專利名稱：：心力衰竭預(yù)防劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有心臟壁肥厚抑制作用的有效成分，含有該有效成分的心臟肥大預(yù)防劑和心力衰竭預(yù)防劑，以及含有該有效成分、有望獲得心臟肥大和心力衰竭預(yù)防效果的功能性食品。本發(fā)明涉及抑制心臟壁肥厚的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及預(yù)防心臟月巴大和心力衰竭的方法。
背景技術(shù)：
：近年來，在部分國家，由于帶有吸煙、高血壓、高血糖、高血脂等引發(fā)心臟疾病的危險(xiǎn)因素的人日漸增多，心力衰竭患者數(shù)有增加趨勢。這些病態(tài)并不只限于人類，在犬類或貓等其它伴侶動(dòng)物或?qū)櫸飫?dòng)物等與人類有密切關(guān)系的動(dòng)物中也有增加趨勢。心力衰竭的病態(tài)、分類、過程各有不同，無法簡單定義，但可以大致分為收縮期心力衰竭和舒張期心力衰竭兩大類，該兩種也可能同時(shí)發(fā)生。收縮期心力衰竭是由于心臟無法正常收縮而發(fā)生。心臟4聶取血液，但是由于心肌較弱，因此無法將充滿的血液充分壓出，結(jié)果送至全身或肺部的血液量減少，心臟、特別是左心室肥大。而舒張期心力衰竭是由于心臟的壁變硬變厚、心臟無法充分存留血液而發(fā)病。結(jié)果，血液停留在左心房內(nèi)或肺部血管內(nèi)，引發(fā)淤血。這樣，通常的心力衰竭是心臟的泵功能陷入衰竭，因此心臟無法送出足夠量的血液，由于心力衰竭，發(fā)生血流量減少、血液在靜脈或肺中滯留等使心臟功能進(jìn)一步降低的其它變化。形成心力衰竭的原發(fā)病(原疾患)例如有高血壓，主動(dòng)脈狹窄等導(dǎo)致壓力負(fù)荷的增大、瓣膜病等導(dǎo)致的容量負(fù)荷增大等而引起的心臟壁肥厚的心臟肥大。而心肌梗塞發(fā)病后，損傷組織中作為自發(fā)性功能回復(fù)反應(yīng)而形成心臟壁肥厚。心肌病等由于發(fā)生原因不明的心肌障礙而導(dǎo)致心臟壁肥厚。持續(xù)地對(duì)心臟施加機(jī)械性負(fù)荷，則心肌的收縮力漸漸降低，導(dǎo)致心功能降低，即而導(dǎo)致心室性心律失常、心臟缺血、冠狀動(dòng)脈疾病、缺血性心力衰竭。由此，具有心臟壁肥厚抑制作用的化合物對(duì)于心臟月巴大或心力衰竭的預(yù)防和治療有效。例如由于高血壓等導(dǎo)致心臟肥大時(shí)，作為心臟壁肥厚的改善方法，通過治療作為病因的高血壓也可以改善心臟壁肥厚，但是其作用并不令人滿意，并且降壓藥可能完全無效(AmJHypertens.1997Aug;10(8):913~20)。即使高血壓得到改善，也大多殘留心臟壁肥厚未改善的狀態(tài)，這種狀況下也有心力衰竭發(fā)病的危險(xiǎn)性。對(duì)心力衰竭治療有效的藥物是可抑制由血管緊張素I變換為具有升壓作用的血管緊張素II的酶(即血管緊張素轉(zhuǎn)換酶，ACE)、具有降壓作用的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)，例如依那普利。有報(bào)告指出，降壓劑在降低血壓的同時(shí)可以改善腎功能障礙的發(fā)展(丄Clin.Invest,77,1993-2000,1986)。但是另一方面，ACE抑制劑未必對(duì)于由各種原有疾病誘發(fā)的心力衰竭的所有的病例有效，并且伴隨著降壓，也有導(dǎo)致急性腎功能衰竭的危險(xiǎn)，因此必須慎重給予(最新醫(yī)學(xué)，48:1404-1409,1993),即，降壓劑不僅對(duì)于心力衰竭的預(yù)防不充分，還可能誘發(fā)腎功能衰竭。另一方面，有報(bào)告指出酪蛋白等來自食品材料的肽具有ACE抑制活性，已知它們具有降血壓作用，但是并未直接顯示是否具有心臟壁肥大抑制作用(日本特許第2782142號(hào)公報(bào)，J.DairySci.1995,78:777-78,J.DairySci.1995,78:1253-1257,Am.J.Clin.Nutr.1996,64:767-771)。如上所述，ACE抑制帶來的心力衰竭的預(yù)防或治療效果是有限度的，人們需求不依賴ACE抑制的疾病的預(yù)防或治療。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供不依賴于ACE抑制活性、具有心臟壁肥厚抑制作用的4匕合物或組合物。本發(fā)明又提供含有上述化合物或組合物的心力衰竭預(yù)防劑。本發(fā)明還提供含有上述化合物或組合物、有望獲得心力衰竭預(yù)防效果的功能性食品。本發(fā)明進(jìn)一步提供抑制心臟壁肥厚的方法，該方法包含將上述化合物或組合物給予對(duì)象。本發(fā)明還提供預(yù)防心力衰竭的方法，該方法包含將上述化合物或組合物給予對(duì)象。本發(fā)明是上述化合物或組合物在制備抑制心臟壁肥厚的藥物中的應(yīng)用。特別是本發(fā)明是上述化合物或組合物在制備預(yù)防心臟肥大用藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還是上述化合物或組合物在制備預(yù)防心力衰竭用藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)具有XaaProPro(Xaa為任意的天然氨基酸)這樣的特定結(jié)構(gòu)的三肽具有心臟壁肥厚抑制作用，從而發(fā)明了對(duì)預(yù)防心力衰竭起作用的藥物和功能性食品。