專利名稱：治療非缺血性心力衰竭的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及治療非缺血性心力衰竭的藥物組合物，其包含作為活性成分的集落刺激因子。本發(fā)明也涉及治療非缺血性心力衰竭的方法，其包含施用集落刺激因子。
背景領域心力衰竭是這樣的狀態(tài)，即減弱的心臟功能使其無法保證全身組織代謝所需的射血，或者此射血只在心室填充壓力升高時完成[ShinRinsho Naikagaku(New Clinical Internal Medicine)，IgakuShoinLtd.，Japan]。缺血性心力衰竭是無法接收到代謝所需的血量而引起的誘導缺癢的心力衰竭，而非缺血性心力衰竭指缺血性心力衰竭之外的心力衰竭。非缺血性心力衰竭包括由心肌病如特發(fā)的、繼發(fā)的或其它形式心肌病的惡化所導致的類型。
人粒細胞-集落刺激因子(G-CSF)是被發(fā)現作為粒細胞譜系造血祖細胞的分化和增殖因子的造血因子，因為其促進體內中性粒細胞的造血，臨床上用作治療伴隨骨髓移植或癌癥化療的中性粒細胞減少的藥劑。除上述效應之外，人G-CSF作用于造血干細胞以刺激它們的分化和增殖。此外，本發(fā)明的發(fā)明人近來報道了G-CSF誘導造血干細胞從骨髓補充到外周血液中，促進它們移動到心肌梗死損傷和分化成心肌細胞，以此減緩心肌梗死后的左心室重建和心力衰竭(Minatoguchi，S.等Circulation，2004(in press))。
然而，不清楚G-CSF是否也對心肌病如擴張性心肌病導致的非缺血性心力衰竭有效。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目標是提供治療由心肌病惡化引起的非缺血性心力衰竭的藥物組合物。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現在心肌病動物模型中，長時間的施用G-CSF，改善了進行性心肌纖維化、左心室重建(remodeling)和心力衰竭。此發(fā)現導致了本發(fā)明的完成。
即，本發(fā)明提供治療非缺血性心力衰竭的藥物組合物，其包含作為活性成分的集落刺激因子。
本發(fā)明也提供治療非缺血性心力衰竭的方法，其包含對有此需要的患者以治療非缺血性心力衰竭的有效量施用作為活性成分的集落刺激因子。
本發(fā)明進一步涉及集落刺激因子在用于治療非缺血性心力衰竭的藥物組合物的制備中的應用。
本發(fā)明進一步提供治療非缺血性心力衰竭的試劑盒(kit)，其包含了治療非缺血性心力衰竭所需的有效劑量的集落刺激因子和使用指南。
附圖簡述

圖1顯示被Masson’s三色染劑染色的心室橫切標本的顯微照片。(A)對照組，(B)G-CSF組。染成藍色的區(qū)域是纖維化的區(qū)域(用箭頭指出)。
圖2顯示骨髓細胞來源的心肌細胞在聚焦激光掃描顯微鏡下觀察的顯微照片。(A)DiI標記的骨髓細胞(紅色，細箭頭)，(B)核的染色(藍色，粗箭頭)，(C)被α-肌節(jié)肌動蛋白染色的心肌細胞(綠色)，(D)(A)到(C)的合并圖。標尺是20μm。
實行本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明涉及治療非缺血性心力衰竭的藥物組合物，其包含作為活性成分的集落刺激因子。非缺血性心力衰竭包含，例如，由心肌病惡化引起的類型。心肌病的例子包括特發(fā)性心肌病如擴張性、肥大的和限制性形式的心肌病，也包括繼發(fā)心肌病如心肌炎和結節(jié)病。本發(fā)明可用于，例如，擴張性心肌病。
集落刺激因子的例子包括粒細胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-單核細胞-集落刺激因子(GM-CSF)和單核細胞-集落刺激因子(M-CSF)。例如，G-CSF可在本發(fā)明中應用。
