，以通常30-60% (w/v)的濃度添加預先加溫至37。C左右的 PEG溶液、例如平均分子量為1000-6000左右的PEG溶液，混合，由此
ii形成目標融合細胞(雜交瘤)。接著，依次反復進行添加適當?shù)呐囵B(yǎng)液、 離心、除去上清的操作，可以除去雜交瘤生長中不優(yōu)選的細胞融合劑等。
該雜交瘤可以通過在常規(guī)的選擇培養(yǎng)液、例如HAT培養(yǎng)液(含有次 黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)液)中培養(yǎng)來選擇。在該HAT培養(yǎng)液中 的培養(yǎng)是持續(xù)培養(yǎng)至目標雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)死亡所足夠的 時間，通常持續(xù)數(shù)天-數(shù)周。接著實施通常的極限稀釋法，進行生成目標 抗體的雜交瘤的篩選和克隆。
對人以外的動物免疫抗原，獲得上述雜交瘤，除此之外可以通過體 外用所需抗原蛋白或抗原表達細胞致敏人淋巴細胞，將致壽丈B淋巴細胞 與人骨髓瘤細胞例如U266融合，獲得與所需抗原或抗原表達細胞具有 結(jié)合活性的所需的人抗體(參照日本特公平1-59878)。并且還可以將抗原 或抗原表達細胞給予具有人抗體基因的所有組成成分的轉(zhuǎn)基因動物，按 照上述方法取得所需的人抗體(參照國際專利申請公開號W093/12227、 WO 92/03918 、 WO 94/02602、 WO 94/25585 、 WO 96/34096、 WO 96/33735)。
上述制備的生成單克隆抗體的雜交瘤可在通常培養(yǎng)液中繼代培養(yǎng)， 也可以在液氮中長期保存。
由該雜交瘤獲得單克隆抗體時可采取以下的方法按照常規(guī)方法培 養(yǎng)該雜交瘤，以其培養(yǎng)上清的形式獲得；或者是將雜交瘤給予與其具有 相容性的哺乳動物，使其增殖，以其腹水的方式獲得等。前者的方法適 合獲得高純度的抗體，而后者的方法適合抗體的大量生產(chǎn)。
例如，生成抗IL-6受體抗體的雜交瘤的制備可按照日本特開平 3-139293中公開的方法進行。可按照以下的方法進行將生成PM-1抗 體的雜交瘤注入到BALB/c小鼠的腹腔內(nèi)，獲得腹水，由該腹水純化該 PM-1抗體地方法；或者將該雜交瘤在適當?shù)呐囵B(yǎng)基、例如含10%胎牛 血清、5%BM-Condimed Hl(Boehringer Mannheim制備)的RPMI1640培 養(yǎng)基、雜交瘤SFM培養(yǎng)基(GIBCO-BRL制備)、PFHM-II培養(yǎng)基 (GIBCO-BRL制備)等中培養(yǎng)，由該培養(yǎng)上清中純化PM-1抗體的方法。
本發(fā)明中，作為單克隆抗體，可以使用從雜交瘤中克隆抗體基因、 摻入到適當?shù)妮d體中、將其導入宿主、采用基因重組技術(shù)生成的重組型 ^t體(i"列嘖口參照、Borrebaeck, C. A. K. and Larrick, J. W., Therapeutic Monoclonal Antibodies, published in the United Kingdom by MacmillanPublishers Ltd, 1990)。
具體來說，/人生成目標抗體的細刃包、例如雜交瘤中分離編碼抗體的 可變(V)區(qū)的mRNA。 mRNA的分離可3姿照7>知的方法、例如胍超離心 法(Chirgwin, J. M.等人.,Biochemistry (1979) 18, 5294-5299)、 AGPC法 (Chomczynski, P.等.，Anal. Biochem. (1987) 162, 156國159)等制備總RNA， 使用mRNA純化試劑盒(Pharmacia制備)等制備mRNA。還可使用 QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia制備)，直接制備mRNA。
使用反轉(zhuǎn)錄酶，由所得mRNA合成抗體V區(qū)的cDNA。 cDNA的合 成可使用AMV反轉(zhuǎn)錄第 一鏈cDNA合成試劑盒等進行。進行cDNA的 合成和擴增時，可以采用5'-Ampli FINDER RACE試劑盒(Clontech制備) 和使用PCR的5'-RACE法(Frohman, M. A.等人.，Proc. Natl, Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A.等人.,Nucleic Acids Res. (1989) 17,2919-2932)。由所得PCR產(chǎn)物純化目標DNA片段，與載體DNA連 接。進一步由此制備重組載體，導入到大腸桿菌中，選擇集落，制備所 需重組載體。可通過公知的方法例如脫氧法確認目標DNA的堿基序列。
如果獲得了編碼目標抗體的V區(qū)的DNA,則可以將其與編碼所需 抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA連接，將其摻入表達載體中。或者將編碼抗體 V區(qū)的DNA摻入到含有抗體C區(qū)的DNA的表達載體中。
制備本發(fā)明中使用的抗體時，如后所述，可以將抗體基因摻入到表 達載體，使其在表達控制區(qū)、例如在增強子、啟動子的控制下進行表達。 接著，通過該表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，使抗體表達。
本發(fā)明中，為了降低人的異種抗原性等，可使用人工變異的基因重 組型抗體，例如嵌合抗體、人源化抗體、人抗體。這些變異抗體可釆用 已知的方法制備。
嵌合抗體如前所述，可以將編碼上述所得抗體V區(qū)的DNA與編碼 人抗體C區(qū)的DNA連接，將其摻入表達載體中，導入宿主，生成(參照 歐洲專利申請公開號EP125023、國際專利申請公開號W092-19759)。 使用該已知方法，可獲得本發(fā)明有用的嵌合抗體。
人源化抗體也稱為重構(gòu)人抗體或人化抗體，是將人以外的哺乳動 物、例如小鼠抗體的互補決定區(qū)(CDR)移植到人抗體的互補決定區(qū)所得， 其常規(guī)的基因重組方法已經(jīng)公知(參照歐洲專利申請公開號EP125023 、 國際專利申請公開號W092-19759)。具體來說，通過PCR法，由制備成末端具有重疊部分的多個寡核