其具體內(nèi)容如下所述。本發(fā)明提供含有XaaProPro作為有效成分的心臟壁肥厚抑制劑。本發(fā)明提供具有上述心臟壁肥厚抑制作用的心臟肥大預(yù)防劑。本發(fā)明提供具有上述心臟壁肥厚抑制作用的心力衰竭預(yù)防劑。本發(fā)明提供包含上述心臟壁肥厚抑制劑的功能性食品。本發(fā)明提供抑制心臟壁肥厚的方法，該方法包含將XaaProPro或含有XaaProPro的組合物給予對(duì)象。本發(fā)明提供預(yù)防心臟肥大的方法，該方法包含將XaaProPro或含有XaaProPro的組合物給予對(duì)象。本發(fā)明提供預(yù)防心力衰竭的方法，該方法包含將XaaProPro或含有XaaProPro的組合物給予對(duì)象。本發(fā)明是XaaProPro或含有XaaProPro的組合物在制備抑制心臟壁肥厚的藥物中的應(yīng)用。特別是本發(fā)明是XaaProPro或含有XaaProPro的組合物在制備防止心臟肥大用藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還是XaaProPro或含有XaaProPro的組合物在制備預(yù)防心力衰竭用藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選XaaProPro是ValProPro和/或lieProPro。在本發(fā)明的另一方案中，有效成分XaaProPro來自動(dòng)物乳酪蛋白水解物或其濃縮物。本發(fā)明的又一方案中，有效成分XaaProPro來自用瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)種的菌使含有乳蛋白質(zhì)的原料發(fā)酵得到的發(fā)酵物。優(yōu)選瑞士乳桿菌種的菌是瑞士乳桿菌CM4林(FERMBP-6060)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的心臟壁肥厚抑制劑含有XaaProPro結(jié)構(gòu)的三肽作為有效成分。這里，"劑，，并不限于藥物，例如是指藥物組合物或食品組合物等的組合物，或者例如食品添加劑等的化合物。本發(fā)明中所述的"心臟壁肥厚抑制劑"是指具有抑制心臟壁肥厚病變發(fā)展的作用、具有改善心臟壁肥厚病變的作用、或者具有心臟壁肥厚發(fā)病的預(yù)防效果的化合物或組合物。本發(fā)明的有效成分XaaProPro的Xaa可以是任意的天然氨基酸。具體有ValProPro(纈氨酸-脯氨酸-脯氨酸)、lieProPro(異亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸)、SerProPro(絲氨酸-脯氨酸-脯氨酸)、LeuProPro(亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸)等，優(yōu)選ValProPro、lieProPro,更優(yōu)選ValProPro。有效成分可以含有ValProPro和lieProPro這樣的1種以上三肽XaaProPro的組合。有效成分XaaProPro可以是有機(jī)化學(xué)合成的三肽，還可以是天然的三肽。三肽XaaProPro的有才幾化學(xué)合成方法可以采用固相法(Boc法、Fmoc法)或液相法等常規(guī)方法，例如可以是使用島津制作所制造的肽合成裝置(PSSM-8型)等肽自動(dòng)合成裝置合成的。肽合成的反應(yīng)條件等可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)常識(shí)、結(jié)合所選擇的合成方法或所需的三肽XaaProPro,任意設(shè)定適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件等?；蛘撸鳛樘烊坏娜腦aaProPro可以來自動(dòng)物乳酪蛋白水解物或其濃縮物，還可以來自用曲霉菌或乳酸菌等菌類使含有蛋白質(zhì)的食品原料發(fā)酵得到的發(fā)酵物。使用動(dòng)物乳酪蛋白水解物或其濃縮物、或用瑞士乳桿菌種的菌使含有乳蛋白質(zhì)的原料發(fā)酵得到的發(fā)酵物時(shí)，除本發(fā)明的有效成分一一三肽XaaProPro之外，還可以含有游離氨基酸，并且，除上述肽和游離氨基酸之外，例如可含有通常動(dòng)物乳酪蛋白、乳蛋白質(zhì)中所含有的脂類、灰分、碳水化合物、食物纖維、水分等，還可根據(jù)需要將其中的適當(dāng)?shù)某煞值囊徊糠只蛘呷砍?。本發(fā)明的有效成分XaaProPro可以來自動(dòng)物乳酪蛋白水解物或其濃縮物，該動(dòng)物乳酪蛋白水解物或其濃縮物可以通過使用可得到XaaProPro、特別是ValProPro和lieProPro的酶組(酵素群)將動(dòng)物乳酪蛋白水解的方法、將動(dòng)物乳酪蛋白用曲霉菌發(fā)酵的方法獲得。動(dòng)物乳酪蛋白例如有牛乳、馬乳、山羊乳、羊乳等的酪蛋白，可特別優(yōu)選使用牛乳酪蛋白。對(duì)將動(dòng)物乳酪蛋白水解或發(fā)酵時(shí)的酪蛋白濃度沒有特別限定，為了高效的生產(chǎn)動(dòng)物乳酪蛋白分解物，優(yōu)選1-19重量％。上述酶組例如優(yōu)選酶組(X)，該酶組(X)含有可切斷XaaProProXaa序列的羧基末端的ProXaa殘基之間的肽酶。