在G-CSF以本發(fā)明藥物組合物中的活性成分應用的病例中，任何G-CSF都能應用，但優(yōu)選高度純化的產品。具體例子包括哺乳動物G-CSF，尤其人G-CSF或基本具有相同生物活性的其等價物。其中應用的G-CSF可以是任何來源的，包括那些自然產生或那些重組產生的。此重組產生的G-CSF可以具有與自然產生的G-CSF相同的氨基酸序列(例如，JP 2-5395B，JP 62-236488A)，或在氨基酸序列中含有一個或多個氨基酸殘基的刪除、替換和/或添加，而只要它保持了與天然產生的G-CSF相同的生物活性。例如，定點突變(Gotoh，T.等(1995)Gene 152，271-275；Zoller，M.J.和Smith，M.(1983)MethodsEnzymol.100，468-500；Kramer，W.等(1984)Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer，W.和Fritz H.J.(1987)MethodsEnzymol.154，350-367；Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488-492；Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，2763-2766)或其它技術能被用于在G-CSF的氨基酸序列中引入合適的突變，以此制備在功能上與G-CSF等同的多肽。同樣地，氨基酸突變也會在自然界中發(fā)生。已經眾所周知，通過一個或多個氨基酸殘基的刪除和/或添加，和/或其它氨基酸對它們的置換，由一種氨基酸序列修飾得到的另一種氨基酸序列的多肽，保持了與原始多肽相同的生物活性(Mark，D.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666；Zoller，M.L.和Smith，M.Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500；Wang，A.等，Science(1984)224，1431-1433；Dalbadie-McFarland，G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。
因此，其氨基酸序列包含了G-CSF氨基酸序列一個或多個氨基酸突變而功能上與G-CSF等同的多肽也能在本發(fā)明的藥物組合物中應用。在這樣的多肽中的突變氨基酸數目通常高達30個氨基酸，優(yōu)選高達15個氨基酸，更優(yōu)選高達5個氨基酸(例如，多達3個氨基酸)。
在替換突變體中，氨基酸替換最好以保持氨基酸側鏈的特性方式產生。這種氨基酸替換可利用的氨基酸實例包括疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)，親水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，具有脂肪族側鏈的氨基酸(G、A、V、L、I、P)，具有含羥基側鏈的氨基酸(S、T、Y)，具有含硫側鏈的氨基酸(C、M)，具有含羧酸或氨基側鏈的氨基酸(D、N、E、Q)，具有含堿側鏈的氨基酸(R、K、H)，和具有芳香族側鏈的氨基酸(H、F、Y、W)(括號中的大寫字母指單字母符號中的對應氨基酸)。
含有在G-CSF氨基酸序列中數個氨基酸殘基的添加的多肽包括了含有G-CSF的融合多肽。融合多肽是G-CSF和其它多肽間的融合產物，而這些多肽也能在本發(fā)明中應用。為制備融合多肽，例如，可將編碼G-CSF的DNA和編碼不同多肽的DNA在閱讀框中連接在一起，引入合適的表達載體，然后在合適的宿主中表達。其他與G-CSF融合的多肽沒有限制，而無論如何只要得到的融合多肽保持與G-CSF一樣的生物活性。
已有許多關于G-CSF氨基酸序列中帶有突變的G-CSF衍生物的報道，而應用這些已知的G-CSF衍生物也有可能(例如，USP 5,581,476，USP 5,214,132，USP 5,362,853，USP 4,904,584)。