苷酸合成DNA序列，該DNA序列是設計成小鼠抗體的CDR與人抗體 的支架區(qū)(FR)連接。將所得DNA與編碼人抗體C區(qū)的DNA連接，接著， 摻入到表達載體中，將其導入宿主，生成并獲得(參照歐洲專利申請公開 號EP239400、國際專利申請公開號W092-19759)。
抗原結(jié)合部位的FR?？筛鶕?jù)需要置換抗體可變區(qū)的支架區(qū)的氨基酸， 使重構(gòu)人抗體的互補決定區(qū)形成適當?shù)目乖Y(jié)合部位(Sato, K.等人., Cancer Res. (1993) 53, 851-856)。
嵌合抗體、人源化抗體可以使用人抗體C區(qū)。人抗體C區(qū)有Cy， 例如可4吏用Oyl、 Cy2、 Cy3或Oy4。為了改善抗體及其生成的穩(wěn)定性， 還可以對人抗體C區(qū)進4亍改性。
嵌合抗體含有來自人以外的哺乳動物的抗體可變區(qū)和來自人抗體
區(qū)、和來自人抗體的支架區(qū)以及C區(qū)，兩者在人體內(nèi)的抗原性低，因此 可作為本發(fā)明中使用的抗體使用。
本發(fā)明中使用的人源化抗體的優(yōu)選的具體例子有人源化PM-1抗 體(參照國利專利申請公開號WO 92-19759)。
人抗體的取得方法除之前所述的方法之外，還已知有使用人抗體文 庫，通過淘選獲得人抗體的技術(shù)。例如，可將人抗體的可變區(qū)作為單鏈 抗體(scFv),通過噬菌體展示法在噬菌體的表面表達，選擇與抗原結(jié)合 的噬菌體。對所選擇的噬菌體的基因進行分析，則可以確定編碼與抗原 結(jié)合的人抗體可變區(qū)的DNA序列。如果了解了與抗原結(jié)合的scFv的 DNA序列，則可以制備含有該序列的適當?shù)谋磉_載體，獲得人抗體。這 些方法都是已知的，可參考WO 92/01047、 WO 92/20791、 WO 93/06213、 WO 93/11236、 WO 93/19172、 WO 95/01438和WO 95/15388。
如上所述構(gòu)建的抗體基因可通過公知的方法表達。采用哺乳類細胞 時，可以通過常用的有效啟動子、要表達的抗體基因、在其3'下游一側(cè) 功能性結(jié)合polyA信號的DNA或含有該DNA的載體表達。例如，啟動 子/增強子可以是人巨細胞病毒早期啟動子/增強子。
除此之外，可在本發(fā)明中使用、用于抗體表達的啟動子/增強子可使 用反轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40 (SV40)等的病毒啟動子/增強子，或者是人延伸因子la (HEFla)等來自哺乳類細胞的啟動子/ 增強子。
例如使用SV40啟動子/增強子時，可以按照Mulligan等人的方法 (Mulligan, R. C.等人.，Nature (1979) 277, 108-114)，使用HEFla啟動子/ 增強子時，可按照Mizushima等人的方法(Mizushima, S.和Nagata S., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)容易地實施。
采用大腸桿菌時，可以將常用的有效啟動子、用于抗體分泌的信號 序列、要表達的抗體基因功能性結(jié)合，使其表達。例如，啟動子可以是 lacZ啟動子、araB啟動子。使用lacZ啟動子時，可按照Ward等人的方 法(Ward, E. S.等人.,Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E. S.等人., FASEB J. (1992) 6, 2422-2427)進行，使用araB啟動子時，可按照Better 等人的方法(Better, M.等人.，Science (1988) 240, 1041-1043)進行。
在大腸桿菌的周質(zhì)中生成時，抗體分泌的信號序列可使用pe舊信 號序列(Lei, S. P.等人.，J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383)。將周質(zhì)中生 成的抗體進行分離，然后將抗體的結(jié)構(gòu)適當重折疊使用(例如參照 WO96/30394)。
作為復制起源，可以使用來自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭 瘤病毒(BPV)等的病毒，并且，為了在宿主細胞系統(tǒng)中擴增基因拷貝數(shù)， 表達載體可以含有氨基糖普磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、 大腸桿菌次黃噤呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原 酶(dhfr)基因等作為選擇標志。
本發(fā)明中使用的抗體的制備中，可使用任意的生成系統(tǒng)。用于制備 抗體的生產(chǎn)系統(tǒng)有體外和體內(nèi)的生產(chǎn)系統(tǒng)。體外的生產(chǎn)系統(tǒng)有使用真 核細月包的生產(chǎn)系統(tǒng)和4吏用原核細月包的生產(chǎn)系統(tǒng)。
使用真核細胞時，有使用動物細胞、植物細胞或真菌細胞的生產(chǎn)系 統(tǒng)。動物細胞已知有(l)哺乳類細胞例如CHO、 COS、骨髓瘤、BHK(幼 地鼠腎細>9包)、HeLa、 Vero等，(2)兩棲類細^/f列如非洲爪蟾卵母細月包， 或者(3)昆蟲細胞例如sf9、 sf21、 Tn5等。植物細胞已知有來自煙草 (Mco"a陋toZ^cwm)的細胞，可以將其進行愈傷組織培養(yǎng)。真菌細胞已知 有酵母、例》口并唐酵母屬(S"cc/^ramyce力、例々口p卑酒并唐酵母(5Wcc/wn9附y(tǒng)c^y cewW&ae),霉菌、例如曲霉屬(^45perg〃/z^)、例如黑曲霉(^4s/ ergz7/ws m'ge。 等。使用原核細月包時，有使用細菌細月包的生產(chǎn)系統(tǒng)。細菌細胞已知有大
腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌。