酶組(X)優(yōu)選含有在活性中心具有絲氨酸的絲氨酸型的蛋白酶或在活性中心具有金屬的金屬蛋白酶。金屬蛋白酶有中性蛋白酶I、中性蛋白酶II和亮氨酸氨基肽酶等，進(jìn)一步含有它們的至少一種可以效率良好且在短時(shí)間內(nèi)、并且以一步反應(yīng)即可以獲得所需的水解物，因此優(yōu)選。另外，可切斷上述ProXaa序列的肽酶優(yōu)選為等電點(diǎn)顯示為酸性區(qū)域的酶。上述酶組或酶組(X)例如有來自米曲霉(Aspergillusoryzae)等曲霉菌的酶組。上述酶組可以是在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)菌體、通過水提取生成的酶所得的酶組等，特別優(yōu)選來自米曲霉的酶組中的等電點(diǎn)顯示酸性區(qū)域的酶組。來自米曲霉的酶組可以利用市售商品，例如優(yōu)選4吏用義；、f一厶FP、LP或MP(以上為注冊商標(biāo)，新日本化學(xué)(抹)制)、々7;、if>f厶(注冊商標(biāo)，天野工乂if、厶(林)制)、SternzymeB11024、PROHIDROXYAMPL(以上為商品名，林式會(huì)社樋口商會(huì)制)、才i;工7夕一七、ons(注冊商標(biāo)，阪急"4才0夕'只卜卩一(林)制)、f、大f—厶AP(注冊商標(biāo)，,方、七生化學(xué)制)等，特別優(yōu)選使用只Sf—厶FP(以上為注冊商標(biāo)，新日本化學(xué)(抹)制)。使用這些市售酶組時(shí)，通常設(shè)定最佳條件，也可以根據(jù)所使用的酶組，適當(dāng)改變獲得上述酪蛋白水解物的條件、例如使用的酶量或反應(yīng)時(shí)間等進(jìn)行。對(duì)上述動(dòng)物乳酪蛋白進(jìn)行水解時(shí)的酶組的添加量例如是在溶解動(dòng)物乳酪蛋白的水溶液中，酶組/動(dòng)物乳酪蛋白按照重量比為1/1000以上、優(yōu)選1/1000-1/10、特別優(yōu)選1/100-1/10、進(jìn)一步優(yōu)選1/40-1/10的比例的量。反應(yīng)條件根據(jù)所使用的酶組適當(dāng)選擇，以獲得目標(biāo)酪蛋白水解物，溫度通常是25-60°C，優(yōu)選45-55。C,pH為3-10，優(yōu)選5-9，特別優(yōu)選5-8。酶促反應(yīng)時(shí)間通常為2-48小時(shí)，優(yōu)選7-15小時(shí)。酶促反應(yīng)的結(jié)束可通過使酶失活進(jìn)行，通常在60-ll(TC下使酶失說活，使反應(yīng)停止。酶促反應(yīng)停止后，可以根據(jù)需要通過離心分離或各種過濾器處理除去沉淀物。味成分i2味成分的除去;使用活性碳或疏水性樹;旨等進(jìn)行。例如，可以在所得水解物中添加相對(duì)于所使用的酪蛋白量為1-20重量％的活性碳，反應(yīng)1-10小時(shí)。所使用的活性碳的除去可通過離心或膜處理操作等7>^口的方法進(jìn)4亍。上述得到的含有動(dòng)物乳酪蛋白水解物或其濃縮物的反應(yīng)液可以直接添加到飲料等液體制品中，用作功能性食品。另外，為了提高動(dòng)物乳酪蛋白水解物的通用性，可以將上述反應(yīng)液濃縮，然后干燥，制成粉末形態(tài)。動(dòng)物乳酪蛋白水解物或其濃縮物中所含的XaaProPro的含有比例相對(duì)于動(dòng)物乳酪蛋白水解物或其濃縮物中肽和游離氨基酸的總量通常為1重量％以上、優(yōu)選1-5重量％。使該含有比例為1重量％以上，可以獲得更高的作用。動(dòng)物乳酪蛋白水解物或其濃縮物中所含的lieProPro或ValProPro的含有比例相對(duì)于動(dòng)物乳酪蛋白水解物或其濃縮物中肽和游離氨基酸的總量分別單獨(dú)為0.3重量％以上，或lieProPro和ValProPro的總量為0.3重量°/。以上都可獲得高效果。并且，在分別含有0.3重量％以上lieProPro和ValProPro時(shí)，可獲得更高的效果。本發(fā)明的有效成分XaaProPro還可以來自用瑞士乳桿菌種的菌4吏含有乳蛋白質(zhì)的原料發(fā)酵獲得的發(fā)酵物。乳桿菌種的菌，可以將瑞士乳桿菌種單獨(dú)用于發(fā)酵，在不損害本發(fā)明的效果的范圍內(nèi)也可以含有其它乳酸菌等。瑞士乳桿菌種的菌優(yōu)選可以高產(chǎn)lieProPro和/或ValProPro的蛋白酶生產(chǎn)菌。例如可優(yōu)選按照Yamamoto等人的根據(jù)Twining等人的方法((Twining,S.Anal.Biochem.)1433410(1984)的方法(Yamamoto，N,等人.J.Biochem.)(1993)114,740)測定的、U/OD590的值為400以上的菌抹。上述優(yōu)選的菌林例如有瑞士乳桿菌CM4林(日本通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，日本國茨城縣筑波市東1丁目l番3號(hào)，郵政編碼305(現(xiàn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心，日本國茨城縣央笫6,郵政編碼305-8566),保藏號(hào)FERMBP-6060,保藏日1997.8.15)(以下稱為CM4抹)。