此外，應用化學性修飾的G-CSF也有可能?；瘜W性修飾的G-CSF實例包括那些對糖鏈結構性改變，添加和/或刪除而修飾的類型，也包括那些和化合物如聚乙二醇結合的類型(例如，USP 5,824,778，USP5,824,784，WO 96/11953，WO 95/21629，WO 94/20069，USP 5,218,092，JP 4-164098A)。
本發(fā)明所用的G-CSF可通過任何方式制備，例如通過培養(yǎng)人腫瘤細胞系或通過在大腸桿菌細胞、酵母細胞、例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、C127細胞、COS細胞、骨髓瘤細胞或BHK細胞的哺乳動物細胞或昆蟲細胞中基因工程化的生產而制備。如此制備的G-CSF在使用前以多種方式被抽提、分離和純化(例如JP 1-44200B，JP 2-5395B，JP 62-129298A，JP 62-132899A，JP 62-236488A，JP 64-85098A)。
如果需要，根據施用模式和劑量形式，治療非缺血性心力衰竭的本發(fā)明藥物組合物可適當地補充加入下列試劑懸浮劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、防腐劑、抗吸附劑、表面活性劑、稀釋劑、賦形劑、pH調節(jié)物、光滑劑、緩沖劑、含硫的還原劑、抗氧化劑等。
懸浮劑實例包括甲基纖維素、Polysorbate 80、羥乙基纖維素、阿拉伯膠、粉末化的黃芪膠、羧甲基纖維素鈉和聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯。
增溶劑實例包括聚氧乙烯氫化蓖麻油、Polysorbate 80、煙酰胺、聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯、Magrogol和蓖麻油脂肪酸乙酯。
穩(wěn)定劑實例包括Dextran 40、甲基纖維素、明膠、亞硫酸納和焦亞硫酸納(sodium metasulfide)。
等滲劑實例包括D-甘露糖醇和山梨醇。
防腐劑實例包括對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚和氯甲酚。
抗吸附劑實例包括人血清白蛋白、卵磷脂、葡聚糖、環(huán)氧乙烷環(huán)氧丙烷共聚物、羥丙基纖維素、甲基纖維素、聚氧乙烯氫化蓖麻油和聚乙二醇。
含硫的還原劑實例包括那些具有巰基基團的化合物如N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰同型半胱氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代乙醇胺、硫甘油、硫山梨醇、巰基乙酸和它的鹽、硫代硫酸鈉、谷胱甘肽和C1-C7的硫鏈烷酸。
抗氧化劑實例包括異抗壞血酸、二丁基羥基甲苯、丁基羥基苯甲醚、α-維生素E、維生素E乙酸酯、L-抗壞血酸和它的鹽、L-棕櫚酸抗壞血酸酯、L-硬脂酸抗壞血酸酯、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、焙酸三戊酯和焙酸丙酯，也包括螯合劑如乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)、焦磷酸鈉和偏磷酸納。
此外，本發(fā)明的藥物組合物可包括其他普遍使用的成分，例如無機鹽如氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、磷酸鈉、磷酸鉀和碳酸氫鈉，也例如有機鹽如檸檬酸鈉、檸檬酸鉀和醋酸鈉。
治療非缺血性心力衰竭的本發(fā)明藥物組合物能以注射(例如皮下、皮內、肌肉內、靜脈內或腹膜內注射)的劑型，適于經皮、經粘膜或經鼻施用的任何劑型，或適于口服施用的任何劑型(例如片劑、膠囊、顆粒、溶液、懸浮液)而施予，但不限于這些形式。
在本發(fā)明的藥物組合物中，施用的劑量和頻率能被本領域的技術人員通過考慮將要治療的疾病患者的癥狀而合理確定。G-CSF的單一劑量通常是每個成人0.1到100μg/kg，優(yōu)選每個成人1到10μg/kg，通常每周以每日一次到三次施用一到七天，但不限于此。
