專利名稱：預(yù)防性和治療性流感疫苗、抗原、組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
無
背景技術(shù)：
流感具有很長的歷史，其特征為反復(fù)不斷的大范圍流行性、流行性、復(fù)發(fā)性和爆發(fā)性。流感是高度傳染性疾病，其在發(fā)展中國家和發(fā)達(dá)國家中會具有同樣的破壞性。流感病毒是對人類群體的主要威脅之一。盡管每年都進(jìn)行疫苗接種工作，但流感感染仍然導(dǎo)致大量發(fā)病率和死亡率。雖然幾乎每年都會發(fā)生流感流行病，但幸運的是大范圍流行病并不經(jīng)常發(fā)生。然而，最新流感病毒株已經(jīng)出現(xiàn)，使得我們再次面對流感大范圍流行病的可能性。目前在亞洲以及東歐地區(qū)造成家禽流行病的H5N1型禽流感病毒已在全球范圍持續(xù)傳播。感染的快速擴(kuò)散以及從鳥類到人類個體的跨物種傳播增加人類群體爆發(fā)和大范圍流行病風(fēng)險的可能性。所述病毒具有高度致病性，導(dǎo)致超過50％的鳥類死亡率以及少數(shù)已被確診的人類病例。如果病毒獲得人類向人類傳播，那么將有可能會導(dǎo)致快速的大范圍疾病和死亡。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供改良的流感抗原(例如流感抗原多肽)、組合物、疫苗和給藥方案。本發(fā)明提供流感抗原多肽，諸如血細(xì)胞凝集素多肽和/或神經(jīng)氨酸酶多肽。本發(fā)明提供包含至少一種植物產(chǎn)流感抗原多肽的亞單位疫苗。本發(fā)明的亞單位疫苗通常包含至少一種植物產(chǎn)流感抗原多肽和醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑。
在一些實施例中，當(dāng)向個體投予相對低的劑量時，所述疫苗組合物具有免疫原性和/或保護(hù)性。
在一些實施例中，用于亞單位疫苗中的植物產(chǎn)流感多肽是從植物材料中純化而來。在一些實施例中，用于亞單位疫苗中的植物產(chǎn)流感多肽不是從植物材料中純化而來。
本發(fā)明提供在個體中誘導(dǎo)對抗流感感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)的方法，其包含向個體投予有效量的包含至少一種植物產(chǎn)流感抗原多肽的疫苗組合物。
本發(fā)明提供在植物中產(chǎn)生流感抗原多肽的方法和系統(tǒng)。所述方法一般包括使用病毒表達(dá)載體。在一些實施例中，如本文所述，所述方法涉及二元載體(binary vector)，諸如“投放載體(launch vector)”。在一些實施例中，在樹苗(例如發(fā)芽的籽苗)中產(chǎn)生流感抗原多肽。本發(fā)明提供適用于在植物中表達(dá)流感抗原多肽的核酸構(gòu)筑體以及含有所述核酸構(gòu)筑體的宿主細(xì)胞。
定義 氨基酸如本文中所使用，術(shù)語“氨基酸”在其最廣泛意義上是指任何可并入多肽鏈中的化合物和/或物質(zhì)。在一些實施例中，氨基酸具有通用結(jié)構(gòu)H2N-C(H)(R)-COOH。在一些實施例中，氨基酸為天然存在的氨基酸。在一些實施例中，氨基酸為合成氨基酸；在一些實施例中，氨基酸為D-氨基酸；在一些實施例中，氨基酸為L-氨基酸?！皹?biāo)準(zhǔn)氨基酸”是指天然存在的肽中常見的二十種標(biāo)準(zhǔn)L-氨基酸中的任一種。“非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸”是指除標(biāo)準(zhǔn)氨基酸以外的任何氨基酸，這與其是合成制備還是從天然來源獲得無關(guān)。如本文中所使用，“合成氨基酸”涵蓋經(jīng)化學(xué)修飾的氨基酸，包括(但不限于)鹽、氨基酸衍生物(諸如酰胺)和/或取代。肽中的氨基酸(包括羧基端和/或氨基端氨基酸)可通過甲基化、酰胺化、乙?；?或用其它可改變所述肽的循環(huán)半衰期而不會不利地影響其活性的化學(xué)基團(tuán)取代來修飾。氨基酸可能會參與二硫鍵。術(shù)語“氨基酸”可與“氨基酸殘基”互換使用并且可以指游離氨基酸和/或肽的氨基酸殘基。可從使用術(shù)語的上下文明了其是指游離氨基酸還是肽的殘基。
動物如本文中所使用，術(shù)語“動物”是指動物界的任何成員。在一些實施例中，“動物”是指處于任何發(fā)育階段的人類。在一些實施例中，“動物”是指處于任何發(fā)育階段的非人類動物。在某些實施例中，所述非人類動物為哺乳動物(例如嚙齒動物、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、貓、綿羊、牛、靈長類動物和/或豬)。在一些實施例中，動物包括(但不限于)哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物、魚類、昆蟲和/或蠕蟲。在一些實施例中，動物可為轉(zhuǎn)基因動物、遺傳工程改造動物和/或克隆。
抗體如本文中所使用，術(shù)語“抗體”是指天然或完全或部分合成產(chǎn)生的任何免疫球蛋白。其維持特定結(jié)合能力的所有衍生物也都包括在所述術(shù)語中。所述術(shù)語還涵蓋具有與免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源或基本上同源的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)可以來源于天然來源，或部分或完全合成產(chǎn)生?？贵w可為單克隆或多克隆抗體?？贵w可為任何免疫球蛋白類別的成員，包括任何人類類別IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。如本文中所使用，術(shù)語“抗體片段”或“抗體的特征性部分”可互換使用并且是指小于全長的任何抗體衍生物。一般來說，抗體片段至少保留全長抗體的特定結(jié)合能力的相當(dāng)大部分。抗體片段的實例包括(但不限于)Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、Fv、dsFv雙功能抗體和Fd片段?？贵w片段可以通過任何方式來產(chǎn)生。舉例來說，抗體片段可以通過裂解完整抗體以酶促方式或以化學(xué)方式產(chǎn)生和/或其可以由編碼部分抗體序列的基因重組產(chǎn)生。其它或另外，抗體片段可以完全或部分合成產(chǎn)生?？贵w片段可以任選包含單鏈抗體片段。其它或另外，抗體片段可以包含例如由二硫鍵連接在一起的多個鏈?？贵w片段可以任選包含多分子復(fù)合物。功能性抗體片段通常包含至少約50個氨基酸且更通常包含至少約200個氨基酸。
約如本文中所使用，術(shù)語“約(approximately/about)”在應(yīng)用于一個或多個所關(guān)注值時是指類似于所述參考值的值。在某些實施例中，除非另有規(guī)定或另外從上下文顯而易見(除了所述數(shù)值將超過可能值的100％的情況以外)，否則術(shù)語“約”是指處于所述參考值在任一方向(大于或小于)上的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小以內(nèi)的值范圍。
特征性部分如本文中所使用，短語蛋白質(zhì)或多肽的“特征性部分”是含有一段連續(xù)氨基酸或共同作為蛋白質(zhì)或多肽的特點的許多段連續(xù)氨基酸的部分。各所述連續(xù)段一般將含有至少兩個氨基酸。此外，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，通常需要至少5個、至少10個、至少15個、至少20個或更多氨基酸表現(xiàn)蛋白質(zhì)的特點。一般來說，特征性部分是除以上所指定的序列特性外還與相關(guān)完整蛋白質(zhì)共有至少一種功能性特征的部分。
特征性序列“特征性序列”是存在于多肽或核酸家族的所有成員中的序列，且因此所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可用來定義家族的成員。
組合療法如本文中所使用，術(shù)語“組合療法”是指以重疊方案投予兩種或兩種以上不同醫(yī)藥劑以使個體同時接觸兩種藥劑的那些情形。
給藥方案如本文中所使用，“給藥方案”是指間隔一定時段個別地投予的一組單位劑量(通常是一個以上)。推薦用于特定醫(yī)藥劑的劑量組(即，投藥量、時序、途徑等)構(gòu)成其給藥方案。
表達(dá)如本文中所使用，核酸序列的“表達(dá)”是指一個或多個以下事件(1)從DNA序列產(chǎn)生RNA模板(例如通過轉(zhuǎn)錄)；(2)加工RNA轉(zhuǎn)錄物(例如通過拼接、編輯和/或3′末端形成)；(3)將RNA翻譯為多肽或蛋白質(zhì)；(4)多肽或蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。
基因如本文中所使用，術(shù)語“基因”具有如所屬領(lǐng)域中所了解的含義。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，術(shù)語“基因”可以包括基因調(diào)控序列(例如啟動子、增強子等)和/或內(nèi)含子序列。應(yīng)進(jìn)一步了解，基因的定義包括提及不編碼蛋白質(zhì)而是編碼功能性RNA分子(諸如tRNA)的核酸。為了清楚起見，我們應(yīng)注意，如本申請案中所使用，術(shù)語“基因”一般是指編碼蛋白質(zhì)的核酸的一部分；所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員從上下文可顯而易見，所述術(shù)語可任選涵蓋調(diào)控序列。這一定義并不打算排除對不編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)單元應(yīng)用術(shù)語“基因”，而是澄清在大多數(shù)情況下，如本文獻(xiàn)中所使用的所述術(shù)語是指編碼蛋白質(zhì)的核酸。
基因產(chǎn)物如本文中所使用，術(shù)語“基因產(chǎn)物”或“表達(dá)產(chǎn)物”一般是指從基因轉(zhuǎn)錄的RNA(加工前和/或加工后)或由從所述基因轉(zhuǎn)錄的RNA所編碼的多肽(修飾前和/或修飾后)。
HA多肽如本文中所使用，術(shù)語“血細(xì)胞凝集素多肽”或“HA多肽”是指與表1中所列的一種或多種HA多肽顯示至少50％總體序列一致性的多肽。在一些實施例中，HA多肽與所列HA多肽顯示至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。在一些實施例中，HA多肽與所列HA多肽進(jìn)一步共有至少一個特征性序列元件。
同源性如本文中所使用，術(shù)語“同源性”是指聚合分子之間，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之間和/或多肽分子之間的總體相關(guān)性。在一些實施例中，如果聚合分子的序列至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％一致，那么認(rèn)為這些聚合分子彼此“同源”。在一些實施例中，如果聚合分子的序列至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％類似，那么認(rèn)為這些聚合分子彼此“同源”。
一致性如本文中所使用，術(shù)語“一致性”是指聚合分子之間，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之間和/或多肽分子之間的總體相關(guān)性。舉例來說，兩個核酸序列的一致性百分比的計算可通過出于最佳比較目的對準(zhǔn)兩個序列來進(jìn)行(例如，可將間隙引入第一和第二核酸序列中的一個或兩個中以便最佳對準(zhǔn)且出于比較目的可以忽略非一致序列)。在某些實施例中，出于比較目的所對準(zhǔn)的序列長度為參考序列長度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。接著比較相應(yīng)核苷酸位置的核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈恢梦幢慌c第二序列中的相應(yīng)位置相同的核苷酸占據(jù)時，則所述分子在那個位置上是一致的。兩個序列之間的一致性百分比與所述序列共有的一致位置的數(shù)目有關(guān)，并且考慮最佳對準(zhǔn)兩個序列需要引入的間隙的數(shù)目和各間隙的長度。序列的比較和兩個序列之間的一致性百分比的測定可以使用數(shù)學(xué)算法來完成。舉例來說，兩個核苷酸序列之間的一致性百分比可以使用邁爾(Meyers)和米勒(Miller)(生物科學(xué)中的計算機(jī)應(yīng)用(CABIOS)，1989，411-17)的算法來測定，所述算法已并入使用PAM120權(quán)數(shù)殘基表、間隙長度罰分12和間隙罰分4的ALIGN程序(2.0版)中。或者，兩個核苷酸序列之間的一致性百分比可以使用GCG軟件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩陣來測定。如本文中所使用，術(shù)語“總體一致性”是指一長段序列中的一致性。在一些實施例中，總體一致性是指至少50個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、250個、300個、400個、500個或更多個氨基酸和/或核苷酸中的一致性。在一些實施例中，總體一致性是指指定序列的完整長度中的一致性。
起始如本文中所使用，術(shù)語“起始”在應(yīng)用于給藥方案時可用于指第一次向先前未接受醫(yī)藥劑的個體投予所述醫(yī)藥劑。其它或另外，術(shù)語“起始”可用于指在患者治療期間投予特定單位劑量的醫(yī)藥劑。
經(jīng)分離的如本文中所使用，術(shù)語“經(jīng)分離的”是指已經(jīng)如下的物質(zhì)和/或?qū)嶓w(1)與至少一些在最初產(chǎn)生(在自然界中和/或在實驗環(huán)境中)時與其結(jié)合的組分分離；和/或(2)人工產(chǎn)生、制備和/或制造。經(jīng)分離的物質(zhì)和/或?qū)嶓w可以與最初與其結(jié)合的其它組分的至少約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約98％、約99％或100％分離。在一些實施例中，經(jīng)分離的藥劑的純度大于約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、實質(zhì)上100％或100％。如本文中所使用，如果物質(zhì)實質(zhì)上不含其它組分，那么其是“純的”。如本文中所使用，術(shù)語“經(jīng)分離的細(xì)胞”是指不包含在多細(xì)胞生物體中的細(xì)胞。
地衣多糖酶(lichenase)多肽如本文中所使用，術(shù)語“地衣多糖酶多肽”是指與表3中所列的一種或多種地衣多糖酶多肽顯示至少50％總體序列一致性的多肽。在一些實施例中，地衣多糖酶多肽與所列地衣多糖酶多肽顯示至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。在一些實施例中，地衣多糖酶多肽與所列地衣多糖酶多肽進(jìn)一步共有至少一個特征性序列元件。
低劑量如本文中提及亞單位疫苗時所使用，術(shù)語“低劑量”是指小于100μg植物產(chǎn)抗原(例如流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分)和/或包含植物產(chǎn)抗原的疫苗組合物的劑量。在一些實施例中，低劑量是指小于約90μg、小于約80μg、小于約70μg、小于約60μg、小于約50μg、小于約40μg、小于約30μg、小于約25μg、小于約20μg、小于約15μg、小于約5μg、小于約4μg、小于約3μg、小于約2μg或小于約1μg植物產(chǎn)抗原(例如流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分)和/或包含植物產(chǎn)抗原的疫苗組合物的劑量。
NA多肽如本文中所使用，術(shù)語“神經(jīng)氨酸酶多肽”或“NA多肽”是指與表2中所列的一種或多種NA多肽顯示至少50％總體序列一致性的多肽。在一些實施例中，NA多肽與所列NA多肽顯示至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。在一些實施例中，NA多肽與所列NA多肽進(jìn)一步共有至少一個特征性序列元件。
核酸如本文中所使用，術(shù)語“核酸”在其最廣泛意義上是指并入或可以并入寡核苷酸鏈中的任何化合物和/或物質(zhì)。在一些實施例中，核酸是經(jīng)由磷酸二酯鍵并入或可以經(jīng)由磷酸二酯鍵并入寡核苷酸鏈中的化合物和/或物質(zhì)。在一些實施例中，“核酸”是指個別核酸殘基(例如核苷酸和/或核苷)。在一些實施例中，“核酸”是指包含個別核酸殘基的寡核苷酸鏈。如本文中所使用，術(shù)語“寡核苷酸”和“聚核苷酸”可互換使用。在一些實施例中，“核酸”涵蓋RNA以及單鏈和/或雙鏈DNA和/或cDNA。此外，術(shù)語“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或類似術(shù)語包括核酸類似物，即具有非磷酸二酯主鏈的類似物。舉例來說，所屬領(lǐng)域中已知且在主鏈中具有肽鍵以代替磷酸二酯鍵的所謂“肽核酸”被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。術(shù)語“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括互為簡并形式和/或編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質(zhì)和/或RNA的核苷酸序列包括內(nèi)含子。核酸可以從天然來源純化，使用重組表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生且任選純化，化學(xué)合成等。適當(dāng)時，例如在化學(xué)合成分子的情況下，核酸可以包含核苷類似物，諸如具有經(jīng)化學(xué)修飾的堿基或糖、主鏈修飾等的類似物。除非另有指示，否則核酸序列以5′到3′方向呈現(xiàn)。術(shù)語“核酸區(qū)段”在本文中用于指作為較長核酸序列的一部分的核酸序列。在許多實施例中，核酸區(qū)段包含至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個或10個以上殘基。在一些實施例中，核酸是以下物質(zhì)或包含以下物質(zhì)天然核苷(例如腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥苷和脫氧胞苷)；核苷類似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、(N-吡咯基)-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脫氮腺苷、7-脫氮鳥苷、8-氧代腺苷、8-氧代鳥苷、O(6)-甲基鳥嘌呤和2-硫代胞苷)；經(jīng)化學(xué)修飾的堿基；經(jīng)生物修飾的堿基(例如甲基化堿基)；插入的堿基；經(jīng)修飾的糖(例如2′-氟核糖、核糖、2′-脫氧核糖、阿拉伯糖和己醣)；和/或經(jīng)修飾的磷酸酯基(例如硫代磷酸酯和5′-N-亞磷酰胺鍵聯(lián))。在一些實施例中，本發(fā)明可能具體涉及“未經(jīng)修飾的核酸”，其意思是尚未經(jīng)化學(xué)修飾以促進(jìn)或?qū)崿F(xiàn)傳遞的核酸(例如聚核苷酸和殘基，包括核苷酸和/或核苷)。