該CM4抹在專利手續(xù)上在基于微生物保藏的國際性認(rèn)可的布達(dá)佩斯條約下，以上述保藏號(hào)注冊，該菌林已經(jīng)獲得專利。用瑞士乳桿菌種的菌使含有乳蛋白質(zhì)的原料發(fā)酵獲得的發(fā)酵物可通過將含有瑞士乳桿菌種的菌林的發(fā)酵乳引子添加到含有乳蛋白質(zhì)的原料中，適當(dāng)選擇發(fā)酵溫度等發(fā)酵條件，通過發(fā)酵獲得。將這樣得到的發(fā)酵物的濃縮物等進(jìn)行冷凍干燥、噴霧干燥等，以粉末形式使用。瑞士乳桿菌種的菌優(yōu)選預(yù)先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，以活性足夠高的引子的形式使用。初始菌數(shù)優(yōu)選為10M(^個(gè)/mL左右。用瑞士乳桿菌種的菌使含有乳蛋白質(zhì)的原料發(fā)酵獲得的發(fā)酵物例如在利用于特定保健用食品等功能性食品中時(shí)，為了使風(fēng)味良好、喜好性良好，可以將酵母與上述瑞士乳桿菌種的菌林并用進(jìn)行發(fā)酵。對(duì)酵母的菌種沒有特別限定，例如優(yōu)選釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等酵母屬酵母等。酵母的含有比例可根據(jù)目的適當(dāng)選擇。含有乳蛋白質(zhì)的原料例如有牛乳、馬乳、羊乳、山羊乳等動(dòng)物乳，以及豆乳等植物乳，它們的加工乳一一脫脂乳、還原乳、乳粉、煉乳，優(yōu)選牛乳、豆乳、它們的加工乳，特別優(yōu)選牛乳或其加工乳。對(duì)乳的固形成分濃度沒有特別限定，例如使用脫脂乳時(shí)，無脂乳固形成分濃度通常為3-15重量％左右，從生產(chǎn)性考慮優(yōu)選6-15重量％。上述發(fā)酵通常通過靜置或攪拌發(fā)酵、例如在發(fā)酵溫度25-45°C、優(yōu)選30-45t:、發(fā)酵時(shí)間3-72小時(shí)、優(yōu)選12-36小時(shí)下、在乳酸酸度達(dá)到1.5%以上時(shí)停止發(fā)酵的方法進(jìn)行。用瑞士乳桿菌種的菌使含有乳蛋白質(zhì)的原料發(fā)酵得到的發(fā)酵物中含有的XaaProPro、優(yōu)選HeProPro和/或ValProPro的含有比例換算為100g該發(fā)酵物的凍干物，優(yōu)選為10mg以上，更優(yōu)選15mg以上。對(duì)于人類，本發(fā)明的心臟壁肥厚抑制劑的給予量或攝取量是每天以通常lOpg-lOg、優(yōu)選1mg-5g、進(jìn)一步優(yōu)選3mg-1g左右的用量，每天分多次給予或攝取有效成分XaaProPro、優(yōu)選ValProPro和/或lieProPro。心臟壁肥厚抑制劑的給予或攝取時(shí)間可以考慮給予或攝取的人或動(dòng)物的年齡、該人或動(dòng)物面對(duì)心力衰竭的危險(xiǎn)因素的環(huán)境等進(jìn)行各種調(diào)節(jié)，例如通常可以是l天以上，優(yōu)選7天-365天。本發(fā)明的心力衰竭預(yù)防劑是以上述三肽作為有效成分。對(duì)于人類，本發(fā)明的心力衰竭預(yù)防劑的給予量或攝取量是每天以通常10昭-10g、優(yōu)選lmg-5g、進(jìn)一步優(yōu)選3mg-lg左右的用量，每天分多次給予或攝取有效成分XaaProPro、優(yōu)選ValProPro和/或lieProPro。心力衰竭預(yù)防劑的給予或攝取時(shí)間可以考慮給予或攝取的人或動(dòng)物的年齡、該人或動(dòng)物面對(duì)心力衰竭的危險(xiǎn)因素的環(huán)境等進(jìn)行各種調(diào)節(jié)，例如通?？梢允莑天以上，優(yōu)選7天-365天。本發(fā)明的心力衰竭預(yù)防劑是以上述三肽作為有效成分。本發(fā)明的心臟肥大預(yù)防劑的給予量或攝取量、以及給予或攝取的時(shí)間與本發(fā)明的心力衰竭預(yù)防劑相同。本發(fā)明的心臟壁肥厚抑制劑、心臟肥大預(yù)防劑以及心力衰竭預(yù)防劑的給予或攝取的方法優(yōu)選為經(jīng)口。使用本發(fā)明的心臟壁肥厚抑制劑、心臟肥大預(yù)防劑以及心力衰竭預(yù)防劑作為藥物時(shí)的形態(tài)可以是用于經(jīng)口給予的制劑的形態(tài)。例如有片劑、丸劑、硬膠嚢劑、軟膠嚢劑、微嚢、散劑、顆粒劑、液體制劑等。制備成藥物的形式時(shí)，例如可以根據(jù)需要適當(dāng)使用制藥可接受的載體、佐劑、賦型劑、補(bǔ)型劑(補(bǔ)形剤)、防腐劑、穩(wěn)定劑、結(jié)合劑、pH調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、增稠劑、凝膠化劑、保存劑、抗氧化劑等，以通常認(rèn)可的制劑給予時(shí)所要求的單位用量形式制備。本發(fā)明的食品含有本發(fā)明的心臟壁肥厚抑制劑作為有效成分，例如可以制成具有心臟壁肥厚抑制作用、心臟肥大預(yù)防和心力衰竭預(yù)防等效能的特定的保健用食品等功能性食品。關(guān)于為獲得上述效能而采取的攝取量，對(duì)于食品、例如功能性食品來講，鑒于日常、連續(xù)性或斷續(xù)性長時(shí)間攝取，人每天的有效成分XaaProPro的攝取量、或者ValProPro和/或lieProPro的攝取量通常為10ILig-10g,優(yōu)選1mg-5g,進(jìn)一步優(yōu)選3mg-lg左右，根據(jù)每天的攝取次數(shù)，可以使食品、例如功能性食品中每次的攝取量比上述量低。