包含作為活性成分的集落刺激因子的治療非缺血性心力衰竭的本發(fā)明藥物組合物，對非缺血性心力衰竭的治療和/或防止有效。
本發(fā)明的試劑盒(kit)包含集落刺激因子，一種或多種藥學上可接受的適當的載體等(如果需要)，也包含使用指南。
本發(fā)明現在將在下列的實施例中進一步闡述，其意圖不在于限制本發(fā)明的范圍。
實施例心肌病的動物模型被用于檢查G-CSF的施用是否會防止心肌病誘導的心力衰竭的發(fā)展。
(1)實驗程序心力衰竭的動物模型UM-X7.1心肌病倉鼠缺乏δ-sarcoglycan基因(Sakamoto A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997，9413873-13878)，在出生后四周齡時開始失去心肌細胞(Jasmin G.等，Muscle Nerve 1982，520-25)。隨后，該動物經歷伴隨心肌細胞丟失的的多重損傷的進行性形成，并發(fā)展為明顯的纖維化，這導致心臟擴大和/或心力不足，最后引起心力衰竭的死亡。在自然過程中，30周齡的存活率是大約50％。
G-CSF施用的程序實驗1對16只雄性UM-X7.1心肌病倉鼠(出生后15周齡)根據施用時間表進行處理，在時間表中，以10μg/kg/天連續(xù)5天皮下注射G-CSF，然后停藥2天。該處理一直持續(xù)15周，直到30周齡時為止。作為對照組，相同年齡的15只雄性UM-X7.1倉鼠也以同樣方式皮下注射蒸餾水。在30周齡時，比較兩個組的存活率，和進行血液動力學、組織學、生物化學評估。
實驗2根據上述施用時間表施用G-CSF或蒸餾水2周后(每組中n＝6)，對動物進行Evans藍染液的腹膜內注射，以檢查此染液到心肌細胞的吸收。
實驗3進一步完成隨后的實驗以檢測骨髓細胞補充到心肌和它們分化成心肌細胞現象的存在或缺乏。骨髓細胞從每一雄性UM-X7.1倉鼠(出生后15周齡)的股骨中收集，用DiI染料標記，然后再植入動物的髓腔中。根據上面的施藥時間表施用G-CSF或蒸餾水(每組中n＝6)之后，來自每一動物的心肌兩周后進行組織學檢測。
血液動力學評估采用超聲診斷設備SSD-2000(Aloka)通過超聲心動描記術完成此評估。
組織學評估在實驗1中，10％福爾馬林固定和石蠟包埋的心室橫切片(4μm)用Masson’s三色染劑染色以鑒別心肌纖維化的區(qū)域，隨后用圖像分析儀Luzex-F(NIRECO)進行定量分析。每一心臟的又一部分也被進行電鏡固定和在電鏡下觀察。
實驗2和3中的心臟被制備成冰凍樣本。
生物化學評估明膠酶譜法被用于檢測基質金屬蛋白酶(MMP)在心肌組織中的活性。
激光聚焦掃描顯微鏡從得到DiI標記骨髓細胞再植的動物制得的心肌冰凍切片(6μm)被用α-肌節(jié)肌動蛋白免疫熒光染色，然后在激光聚焦掃描顯微鏡(Zweiss)下觀察。
免疫組織化學心肌組織的石蠟切片(4μm)以抗δ-sarcoglycan的抗體用ABC試劑盒(Vector Laboratories)免疫染色。
統(tǒng)計學分析數字性數據以均值±標準差形式表示。用Student’s T-檢驗進行兩組的比較，而用Kaplan-Meier方法進行存活率的比較。P＜0.05被認為是統(tǒng)計學上顯著。
(2)結果存活率30周齡的存活率在G-CSF組中是100％，在對照組中是53％，說明G-CSF的施用對存活率提供顯著的改善(p＜0.0001)。
血液動力學和左心室重建超聲心動描記評估證明，因為G-CSF組的左心室射血部分(EF)和左心室的部分縮減(fraction shortening，％FS)都有顯著改善，G-CSF組表現出改善的左心室收縮功能。此外，評估也證明，因為G-CSF組顯示出左心室舒張末期直徑(LVEDD)和左心室收縮末期直徑(LVESD)相對于對照組都有顯著減少(表1)，所以在G-CSF組中防止了左心室的重建。
當解剖尸體測量器官重量時，雖然兩組間的體重沒有差異，G-CSF組中的心臟重量/體重和肺重量/體重的比率明顯小于對照組(表1)。