可操作地連接如本文中所使用，術(shù)語“可操作地連接”是指兩個核酸序列之間的關(guān)系，其中一個核酸序列的表達(dá)受另一核酸序列控制、調(diào)控、調(diào)節(jié)等。舉例來說，核酸序列的轉(zhuǎn)錄受可操作地連接的啟動子序列指導(dǎo)；核酸的轉(zhuǎn)錄后加工受可操作地連接的加工序列指導(dǎo)；核酸序列的翻譯受可操作地連接的翻譯調(diào)控序列指導(dǎo)；核酸或多肽的轉(zhuǎn)運或定位受可操作地連接的轉(zhuǎn)運或定位序列指導(dǎo)；且多肽的翻譯后加工受可操作地連接的加工序列指導(dǎo)?？刹僮鞯剡B接于第二核酸序列的核酸序列可以直接或間接共價連接于所述序列，不過任何有效三維結(jié)合都是可接受的。
醫(yī)花劑如本文中所使用，短語“醫(yī)藥劑”是指當(dāng)投予個體時具有治療作用和/或引發(fā)所需生物和/或藥理作用的任何藥劑。
醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑或賦形劑如本文中所使用，術(shù)語“醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑或賦形劑”的意思是任何類型的無毒、惰性固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、囊封材料或調(diào)配助劑。
部分如本文中所使用，短語物質(zhì)的“部分”或“片段”在最廣泛意義上是與相關(guān)完整物質(zhì)共有一定程度的序列和/或結(jié)構(gòu)一致性和/或至少一種功能性特征的部分或片段。舉例來說，蛋白質(zhì)或多肽的“部分”是含有一段連續(xù)氨基酸或共同作為蛋白質(zhì)或多肽的特點的許多段連續(xù)氨基酸的部分。在一些實施例中，各所述連續(xù)段一般將含有至少2個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個或更多個氨基酸。一般來說，部分是除以上所指定的序列一致性外還與相關(guān)完整蛋白質(zhì)共有至少一種功能性特征的部分。在一些實施例中，所述部分可以具有生物活性。
蛋白質(zhì)如本文中所使用，術(shù)語“蛋白質(zhì)”是指多肽(即，含至少兩個由肽鍵相互連接的氨基酸的鏈)。蛋白質(zhì)可以包括非氨基酸部分(例如可為糖蛋白、蛋白聚糖等)和/或可以另外經(jīng)加工或修飾。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，“蛋白質(zhì)”可為由細(xì)胞所產(chǎn)生的完整多肽鏈(有或無信號序列)，或可為其特征性部分。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，蛋白質(zhì)有時可以包括一個以上多肽鏈，例如由一個或多個二硫鍵連接或通過其它方式結(jié)合。多肽可以含有L-氨基酸、D-氨基酸或兩者而且可以含有所屬領(lǐng)域中已知的多種氨基酸修飾或類似物中的任一種。適用的修飾包括例如末端乙酰化、酰胺化等。在一些實施例中，蛋白質(zhì)可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸和其組合。術(shù)語“肽”一般用于指長度小于約100個氨基酸的多肽。
相似性如本文中所使用，術(shù)語“相似性”是指聚合分子之間，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之間和/或多肽分子之間的總體相關(guān)性。聚合分子彼此的相似性百分比的計算可以與計算一致性百分比相同的方式進(jìn)行，除了相似性百分比的計算考慮如所屬領(lǐng)域中所了解的保守性取代以外。
個體如本文中所使用，術(shù)語“個體”或“患者”是指例如出于實驗、診斷、預(yù)防和/或治療目的可以投予本發(fā)明的組合物的任何生物體。典型個體包括動物(例如哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、兔、非人類靈長類動物和人類；昆蟲；蠕蟲；等)。
實質(zhì)上如本文中所使用，術(shù)語“實質(zhì)上”是指展現(xiàn)全部程度或接近全部程度的所關(guān)注特征或性質(zhì)的定性條件。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，生物和化學(xué)現(xiàn)象很少(如果發(fā)生過的話)達(dá)到完全和/或進(jìn)行到完全或達(dá)成或避免絕對結(jié)果。因此，術(shù)語“實質(zhì)上”在本文中用于記錄許多生物和化學(xué)現(xiàn)象中所固有的可能的完全性缺乏。
亞單位疫苗如本文中所使用，“亞單位疫苗”是指包含經(jīng)純化抗原而非整個生物體的疫苗組合物。在一些實施例中，亞單位疫苗包含從非抗原性組分至少部分純化的抗原。在一些實施例中，亞單位疫苗的純度為至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％。在一些實施例中，亞單位疫苗包含并未從非抗原性組分至少部分純化的抗原。在一些實施例中，亞單位疫苗包含正好一種抗原。在一些實施例中，亞單位疫苗包含兩種或兩種以上(例如2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種或更多種)抗原。在一些實施例中，向個體投予低劑量的亞單位疫苗。
罹患“罹患”疾病、病癥和/或病狀的個體已確診患有所述疾病、病癥和/或病狀或呈現(xiàn)所述疾病、病癥和/或病狀的一種或多種癥狀。
易患“易患”疾病、病癥和/或病狀的個體尚未確診患有所述疾病、病癥和/或病狀。在一些實施例中，易患疾病、病癥和/或病狀的個體可能不展現(xiàn)所述疾病、病癥和/或病狀的癥狀。在一些實施例中，易患疾病、病癥和/或病狀的個體將發(fā)展所述疾病、病癥和/或病狀。在一些實施例中，易患疾病、病癥和/或病狀的個體不會發(fā)展所述疾病、病癥和/或病狀。在一些實施例中，易患疾病、病癥和/或病狀的個體為發(fā)展特定疾病或病癥或其癥狀的風(fēng)險(通?；谶z傳傾向、環(huán)境因素、個人病史或其組合)高于一般群體中所觀察到的風(fēng)險的個體。
治療有效量術(shù)語醫(yī)藥劑或藥劑組合的“治療有效量”欲指在適用于任何醫(yī)學(xué)治療的合理益處/風(fēng)險比下對所治療的個體賦予治療作用的藥劑的量。在一些實施例中，治療有效量是當(dāng)投予罹患或易患疾病、病癥和/或病狀的個體時足以治療、診斷、預(yù)防和/或延緩疾病、病癥和/或病狀的癥狀的發(fā)作的量。所述治療作用可為客觀的(即，可通過一些測試或標(biāo)記來測量)或主觀的(即，個體聲明有作用或感到有作用)。治療有效量通常以可能包含多個單位劑量的給藥方案來投予。對于任何特定醫(yī)藥劑，治療有效量(和/或有效給藥方案中的適當(dāng)單位劑量)可以例如視投藥途徑、與其它醫(yī)藥劑的組合而變化。用于任何特定患者的特定治療有效量(和/或單位劑量)也可以視多種因素而定，包括所治療的病癥和病癥的嚴(yán)重程度；所用特定醫(yī)藥劑的活性；所用的特定組合物；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；投藥時間、投藥途徑和/或所用特定醫(yī)藥劑的排泄或代謝速率；治療持續(xù)時間；和如醫(yī)學(xué)技術(shù)中熟知的類似因素。
治療劑如本文中所使用，短語“治療劑”是指當(dāng)投予個體時具有治療作用和/或引發(fā)所需生物和/或藥理作用的任何藥劑。
治療如本文中所使用，術(shù)語“治療”是指以任何形式投予生物活性劑，其部分或完全減輕、改善、緩解、抑制特定疾病、病癥和/或病狀的一種或多種癥狀或特征，延緩其一種或多種癥狀或特征發(fā)作，預(yù)防其一種或多種癥狀或特征，降低其一種或多種癥狀或特征的嚴(yán)重程度和/或降低其一種或多種癥狀或特征的發(fā)生率。所述治療可以用于不展現(xiàn)相關(guān)疾病、病癥和/或病狀的征兆的個體和/或僅展現(xiàn)疾病、病癥和/或病狀的早期征兆的個體。其它或另外，所述治療可以用于展現(xiàn)相關(guān)疾病、病癥和/或病狀的一種或多種既定征兆的個體。
單位劑量如本文中所使用，術(shù)語“單位劑量”是指通常在給藥方案的情形下醫(yī)藥劑的不連續(xù)投予。
載體如本文中所使用，“載體”是指可以轉(zhuǎn)運與其所連接的另一核酸的核酸分子。在一些實施例中，載體可以在諸如真核和/或原核細(xì)胞等宿主細(xì)胞中實現(xiàn)與其所連接的核酸的染色體外復(fù)制和/或表達(dá)。能夠指導(dǎo)可操作地連接的基因的表達(dá)的載體在本文中稱為“表達(dá)載體”。



圖1.血細(xì)胞凝集素(HA)蛋白和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的示意圖。結(jié)構(gòu)域1、2和2、1折疊在一起形成莖干結(jié)構(gòu)域(stem domain，SD)。結(jié)構(gòu)域3為球狀結(jié)構(gòu)域(GD)。條目1-6中呈示的范圍對應(yīng)于HA的氨基酸位置。
圖2.在植物中制備抗原的策略。將抗原克隆到“投放載體”系統(tǒng)中。接著將投放載體引入農(nóng)桿菌(Agrobacterium)中并真空滲透到植物中。讓抗原表達(dá)并積累在植物生物質(zhì)中。從植物生物質(zhì)純化重組HA抗原。
圖3.植物產(chǎn)H5HA的表達(dá)數(shù)據(jù)。(A)表達(dá)來自四種不同病毒株的H5HA和NA(全長，除了缺乏跨膜錨定區(qū))(即，來自A/安徽(Anhui)/1/2005的HA抗原，“H5HA-A”或“HAA”；來自A/印度尼西亞(Indonesia)/5/05的HA抗原，“H5HA-I”或“HAI”；來自A/斑頭雁/青海(Qinghai)/1A/2005的HA抗原，“H5HA-Q”或“HAQ”；和來自A/越南(Vietnam)/04的HA抗原，“H5HA-V”或“HAV”；以及來自相同四種病毒株的相應(yīng)NA抗原)的四種不同構(gòu)筑體的例示性表達(dá)數(shù)據(jù)。(B)數(shù)種不同的大范圍流行性和季節(jié)性流感病毒株的例示性表達(dá)數(shù)據(jù)。
圖4.植物中產(chǎn)生的HAA、HAI、HAQ和HAV中的每一個的抗原性。這使用ELISA分析顯示圖3A中所示的植物產(chǎn)抗原的抗原性。這個分析通過用1μg/ml各H5HA蛋白涂布96孔板來進(jìn)行。接著使用抗A/安徽/01/05雪貂血清、抗A/印度尼西亞/05/2005雪貂血清、抗A/越南/1194/04HA綿羊抗血清或抗A/懷俄明(Wyoming)/03/2003HA綿羊抗血清的1∶6000稀釋液來檢測抗原。所有植物產(chǎn)H5HA都顯示與針對同源H5HA所產(chǎn)生的抗血清而非針對A/懷俄明/03/03H3病毒所產(chǎn)生的抗血清的特異性反應(yīng)性。
圖5.HAA和HAQ的表達(dá)。在植物中表達(dá)并從植物純化的H5HA-A和H5HA-Q的庫馬斯凝膠(Coomassie gel)(左圖)和西方印跡法(western blot)(右圖)。使用抗His抗體進(jìn)行西方印跡法。
圖6.免疫時程。在10μg Quil A存在下用H5HA-Q或H5HA-A皮下免疫各組8周齡雌性Balb/c小鼠。在第0天、第14天和第28天施以免疫。
圖7.血清血細(xì)胞凝集-抑制和病毒中和抗體效價。來自用植物中產(chǎn)生的A/安徽/01/05或A/斑頭雁/青海/1A/05HA免疫的小鼠的血清顯示顯著血細(xì)胞凝集抑制(A)和病毒中和(B)抗體效價，即使當(dāng)用低至5μg劑量的抗原免疫小鼠時。
圖8.由用低至1μg的抗原免疫所產(chǎn)生的血清HI抗體效價。用低至2.5μg和1μgHAA的抗原劑量免疫小鼠。植物產(chǎn)HA在低至1μg的劑量下引發(fā)高效價的HI。
圖9.活體外表征ppH3HAwy。(A)純化的ppH3HAwy(泳道3)和iA/Wyo(泳道2)的SDS-PAGE，隨后為西方印跡法分析。泳道1為分子量標(biāo)記。(B)使用參考綿羊抗H3HA或抗N2NA對ppH3Hawy進(jìn)行的ELISA分析。在綿羊抗H3(灰色條柱)和抗N2NA(空條柱)血清的1∶1600稀釋度下，數(shù)據(jù)以平均OD值±標(biāo)準(zhǔn)偏差顯示。(C)用單輻射免疫擴(kuò)散(SRID)進(jìn)行ppH3HAwy的定量和分析。使用iA/Wyo作為參考抗原。
圖10.由ppH3HAwy誘導(dǎo)的流感特異性抗體反應(yīng)的ELISA分析。顯示接受30μg、10μg和5μg劑量的抗原的各組小鼠的IgG效價。數(shù)據(jù)以平均血清IgG效價±標(biāo)準(zhǔn)偏差顯示。
圖11.小鼠血清中的IgG亞型的ELISA分析和從經(jīng)ppH3HAwy免疫的小鼠收集的脾細(xì)胞分泌IFNγ或1L-5的ELISPOT分析。在第42天從用5μg劑量的抗原免疫的動物收集的血清中測量IgG亞型反應(yīng)。數(shù)據(jù)以平均血清IgG亞型效價±標(biāo)準(zhǔn)偏差(A)顯示。經(jīng)iA/Wyo免疫的小鼠(B)或經(jīng)ppH3HAwy免疫的小鼠(C)的分泌IFNγ或IL-5的脾細(xì)胞的頻率是以每106個細(xì)胞中斑點形成細(xì)胞(SFC)的平均數(shù)目±標(biāo)準(zhǔn)偏差顯示。
圖12.血清血細(xì)胞凝集-抑制和病毒中和抗體效價。顯示接受30μg、10μg和5μg劑量的抗原的各組小鼠的HI效價(A)和VN效價(B)。在第0天、第28天和第42天收集血清樣品。使用iA/Wyo作為對照組。HI效價表示為對8個血細(xì)胞凝集素單位的病毒的血細(xì)胞凝集產(chǎn)生抑制的血清的最高稀釋度的倒數(shù)。VN效價表示為對2×103TCID50的病毒產(chǎn)生50％中和的血清的最高稀釋度的倒數(shù)表示。指定無可檢測HI或VN效價的樣品的效價為5或10。數(shù)據(jù)以平均效價±標(biāo)準(zhǔn)偏差顯示。
圖13.在植物中制備蛋白質(zhì)的時間安排的示意圖。
圖14.活體外表征植物產(chǎn)H5HA-I。使用抗His抗體對所表達(dá)的H5HA-I進(jìn)行的(A)庫馬斯亮藍(lán)和(B)西方印跡法。(C)用針對A/印度尼西亞/05/05的參考雪貂血清或針對A/懷俄明/03/03的綿羊參考血清對H5HA-I進(jìn)行的ELISA分析。數(shù)據(jù)以平均OD值±標(biāo)準(zhǔn)偏差顯示。
圖15.植物產(chǎn)H5HA-I的免疫原性和保護(hù)性功效。(A)來自用植物中產(chǎn)生的A/印度尼西亞/05/05HA免疫的小鼠的血清顯示顯著血細(xì)胞凝集抑制活性，即使當(dāng)用低至15μg劑量的抗原免疫小鼠時。(B)來自用植物中產(chǎn)生的A/印度尼西亞/05/05HA免疫的小鼠的血清顯示顯著病毒中和活性，即使當(dāng)用低至5μg劑量的抗原免疫小鼠時。
圖16.植物產(chǎn)H5HA-I的免疫原性和保護(hù)性功效。(A)來自用植物中產(chǎn)生的A/印度尼西亞/05/05HA免疫的雪貂的血清顯示顯著血細(xì)胞凝集抑制活性。(B)攻毒后雪貂的存活百分比。(C)攻毒后8天雪貂的體重變化百分比。(D)攻毒后4天雪貂鼻洗滌液中的病毒效價。
圖17.在植物中制備HA抗原。(A)所制備的HAB1-H3和HAB1-H1蛋白的庫馬斯亮藍(lán)染色和西方印跡法。各構(gòu)筑體的總蛋白質(zhì)表達(dá)為每千克植物生物質(zhì)約800mg。如所指示，使用抗H3N2多克隆抗體或抗His單克隆抗體進(jìn)行西方印跡法。對于A/布里斯班(Brisbane)/10e/2007，將2μl、5μl或10μl最終產(chǎn)物加載到各凝膠上。對于A/布里斯班/59/07，如下對庫馬斯染色的凝膠進(jìn)行加載泳道1分子量標(biāo)記；泳道20.5μg BSA；泳道31.0μg BSA；泳道42.5μg BSA；泳道50.5μl最終產(chǎn)物；泳道61.0μl最終產(chǎn)物；泳道72.0μl最終產(chǎn)物；泳道85.0μl最終產(chǎn)物。對于A/布里斯班/59/07，如下對西方印跡法的凝膠進(jìn)行加載泳道1200ng Lic-LF(地衣多糖酶與炭疽致死因子蛋白的融合物)；泳道2100ng Lic-LF；泳道350ng Lic-LF；泳道4分子量標(biāo)記；泳道5-71.0μl可溶性提取物(3種獨立可溶性提取物樣品的1×PBS、10mM Dieca和0.1％曲通(Triton)溶液)。(B)所制備的HAB1-B和HAF1-B蛋白的庫馬斯亮藍(lán)染色和/或西方印跡法。使用抗His抗體進(jìn)行西方印跡法。S于包含1×PBS和10mM EDTA的緩沖液中的所提取蛋白。P提取S部分后的剩余蛋白質(zhì)，通過將顆粒再懸浮于2×SDS-SB中并沸騰來獲得。HAB1-B的總蛋白質(zhì)表達(dá)為每千克植物生物質(zhì)約800mg。對于B/佛羅里達(dá)(Florida)/4/2006，如下對庫馬斯染色的凝膠進(jìn)行加載泳道1分子量標(biāo)記；泳道2加載到Q-管柱上之前的物質(zhì)；泳道32.5μl最終產(chǎn)物的1∶10稀釋液；泳道41μl最終產(chǎn)物的1∶10稀釋液；泳道53μl最終產(chǎn)物的1∶10稀釋液；泳道65μl最終產(chǎn)物的1∶10稀釋液；泳道7空白；泳道80.3μg BSA；泳道90.5μg BSA；泳道101.0μg BSA；和泳道111.5μg BSA。對于B/佛羅里達(dá)/4/2006，如下對西方印跡法的凝膠進(jìn)行加載泳道1分子量標(biāo)記；泳道2總蛋白質(zhì)，15μl 1∶10稀釋液；泳道3總可溶性蛋白質(zhì)，15μl 1∶10稀釋液；泳道4從鎳管柱流過，15μl 1∶10稀釋液；泳道5從鎳管柱洗脫，0.75μl 1∶10稀釋液；泳道6加載到Q-管柱上之前的物質(zhì)，0.975μl1∶10稀釋液；泳道71μl最終產(chǎn)物的1∶50稀釋液；泳道82μl最終產(chǎn)物的1∶50稀釋液；和泳道93μl最終產(chǎn)物的1∶50稀釋液。HAF1-B的總蛋白質(zhì)表達(dá)為每千克植物生物質(zhì)約325mg。