含有有效成分XaaProPro的動(dòng)物乳酪蛋白水解物或其濃縮物直接使用時(shí)，對(duì)于人，每天通常攝取1mg-100g、特別是100mg-10g左右該水解物或其濃縮物。直接^f吏用含有有效成分XaaProPro的發(fā)酵物的冷凍干燥物時(shí)，對(duì)于人，以干燥量計(jì)，每天通常攝取1-100g、特別是2-50g左右該發(fā)酵物的冷凍干燥物。本發(fā)明的食品、例如功能性食品的攝取時(shí)間沒有特別限定，優(yōu)選長時(shí)間攝取，為了獲得上述效能，例如通?？梢允?天以上，優(yōu)選7天-365天。本發(fā)明的食品、例如功能性食品含有心臟壁肥厚抑制劑，該心臟壁肥厚抑制劑含有本發(fā)明的有效成分XaaProPro，優(yōu)選含有ValProPro和/或lieProPro，例如，可以將如上所述得到的動(dòng)物乳酪蛋白水解物或其濃縮物、或含有乳蛋白質(zhì)的原料的發(fā)酵物直接或者制成粉末狀或顆粒狀添加到各種食品中。還可以根據(jù)需要添加瑞士乳桿菌以外的乳酸菌的發(fā)酵物、或食品中使用的其它成分，例如糖類、蛋白質(zhì)、脂類、維生素、礦物質(zhì)、風(fēng)味劑例如各種碳水化合物、脂類、維生素類、礦物質(zhì)類、甜味劑、香精、色素、口感改善劑或它們的混合物等添加物，可以改善營養(yǎng)平衡或風(fēng)味等。本發(fā)明的食品例如功能性食品可以制成固形物、凝膠狀物、液體狀物的任何形態(tài)，例如有乳酸菌飲料等發(fā)酵乳制品、各種加工飲料食品、干燥粉末、片劑、膠嚢劑、顆粒劑等，還可以制成各種飲料、酸奶、流食、果凍、糖果、罐頭食品、糖果片、曲奇、蛋糕、面包、餅干、巧克力等。以下采用實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不限于實(shí)施例。(實(shí)施例)[肽合成例]本發(fā)明的有效成分lieProPro和ValProPro按以下所示有機(jī)化學(xué)合成方法(Fmoc法)合成。合成通過使用島津制作所制造的肽自動(dòng)合成裝置(PSSM-8型)的固相法進(jìn)行。固相載體使用50mg樹脂，該樹脂是2-氯三苯曱基(2-Chlorotrityl)型的聚苯乙烯樹脂，結(jié)合有氨基被芴基甲氧基羰基(以下簡稱為Fmoc)保護(hù)的脯氨酸(島津制作所制，注冊商標(biāo)SynProPep樹脂)。按照上述氨ii基酸序歹'j，按照常規(guī)方法，將氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的Fmoc-Ile、Fmoc-Pro和Fmoc-Val各100pmol按照肽序列依次反應(yīng)，獲得結(jié)合有肽的樹脂。接著，將該結(jié)合有肽的樹脂懸浮于1mL反應(yīng)液A(10容量。/。乙酸、10容量％三氟乙醇、80容量％二氯曱烷)，在室溫下反應(yīng)30-60分鐘，從樹脂上切離肽，然后將反應(yīng)液A用玻璃濾器過濾。減壓除去濾液的溶劑，然后立即加入lmL的反應(yīng)液B(82.5容量％三氟乙酸、3容量％乙基曱基硫醚、5容量％純水、5容量％茴香硫醚、2.5容量％乙二硫醇、2容量%苯硫酚)，在室溫下反應(yīng)6小時(shí)，除去側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。向其中加入10mL無水乙醚，4吏肽沉淀，以3000轉(zhuǎn)離心5分鐘，進(jìn)行分離。將該沉淀用無水乙醚清洗數(shù)次，然后吹氮?dú)飧稍?。將這樣得到的未純化的合成肽全部溶解于2mL0.1N鹽酸水溶液中，然后通過采用C18反相柱的HPLC、在以下條件下純化。泵型號(hào)L6200智能泵(日立制作所)，檢測儀用型號(hào)L4000UV檢測器(日立制作所);險(xiǎn)測215nm的紫外部分的吸收，柱74夕口求>夕'^7工75(xC18(々才一夕一乂制備)，洗脫液A液0.1重量。/oTFA水溶液、B'液加入0.1%重量TFA的乙腈(B/A+B)x100(0/0)0—40%(60分鐘)，流速1mL/分鐘。制備顯示最大吸收的洗脫組分，將其冷凍干燥，分別獲得5.7mg、6.5mg目標(biāo)合成肽lieProPro和ValProPro。將純化肽用全自動(dòng)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析裝置(型號(hào)PPSQ-10,島津制作所制造)，由肽的N末端分析，進(jìn)一步通過氨基酸分析裝置(型號(hào)800系列，日本分光制造)進(jìn)行分析，結(jié)果確認(rèn)與所設(shè)計(jì)的一致。將1g來自牛乳的酪蛋白(日本NZMP社制)加入到99g調(diào)節(jié)為約80。C的蒸餾水中，充分?jǐn)嚢瑁缓筇砑?N氫氧化鈉(和光純藥社制)溶液，使pH為7.0,將溫度調(diào)節(jié)為2(TC，制備底物溶液。向所得底物溶液中添加來自米曲霉、至少含有金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、中性蛋白酶I、中性蛋白酶II和亮氨酸氨基肽酶的市售酶(注冊商標(biāo)"只；、*一厶FP，，，新日本化學(xué)工業(yè)社制)，使酶/酪蛋白的重量比為1/25,在50。C下反應(yīng)14小時(shí)。接著在110。C下進(jìn)行10分鐘的高壓釜蒸，使酶失活，獲得酪蛋白酶分解物溶液。