將目標抗體基因通過轉(zhuǎn)化導入到這些細胞中，將轉(zhuǎn)化的細胞在體外 培養(yǎng)，可獲得抗體。培養(yǎng)可按照公知的方法進行。例如，培養(yǎng)液可4吏用 DMEM、 MEM、 RPMI1640、 IMDM,也可以結(jié)合使用胎牛血清(FCS)等 的血清補充液。通過將導入了抗體基因的細胞轉(zhuǎn)移至動物的腹腔等，可 在體內(nèi)生成抗體。
另一方面，體內(nèi)生產(chǎn)系統(tǒng)有使用動物的生產(chǎn)系統(tǒng)或使用植物的生產(chǎn) 系統(tǒng)。使用動物時，有使用哺乳類動物、昆蟲的生產(chǎn)系統(tǒng)等。
哺乳類動物可以使用山羊、豬、綿羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。昆蟲可以4吏用蠶。采用 植物時，例如可以使用煙草。
向這些動物或植物中導入抗體基因，在動物或植物的體內(nèi)生成抗 體，回收。例如，將抗體基因插入到編碼山羊P酪蛋白等乳汁中特性生 產(chǎn)的蛋白質(zhì)的基因的中間，制備成融合基因。將含有插入了了抗體基因 的融合基因的DNA片段注入到山羊的胚胎中，將該胚胎導入到雌山羊
可獲得所需抗體^為了增加由轉(zhuǎn)基^山羊生A的含有所需抗體的乳汁 量，可以對轉(zhuǎn)基因山羊使用適當?shù)募に?Ebert, K. M.等人., Bio/Technology (1994) 12, 699-702)。
使用蠶時，將插入了目標抗體基因的桿狀病毒感染蠶，由該蠶的體 液獲得所需抗體(Maeda, S.等人.，Nature (1985) 315, 592-594)。并且，使 用煙草時，將目標抗體基因插入到植物表達用載體例如pMON530中， 將該載體導入到根癌土i襄桿菌(JgTOZ acfenwm ^me/ac/era)等的細菌中。 將該細菌感染煙草例如煙草(Mco"a"a to6acwm),可由該煙草葉片獲得所 需抗體(Julian, K. —C. Ma等人.，Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138)。
如上所述，通過體外或體內(nèi)生產(chǎn)系統(tǒng)生產(chǎn)抗體時，可以將編碼抗體 重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA分別摻入到表達載體中，同時轉(zhuǎn)化宿主， 或者將編碼H鏈和L鏈的DNA摻入到單一的表達載體中，轉(zhuǎn)化宿主(參 照國際專利申請公開號W094-11523)。
本發(fā)明中使用的抗體只要適合本發(fā)明中使用即可，可以是抗體片段 或其改性物?？贵w的片段有Fab、 F(ab')2、 Fv、或?qū)鏈和L鏈的Fv
16用適當?shù)慕宇^連接而成的單鏈Fv(scFv)。
具體來說，將抗體用酶、例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶進行處理，生 成抗體片段，或者構(gòu)建編碼這些抗體片段的基因，將其導入表達載體中， 然后在適當?shù)乃拗骷毎斜磉_(參照Co, M. S.等人.，J. Immunol. (1994) 152， 2968-2976、 Better, M,和Horwitz, A. H., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496、 Plueckthun, A.和Skerra, A., Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515、 Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663 、 Rousseaux, J.等人.，Methods in Enzymology (1989) 121, 663-666、 Bird, R. E.等人.,TIBTECH (1991) 9, 132-137)。
scFv可通過將抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)連接獲得。該scFv中， H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)經(jīng)由接頭、優(yōu)選肽接頭連接(Huston, J. S.等人.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883)。 scFv中的H鏈V區(qū)和L鏈V 區(qū)可以是作為上述抗體的任意來源。連接V區(qū)的肽接頭例如可使用含有 氨基酸12-19個殘基的任意的單鏈肽。
編碼scFv的DNA如下獲得以編碼上述抗體的H鏈或H鏈V區(qū) 的DNA、以及編碼L鏈或L鏈V區(qū)的DNA為^t板，用身見定了其兩端的 引物對、通過P CR法擴增這些序列中編碼所需氨基酸序列的DNA部分， 接著，進一步將編碼肽接頭部分的DNA以及規(guī)定將其兩端與各H鏈、L 鏈連接而成的引物對組合進行擴增。
如果一旦制備了編碼scFv的DNA,則可以按照常規(guī)方法獲得含有 它們的表達載體、以及由該表達載體轉(zhuǎn)化的宿主，還可4吏用該宿主，按 照常規(guī)方法獲得scFv。
這些抗體的片段可以與上述同樣獲得其基因并使其表達，通過宿主 生成。本發(fā)明中所述的"抗體"也包含這些抗體的片段。
抗體的改性物可以使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子結(jié)合的抗體。 本發(fā)明所述的"抗體"中也包含這些抗體改性物。為獲得上述抗體改性 物，可以通過對所得抗體實施化學改性獲得。這些方法在該領域中已得 到建立。
如上所述，生成并表達的抗體可以由細胞內(nèi)外、宿主中分離并純化 至均勻。本發(fā)明中使用的抗體的分離、純化可通過親和層析進行。
親和層析中使用的柱例如有蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱中使 用的載體例如有HyperD、 POROS、 SepharoseF.F.等。除此之外可以使用在通常的蛋白質(zhì)中使用的分離、純化方法，沒有任何限定。
例如，將上述親和層析以外的色語、過濾、超濾、鹽析、透析等適 當選擇并組合，可以分離并純化本發(fā)明所使用的抗體。色鐠例如有離子