圖18.免疫時程。用60μg、30μg或15μg來自A/布里斯班/59/07(HAB1-H1)或A/布里斯班/10e/07(HAB1-H3)的植物產(chǎn)HA免疫小鼠。
圖19.植物產(chǎn)HAB1-H1的免疫原性。在HAB1-H1抗原的引發(fā)、第一次加強和第二次加強后，通過ELISA來測定HA特異性抗體的血清效價。數(shù)據(jù)以平均抗體效價±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。
圖20.由植物產(chǎn)HAB1-H1引發(fā)的血清紅細(xì)胞凝集抑制抗體效價。顯示接受60μg、30μg或15μg劑量的抗原的各組小鼠的HI抗體效價。在第0天、第28天和第42天收集血清樣品。針對同源A/布里斯班/59/07病毒測量HI效價。
圖21.植物產(chǎn)HAB1-H3的免疫原性。在HAB1-H3抗原的引發(fā)、第一次加強和第二次加強后，通過ELISA來測定HA特異性抗體的血清效價。數(shù)據(jù)以平均抗體效價±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。
圖22.由植物產(chǎn)HAB1-H3引發(fā)的血清紅細(xì)胞凝集抑制抗體效價。顯示接受60μg、30μg或15μg劑量的抗原的各組小鼠的HI抗體效價。在第0天、第28天和第42天收集血清樣品。針對同源A/布里斯班/10e/07病毒測量HI效價。

具體實施例方式 流感和流感療法 對抗流感的主要防御是疫苗接種。流感病毒是屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的分段負(fù)鏈RNA病毒。病毒抗原是高效免疫原，能夠引發(fā)全身性與粘膜抗體反應(yīng)。通常將流感病毒血細(xì)胞凝集素糖蛋白(hemagglutinin glycoprotein，HA)視為刺激中和抗體和疫苗設(shè)計的最重要病毒抗原。對于一些疫苗組合物，已顯示病毒神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)的存在對于產(chǎn)生針對病毒的多臂保護(hù)性免疫反應(yīng)至關(guān)重要。已經(jīng)開發(fā)出抑制神經(jīng)氨酸酶活性的抗病毒劑且其可為另一種對抗感染的抗病毒治療。離子通道蛋白M2和基質(zhì)蛋白M1蛋白是有時認(rèn)為適用于開發(fā)流感抗病毒劑和疫苗的其它組分。
利用由抗原性轉(zhuǎn)變(antigenic shift)產(chǎn)生的不同HA和NA命名流感病毒亞型。此外，由抗原性轉(zhuǎn)變或HA或NA分子中產(chǎn)生新的不同抗原決定基的突變作用產(chǎn)生同一亞型的新病毒株。盡管已記錄15種HA抗原亞型，但這些亞型中僅三種，即H1、H2和H3在人類中廣泛循環(huán)。
在工業(yè)化和不發(fā)達(dá)國家中，疫苗接種在追求高品質(zhì)生活中都已變得極為重要。大多數(shù)可獲得的疫苗仍遵循模擬感染形態(tài)以誘導(dǎo)可防止相關(guān)感染的免疫反應(yīng)的基本原理。然而，各種亞型和組合的減毒病毒的產(chǎn)生可能耗時并且價格不菲。新技術(shù)的出現(xiàn)，對病原體分子生物學(xué)、發(fā)病機(jī)制和其與個體免疫系統(tǒng)的相互作用的深入了解已產(chǎn)生疫苗開發(fā)和疫苗傳遞的新方法。因此，盡管技術(shù)進(jìn)步已提高產(chǎn)生改良的流感抗原疫苗組合物的能力，但仍然需要提供疫苗和新抗原的其它來源以便制造疫苗來解決新出現(xiàn)的亞型和病毒株。需要用于流感病毒亞型的改良疫苗設(shè)計和開發(fā)以及制備和使用所述組合物的方法。
流感抗原 一般來說，流感抗原可以包括引發(fā)針對流感病毒的免疫反應(yīng)的任何免疫原性多肽。根據(jù)本發(fā)明，所關(guān)注的免疫原性多肽可以獨立多肽形式、以融合蛋白形式、以經(jīng)修飾多肽(例如含有其他側(cè)接基團(tuán)，諸如碳水化合物基團(tuán)、甲基、烷基[諸如甲基、乙基等]、磷酸酯基、脂質(zhì)基團(tuán)、酰胺基、甲?；⑸锼鼗?、血紅素基、羥基、碘基、異戊二烯基、十四烷酰基、黃素基、軟脂酰基、硫酸酯基、聚乙二醇等)形式提供。在一些實施例中，用于本發(fā)明的流感抗原多肽具有是或包括與自然界中所發(fā)現(xiàn)的流感多肽序列一致的序列的氨基酸序列；在一些實施例中，流感抗原多肽具有是或包括與自然界中所發(fā)現(xiàn)的流感多肽的特征性部分(例如免疫原性部分)一致的序列的氨基酸序列。
在某些實施例中，利用全長蛋白質(zhì)作為本發(fā)明的疫苗組合物中的流感抗原多肽。在一些實施例中，使用流感多肽的一個或多個免疫原性部分。在某些實施例中，以一個或多個單獨多肽形式或以一個或多個融合多肽中連接在一起的形式利用兩個或三個或三個以上免疫原性部分。
用于本發(fā)明的流感抗原多肽可以包括全長流感多肽、其融合物和/或其免疫原性部分。當(dāng)無論單獨還是以融合蛋白形式利用流感蛋白的部分時，所述部分都保留免疫活性(例如與抗流感抗體的交叉反應(yīng)性)。基于其誘導(dǎo)針對病毒感染的免疫保護(hù)反應(yīng)的能力，血細(xì)胞凝集素和神經(jīng)氨酸酶為在產(chǎn)生疫苗方面受到關(guān)注的抗原。諸如膜離子通道M2或基質(zhì)蛋白M1等其它抗原可能適用于制造疫苗(例如組合疫苗)以提高免疫保護(hù)的功效。
因此，本發(fā)明提供表達(dá)異源蛋白質(zhì)(例如流感抗原多肽，諸如流感蛋白或其免疫原性部分，或包含流感蛋白或其免疫原性部分的融合蛋白)的植物細(xì)胞和植物。本發(fā)明的異源蛋白質(zhì)可以包含所關(guān)注的任何流感抗原多肽，包括(但不限于)血細(xì)胞凝集素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、膜離子通道M2(M2)、基質(zhì)蛋白M1(M1)、血細(xì)胞凝集素(HA)的一部分、神經(jīng)氨酸酶(NA)的一部分、膜離子通道(M2)的一部分、基質(zhì)蛋白M1(M1)的一部分、其融合蛋白、其免疫原性部分，或血細(xì)胞凝集素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、膜離子通道M2(M2)、基質(zhì)蛋白M1(M1)、血細(xì)胞凝集素(HA)的一部分、神經(jīng)氨酸酶(NA)的一部分、膜離子通道(M2)的一部分和/或基質(zhì)蛋白M1(M1)的一部分的組合。
所屬領(lǐng)域中已知多種不同流感HA、NA、M2和M1蛋白(例如來自不同亞型或病毒株或分離株)的氨基酸序列且其可在諸如基因庫(GenBank)等公共數(shù)據(jù)庫中獲得。以下表1和2中提供多種流感亞型、病毒株和/或進(jìn)化枝的HA和NA的例示性全長蛋白質(zhì)序列。
在某些實施例中，本發(fā)明的疫苗組合物中利用全長血細(xì)胞凝集素(HA)。在一些實施例中，使用HA的一個或一個以上結(jié)構(gòu)域。在某些實施例中，以一個或多個單獨多肽形式或以在一個或多個融合多肽中連接在一起的形式利用兩個或三個或三個以上結(jié)構(gòu)域。表1中呈示例示性HA多肽的序列。
表1例示性HA序列 在某些實施例中，本發(fā)明的疫苗抗原中利用全長神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原。在一些實施例中，使用NA的結(jié)構(gòu)域。在某些實施例中，在本發(fā)明的抗原中提供兩個或三個或三個以上結(jié)構(gòu)域。某些例示性實施例提供包含全長NA但缺乏跨膜錨定肽序列的流感抗原。表2中呈示例示性NA多肽的序列。
表2例示性NA序列 另外，范例提供數(shù)種可用于本發(fā)明的其他HA多肽序列。
雖然本文提供例示性流感抗原多肽的序列，但應(yīng)了解可以使用具有HA和/或NA的免疫原性特征的任何序列。在一些實施例中，用于本發(fā)明的流感抗原多肽具有如下氨基酸序列其與選自由SEQ ID NO1-43、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109組成的群組的序列約60％一致、約70％一致、約80％一致、約85％一致、約90％一致、約91％一致、約92％一致、約93％一致、約94％一致、約95％一致、約96％一致、約97％一致、約98％一致、約99％一致或100％一致。在一些實施例中，所述流感抗原多肽保留免疫原性活性。
在一些實施例中，用于本發(fā)明的流感抗原多肽具有如下氨基酸序列其包含具有選自由SEQ ID NO1-43、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109組成的群組的序列的約100個連續(xù)氨基酸。在一些實施例中，流感抗原多肽具有如下氨基酸序列其與具有選自由SEQ ID NO1-43、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109組成的群組的序列的約100個氨基酸的連續(xù)段約60％一致、約70％一致、約80％一致、約85％一致、約90％一致、約91％一致、約92％一致、約93％一致、約94％一致、約95％一致、約96％一致、約97％一致、約98％一致、約99％一致或100％一致。
在一些實施例中，用于本發(fā)明的流感抗原多肽具有如下氨基酸序列其包含具有選自由SEQ ID NO1-43、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109組成的群組的序列的約150個、約200個、約250個、約300個、約350個、約400個、約450個、約500個、約550個或更多個連續(xù)氨基酸。在一些實施例中，流感抗原多肽具有如下氨基酸序列其與具有選自由SEQ ID NO1-43、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109組成的群組的序列的約150個、200個、250個、300個、350個或更多個氨基酸的連續(xù)段約60％一致、約70％一致、約80％一致、約85％一致、約90％一致、約91％一致、約92％一致、約93％一致、約94％一致、約95％一致、約96％一致、約97％一致、約98％一致、約99％一致或100％一致。
舉例來說，與流感抗原多肽具有足夠一致性且保留免疫原性特征的序列能夠同與本文所提供的一種或多種抗原反應(yīng)的抗體結(jié)合。免疫原性特征常常包括相關(guān)氨基酸或側(cè)基的三維呈現(xiàn)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可易于鑒別在序列上具有適度差異的序列(例如在邊界和/或某些序列替代物中具有差異，然而仍保留免疫原性特征)。
在一些實施例中，可從流感多肽中刪去SEQ ID NO1-43、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109中所示任何例示性序列的特定部分和/或結(jié)構(gòu)域。舉例來說，HA和NA多肽通常含有跨膜錨定序列。本發(fā)明涵蓋刪去跨膜錨定序列的HA和NA多肽。
我們已利用來自如本文所詳述的特定亞型的血細(xì)胞凝集素和神經(jīng)氨酸酶的序列作為例示性抗原。存在各種亞型的流感病毒且當(dāng)新亞型出現(xiàn)時，其可被持續(xù)鑒別出。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，本文所提供的方法和組合物可適合于利用其它亞型的序列。本文所提供的方法和組合物涵蓋和包涵所述變化。
流感多肽與熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)的融合物 在某些方面，提供包含融合多肽的流感抗原多肽，所述融合多肽包含可操作地連接于熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)的流感蛋白(或其部分或變異體)。本發(fā)明融合多肽可在所屬領(lǐng)域中已知的任何可用表達(dá)系統(tǒng)中制備。在某些實施例中，本發(fā)明融合蛋白是在植物或其部分(例如植物、植物細(xì)胞、根、芽等)中制備。
人類或動物細(xì)胞中未天然發(fā)現(xiàn)的酶或其它蛋白質(zhì)尤其適合用于本發(fā)明的融合多肽中。當(dāng)融合時賦予融合產(chǎn)物熱穩(wěn)定性的熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)是適用的。熱穩(wěn)定性允許所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)保持構(gòu)形，且將所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)保持在室溫下。這一特征有利于以容易、節(jié)省時間和節(jié)省成本的方式回收融合多肽。適用于本發(fā)明的熱穩(wěn)定性酶的代表性家族為葡聚糖水解酶家族。這些酶特異性裂解混合連接型多糖中相鄰于1，3-β鍵聯(lián)的1，4-β糖苷鍵(漢(Hahn)等人，1994美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，9110417；以引用的方式并入本文中)。這些酶發(fā)現(xiàn)于諸如燕麥和大麥等谷物中，且也在包括熱纖梭菌(C.thermocellum)等許多真菌和細(xì)菌物種中發(fā)現(xiàn)(金科瓦(Goldenkova)等人，2002，分子生物學(xué)(Mol.Biol.)36698；以引用的方式并入本文中)。因此，用于本發(fā)明的融合多肽中的所需熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)包括糖苷酶。例示性熱穩(wěn)定性糖苷酶蛋白包括由選自表A中所示的基因庫保藏編號的基因庫保藏編號表示的蛋白質(zhì)，各自內(nèi)容是通過完全并入各參考編號的基因庫保藏信息以引用的方式并入本文中。用于本發(fā)明的融合蛋白中的例示性熱穩(wěn)定性酶包括熱纖梭菌(Clostridivm thermocellum)P29716、短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)P37073和海洋紅嗜熱鹽菌(Rhodthermus marinus)P45798，其各自以引用其基因庫保藏編號的方式并入本文中。代表性融合蛋白利用從熱纖梭菌分離的改良熱穩(wěn)定性酶，然而，根據(jù)本發(fā)明可類似地利用任何熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)。例示性熱穩(wěn)定性糖苷酶蛋白列于表3中 表3熱穩(wěn)定性糖苷酶蛋白 雖然本文提供例示性熱穩(wěn)定性多肽的序列，但應(yīng)了解可以使用展現(xiàn)熱穩(wěn)定性的任何序列。在一些實施例中，用于本發(fā)明的熱穩(wěn)定性多肽具有如下氨基酸序列其與具有選自由SEQ ID NO44-83組成的群組的序列約60％一致、約70％一致、約80％一致、約85％一致、約90％一致、約91％一致、約92％一致、約93％一致、約94％一致、約95％一致、約96％一致、約97％一致、約98％一致、約99％一致或100％一致。在一些實施例中，所述熱穩(wěn)定性多肽保留熱穩(wěn)定性。
在一些實施例中，熱穩(wěn)定性多肽具有如下氨基酸序列其包含具有選自由SEQ IDNO44-83組成的群組的序列的約100個連續(xù)氨基酸。在一些實施例中，熱穩(wěn)定性多肽具有如下氨基酸序列其與具有選自由SEQ ID NO44-83組成的群組的序列的約100個氨基酸的連續(xù)段約60％一致、約70％一致、約80％一致、約85％一致、約90％一致、約91％一致、約92％一致、約93％一致、約94％一致、約95％一致、約96％一致、約97％一致、約98％一致、約99％一致或100％一致。
在一些實施例中，熱穩(wěn)定性多肽具有如下氨基酸序列其包含具有選自由SEQ IDNO44-83組成的群組的序列的約150個、約200個、約250個、約300個、約350個、約400個、約450個、約500個、約550個、約600個、約650個、約700個或更多個連續(xù)氨基酸。在一些實施例中，熱穩(wěn)定性多肽具有如下氨基酸序列其與具有選自由SEQID NO44-83組成的群組的序列的約150個、200個、250個、300個、350個或更多個氨基酸的連續(xù)段約60％一致、約70％一致、約80％一致、約85％一致、約90％一致、約91％一致、約92％一致、約93％一致、約94％一致、約95％一致、約96％一致、約97％一致、約98％一致、約99％一致或100％一致。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明設(shè)計融合蛋白和多肽時，當(dāng)然需要保留抗原的免疫原性。此外，在本發(fā)明的某些方面需要提供使融合蛋白具有熱穩(wěn)定性的構(gòu)筑體。這一特征有利于以容易、節(jié)省時間和節(jié)省成本的方式回收目標(biāo)抗原。在某些方面，可選擇提供其它優(yōu)勢的抗原融合搭配物，所述優(yōu)勢包括增強免疫原性、并入多個疫苗決定子的可能性、缺乏對疫苗接種個體的預(yù)先免疫原性暴露。所關(guān)注的融合肽的其它有利性質(zhì)包括使并入一個或一個以上抗原的操作變得容易的蛋白質(zhì)，以及可能使疫苗制劑的制備、純化和/或調(diào)配變得容易的蛋白質(zhì)。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員應(yīng)了解三維呈現(xiàn)可能會影響這些有利特征中的每一種。因此，免疫性或優(yōu)選性質(zhì)的保留可能會影響例如融合搭配物的選擇和/或融合位置的選擇(例如N端、C端、內(nèi)部、其組合)。其它或另外，優(yōu)選可能會影響選擇用于融合的區(qū)段的長度，無論其為抗原長度，還是為所選融合搭配物的長度。