表1 血液動力學和左心室重建的參數比較

左心室纖維化相對于對照組(20.2±6.5％)，G-CSF組中的左心室纖維化區(qū)域的百分比顯著降低(8.6±4.0％)(p＜0.0001)(圖1)。
明膠酶譜法證明相對于對照組(數據未顯示)，G-CSF組顯示出心肌組織中MMP-2和MMP-9活性的增加。
心肌細胞的超微形態(tài)學對照組中30周大的倉鼠被發(fā)現在其心臟中存在大量含有退化線粒體和顯現出自體吞噬性退化的心肌細胞，而此 在G-CSF組中的頻率減小。
心肌細胞的細胞膜滲透性(脆弱性)在實驗2中，對照組被發(fā)現存在 Evans藍染料的心肌細胞，即，其細胞膜滲透性增加(0.75±0. )，而G-CSF組中的此類細胞頻率減小(0.071±0.004％)。
骨髓細胞向心肌細胞的分化當在激光聚焦掃描顯微鏡下觀察時，DiI-陽性和α-肌節(jié)肌動蛋白陽性細胞，即，骨髓細胞來源的心肌細胞在G-CSF組的心肌組織中被發(fā)現(圖2)。
δ-sarcoglycan兩組中任一組都未觀察到δ-sarcoglycan在心肌組織中的表達(數據未顯示)。
(3)討論如上述所證明的，G-CSF的長期施用改善了心肌病動物模型中的進行性心肌纖維化，左心室重建和心力衰竭。G-CSF這種效用的機理可由至少以下4種可能來解釋1)骨髓細胞補充到心肌組織和分化成心肌細胞所引起的心肌再生效應；2)對心肌細胞丟失的抑制效應；3)對心肌纖維化的抑制效應；和4)抗細胞因子效應1)當在激光聚焦掃描顯微鏡下觀察時，骨髓細胞來源的DiI染料標記和α-肌節(jié)肌動蛋白陽性細胞(即心肌細胞)在G-CSF組的心肌組織中被發(fā)現的事實支持了通過G-CSF的心肌再生的可能性。
2)超微形態(tài)學觀察和Evans藍染支持了G-CSF對心肌細胞的抗自體吞噬性退化/死亡效應的可能性。對心肌細胞丟失的抑制效應(即對心肌細胞的保護效應)可由以下事實所充分推斷，即伴隨心肌細胞丟失的損傷在G-CSF組中較小，正如左心室纖維化區(qū)域的百分比降低所指明的一樣。
3)根據圖1，G-CSF的抗纖維化效應明顯。正如G-CSF組心肌中MMP活性增加所指明的，存在另外的可能性即G-CSF也通過增加MMP活性而促進了膠原纖維的降解，因此產生抗纖維化的效應。
4)已知心力衰竭導致血液中細胞因子水平的提高，包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)?？傊?，TNF-α顯示出對心臟功能具有抑制效應(Meldrum DR.，Am.J.Physiol.1998，274R577-R595)。因此估計G-CSF將抑制這些細胞因子，由此而改善心臟功能。
這說明G-CSF對人擴張性心肌病有效。
產業(yè)適用性集落刺激因子的長期施用使針對由心肌病惡化引起的非缺血性心力衰竭的治療成為可能。
權利要求
1.治療非缺血性心力衰竭的藥物組合物，其包含作為活性成分的集落刺激因子。
2.根據權利要求1的藥物組合物，其中非缺血性心力衰竭由心肌病惡化引起。
3.根據權利要求2的藥物組合物，其中心肌病是特發(fā)性心肌病。
4.根據權利要求3的藥物組合物，其中特發(fā)性心肌病是擴張性心肌病。
5.根據權利要求1到4中的任一項的藥物組合物，其中集落刺激因子是粒細胞集落刺激因子。
6.治療非缺血性心力衰竭的方法，其包含對有此需要的患者以治療非缺血性心力衰竭的有效量施用作為活性成分的集落刺激因子。
7.集落刺激因子在用于治療非缺血性心力衰竭的藥物組合物的制備中的應用。
8.治療非缺血性心力衰竭的試劑盒，其包含了治療非缺血性心力衰竭所需的有效劑量的集落刺激因子和使用指南。
全文摘要
本發(fā)明的目標是提供治療由心肌癥惡化引起的非缺血性心力衰竭的藥物組合物。集落刺激因子的長期施用改善進行性心肌纖維化，左心室重塑和心力衰竭。
文檔編號A61P9/00GK1738638SQ200380108979
公開日2006年2月22日 申請日期2003年12月11日 優(yōu)先權日2002年12月13日
發(fā)明者藤原久義, 竹村元三 申請人:藤原久義