交換色譜、疏水色譜、凝膠過濾等。這些色譜可應用于HPLC (高效液 相色譜)。還可以使用反相HPLC。
上述所得抗體的濃度測定可通過吸光度的測定或ELISA等進行。 即，進行吸光度測定時，可以用PBS(-)適當稀釋，然后測定280 nm的 吸光度，以lmg/mL為1.35 0D計算。通過ELISA進行時，可如下測定。 即，將100 pL用0.1 M重碳酸緩沖液(pH 9.6)稀釋為1昭/mL的山羊抗 人IgG (TAG制備)力。入到96孔板(Nunc制備)中，在4。C下溫育過夜，固 定抗體。封閉后添加100 jiL含有適當稀釋的本發(fā)明使用的抗體或含抗體 的樣品、或者人IgG(CAPPEL制備)作為標準品，在室溫下溫育l小時。
清洗后加入100 稀釋為5000倍的堿性磷酸酶標記抗人IgG (BIO SOURCE制備)，在室溫下溫育1小時。清洗后加入底物溶液，溫育， 然后使用微量板讀板器型號3550 (Bio-Rad制造)測定405 nm的吸光度， 計算目標抗體的濃度。
本發(fā)明中使用的IL-6變異體是具有與IL-6受體的結(jié)合活性、且不 傳遞IL-6的生物學活性的物質(zhì)。即，IL-6變異體和IL-6竟爭性地與IL-6 結(jié)合，但不傳遞IL-6的生物學活性，因此可以阻斷IL-6的信號傳遞。
IL-6變異體是通過置換IL-6的氨基酸序列的氨基酸殘基來導入變 異。作為IL-6變異體原型的IL-6,不管其來源，但考慮到抗原性等，優(yōu) 選人IL-6。
具體來說，使用公知的分子建才莫程序、例如WHATIF(Vriend等.，J. Mol. Graphics (19卯)8, 52-56),預測IL-6的氨基酸序列的二次結(jié)構(gòu)，進 一步評價置換的氨基酸殘基對全體的影響。確定了適當?shù)闹脫Q氨基酸殘 基之后，以含有編碼人IL-6基因的堿基序列的載體作為模板，通過通常 進行的PCR法導入變異，進行氨基酸置換，由此可得到編碼IL-6變異 體的基因。可將其根據(jù)需要摻入適當?shù)谋磉_載體中，根據(jù)上述重組型抗 體的表達、生產(chǎn)和純化方法獲得IL-6變異體。
IL-6變異體的具體例子在Brakenhoff等人.,J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93、以及Savino等人.，EMBO J. (1994) 13, 1357-1367, WO 96/18648、 WO 96/17869中有公開。本發(fā)明中使用的IL-6部分肽或IL-6受體部分肽是分別具有與IL-6 受體或與IL-6的結(jié)合活性、且不傳遞IL-6生物學活性的物質(zhì)。即，IL-6 部分肽或IL-6受體部分肽與IL-6受體或IL-6結(jié)合，捕獲它們，由此特 異性地抑制IL-6與IL-6受體的特異性結(jié)合。結(jié)果不傳遞IL-6的生物學 活性，因此阻斷IL-6的信號傳遞。
IL-6部分肽或IL-6受體部分肽是在IL-6或IL-6受體的氨基酸序列 中，含有與IL-6和IL-6受體結(jié)合相關(guān)的區(qū)域的一部分或全部氨基酸序 列的肽。上述肽通常含有10-80、優(yōu)選20-50、更優(yōu)選20-40個氨基酸殘 基。
IL-6部分肽或IL-6受體部分肽可如下制備在IL-6或IL-6受體的 氨基酸序列中，確定與IL-6或IL-6受體結(jié)合相關(guān)的區(qū)域，按照通常已 知的方法例如基因工程方法或肽合成方法，根據(jù)該確定的區(qū)域的一部分 或全部氨基酸序列制備。
通過基因工程方法制備IL-6部分肽或IL-6受體部分肽時，可以將 編碼所需肽的DNA序列摻入到表達載體中，按照上述重組型抗體的表 達、生產(chǎn)和純化方法獲得。
按照肽的合成方法制備IL-6部分肽或IL-6受體部分肽時，可以釆 用肽合成中通常4吏用的方法、例如固相合成法或液相合成法。
具體來說，可按照續(xù)醫(yī)藥品的開發(fā)第14巻肽合成監(jiān)修矢島治明 廣川書店1991年記載的方法進行。固相合成法例如可采用以下的方法 使要在不溶解于有機溶劑的支撐體上合成的肽的C末端所對應的氨基 酸結(jié)合，將a-氨基和支鏈官能基團用適當?shù)谋Ｗo基保護了的氨基酸按照 由C末端至N末端的方向依次進行一個一個氨基酸縮合的反應；再進行 使與樹脂結(jié)合的氨基酸或肽的a-氨基的該保護基團脫離的反應，將上述 兩種反應交替反復進行，使肽鏈伸長。固相肽合成法根據(jù)所使用的保護 基團的種類大致分為Boc法和Fmoc法。
這樣，在合成了目標肽之后進行脫保護反應和肽鏈從支撐體上切斷 的反應。肽鏈的切斷反應中，Boc法通常可使用氟化氫或者三氟甲石黃酸， Fmoc法通?？墒褂肨FA。 Boc法中，例如可在氟化氫中、在茴香醚的 存在下，對上述保護肽的樹脂進行處理。接著，進行保護基團的脫離和 支撐體上的切斷，回收肽。將其冷凍干燥，由此可得到粗制肽。而在Fmoc 法中，例如可在TFA中、按照與上述同樣的操作進行脫保護反應和肽鏈從支撐體上切斷的反應。
所得粗制肽可以通過HPLC來進行分離、純化。在其洗脫時，可使 用蛋白質(zhì)純化中通常使用的水-乙腈系溶劑，在最佳條件下進行。獲得所 得色譜的譜圖峰的組分，將其冷凍干燥。通過質(zhì)譜的分子量分析、氨基 酸組成分析或氨基酸序列分析等對這樣純化的肽組分進行鑒定。
IL-6部分肽或IL-6受體部分肽的具體例子在日本特開平2-188600、 日本特開平7-324097、日本特開平8-311098和美國專利公報US5210075 中有公開。
本發(fā)明中使用的抗體可以是與聚乙二醇(PEG)、放射性物質(zhì)、毒素 等各種分子結(jié)合的螯合抗體。上述螯合抗體可通過對所得抗體進行化學 改性獲得?？贵w的改性方法在該領域中已經(jīng)確立。本發(fā)明的"抗體"也包 含這些螯合抗體。
本發(fā)明的含有IL-6抑制劑作為有效成分的慢性排斥反應的抑制劑 可在慢性排斥反應的治療中使用。本發(fā)明還提供含有IL-6抑制劑作為有 效成分的心臟移植中的慢性排斥反應的抑制劑。