本發(fā)明者已證明多種抗原可與熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)成功融合。舉例來說，本發(fā)明者已使用又稱為地衣多糖酶的熱穩(wěn)定性載體分子LicB來產(chǎn)生融合蛋白。LicB是來自熱纖梭菌的1，3-1，4-β葡聚糖酶(LicB)(基因庫保藏編號X63355[gi40697]) MKNRVISLLMASLLLVLSVIVAPFYKAEAATVVNTPFVAVFSNFDSSQWEKADWAN GSVFNCVWKPSQVTFSNGKMILTLDREYGGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYEVRMKA AKNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEIDIEFLGKDTTKVQFNWYKNGVGGNEYLHNLG FDASQDFHTYGFEWRPDYIDFYVDGKKVYRGTRNIPVTPGKIMMNLWPGIGVDEWL GRYDGRTPLQAEYEYVKYYPNGVPQDNPTPTPTIAPSTPTNPNLPLKGDVNGDGHVN SSDYSLFKRYLLRVIDRFPVGDQSVADVNRDGRIDSTDLTMLKRYLIRAIPSL(SEQ IDNO82)。LicB屬于球狀蛋白質(zhì)家族?；贚icB的三維結(jié)構(gòu)，其N和C端彼此接近地位于表面上，極其接近于活性結(jié)構(gòu)域。LicB還具有暴露于表面上的遠(yuǎn)離活性結(jié)構(gòu)域定位的環(huán)結(jié)構(gòu)。我們已產(chǎn)生構(gòu)筑體以使得蛋白質(zhì)的環(huán)結(jié)構(gòu)和N和C端可用作流感抗原多肽的插入位點。流感抗原多肽可表達(dá)為N或C端融合物或插入表面環(huán)中的插入物。重要的是，LicB在低pH值和高溫下(高達(dá)75℃)保持其酶活性。因此，使用LicB作為載體分子提供優(yōu)勢，包括可能增強目標(biāo)特異性免疫原性、并入多個疫苗決定子的可能性和直接調(diào)配可以經(jīng)鼻、經(jīng)口或非經(jīng)腸傳遞的疫苗。此外，在植物中制備LicB融合物應(yīng)會降低動物或人類病原體的污染風(fēng)險。參見本文所提供的實例。
本發(fā)明的包含流感抗原多肽的融合蛋白可在包括活體外與活體內(nèi)系統(tǒng)等多種表達(dá)系統(tǒng)的任一種中制備。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將易于理解通常需要優(yōu)化核酸序列以用于特定表達(dá)系統(tǒng)。舉例來說，提供用于在植物中表達(dá)流感抗原-LicB融合物的例示性優(yōu)化序列并且以SEQ ID NO83顯示 5’

GGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYE VRMKAAKNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEIDIEFLGKDTTKVQFNWYKNGVGGNEY LHNLGFDASQDFHTYGFEWRPDYIDFYVDGKKVYRGTRNIPVTPGKIMMNLWPGIG VDEWLGRYDGRTPLQAEYEYVKYYPNGrsklVVNTPFVAVFSNFDSSQWEKADWAN GSVFNCVWKPSQVTFSNGKMILTLDREYvd

3’(SEQ IDNO83). 應(yīng)注意在SEQ ID NO83中，粗體/下劃線部分對應(yīng)于信號序列，斜體/下劃線部分對應(yīng)于6×His標(biāo)簽和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列，而呈小寫字母形式的兩個部分對應(yīng)于限制性位點。
因此，編碼本發(fā)明的流感抗原多肽、融合蛋白和其免疫原性部分的任何相關(guān)核酸都打算涵蓋在本發(fā)明的核酸構(gòu)筑體中。
對于在植物系統(tǒng)中制備，可利用表達(dá)流感抗原(例如流感多肽、其融合物和/或其免疫原性部分)的轉(zhuǎn)基因植物。其它或另外，可使用所屬領(lǐng)域中熟知的產(chǎn)生穩(wěn)定生產(chǎn)作物的方法來制備轉(zhuǎn)基因植物。另外，可使用利用短暫表達(dá)系統(tǒng)的植物來制備流感抗原多肽。當(dāng)利用植物表達(dá)系統(tǒng)時，不管是利用在植物中轉(zhuǎn)基因還是短暫表達(dá)，都可根據(jù)系統(tǒng)對所需抗原的適用性，利用細(xì)胞核表達(dá)、葉綠體表達(dá)、線粒體表達(dá)或病毒表達(dá)中的任一種。此外，可利用其它表達(dá)系統(tǒng)來制備本發(fā)明的抗原和融合蛋白。舉例來說，可使用哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)(例如哺乳動物細(xì)胞系[例如CHO等])、細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)(例如大腸桿菌(E.coli))、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)(例如桿狀病毒)、酵母表達(dá)系統(tǒng)和活體外表達(dá)系統(tǒng)(例如網(wǎng)狀組織溶解產(chǎn)物)來表達(dá)本發(fā)明的抗原和融合蛋白。
制備流感抗原 根據(jù)本發(fā)明，可在任何所需系統(tǒng)中制備流感抗原(包括流感多肽、其融合物和/或其免疫原性部分)；制備不限于植物系統(tǒng)。載體構(gòu)筑體和表達(dá)系統(tǒng)為所屬領(lǐng)域中所熟知且可適合于結(jié)合使用本文所提供的流感抗原多肽。舉例來說，流感抗原多肽可在已知表達(dá)系統(tǒng)中制備，所述表達(dá)系統(tǒng)包括哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)、轉(zhuǎn)基因動物、微生物表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)和植物系統(tǒng)(包括轉(zhuǎn)基因和短暫植物系統(tǒng))。具體來說，如果以融合蛋白形式制備流感抗原多肽，那么可能需要在非植物系統(tǒng)中制備所述融合蛋白。
在一些實施例中，希望在植物系統(tǒng)中制備流感抗原多肽。植物相對易于遺傳操作，且具有數(shù)種優(yōu)于諸如人類流體、動物細(xì)胞系、重組微生物和轉(zhuǎn)基因動物等替代源的優(yōu)點。植物對于蛋白質(zhì)具有類似于哺乳動物的完善的翻譯后修飾機(jī)構(gòu)(但應(yīng)注意到在植物與哺乳動物之間糖基化模式存在某些差異)。這使得能夠在植物組織中制備生物活性試劑。同時，植物可經(jīng)濟(jì)地產(chǎn)生極大量的生物質(zhì)，而無需復(fù)雜的設(shè)施。此外，植物不受動物病原體污染。如脂質(zhì)體和微囊一般，預(yù)期植物細(xì)胞對抗原通過胃腸道提供保護(hù)。
可經(jīng)由使用各種制備系統(tǒng)，利用植物來制備異源蛋白質(zhì)。一種所述系統(tǒng)包括使用轉(zhuǎn)基因/遺傳改造植物，其中將編碼目標(biāo)產(chǎn)物的基因永久地并入到植物的基因組中。轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)可產(chǎn)生作物制備系統(tǒng)。多種外來蛋白質(zhì)(包括許多哺乳動物來源的蛋白質(zhì)和許多疫苗候選抗原)已在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)且顯示具有功能活性。(塔科特(Tacket)等人，2000，傳染病雜志(J.Infect.Dis.)，182302；和山瓦拉(Thanavala)等人，2005，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，1023378；兩者都以引用的方式并入本文中)。另外，向未經(jīng)免疫的人類志愿者投予表達(dá)乙型肝炎主要表面抗原的未經(jīng)處理的轉(zhuǎn)基因植物導(dǎo)致發(fā)生免疫反應(yīng)(庫塔(Kapusta)等人，1999，美國實驗生物學(xué)聯(lián)合會會志(FASEBJ.)，131796；以引用的方式并入本文中)。
一種用于在植物中表達(dá)多肽的系統(tǒng)利用經(jīng)工程改造以表達(dá)外來序列(例如短暫表達(dá))的植物病毒載體。這種方法允許使用健康非轉(zhuǎn)基因植物作為快速制備系統(tǒng)。因此，遺傳工程改造植物和經(jīng)重組植物病毒感染的植物可充當(dāng)“綠色工廠”以迅速產(chǎn)生和制備所關(guān)注的特定蛋白質(zhì)。植物病毒具有某些使得其作為用于制備外來蛋白質(zhì)的表達(dá)載體具有吸引力的優(yōu)勢。已充分表征植物RNA病毒的數(shù)個成員，且感染性cDNA克隆可用來促進(jìn)遺傳操作。感染性病毒遺傳物質(zhì)進(jìn)入易感宿主細(xì)胞后，其復(fù)制成高含量且迅速傳遍整個植物。存在數(shù)種使用植物病毒表達(dá)載體來制備目標(biāo)多肽的方法，包括將目標(biāo)多肽并入病毒基因組中。一種方法包括工程改造感染細(xì)菌、動物或植物的病毒的外殼蛋白以充當(dāng)抗原性肽的載體分子。所述載體蛋白具有裝配和形成在表面上呈現(xiàn)所需抗原性抗原決定基的重組病毒樣粒子的能力。由于疫苗候選物的微粒性質(zhì)有利于以容易且節(jié)省成本的方式從植物組織中回收，因此這種方法允許以節(jié)省時間的方式制備疫苗候選物。其它優(yōu)勢包括目標(biāo)特異性免疫原性增強，并入多個疫苗決定子的可能性和易于調(diào)配成可以經(jīng)鼻、經(jīng)口或非經(jīng)腸傳遞的疫苗。舉例來說，含有帶有與外殼蛋白融合的病毒的抗原決定基的重組植物病毒粒子的菠菜葉在投予后產(chǎn)生免疫反應(yīng)(莫德斯卡(Modelska)等人，1998，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，952481；和友斯博(Yusibov)等人，2002，疫苗(Vaccine)，19/203155；兩者都以引用的方式并入本文中)。
植物表達(dá)系統(tǒng) 本發(fā)明的教示適用于多種不同植物。一般來說，任何適于表達(dá)如本文所述的所引入構(gòu)筑體的植物都適用于本發(fā)明。在許多實施例中，將需要使用幼苗來提高蛋白質(zhì)/多肽產(chǎn)生的速度。如本文所指示，在許多實施例中，利用發(fā)芽的籽苗。如所屬領(lǐng)域中已知，大多數(shù)芽生長迅速，從而由貯藏種子長出可食用植物。然而，所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)了解，術(shù)語“發(fā)芽的籽苗”在本文中在較普遍情形下用于指幼苗，而不管品種是否通常歸類為“芽”。生長足夠長時間從而具有足夠綠色生物質(zhì)以便允許引入和/或表達(dá)如本文所提供的表達(dá)構(gòu)筑體的任何植物(應(yīng)認(rèn)識到相關(guān)時間可以視表達(dá)構(gòu)筑體的傳遞和/或表達(dá)模式而變化)在本文中可以視為“發(fā)芽的籽苗”。
在許多實施例中，利用可食用植物(即欲投予蛋白質(zhì)或多肽的個體可食用(對所述個體無毒)的植物)。
根據(jù)本發(fā)明可利用容易并入和/或維持異源核酸且能夠產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的任何植物。一般來說，通常需要利用能夠在指定條件下(例如在溫室中和/或在水性系統(tǒng)中)生長的植物。可能需要選擇通常不由人類或馴養(yǎng)動物食用的植物和/或通常不為人類食物鏈的部分的植物，以便其可在外界生長而無需考慮可能不當(dāng)攝取所表達(dá)的多核苷酸。然而，在一些實施例中，可能需要使用可食用植物。在特定實施例中，將需要利用在植物的可食用部分累積所表達(dá)的多肽的植物。
通常，某些所需植物特征將由所欲表達(dá)的特定多核苷酸確定。僅舉數(shù)個實例，當(dāng)多核苷酸編碼欲以高產(chǎn)量產(chǎn)生的蛋白質(zhì)時(例如當(dāng)將表達(dá)抗原蛋白時，情況通常如此)，通常需要選擇具有相對高的生物質(zhì)的植物(例如煙草，其具有其它優(yōu)勢，即其高度容易感染病毒，具有短生長期且不在人類食物鏈中)。如果多核苷酸編碼完全活性要求特定翻譯后修飾(或受特定翻譯后修飾抑制)的抗原蛋白，那么某些植物物種完成相關(guān)修飾(例如特定糖基化)的能力(或無法完成)可指導(dǎo)選擇。舉例來說，植物能夠完成某些翻譯后修飾(例如糖基化)，然而，植物將不會產(chǎn)生哺乳動物翻譯后修飾中所見的唾液酸化(sialyation)模式。因此，抗原的植物制備可能導(dǎo)致產(chǎn)生不同于替代系統(tǒng)中所產(chǎn)生的相同蛋白質(zhì)序列的實體。
在某些實施例中，利用作物植物或作物相關(guān)植物。在某些特定實施例中，利用可食用植物。
用于本發(fā)明的植物包括被子植物(Angiosperm)、苔蘚植物(Bryophyte)(例如苔綱(Hepaticae)、蘚綱(Musci)等)、蕨類植物(Pteridophyte)(例如蕨類、楔葉類、石松植物)、裸子植物(Gymnosperm)(例如針葉樹、蘇鐵(cycase)、銀杏(Ginko)、買麻藤(Gnetale))和藻類(Algae)(例如綠藻綱(Chlorophyceae)、褐藻綱(Phaeophyceae)、紅藻綱(Rhodophyceae)、藍(lán)藻綱(Myxophyceae)、黃藻綱(Xanthophyceae)和裸藻綱(Euglenophyceae))。例示性植物為以下各科的成員豆科(Leguminosae)(豆科(Fabaceae)；例如豌豆、紫花苜蓿、大豆)；禾本科(Gramineae)(禾本科(Poaceae)；例如玉米、小麥、稻谷)；茄科(Solanaceae)，尤其西紅柿屬(Lycopersicon)(例如西紅柿)、茄屬(Solanum)(例如馬鈴薯、茄子)、番椒屬(Capsium)(例如胡椒)或煙草屬(Nicotiana)(例如煙草)；傘形科(Umbelliferae)，尤其胡蘿卜屬(Daucus)(例如胡蘿卜)、旱芹屬(Apium)(例如芹菜)或蕓香科(Rutaceae)(例如橙)；菊科(Compositae)，尤其萵苣屬(Lactuca)(例如萵苣)；十字花科(Brassicaceae/Cruciferae)，尤其蕓苔屬(Brassica)或芥子屬(Sinapis)。在某些方面，本發(fā)明的植物可為蕓苔屬或擬南芥屬(Arabidopsis)物種。一些例示性十字花科成員包括油菜(Brassica campestris)、埃塞俄比亞芥(B.carinata)、芥菜(B.juncea)、歐洲油菜(B.napus)、黑芥(B.nigra)、甘藍(lán)(B.oleraceae)、撒哈拉芥(B.tournifortii)、白芥子(Sinapis alba)和蘿卜(Raphanussativus)。一些適于轉(zhuǎn)化且發(fā)芽籽苗可食用的適合植物包括紫花苜蓿、綠豆、蘿卜、小麥、芥菜、菠菜、胡蘿卜、甜菜、洋蔥、大蒜、芹菜、大黃、葉狀植物(諸如卷心菜或生菜)、水田芹或水芹、草本植物(諸如歐芹、薄荷或三葉草)、花椰菜、西蘭花、大豆、小扁豆、可食用花(諸如向日葵)等。
多種植物物種可能適合于實施本發(fā)明。多種不同豆類和其它物種可以適于由從農(nóng)桿菌構(gòu)筑體(例如通過農(nóng)桿菌滲透(agroinfiltration)引入)投放的病毒載體產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)，所述豆類和其它物種包括例如赤豆、紫花苜蓿、大麥、西蘭花、比爾跳豆(billjumppea)、蕎麥、卷心菜、花椰菜、三葉草、羽衣甘藍(lán)、胡蘆巴、亞麻、鷹嘴豆、青豆、日本菠菜、無頭甘藍(lán)、卡姆小麥(kamut)、甘藍(lán)、大粒豌豆、綠豆、芥菜葉、斑豆、蘿卜、紅三葉草、大豆、斑點豌豆、向日葵、蕪菁、黃夾豆和其他植物。在一些實施例中，比爾跳豆、青豆、大粒豌豆、斑點豌豆和/或黃夾豆特別適用于本發(fā)明的這一方面。因此，在某些實施例中，本發(fā)明提供在一種或一種以上所述植物中使用投放編碼所關(guān)注的相關(guān)蛋白質(zhì)或多肽的病毒構(gòu)筑體(即具有植物病毒特征的RNA)的農(nóng)桿菌載體制備蛋白質(zhì)或多肽(例如抗原)。在一些實施例中，RNA具有AlMV的特征(和/或包括AlMV的序列)。在一些實施例中，RNA具有TMV的特征(和/或包括TMV的序列)。
應(yīng)了解，一方面，本發(fā)明提供表達(dá)所關(guān)注的目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽的幼苗(例如發(fā)芽的籽苗)。在一些實施例中，幼苗是由轉(zhuǎn)基因種子長出；本發(fā)明還提供可產(chǎn)生和/或用于本文所述的方法的種子?？墒罐D(zhuǎn)有任何所關(guān)注基因的轉(zhuǎn)基因種子發(fā)芽且任選誘導(dǎo)產(chǎn)生所關(guān)注的蛋白質(zhì)或多肽。舉例來說，可使能夠表達(dá)任何所關(guān)注基因的種子發(fā)芽且通過以下方式誘導(dǎo)i)病毒感染；ii)農(nóng)桿菌滲透；或iii)含有病毒基因組的細(xì)菌?？墒鼓軌虮磉_(dá)任何單克隆抗體的重鏈或輕鏈的轉(zhuǎn)基因的種子發(fā)芽且通過以下方式誘導(dǎo)以產(chǎn)生全長分子i)病毒感染；ii)農(nóng)桿菌滲透；或iii)用含有病毒基因組的細(xì)菌接種?？墒鼓軌虮磉_(dá)包含多個組分的復(fù)合分子(諸如sIgA)中的一種或一種以上組分的轉(zhuǎn)基因的種子發(fā)芽，且通過以下方式使用以便產(chǎn)生全功能分子i)病毒感染；ii)農(nóng)桿菌滲透；或iii)用含有病毒基因組的細(xì)菌接種?？墒箒碜越】捣寝D(zhuǎn)基因植物的種子發(fā)芽且通過以下方式使用以便產(chǎn)生目標(biāo)序列i)病毒感染；ii)農(nóng)桿菌滲透；或iii)用含有病毒基因組的細(xì)菌接種。
在一些實施例中，幼苗是由非轉(zhuǎn)基因的種子長出。通常，所述幼苗將包含指導(dǎo)所關(guān)注的蛋白質(zhì)或多肽表達(dá)的病毒序列。在一些實施例中，所述植物還可包含農(nóng)桿菌序列，任選包括“投放”病毒序列的序列。
將載體引入植物中 一般來說，可根據(jù)已知技術(shù)將載體傳遞到植物中。舉例來說，可將載體本身直接施用到植物(例如經(jīng)由研磨劑接種、機(jī)械化噴霧接種、真空滲透、粒子轟擊或電穿孔)。其它或另外，可(例如從已感染植物)制備病毒粒子，且可根據(jù)已知技術(shù)將其施用到其它植物。
已知多種感染各種植物物種的病毒，且可用于本發(fā)明的多核苷酸表達(dá)(參見例如，病毒分類和命名法(The Classification and Nomenclature of Viruses)，“國際病毒分類委員會第6次報告(Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses)”，(摩非(Murphy)等人編)，施普林格(Springer Verlag)紐約，1995；格日森(Grierson)等人，植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology)，布萊克(Blackie)，倫敦，第126-146頁，1984；格魯茲曼(Gluzman)等人，分子生物學(xué)通訊病毒載體(Communications inMolecular BiologyViral Vectors)，冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，紐約，第172-189頁，1988；和馬修(Mathew)，植物病毒在線(Plant Viruses Online)；所述文獻(xiàn)全部都以引用的方式并入本文中)。在某些實施例中，傳遞共同允許病毒載體的復(fù)制(和任選細(xì)胞間移動和/或長距離移動)的多種不同載體，而不是向植物細(xì)胞傳遞單一病毒載體。轉(zhuǎn)基因植物的基因組可編碼一些或所有蛋白質(zhì)。在本文中進(jìn)一步詳述的某些方面，這些系統(tǒng)包括一種或多種病毒載體組分。