接著將所得酶分解物溶液通過噴霧干燥機(jī)干燥，制備粉末。進(jìn)行所得粉末中含有成分的分析。蛋白質(zhì)通過凱氏定氮法測定，氨基酸用氨基酸分析裝置測定。由該蛋白質(zhì)質(zhì)量減去氨基酸，所得的量為肽量。脂類通過酸分解法、灰分通過直接灰化法、水分通過常壓加熱干燥法分別測定。從100°/。中減去各成分，所得的余量為碳水化合物量。結(jié)果氨基酸為35.8重量％,肽為45.7%重量，水分為6.6重量％,脂類為0.2重量％,灰分為4.1重量％,碳水化合物為7.6重量％。<構(gòu)成肽的氨基酸的測定>將上述制備的粉末溶解于適量蒸餾水中，使用自動(dòng)肽分析儀(商品名PPSQ-10(抹)島津制作所制備)進(jìn)行分析，在粉末中，由N末端一側(cè)依次測定氨基酸的位置。自動(dòng)肽分析儀無法檢測游離氨基酸。第5個(gè)殘基的氨基酸合計(jì)為120pmol，第6個(gè)殘基的氨基酸合計(jì)為lOOpmol。由該結(jié)果判定，上述粉末中所含的肽的大部分是二肽和三肽。第2個(gè)殘基的氨基酸為Pro的肽的比例為49.5%,顯著升高。第3個(gè)殘基的氨基酸為Pro的肽的比例為29.8%，也較多。因此，上述粉末中含有大量XaaProPro,這可以推測這些肽是對(duì)于生物體內(nèi)蛋白酶的酶解作用抵抗性高的肽。'<酶解物中所含的肽的測定〉對(duì)于上述酶解物的粉末，使用各種化學(xué)合成標(biāo)準(zhǔn)肽，按照常規(guī)方法求出該粉末中所含的表1所示的三肽量。結(jié)果如表1所示。肽序列粉末10mg/mL中的三肽量(貼/mL)SerProPro2.9ValProPro29.5lieProPro28.1PheProPro27.2其它XaaProPro28.8將上述粉末用蒸餾水稀釋溶解，所得溶液中的肽和游離氨基酸的量為8.15mg/mL，肽量為4.57mg/mL，該肽中的XaaPro量為514.5嗎，13因此XaaPro相對(duì)于粉末中的肽和游離氨基酸的總量的比例為6.3重量%,并且該肽中XaaProPro量為116.5^g，因此XaaProPro相對(duì)于粉末中的肽和游離氨基酸的總量為1.4重量％。使用通過CM4抹使含有乳蛋白質(zhì)的原料發(fā)酵得到的發(fā)酵乳，制備含有本發(fā)明的有效成分XaaProPro的動(dòng)物飼料。將市售的脫脂乳粉用蒸餾水溶解，使固形成分比例為9%(w/w)，通過高壓釜、在105。C下高溫加熱滅菌10分鐘，然后冷卻至室溫，接種3。/。(v/w)CM4抹引子發(fā)酵液(菌數(shù)5x1()8個(gè)/ml)，在37。C在靜置狀態(tài)下發(fā)酵24小時(shí)，得到CM4發(fā)酵乳。將所得CM4發(fā)酵乳在80。C下滅菌，然后通過冷凍干燥獲得粉末。所得冷凍干燥粉末與市售的粉末飼料(商品"CE-2"，日本夕！^T抹式會(huì)社制)按照質(zhì)量比10:90混合，制備固形飼料，作為CM4發(fā)酵乳飼料。該飼料中含有來自CM4發(fā)酵乳的ValProPro34.1mg/kg和lieProPro17.1mg/kg。對(duì)三肽ValProPro(VPP)對(duì)于左心室壁肥厚的抑制效果進(jìn)行試驗(yàn)。將7周齡、雄性Wistar系大鼠(日本工久工/k一林式會(huì)社)以每組9-12只共3組進(jìn)行試驗(yàn)。馴化飼養(yǎng)一周后，使其自由攝取8周下述飲用水以1g/L的濃度溶解一氧化氮合成抑制劑NG-硝基-L-精氨酸曱基酯鹽酸鹽(L-NAME,Sigma社制)得到的飲用水、分別以1g/L和0.3g/L的濃度溶解L-NAME和VPP得到的飲用水、分別以1g/L和0.5mg/L的濃度溶解L-NAME和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑依那普利得到的飲用水。這里，依那普利給予量設(shè)定為與VPP和ACE抑制活性同等。大鼠是在乙醚麻醉下放血致死，摘除心臟后用10%中性緩沖福爾馬林液固定。由固定的心臟水平切斷心房的下部，包含右心室、中隔、左心室和冠狀動(dòng)脈，制成輪狀的組織切片。將組織切片用石蠟包埋，然后用切片機(jī)切薄成3.0-3.5pm的厚度。各大鼠制備2-5個(gè)切片。將切薄的切片用蘇木精/曙紅染色，測定左心室壁的厚度。心室壁厚度的測定是對(duì)一個(gè)切片，在顯微鏡下通過目鏡測微計(jì)實(shí)際測定被認(rèn)為有平均厚度的多個(gè)點(diǎn)的厚度，以該平均厚度作為該切片的測定值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。厚度的測定和評(píng)<介由不知各樣品名的病理學(xué)者進(jìn)行。所得結(jié)果如圖1所示。與只給予L-NAME的組相比，給予L-NAME和VPP的組左心室壁的厚度減小，顯示VPP抑制左心室壁的肥厚，對(duì)心力衰竭的預(yù)防有效。另外，設(shè)定為具有同等的ACE抑制活性的給予量的依那普利未見效果，由此可以確認(rèn)本效果不依賴于ACE抑制。為了確認(rèn)三肽ValProPro(VPP)的右心室壁肥厚的抑制效果，與試-驗(yàn)l同樣進(jìn)行試^r,進(jìn)行測定和評(píng)價(jià)。所得結(jié)果如圖2所示。與只給予L-NAME的組相比，給予L-NAME和VPP的組左心室壁的厚度減小。因此，VPP抑制右心室壁的肥厚，對(duì)心力衰竭的預(yù)防有效。