問題的慢性排斥反應。該慢性排斥反應是以移植l年以后出現(xiàn)問題的以 血管內(nèi)膜肥厚和間質(zhì)纖維化為特征的、左右受體長期預后的并發(fā)癥，是 急性排斥反應在臨床上被克服后也會緩慢進展的反應。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 IL-6抑制劑在小鼠心臟移植急性排斥模型中 的治療效果(W02007/058194)，慢性排斥反應的病態(tài)機理與主要是經(jīng)由 細胞損傷性T細胞的急性排斥反應不同。具體來說，慢性排斥反應與急 性排斥反應不同的根據(jù)可列舉出
1) 呈現(xiàn)移植器官的間質(zhì)纖維化和管腔組織的內(nèi)膜肥厚導致狹窄病 變的、伴有細胞增殖的特有的病態(tài)；
2) 對抑制急性排斥反應有效的以往的免疫治療法無法抑制發(fā)?。?br> 3) 是臨床克服了急性排斥之后仍潛在進行的免疫反應；
4) 有慢性排斥反應發(fā)病的特征性危險因子。
1)慢性排斥反應的特征性病理組織學觀察中，已知有起因于血管 內(nèi)皮損傷、伴有血管平滑肌細胞增殖的血管狹窄病變。這也表現(xiàn)為移植 后血管病變或移植后動脈硬化，移植器官的血流降低導致循環(huán)損傷，移植器官陷于功能衰竭，由此出現(xiàn)慢性期的嚴重的并發(fā)癥。移植器官的血 管損傷的原因包含移植手術(shù)時缺血再灌流損傷、氧化應激、急性排斥反 應，因此，急性排斥反應的抑制或急性期器官保存技術(shù)等的進步確實在 對慢性排斥反應的抑制方面可見一定的效果，但是尚未有確定性的預防
方法；另外，2)對于慢性排斥反應有效的免疫抑制療法尚未確立。3)潛 在性發(fā)展的排斥反應中包含同種抗體的體液免疫、和巨噬細胞的浸潤或 各種細胞因子介導的各種細胞免疫的遷延。4)作為慢性排斥反應的危險 因子，已知除了受體的常規(guī)動脈硬化的危險因子(糖尿病、高血脂、高血 壓)之外，還有免疫抑制劑的副作用、遺傳因素、移植后感染癥(巨細胞 病毒等)、抗體在組織中的沉淀等多種因素。這樣，由于各種因素的復雜 地參與，導致移植器官的功能損傷。
本發(fā)明中，"移植后的慢性排斥反應的抑制"是指抑制移植的器官的 間質(zhì)纖維化、管腔組織內(nèi)膜肥厚導致的狹窄等、抑制上述慢性排斥反應 的各種癥狀。
使用本發(fā)明的抑制劑的器官移植中，器官移植并沒有特別限定。為 本發(fā)明的對象的器官移植的優(yōu)選例子有心臟、肝臟、腎臟、胰臟、肺、 小腸等實質(zhì)器官，還可應用于心臟瓣膜、血管、皮膚、骨骼、角膜等的 組織移才直。
本發(fā)明中使用的IL-6抑制劑的抑制IL-6信號傳遞的活性可按照通 常使用的方法進行評價。具體來說，培養(yǎng)IL-6依賴性人骨髓瘤抹(S6B45、 KPMM2)、人Lennert T淋巴瘤細胞抹KT3 、或IL-6依賴性細胞 MH60.BSF2，向其中添加IL-6，同時4吏IL-6抑制劑共存，由此可以測定 IL-6依賴性細胞的311-胸苷的攝入。培養(yǎng)作為IL-6受體表達細胞的U266, 添加1251標記的IL-6,同時加入IL-6抑制劑，測定與IL-6受體表達細月包 結(jié)合的1251標記的IL-6。上述測定系統(tǒng)中，除存在IL-6抑制劑的組之夕卜， 還設置不含有IL-6抑制劑的陰性對照組，將兩者所得結(jié)果進行比較，可 以評價IL-6抑制劑的IL-6抑制活性。
關(guān)于移植后的排斥反應是否受到抑制的確認，如果結(jié)果是器官的存 活性提高，則也可視為在器官移植中"移植損傷受到抑制"。器官的存活 可根據(jù)各器官的功能在移植后是否正常來判定。
如后述實施例所示，可見通過給予抗IL-6受體抗體，可以抑制心臟 移植的慢性排斥反應，因此抗IL-6受體抗體等IL-6抑制劑顯示可用作慢性排斥反應抑制劑。
本發(fā)明的抑制劑所給予的對象為哺乳動物。哺乳動物優(yōu)選人。 本發(fā)明的抑制劑可以以藥物的形式給予，可以口服或非口服、全身 或局部給予。例如可選擇點滴等靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、 皮下注射、栓劑、灌腸劑、口服性腸溶劑等，可根據(jù)患者的年齡、癥狀
選擇適當?shù)慕o予方法。有效給予量可以是每次每1 kg體重在0.01 mg-100 mg的范圍內(nèi)選擇?；蛘呙课换颊呖蛇x擇1-1000 mg、優(yōu)選5-50mg的給 予量。例如為抗IL-6受體抗體時，優(yōu)選的給予量、給予方法是血液中存 在游離抗體程度的量為有效給予量，具體例子有以下的方法等lkg體 重1個月(4周)可1次至多次給予0.5 mg-40 mg,優(yōu)選1 mg-20 mg,例如 可按照2次/周、1次/周、1次/2周、1次/4周等的給予日程，通過點滴 等靜脈內(nèi)注射、皮下注射等方法給予。給予日程可以一邊觀察移植后的 狀態(tài)和血液4全查值的動向， 一邊由2次/周或l次/周至l次/2周、1次/3 周、l次/4周，逐漸延長給予間隔等調(diào)節(jié)給予。
本發(fā)明中，抑制劑中可以添加防腐劑或穩(wěn)定劑等制劑中可接受的載 體。制劑可接受的載體可以是其本身可具有上述慢性排斥反應抑制效果 的材料，也可以是不具有該抑制效果的材料，是指可以與上述抑制劑一 起給予的材料。還可以是雖然是不具有慢性排斥反應抑制效果的材料、 但通過與IL-6抑制劑結(jié)合使用，具有協(xié)同或相加的穩(wěn)定化效果的材料。
制劑可接受的材料例如有滅菌水或生理鹽水、穩(wěn)定劑、賦型劑、緩 沖劑、防腐劑、表面活性劑、螯合劑(EDTA)等、粘合劑等。
本發(fā)明中，表面活性劑可例舉非離子表面活性劑，例如典型的例子 有失水山梨醇單辛酸酯、失水山梨醇單月桂酸酯、失水山梨醇單棕櫚 酸酯等失水山梨醇脂肪酸酯；甘油單辛酸酯、甘油單肉豆蔻酸酯、甘油 單硬脂酸酯等甘油脂肪酸酯；十甘油單硬脂酸酯、十甘油二硬脂酸酯、 十甘油一亞油酸酯等聚甘油脂肪酸酯；聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸 酯、聚氧乙烯失水山梨醇單油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇單硬脂酸酯、 聚氧乙烯失水山梨醇單棕櫚酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇三油酸酯、聚氧 乙烯失水山梨醇三硬脂酸酯等聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯；聚氧乙烯 山梨醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇四油酸酯等聚氧乙烯山梨醇脂肪酸 酯；聚氧乙烯甘油基單硬脂酸酯等聚氧乙烯甘油脂肪酸酯；聚乙二醇二 硬脂酸酯等聚乙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯月桂基醚等聚氧乙烯烷基醚；
22聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯
鯨蠟基醚等聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚；聚氧乙烯壬基苯基醚等聚氧乙烯 烷基苯基醚；聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻油等聚氧乙烯氫化蓖 麻油；聚氧乙烯山梨醇蜜蠟等聚氧乙烯蜜蠟衍生物；聚氧乙烯羊毛脂等 聚氧乙烯羊毛脂衍生物；聚氧乙烯硬脂酸酰胺等聚氧乙烯脂肪酸酰胺等 的具有HLB6-18的等。
表面活性劑有陰離子表面活性劑，例如典型的例子有鯨蠟基硫酸 鈉、月桂基硫酸鈉、油基硫酸鈉等具有碳原子數(shù)10-18的烷基的烷基硫 酸鹽；聚氧乙烯月桂基硫酸鈉等環(huán)氧乙烷平均加成摩爾數(shù)為2-4、烷基 的碳原子數(shù)為10-18的聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽；月桂基硫代琥珀酸酯鈉 等烷基的碳原子數(shù)為8-18的烷基硫代琥珀酸酯鹽；天然系的表面活性 劑、例如卵磷脂、甘油磷脂；鞘磷脂等鞘磷脂；碳原子數(shù)12-18的脂肪 酸的蔗糖脂肪酸酯等。
可以將上述表面活性劑的1種或2種或以上組合添加到本發(fā)明的抑 制劑中。本發(fā)明的制劑中使用的優(yōu)選的表面活性劑是聚山梨醇20、 40、 60或80等的聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，特別優(yōu)選聚山梨醇20和 80。還優(yōu)選以泊洛沙姆(PluronicF-68 (注冊商標)等)為代表的聚氧乙烯聚 氧丙烯二醇。
表面活性劑的添加量根據(jù)所使用的表面活性劑的種類而不同，采用 聚山梨醇20或聚山梨醇80時，通常為0.001-100 mg/mL,優(yōu)選0.003-50 mg/mL,進一步優(yōu)選0.005-2 mg/mL。
本發(fā)明中，緩沖劑有磷酸、檸檬酸緩沖液、乙酸、蘋果酸、酒石酸、 琥珀酸、乳酸、磷酸鉀、乙醇酸、辛酸、脫氧膽酸、水楊酸、三乙醇胺、 富馬酸等有機酸等，或者碳酸緩沖液、Tris緩沖液、組氨酸緩沖液、咪 唑緩沖液等。
在溶液制劑的領域中，通過溶解于公知的水性緩沖液中，可制備溶 液制劑。緩沖液的濃度通常為1-500 mM,優(yōu)選5-100 mM，進一步優(yōu)選 10-20 mM。
本發(fā)明的抑制劑可以含有其它低分子量的多肽、血清白蛋白、明膠 或免疫球蛋白等蛋白質(zhì)，氨基酸，多糖和單糖等糖類或碳水化合物，糖醇。
本發(fā)明中，氨基酸有堿性氨基酸，例如精氨酸、賴氨酸、組氨酸、鳥氨酸等，或者這些氨基酸的無機鹽(優(yōu)選鹽酸鹽、磷酸鹽的形式，即磷 酸氨基酸)。使用游離氨基酸時，優(yōu)選的pH值可通過添加適當?shù)纳韺W 可接受的緩沖物質(zhì)、例如無機酸、特別是鹽酸、磷酸、硫酸、乙酸、甲 酸或它們的鹽來調(diào)節(jié)。這種情況下，磷酸鹽的使用特別可獲得穩(wěn)定的凍 干物，因此特別有利。制備物基本不含有機酸、例如蘋果酸、酒石酸、 檸檬酸、琥珀酸、富馬酸等時，或者是不存在對應的陰離子(蘋果酸離子、 酒石酸離子、檸檬酸離子、琥珀酸離子、富馬酸離子等)時特別有利。優(yōu)
選的氨基酸是精氨酸、賴氨酸、組氨酸或鳥氨酸?？蛇M一步使用酸性
氨基酸、例如谷氨酸和天冬氨酸、及其鹽的形式(優(yōu)選鈉鹽)，或中性氨 基酸、例如異亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、甲 硫氨酸、半胱氨酸或丙氨酸，或者芳族氨基酸、例如苯丙氨酸、酪氨酸、
色氨酸或衍生物N-乙?；彼帷?br> 本發(fā)明中，多糖和單糖等糖類或碳水化合物例如有葡聚糖、葡萄糖、 果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖等。 本發(fā)明中，糖醇例如可以是甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇等。 將本發(fā)明的藥物制成注射用的水溶液時，例如可以混合含有生理鹽 水、葡萄糖或其它輔助試劑(例如D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、D-麥芽糖 醇、氯化鈉)的等滲液。該水溶液可以與適當?shù)娜芙庵鷦?例如醇(乙醇等)、 多元醇(丙二醇、PEG等)、非離子性表面活性劑(聚山梨醇80、 HCO-50) 等)結(jié)合使用。
根據(jù)需要，可以進一步含有稀釋劑、溶解助劑、pH調(diào)節(jié)劑、止痛 劑、含硫還原劑、抗氧化劑等。
本發(fā)明中，含硫還原劑例如有N-乙?；腚装彼帷-乙?；甙?胱氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨醇、硫 代乙醇酸及其鹽、硫代硫酸鈉、谷胱甘肽、以及碳原子數(shù)1-7的硫代鏈 烷酸等具有硫化氫基的化合物。
本發(fā)明中，抗氧化劑例如有異抗壞血酸、二丁基羥基甲苯、丁基 羥基茴香醚、a-生育酚、乙酸生育酚、L-抗壞血酸及其鹽、L-抗壞血酸 棕櫚酸酯、L-抗壞血酸硬脂酸酯、亞辟u酸氫鈉、亞碌u酸鈉、沒食子酸三 戊酯、沒食子酸丙酯或乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、焦磷酸鈉、偏磷酸鈉 等螯合劑。
還可以根據(jù)需要封入到微嚢(羥曱基纖維素、明膠、聚[甲基丙烯酸甲酯]等的微嚢)中，制成膠體藥物傳遞系統(tǒng)(脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳
液、納米顆粒和納米膠嚢等)(參照"Remington's Pharmaceutical Science 16thedition", Oslo Ed.， 1980)。并且，將藥物制成緩釋性藥物的方法也是 公知的，可應用于本發(fā)明(Langer等人.，J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15， 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982) 12, 98-105;美國專利第3,773,919 號；歐洲專利申請公開(EP)第58,481號；Sidman等人.，Biopolymers (1983) 22, 547-556; EP第133,988)。
所使用的制劑可接受的載體可以根據(jù)劑型，從上述中適當或者組合 選擇，但并不限于此。
本發(fā)明涉及抑制慢性排斥反應的方法，該方法包含將IL6-抑制劑給 予對象的步驟。
本發(fā)明還涉及抑制心臟移植中慢性排斥反應的方法，該方法包含將 IL-6抑制劑給予對象的步驟。
本發(fā)明中，"對象"是指給予本發(fā)明的IL-6抑制劑的生物體、該生物 體體內(nèi)的一部分。生物體沒有特別限定，包含動物(例如人、家畜動物、 野生動物)。對于上述的"生物體的體內(nèi)的一部分"沒有特別限定。
本發(fā)明中，"給予，，包含口服或非口服給予?？诜o予是以口服制劑 的形式給予，口服制劑可以選擇顆粒劑、散劑、片劑、膠嚢劑、溶劑、 乳劑、或混懸劑等劑型。
非口服性給予有注射劑形式的給予，注射劑有靜脈注射劑、皮下注 射劑、肌肉注射劑或腹腔內(nèi)注射劑等。另外，采用基因治療的方法，將 要給予的含有寡核苷酸的基因?qū)氲缴矬w內(nèi)，由此可實現(xiàn)本發(fā)明的方 法的效果。還可以將本發(fā)明的藥物局部給予要實施處置的區(qū)域。例如， 可以通過手術(shù)中的局部注入、導管的使用或編碼本發(fā)明的肽的DNA的 靼基因傳遞來給予。
本發(fā)明的抑制劑對對象的給予可以在器官移植之前，也可以在器官 移植的同時或器官移植之后進行。另外抑制劑的給予可以是一次也可以 是連續(xù)給予。
對從生物體中摘除的或排出的生物體的 一部分進行給予時，可以使 本發(fā)明的抑制劑與生物體的 一部分"接觸"。
本發(fā)明中，"接觸"根據(jù)生物體的狀態(tài)進行。例如可以是將本抑制劑 散布到生物體的一部分、或者將本抑制劑添加到生物體的一部分的破碎物中等，但并不限于這些方法。生物體的一部分為培養(yǎng)細胞時，可以通 過將本抑制劑添加到該細胞的培養(yǎng)液中，或者將本發(fā)明的含有寡核苷酸
的DNA導入到構(gòu)成生物體一部分的細胞中，由此可進行上述"接觸"。 實踐本發(fā)明的方法時，本發(fā)明的藥物可以與至少一種已知的化學療
法制劑共同作為藥學組合物的一部分給予。或者，本發(fā)明的藥物可以與
至少一種已知的免疫抑制劑同時給予。 一種方案是本發(fā)明的抑制劑和
已知的化學療法制劑實質(zhì)上同時給予。
本發(fā)明的慢性排斥反應抑制劑優(yōu)選在器官移植之后全身給予，也可
以對移植了器官的部位給予，還可以與器官同時對粑進行給予。對于要
移植的器官，可以離體(exvivo)給予。
中。 、 、 、、、 、
附圖簡述


圖1是表示移植60天后移植心臟病理組織切片中，通過排斥評分 進行的比較研究結(jié)果和纖維化區(qū)域的比例的照片和圖。
圖2是表示移植后心血管病變中，分析血管狹窄率的結(jié)果的照片和圖。
實施例
以下通過實施例進一步具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實施 例的限制。
用作供體的B6.C-H2bm12小鼠經(jīng)由日本^ Y —^X'卩7《一抹式會社 購自美國The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME),受體C57BL/6小鼠 購自日本SLC抹式會社。各小鼠MHC抗原是次要錯配(n類錯配)，因 此移植心臟并沒有發(fā)生急性排斥反應，而是在移植后約2個月時呈現(xiàn)與 人的慢性排斥反應 一致的病理組織現(xiàn)象，因此確立了慢性排斥反應的動 物模型。小鼠在信州大學動物實驗設施(正式名稱信洲大學人類環(huán)境科 學研究支援中心生命科學領域動物實驗部門)飼養(yǎng)，按照該設施的動物實 驗說明進行飼養(yǎng)。使用6-8周齡的小鼠，將過去已有報道的小鼠異位心 臟移植模型(Corry, R. J等人.，Transplantation (1973) 16, 343-350)進行一 些改變，按照以下順序，通過顯微鏡下手術(shù)實施小鼠心臟移植。
26供體和受體小鼠均通過腹腔內(nèi)注射70 mg/kg戊巴比妥鈉(Nembutal (注冊商標))實施麻醉。移植心臟是留有用于吻合的升主動脈和肺動脈2 根，其它血管一并結(jié)扎摘除。移植心臟在水上的添加7.5%肝素的冷生理 鹽水中保存。受體的正中部切開腹部，翻轉(zhuǎn)腸管，使腹部腹主動脈和下 腔靜脈露出，用微血管用顯微血管夾阻斷血流，然后分別將該表面切開 約1 mm,制成吻合口。將移植心臟的主動脈和受體的腹主動脈、移植 心臟的肺動脈和受體的下腔靜脈分別用10-0尼龍線連接縫合，進行吻 合。緩慢打開顯微血管夾，使血流重新開放，確認移植心臟的復跳。確 認止血后縫合腹壁和皮膚，關(guān)閉腹腔。 一個手術(shù)時間約45分鐘，成功 率為95%以上。
治療組是以0.5 mg/小鼠/次的給予量將MR16-腹腔內(nèi)注射，每周2 次。對照治療組是同樣給予大鼠IgG(對照IgG)。移植60天后從受體中 摘除移植心臟，使用以下的三種病理學指標評價慢性排斥反應。
(1) 以細胞浸潤和心肌壞死或脫落為指標，換照0-4的五個等級的 基準(Billingham, M. E等人.，J. Heart Transplant (19卯)9, 587-593; Rodriguez, E. R., J. Heart Lung Transplant (2003) 22, 3-15),通過打分的排 斥評分，來比較研究蘇木精-伊紅染色標本中排斥反應的程度。