載體系統(tǒng)包括兩種異源植物病毒的組分以獲得易于感染多種植物類型但僅造成極低感染傳播風(fēng)險或無感染傳播風(fēng)險的系統(tǒng)。先前已描述例示性系統(tǒng)(參見例如PCT公開案WO 00/25574和美國專利公開案2005/0026291，兩者都以引用的方式并入本文中)。如本文所述，在本發(fā)明的特定方面，例如通過滲透或機(jī)械接種、噴霧等將病毒載體施用到植物(例如植物、植物的一部分、芽等)。如果欲通過將病毒基因組直接施用到植物來實現(xiàn)感染，那么可使用任何可用技術(shù)來制備基因組。舉例來說，許多適用于本發(fā)明的病毒具有ssRNA基因組?？赏ㄟ^在活體內(nèi)或活體外轉(zhuǎn)錄基因組的DNA拷貝或復(fù)制RNA拷貝來制備ssRNA?？紤]到易于使用的活體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(例如SP6、T7、網(wǎng)狀組織溶解產(chǎn)物等)的易獲得性，以及保持RNA載體的DNA拷貝的便利性，預(yù)期通常將通過尤其使用T7或SP6聚合酶的活體外轉(zhuǎn)錄來制備本發(fā)明的ssRNA載體。
在某些實施例中，引入多種不同病毒載體，而不是將單一病毒載體類型引入植物中。所述載體可例如關(guān)于諸如復(fù)制、細(xì)胞間移動和/或長距離移動等功能彼此反式互補。載體可含有編碼本發(fā)明流感抗原多肽的不同多核苷酸。可如上文對于單一多核苷酸或多肽所述，對表達(dá)編碼一種或多種流感抗原多肽的多種多肽的植物或其部分進(jìn)行選擇。
植物組織表達(dá)系統(tǒng) 如以上所討論，根據(jù)本發(fā)明，流感抗原多肽可在任何所需系統(tǒng)中制備。載體構(gòu)筑體和表達(dá)系統(tǒng)為所屬領(lǐng)域中所熟知且可適合于結(jié)合使用本文所提供的流感抗原多肽。舉例來說，已知轉(zhuǎn)基因植物制備且可根據(jù)所屬領(lǐng)域中已知的技術(shù)改適構(gòu)筑體的產(chǎn)生和植物制備。在一些實施例中，需要植物中的短暫表達(dá)系統(tǒng)。這些系統(tǒng)中的兩種包括克隆根和克隆植物系統(tǒng)和其衍生物的制備，以及發(fā)芽籽苗系統(tǒng)的制備。
克隆植物 克隆根經(jīng)長時間和多個次培養(yǎng)均勻地在整個根中保持RNA病毒表達(dá)載體且穩(wěn)定產(chǎn)生目標(biāo)蛋白質(zhì)。與植物不同，如果在細(xì)胞間移動或長距離移動期間經(jīng)由重組消除目標(biāo)基因，那么在根培養(yǎng)物中病毒載體的完整性得以保持且目標(biāo)蛋白質(zhì)隨時間的產(chǎn)生量與在初始篩選期間所觀察到的量相似?？寺「试S容易地制備用于抗原和疫苗組合物的口服調(diào)配物的異源蛋白質(zhì)材料。先前已描述用于產(chǎn)生多種從植物獲得且適用于制備抗原(例如本發(fā)明的抗原蛋白)的克隆實體的方法和試劑且其為所屬領(lǐng)域中所已知(參見例如PCT公開案WO 05/81905；其以引用的方式并入本文中)?？寺嶓w包括能夠產(chǎn)生抗原(例如本發(fā)明的抗原蛋白)的克隆根系、克隆根細(xì)胞系、克隆植物細(xì)胞系和克隆植物。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于在從各種植物組織(例如根、葉)獲得的克隆細(xì)胞系和從單細(xì)胞獲得的完整植物(克隆植物)中表達(dá)抗原多核苷酸和多肽產(chǎn)物的方法和試劑。所述方法通常是基于使用各種類型的植物病毒載體。
舉例來說，一方面，本發(fā)明提供獲得表達(dá)編碼本發(fā)明的流感抗原多肽的多核苷酸的克隆根系的方法，其包含以下步驟(i)將包含編碼本發(fā)明的流感抗原多肽的多核苷酸的病毒載體引入植物或其部分中；和(ii)從植物產(chǎn)生一種或多種克隆根系?？衫缤ㄟ^用引起發(fā)根形成的農(nóng)桿菌(例如發(fā)根農(nóng)桿菌(A.rhizogenes))感染植物或植物部分(例如所收集的葉片)來產(chǎn)生克隆根系?？梢愿鞣N方法篩選克隆根系以鑒別保持病毒的根系、以高水平表達(dá)編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的根系等。本發(fā)明進(jìn)一步提供克隆根系，例如根據(jù)本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的克隆根系，且進(jìn)一步涵蓋使用克隆根系表達(dá)多核苷酸和制備編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多肽的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步提供產(chǎn)生表達(dá)編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的克隆根細(xì)胞系的方法，其包含以下步驟(i)產(chǎn)生克隆根系，其細(xì)胞含有基因組包含編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的病毒載體；(ii)從克隆根系釋放個別細(xì)胞；和(iii)將細(xì)胞保持在適于根細(xì)胞增殖的條件下。本發(fā)明提供克隆根細(xì)胞系和使用克隆根細(xì)胞系表達(dá)多核苷酸和制備多肽的方法。
一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生表達(dá)編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的克隆植物細(xì)胞系的方法，其包含以下步驟(i)產(chǎn)生克隆根系，其細(xì)胞含有基因組包含編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的病毒載體；(ii)從克隆根系釋放個別細(xì)胞；和(iii)將培養(yǎng)物中的細(xì)胞保持在適于植物細(xì)胞增殖的條件下。本發(fā)明進(jìn)一步提供產(chǎn)生表達(dá)編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的克隆植物細(xì)胞系的方法，其包含以下步驟(i)將包含編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的病毒載體引入保持在培養(yǎng)物中的植物細(xì)胞系的細(xì)胞中；和(ii)富集含有病毒載體的細(xì)胞?？赏ㄟ^例如以下步驟來進(jìn)行富集(i)從培養(yǎng)物中移出一部分細(xì)胞；(ii)稀釋所移出的細(xì)胞以便降低細(xì)胞濃度；(iii)使所稀釋的細(xì)胞增殖；和(iv)篩選含有病毒載體的細(xì)胞?？墒褂每寺≈参锛?xì)胞系制備本發(fā)明的流感抗原多肽。
本發(fā)明包括多種用于產(chǎn)生克隆植物的方法，所述植物的細(xì)胞含有包含編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的病毒載體。舉例來說，本發(fā)明提供產(chǎn)生表達(dá)編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的克隆植物的方法，其包含以下步驟(i)產(chǎn)生克隆根系，其細(xì)胞含有基因組包含編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的病毒載體；(ii)從克隆根系釋放個別細(xì)胞；和(iii)將所釋放細(xì)胞保持在適于形成植物的條件下。本發(fā)明進(jìn)一步提供產(chǎn)生表達(dá)編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的克隆植物的方法，其包含以下步驟(i)產(chǎn)生克隆植物細(xì)胞系，其細(xì)胞含有基因組包含編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的病毒載體；和(ii)將細(xì)胞保持在適于形成植物的條件下。一般來說，本發(fā)明的克隆植物可表達(dá)任何編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸?？墒褂盟隹寺≈参镏苽淇乖嚯摹?br> 如上文所述，本發(fā)明提供用于在克隆根系、克隆根細(xì)胞系、克隆植物細(xì)胞系(例如從葉、莖等獲得的細(xì)胞系)和克隆植物中表達(dá)編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的系統(tǒng)。使用基因組包括編碼本發(fā)明流感抗原多肽且可操作地連接于啟動子(即在啟動子控制下)的多核苷酸的植物病毒載體將編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸引入植物祖細(xì)胞中。根據(jù)以下進(jìn)一步描述的數(shù)種技術(shù)中的任一種，由含有病毒的細(xì)胞建立克隆根系或克隆植物細(xì)胞系?？赏ㄟ^感染、用病毒轉(zhuǎn)錄物或感染性cDNA克隆接種、電穿孔、T-DNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移等，將植物病毒載體或其部分引入植物細(xì)胞中。
以下部分描述用于產(chǎn)生表達(dá)編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的克隆根系、克隆根細(xì)胞系、克隆植物細(xì)胞系和克隆植物的方法。“根系”與“根細(xì)胞系”的區(qū)別之處在于，根系產(chǎn)生實際根樣結(jié)構(gòu)或根，而根細(xì)胞系由不形成根樣結(jié)構(gòu)的根細(xì)胞組成。打算使用術(shù)語“系”來表明所述系的細(xì)胞可增殖且將遺傳信息傳遞給后代細(xì)胞。細(xì)胞系的細(xì)胞通常在培養(yǎng)物中增殖而不會成為諸如那些在完整植物中發(fā)現(xiàn)的組織結(jié)構(gòu)的一部分。打算使用術(shù)語“根系”來表明根結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞可增殖而不會成為完整植物的一部分。應(yīng)注意術(shù)語“植物細(xì)胞”涵蓋根細(xì)胞。然而，為區(qū)分本發(fā)明的用于產(chǎn)生根系和根細(xì)胞系的方法與那些用于從非根組織直接產(chǎn)生植物細(xì)胞系的方法(與從克隆根系或從克隆根系獲得的克隆植物產(chǎn)生克隆植物細(xì)胞系相對比)，如本文所使用的術(shù)語“植物細(xì)胞”和“植物細(xì)胞系”通常是指由非根植物組織組成的細(xì)胞和細(xì)胞系。植物細(xì)胞可為例如葉、莖、芽、花部分等。應(yīng)注意可從如本文中所獲得產(chǎn)生的克隆植物獲得種子。所述種子與從所述種子獲得的植物一樣可能含有病毒載體。用于獲得種子儲備物的方法為所屬領(lǐng)域中所熟知(參見例如美國專利公開案2004/093643；以引用的方式并入本文中)。
克隆根系 本發(fā)明提供用于產(chǎn)生克隆根系的系統(tǒng)，在所述克隆根系中使用植物病毒載體來指導(dǎo)編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的表達(dá)。根據(jù)多種已知方法中的任一種，將一個或多個包括編碼本發(fā)明流感抗原多肽且可操作地連接于啟動子的多核苷酸的病毒表達(dá)載體引入植物或其部分中。舉例來說，可用病毒轉(zhuǎn)錄物接種植物葉?？蓪⑤d體本身直接施用到植物(例如經(jīng)由研磨劑接種、機(jī)械化噴霧接種、真空滲透、粒子轟擊或電穿孔)。其它或另外，可(例如從已感染植物)制備病毒粒子或可根據(jù)已知技術(shù)將病毒粒子施用到其它植物。
如果通過將病毒基因組直接施用到植物來實現(xiàn)感染，那么可使用任何可用技術(shù)來制備病毒基因組。舉例來說，許多根據(jù)本發(fā)明適用的病毒具有ssRNA基因組?？赏ㄟ^在活體內(nèi)或活體外轉(zhuǎn)錄基因組的DNA拷貝或復(fù)制RNA拷貝來制備ssRNA?？紤]到易于使用的活體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(例如SP6、T7、網(wǎng)狀組織溶解產(chǎn)物等)的易獲得性，以及保持RNA載體的DNA拷貝的便利性，預(yù)期通常將通過尤其使用T7或SP6聚合酶的活體外轉(zhuǎn)錄來制備本發(fā)明的ssRNA載體?？墒褂酶腥拘詂DNA克隆?？筛鶕?jù)所屬領(lǐng)域中已知的方法，使用例如農(nóng)桿菌滲透，使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移將諸如病毒載體(整個病毒基因組或其部分)等病毒核酸轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞。
接著可在適于病毒轉(zhuǎn)錄物復(fù)制的條件下保持(例如培養(yǎng)或生長)植物或植物部分。在某些實施例中，病毒傳播到初始接種的細(xì)胞外，例如從細(xì)胞到細(xì)胞局部地傳播和/或從初始接種的葉系統(tǒng)地傳播到其它葉。然而，在一些實施例中，病毒不傳播。因此，病毒載體可含有編碼功能性MP和/或CP的基因，但可能缺乏所述基因中的一種或兩種。一般來說，將病毒載體引入植物或其部分中的多個細(xì)胞中(感染所述細(xì)胞)。
將病毒載體引入植物中后，收集葉。一般來說，可在引入病毒載體后的任何時間收集葉。然而，將病毒載體引入植物中后，可能需要將植物保持一段時間，例如對于病毒復(fù)制和任選病毒從初始引入其的細(xì)胞傳播來說足夠的一段時間。通過例如以下進(jìn)一步描述的已知方法來制備克隆根培養(yǎng)物(或多個培養(yǎng)物)。
一般來說，可使用任何可用方法從已引入病毒載體的植物或植物組織制備克隆根培養(yǎng)物。一種所述方法使用存在于某些細(xì)菌質(zhì)粒中的基因。在感染多種生物體且將DNA轉(zhuǎn)移到多種生物體的各種農(nóng)桿菌物種中發(fā)現(xiàn)這些質(zhì)粒。作為一個屬，農(nóng)桿菌可將DNA轉(zhuǎn)移到一大組不同的植物類型，其包括許多雙子葉與單子葉被子植物物種和裸子植物(參見例如，戈爾文(Gelvin)，2003，微生物與分子生物學(xué)評論(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)，6716和其中的參考文獻(xiàn)，其全部都以引用的方式并入本文中)。植物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化的分子基礎(chǔ)是從細(xì)菌轉(zhuǎn)移且整合到存在于各種農(nóng)桿菌物種中的大腫瘤誘導(dǎo)(Ti)或生根(Ri)質(zhì)粒的區(qū)域的植物核基因組中。當(dāng)存在于質(zhì)粒中時，將這一區(qū)域稱為T區(qū)，且當(dāng)從質(zhì)粒切除時稱為T-DNA。通常，單鏈T-DNA分子在天然存在的農(nóng)桿菌感染中轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中且最終并入(以雙鏈形式)基因組中。基于Ti質(zhì)粒的系統(tǒng)廣泛用于將外來遺傳物質(zhì)引入植物中和制備轉(zhuǎn)基因植物。
用各種農(nóng)桿菌物種感染植物和轉(zhuǎn)移T-DNA具有許多影響。舉例來說，根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)造成冠癭病，而發(fā)根農(nóng)桿菌造成在感染部位出現(xiàn)發(fā)根，即稱為“發(fā)根病”的病狀。各根是從單一遺傳轉(zhuǎn)化的細(xì)胞形成。因此，根中的根細(xì)胞為克隆細(xì)胞，且各根代表一個克隆細(xì)胞群體。發(fā)根農(nóng)桿菌感染所產(chǎn)生的根的特征為高生長速率和遺傳穩(wěn)定性(格里(Giri)等人，2000，生物技術(shù)進(jìn)展(Biotech.Adv.)，181和其中的參考文獻(xiàn)，其全部都以引用的方式并入本文中)。另外，所述根能夠再生遺傳穩(wěn)定植物(格里(Giri)2000，見上)。
一般來說，本發(fā)明涵蓋使用能夠誘導(dǎo)由植物細(xì)胞形成根的任何農(nóng)桿菌菌株，尤其任何發(fā)根農(nóng)桿菌菌株。如上文所述，Ri質(zhì)粒的一部分(Ri T-DNA)是引起發(fā)根病的原因。盡管將Ri質(zhì)粒的這一部分轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞宜通過用含有Ri質(zhì)粒的農(nóng)桿菌感染來實現(xiàn)，但本發(fā)明涵蓋使用將相關(guān)區(qū)域引入植物細(xì)胞中的替代性方法。所述方法包括將遺傳物質(zhì)引入植物細(xì)胞中的任何可用方法，其包括(但不限于)基因槍、電穿孔、PEG介導(dǎo)的DNA吸收、Ti基載體等。可通過使用病毒載體將Ri T-DNA的相關(guān)部分引入植物細(xì)胞中。Ri基因可包括在含有編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的同一載體中，或可與含有編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的載體為相同或不同類型的不同病毒載體中。應(yīng)注意，如所屬領(lǐng)域中所已知，產(chǎn)生發(fā)根可能不需要整個Ri T-DNA，且本發(fā)明涵蓋使用部分Ri T-DNA，但是所述部分含有足以誘導(dǎo)根形成的遺傳物質(zhì)。可將其它遺傳物質(zhì)(例如存在于Ri質(zhì)粒而不是T-DNA中的基因)轉(zhuǎn)移到本發(fā)明的植物細(xì)胞中，尤其是表達(dá)產(chǎn)物有利于T-DNA整合到植物細(xì)胞DNA中的基因。