與試驗(yàn)1同樣，依那普利未見效果，由此可以確認(rèn)本效果不依賴于ACE抑制。對(duì)三肽lieProPro(IPP)對(duì)于心室壁肥厚的抑制效果進(jìn)行試驗(yàn)。將7周齡、雄性Wistar系大鼠(日本工只工A少一抹式會(huì)社)以每組9-11只共3組進(jìn)行試驗(yàn)。馴化祠養(yǎng)一周后，使其自由攝取8周下述飲用水以1g/L的濃度溶解L-NAME(Sigma社制)得到的飲用水、分別以1g/L和0.3g/L的濃度溶解L-NAME和IPP得到的飲用水、分別以1g/L和0.5mg/L的濃度溶解L-NAME和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑依那普利得到的飲用水。這里，依那普利給予量設(shè)定為與VPP和ACE抑制活性同等。大鼠是在乙醚麻醉下放血致死，摘除心臟后用10%中性緩沖福爾馬林液固定。由固定的心臟水平切斷心房的下部，4吏包含右心室、中隔、左心室和冠狀動(dòng)脈，制成輪狀的組織切片。將組織切片用石蠟包埋，然后用切片機(jī)切薄成3.0-3.5jLim的厚度。各大鼠制備2-5個(gè)切片。將切薄的切片用蘇木精/曙紅染色，測定左心室壁的厚度。心室壁厚度的測定是對(duì)一個(gè)切片，在顯微鏡下通過目鏡測微計(jì)實(shí)際測定被認(rèn)為有平均厚度的多個(gè)點(diǎn)的厚度，以該平均厚度作為該切片的測定值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。厚度的領(lǐng)'J定和評(píng)價(jià)由不知各樣品名的病理學(xué)者進(jìn)行。所得結(jié)果如圖3所示。與只給予L-NAME的組相比，給予L-NAME和IPP的組左心室壁的厚度減小，顯示IPP抑制左心室壁的肥厚，對(duì)心力衰竭的預(yù)防有效。另外，設(shè)定為具有同等的ACE抑制活性的給予量的依那普利未見效果，由此可以確認(rèn)本效果不依賴于ACE抑制。為了確認(rèn)三肽lieProPro(IPP)的右心室壁肥厚的抑制效果，與試驗(yàn)3同樣進(jìn)行試驗(yàn)，進(jìn)行測定和評(píng)價(jià)。將7周齡、雄性Wistar系大鼠(日本工只工A—林式會(huì)社)以每組9-12只共3組進(jìn)行試驗(yàn)。馴化飼養(yǎng)一周后，使其自由攝取8周下述飲用水以1g/L的濃度溶解L-NAME(Sigma社制)得到的飲用水、分別以1g/L和0.3g/L的濃度溶解L-NAME和IPP得到的飲用水、分別以1g/L和0.5mg/L的濃度溶解L-NAME和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑依那普利得到的飲用水。這里，依那普利給予量設(shè)定為與IPP和ACE抑制活性同等。大鼠是在乙醚麻醉下放血致死，摘除心臟后用10%中性緩沖福爾馬林液固定。由固定的心臟水平切斷心房的下部，4吏包含右心室、中隔、左心室和冠狀動(dòng)脈，制成輪狀的組織切片。將組織切片用石蠟包埋，然后用切片機(jī)切薄成3.0-3.5(xm的厚度。各大鼠制備2-5個(gè)切片。將切薄的切片用蘇木精/曙紅染色，測定右心室壁的厚度。心室壁厚度的測定是對(duì)一個(gè)切片，在顯微鏡下通過目鏡測微計(jì)實(shí)際測定被認(rèn)為有平均厚度的多個(gè)點(diǎn)的厚度，以該平均厚度作為該切片的測定值，確定各個(gè)體的心室壁的厚度。厚度的測定和評(píng)價(jià)由不知各樣品名的病理學(xué)者進(jìn)行。心室壁肥厚的判定是測定不加L-NAME、用通常的自來水祠養(yǎng)的相同周齡的6只大鼠的心室壁的厚度，以其平均作為基準(zhǔn)值。心室壁的厚度比基準(zhǔn)值大則為肥厚，相同或較低的厚度為正常，由有肥厚和正常的大鼠數(shù)進(jìn)行似然比檢驗(yàn)的比較。其結(jié)果如下表2所示。[表2]大鼠右心室壁肥厚的判定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>**:p<0.01通過所得結(jié)果可知，IPP抑制右心室壁的肥厚，IPP對(duì)于心力衰竭的預(yù)防也有效。另外，設(shè)定為同等的ACE抑制活性的給予量的依那普利未見效果，由此可確i人本效果不依賴于ACE抑制。為了確認(rèn)三肽lieProPro(IPP)的心臟中隔壁肥厚的抑制效果，與試馬全3同樣進(jìn)行試-驗(yàn)，進(jìn)行測定和評(píng)價(jià)。所得結(jié)果如圖4所示。與只給予L-NAME的組相比，給予L-NAME和IPP的組心臟中隔壁的厚度減小，顯示IPP抑制心臟中隔壁的肥厚，對(duì)心力衰竭的預(yù)防有效。另外，設(shè)定為具有同等的ACE抑制活性的給予量的依那普利未見效果，由此可以確認(rèn)本效果不依賴于ACE抑制。本發(fā)明的心臟壁肥厚抑制劑在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑未見抑制作用的情形下也顯示有效性，因此作為不依賴ACE抑制活性的心臟肥大或心力衰竭預(yù)防用和/或治療用的藥物、特別是作為預(yù)防劑非常有用。另外，有效成分是來自食品等的天然存在的三肽，因此副作用少，并且有望提供具有高效力的藥物。通過將本發(fā)明的心臟壁肥厚抑制劑用于或添加到飲料或食品中，可以安全且日常攝取，提供有望獲得預(yù)防心臟肥大和心力衰竭的效果的功能性食品。