移植60天后，制備移植心臟的病理組織切片，進行蘇木精-伊紅染 色(圖1)。對照治療組(圖la)中可見廣泛的炎癥細胞浸潤和心肌壞死。 MR16-1治療組(圖lb)中，炎癥細胞浸潤只是輕度，較好地保有心肌組 織結(jié)構(gòu)。另外MR16-1給予組的排斥評分與對照治療組相比受到顯著抑 制(圖lc:對照治療組3.1±0.3, MR16-1給予組1.4±0.3, p=0.0013)。
(2) 通過MASSON氏三色染色來鑒定慢性排斥的特征性的心肌間 質(zhì)纖維化監(jiān)定，通過圖像分析軟件(NIHimage, version 1.62)測量各視野 中纖維化區(qū)域的比例(％)。
結(jié)果，與對照治療組(圖lb)相比，MR16-1治療組(圖le)中，纖維 化區(qū)域得到顯著抑制(圖If:對照治療組46.5±4.1%, MR16-1給予組 19.0±2.1%, p=0.0001)。
(3) 為了對以內(nèi)膜肥厚導致的血管狹窄為特征的移植后血管病變進 行分析，使內(nèi)彈性片與原本的血管腔近似，使用同樣的圖像分析軟件， 按照Suzuki, J等人.Nat. Med. 3, 900-卯3., 1997的方法，通過下式測定血 管狹窄率。狹窄率(％)=(內(nèi)彈性片區(qū)域-內(nèi)腔)/內(nèi)彈性片區(qū)域x100
對移植后心血管病變進行分析，結(jié)果，與對照治療組(圖2a)相比， 在MR16-1治療組(圖2b)中，內(nèi)膜肥厚受到抑制，血管內(nèi)腔狹窄受到顯 著抑制(圖2c:對照治療組59.6±6.0%, MR16-1給予組23.7±4.2%， p=0.0019)。
以上，在小鼠心臟移植模型中，對受體給予MR16-1可抑制移植心 臟的慢性排斥反應，顯著抑制特征性病理組織現(xiàn)象——移植心臟的纖維 化和血管內(nèi)膜肥厚。慢性排斥反應是左右受體長期預后的并發(fā)癥，本藥 物的臨床應用有望開發(fā)新的免疫抑制療法。
產(chǎn)業(yè)實用性
根據(jù)本發(fā)明，提供含有IL-6抑制劑作為有效成分的慢性排斥反應的 抑制劑、以及抑制慢性排斥反應的方法，該方法包含將IL-6抑制劑給予 對象的步驟。
通過各種免疫抑制劑使得急性期的排斥反應克服后，慢性排斥反應 仍會緩慢進展，其病態(tài)復雜，且與急性排斥反應不同之處較多。現(xiàn)有的 藥物慢性排斥反應的預防和治療效果尚未確立，本發(fā)明由于IL-6抑制劑 的抑制慢性排斥的效果而提供了新的治療上的有效性。并且，通過選擇 性抑制炎癥性細胞因子IL-6的作用，因此作為比現(xiàn)有藥物的副作用少的 免疫抑制劑，其優(yōu)越性值得期待。
權(quán)利要求
1.慢性排斥反應的抑制劑，該抑制劑含有IL-6抑制劑作為有效成分。
2. 權(quán)利要求1所述的慢性排斥反應的抑制劑，其特征在于IL-6抑制劑是識別IL-6的抗體。
3. 權(quán)利要求1所述的慢性排斥反應的抑制劑，其特征在于IL-6抑制劑是識別IL-6受體的抗體。
4. 權(quán)利要求2或3所述的慢性排斥反應的抑制劑，其中，抗體是單克隆抗體。
5. 權(quán)利要求2或3所述的慢性排斥反應的抑制劑，其中，抗體是識別人IL-6或人IL-6受體的抗體。
6. 權(quán)利要求2或3所述的慢性排斥反應的抑制劑，其中，抗體是重組型抗體。
7. 權(quán)利要求2-6中任一項所述的慢性排斥反應的抑制劑，其特征在于抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
8. 權(quán)利要求1-7中任一項所述的慢性排斥反應的抑制劑，其中，該抑制劑用于抑制心臟移植中的慢性排斥反應。
9. 抑制慢性排斥反應的方法，該方法包含將IL-6抑制劑給予對象的步驟。
10. 權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于IL-6抑制劑是識別IL-6的抗體。
11. 權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于IL-6抑制劑是識別IL-6受體的抗體。
12. 權(quán)利要求10或11所述的抑制慢性排斥反應的方法，其中，抗體是單克隆抗體。
13. 權(quán)利要求10或11所述的方法，其中，抗體是識別人IL-6或人IL-6受體的抗體。
14. 權(quán)利要求10或11所述的方法，其中，抗體是重組型抗體。
15. 權(quán)利要求10-14中任一項所述的方法，其特征在于抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
16. 權(quán)利要求9-15中任一項所述的方法，其特征在于其中，該方法是抑制心臟移植中的慢性排斥反應。
17. IL-6抑制劑在制備慢性排斥反應抑制劑中的應用。
18. 權(quán)利要求17所述的應用，其特征在于IL-6抑制劑是識別IL-6的抗體。
19. 權(quán)利要求17所述的應用，其特征在于IL-6抑制劑是識別IL-6受體的抗體。
20. 權(quán)利要求18或19所述的應用，其中，抗體是單克隆抗體。
21. 權(quán)利要求18或19所述的應用，其中，抗體是識別人IL-6或人IL-6受體的抗體。
22. 權(quán)利要求18或19所述的應用，其中，抗體是重組型抗體。
23. 權(quán)利要求18-22中任一項所述的應用，其特征在于抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
全文摘要
本發(fā)明人對于抗IL-6受體抗體抑制慢性排斥反應的效果進行了研究。使用小鼠心臟移植慢性排斥模型，研究了給予抗小鼠IL-6受體抗體(MR16-1)產(chǎn)生的抑制慢性排斥反應的效果。對移植后60天摘除的移植心臟進行病理組織學分析，結(jié)果在MR16-1治療組中，慢性排斥反應的特征性的病態(tài)——心肌的纖維化和血管狹窄病變與對照組相比得到顯著抑制，由此確認給予MR16-1的抑制慢性排斥反應的效果。即首次發(fā)現(xiàn)通過給予抗IL-6受體抗體，可以抑制器官移植后慢性期的排斥反應。
文檔編號A61K45/00GK101646459SQ20088000282
公開日2010年2月10日 申請日期2008年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月23日
發(fā)明者伊澤淳, 高橋?qū)⑽?申請人:國立大學法人信州大學;中外制藥株式會社