為制備某些實施例的克隆根系，使所收集的葉部分在適于感染和轉(zhuǎn)化的條件下與發(fā)根農(nóng)桿菌接觸。將葉部分保持在培養(yǎng)物中以讓發(fā)根發(fā)育。各根為克隆根，即根中的細(xì)胞是來源于轉(zhuǎn)移有Ri T-DNA的單一祖細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，一部分所述祖細(xì)胞將含有病毒載體。因此，來源于所述祖細(xì)胞的根中的細(xì)胞可能含有病毒載體，因為病毒載體將在細(xì)胞分裂期間復(fù)制和傳遞。因此，高比例(例如至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％)、全部(100％)或?qū)嵸|(zhì)上全部(至少98％)的細(xì)胞將含有病毒載體。應(yīng)注意，由于克隆根內(nèi)的子細(xì)胞遺傳得到病毒載體，因此將病毒載體保持在整個根中并不需要病毒載體在根內(nèi)移動。可從葉部分移出個別克隆發(fā)根并進(jìn)一步培養(yǎng)。所述根在本文中又稱為根系。分離后，分離出的克隆根繼續(xù)生長。
已使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生多種不同克隆根系。使用含有編碼本發(fā)明流感抗原多肽(例如編碼流感多肽、其融合物和/或其免疫原性部分)的多核苷酸的病毒載體產(chǎn)生這些根系。通過西方印跡法(Western blot)檢驗根系。根系呈現(xiàn)多種不同表達(dá)水平的各種多肽。選擇呈現(xiàn)高表達(dá)的根系并進(jìn)一步培養(yǎng)。隨后再次檢驗這些根系且其顯示長時間保持高表達(dá)水平，此表明穩(wěn)定性。表達(dá)水平與以用于產(chǎn)生克隆根系的相同病毒載體感染的完整植物的表達(dá)相當(dāng)或更大。另外，根系表達(dá)的穩(wěn)定性優(yōu)于用相同病毒載體感染的植物中所獲得的穩(wěn)定性。2-3次繼代后，高達(dá)80％的所述病毒感染的植物恢復(fù)為野生型。(所述繼代包括用轉(zhuǎn)錄物接種植物，允許感染(局部或系統(tǒng)性)形成，獲得葉樣品并接種新鮮植物，隨后檢驗所述新鮮植物的表達(dá))。
可大規(guī)模培養(yǎng)根系以制備如下文進(jìn)一步討論的本發(fā)明多肽的抗原。應(yīng)注意通常可將克隆根系(和從克隆根系獲得的細(xì)胞系)保持在不包括通常用于培養(yǎng)根和植物細(xì)胞的各種化合物(例如植物生長激素，諸如植物生長素(auxin)、細(xì)胞分裂素(cytokinin)等)的培養(yǎng)基中。這一特征大大地降低與組織培養(yǎng)相關(guān)的費用，且本發(fā)明者預(yù)期其將顯著促進(jìn)使用植物制備蛋白質(zhì)的經(jīng)濟(jì)可行性。
可用多種方法中的任一種來選擇表達(dá)編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的克隆根。西方印跡法、ELISA分析等可用于檢測所編碼的多肽。在諸如GFP等可檢測標(biāo)記的情況下，可執(zhí)行諸如目視篩選等替代性方法。如果使用含有編碼可選擇性標(biāo)記的多核苷酸的病毒載體，那么可進(jìn)行適當(dāng)選擇(例如，可在適當(dāng)抗生素或營養(yǎng)條件和經(jīng)鑒別且分離的存活根存在下，培養(yǎng)由此獲得的葉材料和/或根)。某些病毒載體含有兩種或兩種以上編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸，例如兩種或兩種以上編碼不同多肽的多核苷酸。如果這些多核苷酸中的一種為可選擇或可檢測標(biāo)記，那么通過選擇或檢測標(biāo)記的表達(dá)而選擇或檢測的克隆根將具有高度的也表達(dá)第二種多核苷酸的可能性。也可以使用PCR和其它核酸檢測方法來進(jìn)行含有特定多核苷酸的根系的篩選。
其它或另外，可通過接種由于病毒感染而形成局部病變的宿主植物(例如告敏感性宿主植物)來篩選存在病毒的克隆根系。舉例來說，可在50μl磷酸鹽緩沖液中將5mg根組織均質(zhì)化且用以接種單一煙草植物葉。如果病毒存在于根培養(yǎng)物中，那么在2到3天內(nèi)所感染的葉上將會出現(xiàn)特征性病變。這意謂根系含有帶有編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的重組病毒。如果無局部病變形成，那么不存在病毒，且根系作為陰性而不被接受。這一方法高度節(jié)省時間和成本。初始篩選病毒的存在后，可通過例如西方印跡法或ELISA對含有病毒的根進(jìn)行第二次篩選以選擇高表達(dá)者?？蓱?yīng)用其它篩選，例如篩選迅速生長、特定培養(yǎng)基中或特定環(huán)境條件下的生長等。一般來說，這些篩選方法可應(yīng)用在本文所述的克隆根系、克隆根細(xì)胞系、克隆植物細(xì)胞系和/或克隆植物的任一個的發(fā)育中。
如對于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將顯而易見，可對本發(fā)明方法的描述進(jìn)行多種修改以用于產(chǎn)生含有病毒載體的克隆根系。所述修改處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。舉例來說，盡管通常需要在引入Ri T-DNA基因前將病毒載體引入完整植物或其部分中，但在某些實施例中，在引入病毒載體前引入Ri-DNA。另外，有可能使完整植物與發(fā)根農(nóng)桿菌接觸，而不是收集葉部分，然后使其暴露于細(xì)菌。
可使用從含有病毒載體的植物或其部分的單一細(xì)胞產(chǎn)生克隆根系的其它方法(即，不使用發(fā)根農(nóng)桿菌或來自Ri質(zhì)粒的遺傳物質(zhì)的方法)。舉例來說，已知用某些植物激素或植物激素的組合處理會導(dǎo)致從植物組織產(chǎn)生根。
從克隆根系獲得的克隆細(xì)胞系 如上文所述，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生克隆根系的方法，其中根系中的細(xì)胞含有病毒載體。如所屬領(lǐng)域中所熟知，可從根產(chǎn)生多種不同細(xì)胞系。舉例來說，可使用多種已知方法從由根獲得的個別根細(xì)胞產(chǎn)生根細(xì)胞系?？蓮母械母鞣N不同根細(xì)胞類型獲得所述根細(xì)胞系。一般來說，收集根材料并解離(例如以物理方式和/或酶促消化)以釋放個別根細(xì)胞，然后進(jìn)一步培養(yǎng)。通常不必形成完整原生質(zhì)體。需要時，可在極稀細(xì)胞濃度下涂鋪根細(xì)胞，以便從單一根細(xì)胞獲得根細(xì)胞系。以此方式獲得的根細(xì)胞系為含有病毒載體的克隆根細(xì)胞系。因此，所述根細(xì)胞系展現(xiàn)編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的穩(wěn)定表達(dá)?？赏ㄟ^例如在適當(dāng)植物激素存在下培養(yǎng)解離的根細(xì)胞，以類似方式從克隆根獲得克隆植物細(xì)胞系。可使用篩選和連續(xù)幾輪富集來鑒別以高水平表達(dá)編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的細(xì)胞系。然而，如果獲得細(xì)胞系的克隆根系已以高水平表達(dá)，那么所述其它篩選可能就不需要了。
如在克隆根系的情況下一般，從含有病毒載體的單一祖細(xì)胞獲得克隆根細(xì)胞系的細(xì)胞，且其因此也將含有病毒載體，因為病毒載體將在細(xì)胞分裂期間復(fù)制和傳播。因此，高比例(例如至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％)、全部(100％)或?qū)嵸|(zhì)上全部(至少98％)的細(xì)胞將含有病毒載體。應(yīng)注意由于克隆根細(xì)胞系內(nèi)的子細(xì)胞遺傳得到病毒載體，因此保持病毒載體并不需要病毒載體在細(xì)胞間移動。如下文所述，可使用克隆根細(xì)胞系來制備編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸。
克隆植物細(xì)胞系 本發(fā)明提供用于產(chǎn)生克隆植物細(xì)胞系的方法，在所述克隆植物細(xì)胞系中，使用植物病毒載體指導(dǎo)編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明方法，將一個或多個包括編碼本發(fā)明流感抗原多肽且可操作地連接于啟動子的多核苷酸的病毒表達(dá)載體引入保持在細(xì)胞培養(yǎng)物中的植物細(xì)胞系的細(xì)胞中。所屬領(lǐng)域中已知來自各種植物類型的許多植物細(xì)胞系，可使用其中任一種。可根據(jù)用于實施本發(fā)明的已知方法來產(chǎn)生新近獲得的細(xì)胞系。根據(jù)許多方法中的任一種，將病毒載體引入植物細(xì)胞系的細(xì)胞中。舉例來說，可制備原生質(zhì)體，然后用電穿孔將病毒轉(zhuǎn)錄物引入到細(xì)胞中。可使用其它將植物病毒載體引入植物細(xì)胞系的細(xì)胞中的方法。
一種用于產(chǎn)生本發(fā)明的克隆植物細(xì)胞系和適于引入植物細(xì)胞(例如原生質(zhì)體)中的病毒載體的方法可如下使用在引入病毒載體后，可將植物細(xì)胞系保持在組織培養(yǎng)物中。此時，病毒載體可能會復(fù)制，且編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸可能得到表達(dá)。通過例如連續(xù)富集法，從培養(yǎng)物獲得克隆植物細(xì)胞系。舉例來說，可任選在稀釋的同時，從培養(yǎng)物中移出樣品以便細(xì)胞濃度較低，且以個別液滴形式涂鋪于皮氏培養(yǎng)皿(Petridish)中。然后，保持液滴以讓細(xì)胞分裂。
應(yīng)了解，視培養(yǎng)物的初始密度和稀釋量而定，液滴可含有可變數(shù)目的細(xì)胞。如果需要在僅一輪富集后獲得表達(dá)編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的克隆細(xì)胞系，那么可稀釋細(xì)胞以使得大多數(shù)液滴含有0或1個細(xì)胞。然而，選擇使得各液滴中存在多個細(xì)胞的濃度并隨后篩選液滴以鑒別那些含有表達(dá)細(xì)胞的液滴可能更為有效。一般來說，可采用任何適當(dāng)篩選程序。舉例來說，可使用諸如GFP等可檢測標(biāo)記的選擇或檢測。可使用西方印跡法或EL1SA分析。個別液滴(100μl)含有過量細(xì)胞以用于進(jìn)行這些分析。進(jìn)行多輪富集以連續(xù)分離較高表達(dá)的細(xì)胞系?？墒褂糜糜趩渭?xì)胞克隆的標(biāo)準(zhǔn)方法，通過進(jìn)一步限制稀釋來產(chǎn)生單克隆植物細(xì)胞系(即，從單一祖細(xì)胞獲得的群體)。然而，不必分離個別克隆系?？墒褂煤卸鄠€克隆細(xì)胞系的群體來表達(dá)編碼一種或多種本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸。
一般來說，上述用于產(chǎn)生克隆根系的某些考慮因素適用于克隆植物細(xì)胞系的產(chǎn)生。舉例來說，可使用多種含有一個或多個編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多核苷酸的病毒載體，也可使用多個不同載體的組合。可使用類似篩選法。如在克隆根系和克隆根細(xì)胞系的情況下一般，從含有病毒載體的單一祖細(xì)胞獲得克隆植物細(xì)胞系的細(xì)胞，且其因此也將含有病毒載體，因為病毒載體將在細(xì)胞分裂期間復(fù)制和傳播。因此，高比例(例如至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％)、全部(100％)或?qū)嵸|(zhì)上全部(至少98％)的細(xì)胞將含有病毒載體。應(yīng)注意由于克隆植物細(xì)胞系內(nèi)的子細(xì)胞遺傳得到病毒載體，因此保持病毒載體并不需要病毒載體在細(xì)胞間移動。如下文所述，可使用克隆植物細(xì)胞系來制備編碼本發(fā)明流感抗原多肽的多肽。
克隆植物 可從根據(jù)上述各種方法所產(chǎn)生的克隆根、克隆根細(xì)胞系和/或克隆植物細(xì)胞系產(chǎn)生克隆植物。用于從根、根細(xì)胞系和植物細(xì)胞系(諸如本文所述的克隆根系、克隆根細(xì)胞系和克隆植物細(xì)胞系)產(chǎn)生植物的方法為所屬領(lǐng)域中所熟知(參見例如皮爾斯(Peres)等人，2001，植物細(xì)胞、組織、有機(jī)培養(yǎng)物(Plant Cell，Tissue，Organ Culture)，6537；以引用的方式并入本文中；和本文別處所引用的關(guān)于植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)參考著作)。因此，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生克隆植物的方法，其包含以下步驟(i)根據(jù)上述本發(fā)明方法中的任一種產(chǎn)生克隆根系、克隆根細(xì)胞系或克隆植物細(xì)胞系；和(ii)從克隆根系、克隆根細(xì)胞系或克隆植物產(chǎn)生完整植物?？寺≈参锟筛鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)方法繁殖和生長。
如在克隆根系、克隆根細(xì)胞系和克隆植物細(xì)胞系的情況下一般，從含有病毒載體的單一祖細(xì)胞獲得克隆植物的細(xì)胞，且其因此也將含有病毒載體，因為病毒載體將在細(xì)胞分裂期間復(fù)制和傳播。因此，高比例(例如至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％)、全部(100％)或?qū)嵸|(zhì)上全部(至少98％)的細(xì)胞將含有病毒載體。應(yīng)注意由于克隆植物內(nèi)的子細(xì)胞遺傳得到病毒載體，因此保持病毒載體并不需要病毒載體的移動。
芽和發(fā)芽籽苗植物表達(dá)系統(tǒng) 根據(jù)本發(fā)明，可使用多種不同系統(tǒng)中的任一種來在幼苗(例如發(fā)芽的籽苗)中表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽。在一些實施例中，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或種子，接著發(fā)芽和生長一段時間以便在幼苗組織中(例如在發(fā)芽的籽苗中)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因序列中所包括的蛋白質(zhì)或多肽。用于制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和/或種子的典型技術(shù)包括根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移和微彈轟擊(microprojectile bombardment)或電穿孔。
先前已描述用于產(chǎn)生多種適用于制備本發(fā)明流感抗原多肽的芽和發(fā)芽籽苗的系統(tǒng)和試劑且其為所屬領(lǐng)域中所已知(參見例如PCT公開案WO 04/43886；以引用的方式并入本文中)。本發(fā)明進(jìn)一步提供可食用的發(fā)芽籽苗作為含有流感抗原多肽的生物質(zhì)。在某些方面，直接提供生物質(zhì)以供食用含有抗原的組合物。在某些方面，生物質(zhì)在食用前通過例如均質(zhì)化、粉碎、干燥或提取進(jìn)行加工。在某些方面，從生物質(zhì)純化流感抗原多肽且調(diào)配成醫(yī)藥組合物。
另外提供用于在可以活體食用或收集的發(fā)芽籽苗(例如蕓苔屬的芽、發(fā)芽籽苗)中制備流感抗原多肽的方法。在某些方面，本發(fā)明包括使種子在封閉的可調(diào)節(jié)環(huán)境中(例如在室內(nèi)、在容器中等)生長為可食用的發(fā)芽籽苗。種子可為含有編碼流感抗原多肽的表達(dá)盒的遺傳工程改造種子，所述流感抗原多肽的表達(dá)由外源誘導(dǎo)型啟動子驅(qū)動?？墒褂每捎衫绻?、熱、植物激素、營養(yǎng)素等誘導(dǎo)的多種外源誘導(dǎo)型啟動子。
在相關(guān)實施例中，本發(fā)明提供在發(fā)芽籽苗中制備流感抗原多肽的方法，所述方法首先通過使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)用編碼流感抗原多肽的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物來產(chǎn)生發(fā)芽籽苗的種子儲備物，其中流感抗原多肽的表達(dá)是由誘導(dǎo)型啟動子驅(qū)動?？蓮霓D(zhuǎn)化植物獲得轉(zhuǎn)基因種子，使其在封閉的可調(diào)節(jié)環(huán)境中生長并誘導(dǎo)以表達(dá)流感抗原多肽。
在一些實施例中，提供包括用編碼流感抗原多肽的病毒表達(dá)盒感染發(fā)芽籽苗的方法，所述流感抗原多肽的表達(dá)可由病毒啟動子或誘導(dǎo)型啟動子中的任一種驅(qū)動。使發(fā)芽籽苗在封閉的可調(diào)節(jié)環(huán)境中生長2到14天或至少直到已獲得對食用或收集來說足量的流感抗原多肽。
本發(fā)明進(jìn)一步提供在發(fā)芽籽苗中制備流感抗原多多肽的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括可控制氣候的容納單元和含有編碼一個或多個流感抗原多肽的表達(dá)盒的發(fā)芽籽苗，其中表達(dá)是由組成型或誘導(dǎo)型啟動子驅(qū)動。系統(tǒng)可提供優(yōu)于不可控制的室外環(huán)境或溫室的獨特優(yōu)點。因此，本發(fā)明使得生長物能夠精確安排流感抗原多肽表達(dá)的誘導(dǎo)。這可大大降低制備流感抗原多肽的時間和成本。
在某些方面，短暫轉(zhuǎn)染的芽含有編碼本發(fā)明流感抗原多肽的病毒載體序列。使籽苗生長一段時間以允許在芽中產(chǎn)生病毒核酸，接著生長一段產(chǎn)生多個病毒拷貝的時間，從而導(dǎo)致產(chǎn)生流感抗原多肽。
在某些方面，使含有編碼流感抗原多肽的核酸的遺傳工程改造的種子或胚芽在封閉的可調(diào)節(jié)環(huán)境中生長到發(fā)芽籽苗階段。所述封閉的可調(diào)節(jié)環(huán)境可為種子可在室內(nèi)生長的容納單元或房間。封閉的可調(diào)節(jié)環(huán)境的所有環(huán)境因素都可控制。由于芽的生長不需要光，且光照費用較高，因此可使遺傳工程改造的種子或胚芽在不存在光的情況下在室內(nèi)生長到發(fā)芽籽苗階段。
本發(fā)明的封閉的可調(diào)節(jié)環(huán)境中可調(diào)節(jié)的其它環(huán)境因素包括溫度、濕度、水分、營養(yǎng)素、氣體(例如，O2或CO2含量或空氣循環(huán))、化學(xué)物質(zhì)(小分子，諸如糖和糖衍生物；或激素，諸如植物激素赤霉酸或脫落酸等)等。