參考文獻(xiàn)1.日本特許第2782142號(hào)公報(bào)2.AmJHypertens.1997Aug;10(8):913~203.J.Clin.Invest.77,1993-2000,19864.最新醫(yī)學(xué)48:1404~1409，19935.J.DairySci.1995,78:777-7836.J.DairySci.1995,78:1253-12577.Am.J.Clin.Nutr.1996,64:767-77圖1表示試驗(yàn)1的ValProPro(VPP)對(duì)大鼠左心室壁肥厚的抑制效果進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果。L-NAME給予組每組11只、L-NAME和依那普利給予組每組9只、L-NAME和VPP給予組每組12只進(jìn)行試驗(yàn)，圖表以平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。通過單側(cè)t-檢驗(yàn)進(jìn)行比較。圖中的符號(hào)(*)表示有顯著差異(p0.05)。圖2表示試驗(yàn)2的ValProPro(VPP)對(duì)大鼠右心室壁肥厚的抑制效果進(jìn)行試纟全的結(jié)果。L-NAME給予組每組11只、L-NAME和依那普利給予組每組9只、L-NAME和VPP給予組每組12只進(jìn)行試驗(yàn)，圖表以平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。通過單側(cè)t-檢驗(yàn)進(jìn)行比較。圖中的符號(hào)(*)表示有顯著差異(p0.05)。圖3表示試驗(yàn)3的lieProPro(VPP)對(duì)大鼠左心室壁肥厚的抑制效果進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果。L-NAME給予組每組9只、L-NAME和依那普利給予組每組9只、L-NAME和IPP給予組每組11只進(jìn)行試驗(yàn)，圖表以平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。通過單側(cè)t-檢驗(yàn)進(jìn)行比較。圖中的符號(hào)(#)表示有顯著差異(pO.l)。圖4表示試馬全5的lieProPro(VPP)對(duì)大鼠心臟中隔壁肥厚的抑制效果進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果。L-NAME給予組每組9只、L-NAME和依那普利給予組每組9只、L-NAME和VPP給予組每組11只進(jìn)行試驗(yàn)，圖表以平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。通過單側(cè)t-檢驗(yàn)進(jìn)行比較。圖中的符號(hào)(*)表示有顯著差異(p0.05)。18權(quán)利要求1.心臟壁肥厚抑制劑，其含有XaaProPro作為有效成分。2.權(quán)利要求1所述的心臟壁肥厚抑制劑，其中，XaaProPro是ValProPro和/或HeProPro。3.權(quán)利要求1或2所述的心臟壁肥厚抑制劑，其中，XaaProPro來自動(dòng)物乳酪蛋白水解物或其濃縮物。4.權(quán)利要求3所述的心臟壁肥厚抑制劑，其中，動(dòng)物乳酪蛋白水解物是通過曲霉菌使動(dòng)物乳酪蛋白發(fā)酵得到的發(fā)酵物。5.權(quán)利要求3所述的心臟壁肥厚抑制劑，其中，動(dòng)物乳酪蛋白水解物是用來自曲霉菌的酶分解動(dòng)物乳酪蛋白得到的分解物。6.權(quán)利要求5所述的心臟壁肥厚抑制劑，其中，來自曲霉菌的酶是來自米曲霉的酶。7.權(quán)利要求1或2所述的心臟壁肥厚抑制劑，其中，XaaProPro來自通過瑞士乳桿菌種的菌使含有乳蛋白質(zhì)的原料發(fā)酵得到的發(fā)酵物。8.權(quán)利要求7所述的心臟壁肥厚抑制劑，其中，瑞士乳桿菌種的菌是瑞士乳桿菌CM4抹(FERMBP-6060)。9.心臟肥大預(yù)防劑，該心臟肥大預(yù)防劑含有權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的心臟壁肥厚抑制劑作為有效成分。10.心力衰竭預(yù)防劑，該心力衰竭預(yù)防劑含有權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的心臟壁肥厚抑制劑作為有效成分。11.功能性食品，該功能性食品含有權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的心臟壁肥厚抑制劑。12.權(quán)利要求11所述的功能性食品，該功能性食品標(biāo)記用于預(yù)防心力衰竭的效能。全文摘要本發(fā)明可提供具有心臟壁肥厚抑制作用的劑、以及含有上述劑的心力衰竭預(yù)防劑或有望獲得心力衰竭預(yù)防效果的功能性食品。本發(fā)明的心臟壁肥厚抑制劑含有XaaProPro作為有效成分。文檔編號(hào)A61K38/00GK101641113SQ20088000972公開日2010年2月3日申請(qǐng)日期2008年3月19日優(yōu)先權(quán)日2007年3月27日發(fā)明者中村哲平,大木浩司,弘田辰彥,高野俊明申請(qǐng)人:卡爾皮斯株式會(huì)社