根據(jù)本發(fā)明的某些方法，編碼流感抗原多肽的核酸的表達(dá)可由外源誘導(dǎo)型啟動子控制。使外源誘導(dǎo)型啟動子響應(yīng)于外部而不是內(nèi)部刺激來增加或降低核酸表達(dá)。多種環(huán)境因素可充當(dāng)遺傳工程改造芽的表達(dá)盒所帶的核酸的表達(dá)的誘導(dǎo)物。啟動子可為熱誘導(dǎo)型啟動子，諸如熱休克啟動子(heat-shock promoter)。舉例來說，使用熱休克啟動子，可簡單地使封閉環(huán)境的溫度上升來誘導(dǎo)核酸表達(dá)。其它啟動子包括光誘導(dǎo)型啟動子。如果封閉的可調(diào)節(jié)環(huán)境中的光總是開啟的，那么可保持光誘導(dǎo)型啟動子作為組成型啟動子。其它或另外，可在發(fā)育期間的特定時間通過簡單地開啟光來啟動核酸表達(dá)。啟動子可為用于誘導(dǎo)核酸表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子。根據(jù)這些實施例，可簡單地將化學(xué)物質(zhì)噴灑或噴霧在種子、胚芽或籽苗上以誘導(dǎo)核酸表達(dá)?？删_控制噴霧和噴灑且引導(dǎo)到預(yù)定目標(biāo)種子、胚芽或籽苗上。封閉環(huán)境缺乏會使化學(xué)物質(zhì)分散偏離預(yù)定目標(biāo)的風(fēng)流或氣流，從而化學(xué)物質(zhì)停留在預(yù)定目標(biāo)上。
根據(jù)本發(fā)明，可選擇誘導(dǎo)表達(dá)的時間以使得到收集時間時發(fā)芽籽苗中流感抗原多肽的表達(dá)最大。在特定生長階段的胚芽中誘導(dǎo)表達(dá)、例如在萌發(fā)后特定天數(shù)時的胚芽中誘導(dǎo)表達(dá)可在收集時間時使得流感抗原多肽的合成最大。舉例來說，在萌發(fā)后4天的啟動子誘導(dǎo)表達(dá)可使得蛋白質(zhì)合成比3天后或5天后的啟動子誘導(dǎo)表達(dá)多。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解可由常規(guī)實驗達(dá)成表達(dá)最大化。在某些方法中，在萌發(fā)后約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或12天時收集發(fā)芽的籽苗。
在表達(dá)載體具有組成型啟動子而不是誘導(dǎo)型啟動子的情況下，可在發(fā)芽籽苗轉(zhuǎn)化后的某一時間收集發(fā)芽籽苗。舉例來說，如果發(fā)芽籽苗在發(fā)育初期階段(例如胚芽階段)用病毒轉(zhuǎn)化，那么可在轉(zhuǎn)化后表達(dá)達(dá)到其最大值的時間，例如轉(zhuǎn)化后約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天收集發(fā)芽的籽苗。視種子的萌發(fā)而定，芽在轉(zhuǎn)化后可能發(fā)育1、2、3個月或3個月以上。
一般來說，流感抗原多肽的表達(dá)開始后，允許種子、胚芽或發(fā)芽籽苗生長直到表達(dá)足量的流感抗原多肽。在某些方面，足量是當(dāng)生食所收集的生物質(zhì)時將向患者提供治療益處的量。其它或另外，足量是可從生物質(zhì)濃縮或純化流感抗原多肽并將所述流感抗原多肽調(diào)配成在投予后向患者提供治療益處的醫(yī)藥組合物的量。流感抗原多肽通常不是自然界中在發(fā)芽籽苗中所表達(dá)的蛋白質(zhì)。無論如何，流感抗原多肽通常以高于自然界中發(fā)芽籽苗中會存在的濃度的濃度表達(dá)。
誘導(dǎo)流感抗原多肽表達(dá)后，允許繼續(xù)生長直到發(fā)芽籽苗階段，此時收集發(fā)芽的籽苗?？墒占畹陌l(fā)芽籽苗。收集活的發(fā)芽籽苗具有數(shù)個優(yōu)點，包括工作量和破壞最小?？梢运苑ㄅ囵B(yǎng)本發(fā)明的發(fā)芽籽苗，從而使得收集成為從水栽法溶液中取出發(fā)芽籽苗的簡單事情。雖然本發(fā)明的發(fā)芽籽苗的生長不需要土壤，但如果所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)為有必要或需要，那么可以提供土壤。因為芽可以無土生長，所以在收集時不需要清洗發(fā)芽籽苗材料。能夠在不洗滌或擦洗的情況下直接從水栽法環(huán)境中收集發(fā)芽籽苗使對所收集材料的破壞最小。植物的破壞和枯萎誘發(fā)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡期間，某些蛋白水解酶變得具有活性，其會降解發(fā)芽籽苗中所表達(dá)的醫(yī)藥蛋白質(zhì)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的治療活性降低。細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的蛋白水解可能會顯著降低成熟植物的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。使用本發(fā)明的方法，當(dāng)不進(jìn)行收集時可避免細(xì)胞凋亡直到從植物提取蛋白質(zhì)時為止。
舉例來說，可研磨、粉碎或摻合活的芽以制備發(fā)芽籽苗生物質(zhì)于含有蛋白酶抑制劑的緩沖液中的漿液?？蓪⒕彌_液維持在約4℃下。在一些方面，將發(fā)芽籽苗生物質(zhì)風(fēng)干、噴霧干燥、冷凍或冷凍干燥。如同在成熟植物中一般，這些方法中的一些方法(諸如風(fēng)干)可能導(dǎo)致醫(yī)藥蛋白質(zhì)的活性損失。然而，因為發(fā)芽籽苗極小且具有大的表面積與體積的比率，所以這很可能不會發(fā)生。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，可利用許多使所表達(dá)蛋白質(zhì)的蛋白水解最小的收集生物質(zhì)的技術(shù)，且可將這些技術(shù)應(yīng)用于本發(fā)明。
在一些實施例中，發(fā)芽的籽苗可食用。在某些實施例中，收集后(例如收集后立即、在收集后最短時間內(nèi))食用表達(dá)足量流感抗原多肽的發(fā)芽籽苗以使得在食用發(fā)芽的籽苗前絕對未進(jìn)行加工。以此方式，使在向需要治療的患者投予流感抗原多肽前流感抗原多肽的任何收集誘導(dǎo)的蛋白水解分解最小。舉例來說，可向患者直接傳遞準(zhǔn)備食用的發(fā)芽籽苗。其它或另外，向需要治療的患者交付遺傳工程改造的種子或胚芽并由患者培養(yǎng)到發(fā)芽籽苗階段。一方面，向患者或治療患者的醫(yī)生提供一批遺傳工程改造的發(fā)芽籽苗，以便可培養(yǎng)表達(dá)某些所需流感抗原多肽的發(fā)芽籽苗的連續(xù)儲備物。這對無法承擔(dān)或交付昂貴藥物的發(fā)展中國家的人群來說可能特別有價值。培養(yǎng)本發(fā)明的發(fā)芽籽苗的容易性使得本發(fā)明的發(fā)芽籽苗尤其合乎所述發(fā)展中國家人群的需要。
封閉環(huán)境的可調(diào)節(jié)性質(zhì)賦予本發(fā)明優(yōu)于在室外環(huán)境中培養(yǎng)植物的優(yōu)點。一般來說，培養(yǎng)在植物中表達(dá)醫(yī)藥蛋白質(zhì)的遺傳工程改造的發(fā)芽籽苗可提供相比于培養(yǎng)遺傳工程改造的植物生長較快且工作量、風(fēng)險和調(diào)節(jié)考慮因素較少的醫(yī)藥產(chǎn)品。本發(fā)明所使用的封閉的可調(diào)節(jié)環(huán)境降低或消除自然界中植物異花受粉的風(fēng)險。
舉例來說，熱誘導(dǎo)型啟動子可能不能在室外使用，因為室外溫度無法控制。室外溫度上升到超過某一水平的任何時間，啟動子都將開啟。類似地，每當(dāng)室外溫度下降時，啟動子都將關(guān)閉。所述溫度轉(zhuǎn)變可能會在一天內(nèi)發(fā)生，例如白天開啟表達(dá)而在晚上關(guān)閉表達(dá)。熱誘導(dǎo)型啟動子(諸如本文中所述的那些啟動子)甚至將不適合用于易受幾乎與室外相同程度的氣候轉(zhuǎn)變影響的溫室中。遺傳工程改造植物在溫室中的培養(yǎng)成本相當(dāng)高。相比之下，在本發(fā)明系統(tǒng)中，每個變量都可控制，從而每次收集都可獲得最大量的表達(dá)。
在某些實施例中，可在發(fā)芽籽苗發(fā)育期間的任何時間澆水、噴霧或噴灑的盤中培養(yǎng)本發(fā)明的發(fā)芽籽苗。舉例來說，盤可配備有一個或多個可在發(fā)芽籽苗發(fā)育期間在特定時間且以精確量傳遞和/或去除水、營養(yǎng)素、化學(xué)物質(zhì)等的澆水、噴霧、噴灑和排水設(shè)備。舉例來說，種子需要足夠水分來保持潮濕。過量水分穿過盤孔排出且進(jìn)入房間地面的排水溝中。通常在將排出水排回到環(huán)境中之前，將其酌情處理以去除有害化學(xué)物質(zhì)。
盤的另一個優(yōu)點在于其可容納在極小的空間內(nèi)。因為發(fā)芽籽苗的生長不需要光，所以含有種子、胚芽或發(fā)芽籽苗的盤可一個疊一個地垂直緊密堆疊，從而在為了達(dá)到這些目的而特定構(gòu)造的容納設(shè)施中每單位占地面積提供大量生物質(zhì)。另外，盤的堆疊可在容納單元內(nèi)以水平行排列。籽苗生長到適于收集的階段(約2到14天)后，將個別籽苗盤人工地或以自動方式(諸如傳送帶)移到加工設(shè)施中。
本發(fā)明的系統(tǒng)的獨特之處在于其提供作為流感抗原多肽來源的發(fā)芽籽苗生物質(zhì)。無論直接食用還是加工成醫(yī)藥組合物形式，因為發(fā)芽籽苗是在封閉的可調(diào)節(jié)環(huán)境中生長，所以發(fā)芽籽苗生物質(zhì)和/或從生物質(zhì)獲得的醫(yī)藥組合物都可以低成本提供給消費者。另外，可控制發(fā)芽籽苗的生長條件的事實使得產(chǎn)品品質(zhì)和純度一致。本發(fā)明的封閉的可調(diào)節(jié)環(huán)境避免可能阻止科學(xué)家在室外培養(yǎng)遺傳工程改造的農(nóng)產(chǎn)品的環(huán)境保護(hù)局(EPA)的許多安全規(guī)程。
轉(zhuǎn)化芽 可使用多種方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞并產(chǎn)生遺傳工程改造的發(fā)芽籽苗。兩種可利用的要求在活體外產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系，接著使細(xì)胞系再生成完整植物的轉(zhuǎn)化植物的方法包括根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移和微彈轟擊或電穿孔。在一些實施例中，利用短暫表達(dá)系統(tǒng)。在植物組織中產(chǎn)生蛋白質(zhì)或多肽的短暫表達(dá)的典型技術(shù)利用植物病毒。病毒轉(zhuǎn)化提供在獲得所需產(chǎn)物之前不會發(fā)生實驗或生育滯后，更快速且不太昂貴的轉(zhuǎn)化可收集的胚芽和發(fā)芽籽苗的方法。對于這些技術(shù)中的任一種，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解如何調(diào)整和優(yōu)化傳統(tǒng)上已經(jīng)用于植物、種子、胚芽或發(fā)芽籽苗的轉(zhuǎn)化方案。
本發(fā)明提供具有病毒表達(dá)系統(tǒng)(例如快速表達(dá)、高產(chǎn)生量)和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化(例如控制投藥)的優(yōu)點的表達(dá)系統(tǒng)。具體來說，如以下所詳細(xì)討論，本發(fā)明提供農(nóng)桿菌構(gòu)筑體(即，在農(nóng)桿菌中復(fù)制且因此可通過傳遞農(nóng)桿菌而傳遞到植物細(xì)胞的構(gòu)筑體)包括引入植物中后指導(dǎo)帶有所關(guān)注蛋白質(zhì)或多肽的基因的病毒序列(例如包括病毒復(fù)制序列)表達(dá)的植物啟動子的系統(tǒng)。這一系統(tǒng)允許蛋白質(zhì)或多肽在植物中以受控方式高水平短暫表達(dá)。
以下更詳細(xì)地個別討論表達(dá)系統(tǒng)的多個不同實施例，其中一些產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物而其它提供短暫表達(dá)。對于這些技術(shù)中的任一種，閱讀本說明書的所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解如何調(diào)整和優(yōu)化用于在幼苗組織(例如發(fā)芽籽苗)中表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽的方案。
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 農(nóng)桿菌是革蘭氏陰性根瘤菌科(Rhizobiaceae)的代表性屬。這一物種造成植物腫瘤，諸如冠癭病和發(fā)根病。在作為腫瘤特征的去分化植物組織中，農(nóng)桿菌產(chǎn)生稱為冠癭堿(opine)的氨基酸衍生物并由植物分解代謝。負(fù)責(zé)冠癭堿表達(dá)的細(xì)菌基因是嵌合表達(dá)盒的控制元件的便利來源。根據(jù)本發(fā)明，可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)產(chǎn)生僅早于成熟植物收集的幼苗(例如發(fā)芽籽苗，包括可食用發(fā)芽籽苗)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法可容易地應(yīng)用于再生表達(dá)流感抗原多肽的發(fā)芽籽苗。
一般來說，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物包括通過與帶有植物/細(xì)菌載體的根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)來轉(zhuǎn)化在組織培養(yǎng)物中生長的植物細(xì)胞。所述載體含有編碼流感抗原多肽的基因。農(nóng)桿菌將載體轉(zhuǎn)移到植物宿主細(xì)胞中，然后使用抗生素處理來清除農(nóng)桿菌。選擇表達(dá)流感抗原多肽的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，使其分化并最終再生成為完整小植物(海倫斯(Hellens)等人，2000，植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)，42819；皮龍·史密茲(Pilon-Smits)等人，1999，植物生理學(xué)(Plant Physiolog.)，119123；巴菲爾德(Barfield)等人，1991，植物細(xì)胞報告(Plant Cell Reports)，10308；和瑞瓦(Riva)等人，1998，生物技術(shù)雜志(J.Biotech)，1(3)；全部都以引用的方式并入本文中)。
用于本發(fā)明中的農(nóng)桿菌表達(dá)載體包括設(shè)計用于在植物中操作的編碼流感抗原多肽的基因(或表達(dá)盒)以及表達(dá)盒的上游和下游的伴隨序列(companion sequence)。伴隨序列通常具有質(zhì)?；虿《緛碓辞蚁蜉d體提供必要的特征以將DNA從細(xì)菌轉(zhuǎn)移到所需植物宿主中。
可能希望基本細(xì)菌/植物載體構(gòu)筑體能提供廣泛宿主范圍的原核生物復(fù)制起點、原核生物可選擇標(biāo)記。合適的原核生物可選擇標(biāo)記包括針對諸如氨芐西林(ampicillin)或四環(huán)素(tetracycline)等抗生素的抗性。載體中可存在所屬領(lǐng)域中熟知的編碼其它功能的其它DNA序列。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的將DNA轉(zhuǎn)移到植物染色體需要農(nóng)桿菌T-DNA序列。通常在構(gòu)建農(nóng)桿菌表達(dá)構(gòu)筑體期間去除T-DNA的腫瘤誘導(dǎo)基因并用編碼流感抗原多肽的序列置換。保留T-DNA邊界序列，因為其啟動T-DNA區(qū)域整合到植物基因組中。如果流感抗原多肽的表達(dá)不易被檢測到，那么細(xì)菌/植物載體構(gòu)筑體可包括適于確定植物細(xì)胞是否已轉(zhuǎn)化的可選擇標(biāo)記基因，例如npt II卡那霉素(kanamycin)抗性基因。Ti序列位于同一或不同細(xì)菌/植物載體(Ti質(zhì)粒)上。Ti序列包括編碼一組負(fù)責(zé)T-DNA切除、轉(zhuǎn)移和整合到植物基因組中的蛋白質(zhì)的毒性基因(謝爾(Schell)，1987，科學(xué)(Science)，2371176-86；以引用的方式并入本文中)。適于允許異源序列整合到植物基因組中的其它序列可包括用于同源重組的轉(zhuǎn)座子序列(transposon sequence)等。
Ti序列位于同一或不同細(xì)菌/植物載體(Ti質(zhì)粒)上。Ti序列包括編碼一組負(fù)責(zé)T-DNA切除、轉(zhuǎn)移和整合到植物基因組中的蛋白質(zhì)的毒性基因(謝爾(Schell)，1987，科學(xué)(Science)，2371176-83；以引用的方式并入本文中)。適于允許異源序列整合到植物基因組中的其它序列也可包括用于同源重組的轉(zhuǎn)座子序列(transposon sequence)等。
某些構(gòu)筑體將包括編碼抗原蛋白的表達(dá)盒。在指定轉(zhuǎn)化中可使用1個、2個或更多個表達(dá)盒。除含有流感抗原多肽編碼序列外，重組表達(dá)盒還含有至少以下元件啟動子區(qū)域、植物5′非翻譯序列、起始密碼子(視所表達(dá)基因是否自身具有而定)以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止序列。另外，本發(fā)明的表達(dá)盒或嵌合基因中可包括轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子。表達(dá)盒中酌情可包括允許蛋白質(zhì)加工和易位的信號分泌序列。
多種啟動子、信號序列以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子例如在勞頓(Lawton)等人(1987，植物分子生物學(xué)(Plant Mol Biol)，9315-24；以引用的方式并入本文中)和美國專利5,888,789(以引用的方式并入本文中)中有所描述。另外，通常利用抗生素抗性的結(jié)構(gòu)基因作為選擇因子(弗雷利(Fraley)等人，1983，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)，804803-7；以引用的方式并入本文中)。表達(dá)盒的5′和3′末端的獨特限制酶位點允許容易地插入預(yù)先存在的載體中。
用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化且?guī)в兄辽僖粋€T-DNA邊界序列的其它二元載體系統(tǒng)在PCT公開案WO 2000/020612(以引用的方式并入本文中)中有所描述。對農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的進(jìn)一步討論見于戈爾文(Gelvin)(2003，微生物與分子生物學(xué)評論(Microbiol Mol BiolRev.)，6716-37；和其中的參考文獻(xiàn)；全部都以引用的方式并入本文中)和勞倫思(Lorence)和費爾波爾特(Verpoorte)(2004，分子生物學(xué)方法(Methods Mol Biol)，267329-50；以引用的方式并入本文中)中。
在某些實施例中，使用除農(nóng)桿菌以外的細(xì)菌將核酸序列引入植物中。參見例如布魯斯特(Broothaerts)等人(2005，自然(Nature)，433629-33；以引用的方式并入本文中)。
由已受農(nóng)桿菌(或其它細(xì)菌)感染以便引入編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)或多肽的所需異源基因的植物制備種子。收集、干燥、清潔所述種子并檢驗其存活力和所需基因產(chǎn)物的存在和表達(dá)。這一點被測定后，通常就將種子儲備物儲存在適當(dāng)溫度、濕度、衛(wèi)生和安全條件下以供必要時使用。然后可從所培養(yǎng)的原生質(zhì)體再生完整植物，例如如伊維恩斯(Evans)等人(植物細(xì)胞培養(yǎng)手冊(Handbook of Plant Cell Cultures)，第1卷，麥克米蘭出版公司(MacMillan Publishing Co.)，紐約(New York，NY)，1983；以引用的方式并入本文中)和瓦斯?fàn)?Vasil)(編，植物細(xì)胞培養(yǎng)和體細(xì)胞遺傳學(xué)(Cell Culture andSomatic Cell Genetics of Plants)，學(xué)術(shù)出版社(Acad.Press)，佛羅里達(dá)州奧蘭多(Orlando，F(xiàn)L)，第I卷，1984和第III卷，1986；以引用的方式并入本文中)所述。在某些方面，植物僅再生到發(fā)芽籽苗階段。在一些方面，再生完整植物以產(chǎn)生種子儲備物且從種子儲備物的種子產(chǎn)生發(fā)芽的籽苗。
在某些實施例中，植物不再生成成熟植物。舉例來說，在一些實施例中，植物僅再生到發(fā)芽籽苗階段。在其它實施例中，再生完整植物以產(chǎn)生種子儲備物且從所述種子儲備物的種子產(chǎn)生本發(fā)明中所使用的幼苗(例如發(fā)芽的籽苗)。
可根據(jù)本發(fā)明用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體可分離和培養(yǎng)以產(chǎn)生完整再生植物的所有植物，以回收含有轉(zhuǎn)移基因的完整植物。已知幾乎所有植物都可從培養(yǎng)的細(xì)胞或組織再生，包括(但不限于)產(chǎn)生可食用芽的植物的所有主要物種。一些合適的植物包括紫花苜蓿、綠豆、蘿卜、小麥、芥菜、菠菜、胡蘿卜、甜菜、洋蔥、大蒜、芹菜、大黃、葉狀植物(諸如卷心菜或生菜)、水田芹或水芹、草本植物(諸如歐芹、薄荷或三葉草)、花椰菜、西蘭花、大豆、小扁豆、可食用花(諸如向日葵)等。
從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植物的方式隨植物物種的不同而變化。然而，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解通常首先提供含有異源基因拷貝的轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的懸浮液。形成愈傷組織且可從愈傷組織誘導(dǎo)出芽，隨后生根。其它或另外，可從原生質(zhì)體懸浮液誘導(dǎo)胚芽形成。這些胚芽如同天然胚芽一樣萌發(fā)形成植物。將種子浸泡在水中或用水噴霧種子以使種子的水分含量增加到35-45％之間，從而啟始萌發(fā)。為使萌發(fā)繼續(xù)進(jìn)行，通常在控制溫度和氣流條件下將種子保持在飽含水分的空氣中。培養(yǎng)基通常將含有各種氨基酸和激素，諸如植物生長素和細(xì)胞分裂素。宜向培養(yǎng)基中添加谷氨酸和脯氨酸，尤其對諸如紫花苜蓿等物種來說。芽和根通常同時發(fā)育。有效再生將視培養(yǎng)基、基因型和培養(yǎng)歷史而定。如果這三個變量受到控制，那么再生完全可再現(xiàn)和可重復(fù)。
使從轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞長成的成熟植物自花授粉并鑒別非隔離純合轉(zhuǎn)基因植物。近親繁殖的植物產(chǎn)生含有本發(fā)明抗原編碼序列的種子。可使所述種子萌發(fā)并生長到發(fā)芽籽苗階段以產(chǎn)生本發(fā)明的流感抗原多肽。
在相關(guān)實施例中，轉(zhuǎn)基因種子(例如帶有編碼流感抗原多肽的轉(zhuǎn)移基因，通常整合到基因組中)可形成為種子產(chǎn)品并與關(guān)于如何使幼苗生長到適當(dāng)階段(例如發(fā)芽籽苗階段)以收集和/或投予或收集到醫(yī)藥組合物中的說明書一起出售。在一些相關(guān)實施例中，可從本發(fā)明的近親繁殖植物發(fā)展體現(xiàn)所需性狀的雜交品種或新品種。
直接整合 還可通過微彈轟擊或電穿孔將DNA片段直接整合到植物細(xì)胞的基因組中來將編碼流感抗原多肽的表達(dá)構(gòu)筑體引入到本發(fā)明的植物組織中(參見例如，奇科特(Kikkert)等人，1999，植物組織培養(yǎng)協(xié)會雜志(PlantJ.Tiss.Cult.Assoc.)，3543；和巴特斯(Bates)，1994，分子生物技術(shù)(Mol.Biotech.)，2135；兩者都以引用的方式并入本文中)。更具體來說，可利用多種技術(shù)將表達(dá)本發(fā)明的流感抗原多肽的載體引入植物細(xì)胞中。如上文所述，載體可包括用于植物細(xì)胞中的可選擇標(biāo)記。載體可包括允許在二級宿主中選擇和傳播的序列，諸如含有復(fù)制起點和可選擇標(biāo)記的序列。二級宿主通常包括細(xì)菌和酵母。在一些實施例中，二級宿主是細(xì)菌(例如大腸桿菌(Escherichia coli)，復(fù)制起點為colE1型復(fù)制起點)而可選擇標(biāo)記是編碼氨芐西林抗性的基因。所述序列為所屬領(lǐng)域中所熟知且可購得(例如克隆泰克公司(Clontech)，加利福尼亞州帕洛阿爾托(Palo Alto，CA)；或斯群他根公司(Stratagene)，加利福尼亞州拉霍亞(La Jolla，CA))。
本發(fā)明的載體可修飾為含有與根癌農(nóng)桿菌載體具有同源性的區(qū)域、來自根癌農(nóng)桿菌的T-DNA邊界區(qū)域和上述嵌合基因或表達(dá)盒的中間植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。其它載體可包括根癌農(nóng)桿菌的卸甲(disarmed)植物腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒。
根據(jù)一些實施例，本發(fā)明載體的直接轉(zhuǎn)化可能包括通過使用微量吸液管機(jī)械轉(zhuǎn)移重組DNA來將載體直接微量注入植物細(xì)胞中(參見例如，克羅斯威(Crossway)，1985，分子普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)，202179，以引用的方式并入本文中)?？墒褂镁垡叶紝⑦z傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中(參見例如，克萊恩斯(Krens)等人，1982，自然(Nature)，29672；以引用的方式并入本文中)。另一種將核酸引入植物中的方法是通過小珠?；蛄Ｗ拥幕|(zhì)內(nèi)或表面上具有核酸的小粒子的高速彈道滲透(參見例如，克萊因(Klein)等人，1987，自然(Nature)，32770；和克努德森(Knudsen)等人，植物(Planta)，185330；兩者都以引用的方式并入本文中)。另一種引入方法是使原生質(zhì)體與其它實體(小型細(xì)胞、細(xì)胞、溶酶體或其它可融合脂質(zhì)表面體)融合(參見例如，費雷利(Fraley)等人，1982，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)，791859；以引用的方式并入本文中)?？赏ㄟ^電穿孔將本發(fā)明的載體引入植物細(xì)胞中(參見例如，佛姆(Fromm)等人，1985，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)，825824；以引用的方式并入本文中)。根據(jù)這一技術(shù)，在含有基因構(gòu)筑體的質(zhì)粒存在下電穿孔植物原生質(zhì)體。高磁場強度的電脈沖可逆地滲透生物膜，從而允許引入質(zhì)粒。電穿孔植物原生質(zhì)體重新形成細(xì)胞壁分割且形成植物愈傷組織，愈傷組織可再生以形成本發(fā)明的發(fā)芽籽苗。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解如何利用這些方法轉(zhuǎn)化可用于產(chǎn)生可食用發(fā)芽籽苗的植物細(xì)胞。
病毒轉(zhuǎn)化 類似于常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)，可使用植物病毒載體制備全長蛋白質(zhì)，包括全長抗原。根據(jù)本發(fā)明，可使用植物病毒載體感染種子、胚芽、發(fā)芽籽苗等并在其中產(chǎn)生抗原。在這點上，感染包括將病毒基因組或其部分引入細(xì)胞中的任何方法，包括(但不限于)病毒的天然感染方法、擦傷、接種等。所述術(shù)語包括將基因組RNA轉(zhuǎn)錄物或其cDNA拷貝引入細(xì)胞中。病毒基因組不需要完整基因組，但通常將含有足以允許復(fù)制的序列。基因組可以編碼病毒復(fù)制酶且可以含有復(fù)制所必需的任何順式作用核酸元件。編碼短肽以及大的復(fù)雜蛋白質(zhì)的外源基因的高水平表達(dá)(例如通過煙草花葉病毒載體)已有描述(參見例如，麥克考米克(McCormick)等人，1999，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)，96703；庫瑪蓋(Kumagai)等人，2000，基因(Gene)，245169；和維奇(Verch)等人，1998，免疫方法雜志(J.Immunol Methods)，22069；其全部都以引用的方式并入本文中)。因此，植物病毒載體具有已證明的表達(dá)短肽以及大的復(fù)雜蛋白質(zhì)的能力。
在某些實施例中，利用宿主/病毒系統(tǒng)產(chǎn)生表達(dá)流感抗原多肽的幼苗(例如芽)。由病毒感染產(chǎn)生的幼苗提供已經(jīng)證明安全的轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)來源。舉例來說，芽未受動物病原體污染。不同于例如煙草，來自可食用芽的蛋白質(zhì)至少在理論上可不經(jīng)純化而用于經(jīng)口應(yīng)用，因此成本顯著降低。
另外，病毒/幼苗(例如芽)系統(tǒng)提供簡單得多、價格較低廉的擴(kuò)大規(guī)模和制造的途徑，因為相關(guān)基因(編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)或多肽)是被引入到病毒中，而所述病毒可在數(shù)日內(nèi)生長到商業(yè)規(guī)模。相比之下，轉(zhuǎn)基因植物在足夠的種子或植物材料可供大規(guī)模試驗或商業(yè)化利用之前可能需要長達(dá)5-7年。
根據(jù)本發(fā)明，植物RNA病毒具有某些優(yōu)點，這使其作為外來蛋白質(zhì)表達(dá)的載體而引人注意。多種植物RNA病毒的分子生物學(xué)和病理學(xué)已經(jīng)充分表征，且存在相當(dāng)多的關(guān)于病毒生物學(xué)、遺傳學(xué)和調(diào)控序列的知識。大多數(shù)植物RNA病毒具有小基因組且感染性cDNA克隆可用于促進(jìn)遺傳操縱。感染性病毒物質(zhì)進(jìn)入易感宿主細(xì)胞后，其復(fù)制到高含量且快速傳遍整個發(fā)芽籽苗(接種后1到10天，例如接種后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或10天以上)。病毒粒子可容易且經(jīng)濟(jì)地從受感染的發(fā)芽籽苗組織回收。病毒具有廣泛宿主范圍，從而使得能夠使用單一構(gòu)筑體來感染數(shù)種易感物種。這些特征可容易地轉(zhuǎn)移到芽上。
通?？赏ㄟ^用所需序列置換一個病毒基因、通過將外來序列插入病毒基因組中的適當(dāng)位置或通過使外來肽與病毒的結(jié)構(gòu)蛋白融合，從植物RNA病毒表達(dá)外來序列。此外，可組合任何這些方法以通過反向互補病毒的重要功能來表達(dá)外來序列。存在許多不同策略作為使用煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus，TMV)、紫花苜蓿花葉病毒(alfalfamosaic virus，AlMV)和其嵌合體在病毒感染的植物中表達(dá)外來序列的手段。
AlMV的基因組是雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)的代表性病毒且由三個基因組RNA(RNA1-3)和亞基因組RNA(RNA4)組成?；蚪MRNA1和2分別編碼病毒復(fù)制酶蛋白P1和P2?；蚪MRNA3編碼細(xì)胞間移動蛋白P3和外殼蛋白(coat protein，CP)。CP是從由基因組RNA3合成的亞基因組RNA4翻譯，且為起始感染所需。研究已證明CP與多種功能有關(guān)，包括基因組活化、復(fù)制、RNA穩(wěn)定性、癥狀形成和RNA衣殼化(encapsidation)(參見例如波爾(Bol)等人，1971，病毒學(xué)(Virology)，4673；范德沃森(Van Der Vossen)等人，1994，病毒學(xué)(Virology)，202891；俞斯波維(Yusibov)等人，病毒學(xué)(Virology)，208405；俞斯波維(Yusibov)等人，1998，病毒學(xué)(Virology)，2421；波爾(Bol)等人，(綜述，100篇參考文獻(xiàn)(Review，100refs.))，1999，普通病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol)，801089；德格拉夫(De Graaff)，1995，病毒學(xué)(Virology)，208583；賈斯帕斯(Jaspars)等人，1974，病毒研究進(jìn)展(Adv.Virus Res.)，1937；洛謝費里斯(Loesch-Fries)，1985，病毒學(xué)(Virology)，146177；尼爾曼(Neeleman)等人，1991，病毒學(xué)(Virology)，181687；尼爾曼(Neeleman)等人，1993，病毒學(xué)(Virology)，196883；范德庫衣(Van Der Kuyl)等人，1991，病毒學(xué)(Virology)，183731；和范德庫衣(Van DerKuyl)等人，1991，病毒學(xué)(Virology)，185496；其全部都以引用的方式并入本文中)。
使病毒從種子、胚芽或發(fā)芽籽苗的接種部分長距離移動到未接種部分和系統(tǒng)性感染通常需要病毒粒子衣殼化。根據(jù)本發(fā)明，接種可在植物發(fā)育的任何階段進(jìn)行。在胚芽和芽中，接種病毒的傳播將非?？?。AlMV病毒粒子由獨特的CP(24kD)衣殼化，形成1種以上類型的粒子。粒子的尺寸(長度為30到60nm且直徑為18nm)和形狀(球形、橢球形或桿狀)視衣殼化RNA的尺寸而定。組裝后，認(rèn)為AlMV CP的N端位于病毒粒子的表面上且似乎不干擾病毒組裝(波爾(Bol)等人，1971，病毒學(xué)(Virology)，673；以引用的方式并入本文中)。另外，在N端具有另一38個氨基酸的肽的ALMV CP在活體外形成粒子且保留生物活性(俞斯波維(Yusibov)等人，1995，普通病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol)，77567；以引用的方式并入本文中)。
AlMV具有廣泛宿主范圍，包括大量農(nóng)業(yè)上有價值的作物植物，包括植物種子、胚芽和芽。這些特征一起使ALMV CP成為載體分子的極佳候選物，并使AlMV成為在發(fā)育的芽階段在植物中表達(dá)外來序列的有吸引力的候選載體。此外，從諸如TMV等異源載體表達(dá)后，AlMV CP在不干擾病毒感染性的情況下衣殼化TMV基因組(俞斯波維(Yusibov)等人，1997，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)，945784；以引用的方式并入本文中)。這允許使用TMV作為與外來序列融合的AlMV CP的載體病毒。
煙草花葉病毒的原型TMV具有由經(jīng)17.0kD CP衣殼化的單一正義RNA組成的基因組，其產(chǎn)生桿狀粒子(長度為300nm)。CP是TMV的唯一結(jié)構(gòu)蛋白且為病毒在受感染宿主中衣殼化和長距離移動所需(塞托(Saito)等人，1990，病毒學(xué)(Virology)，176329；以引用的方式并入本文中)。從基因組RNA翻譯出183kD和126kD蛋白質(zhì)且所述蛋白質(zhì)為病毒復(fù)制所需(石川(Ishikawa)等人，1986，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，148291；以引用的方式并入本文中)。30kD蛋白質(zhì)是病毒的細(xì)胞間移動蛋白(美什(Meshi)等人，1987，歐洲分子生物學(xué)組織雜志(EMBO J.)，62557)。從亞基因組mRNA翻譯出移動蛋白和外殼蛋白(亨特(Hunter)等人，1976，自然(Nature)，260759；布魯寧(Bruening)等人，1976，病毒學(xué)(Virology)，71498；和比奇(Beachy)等人，1976，病毒學(xué)(Virology)，73498；其全部都以引用的方式并入本文中)。
可用于將編碼流感多肽的基因引入植物細(xì)胞中的其它方法包括轉(zhuǎn)化植物的花。擬南芥(Arabidopsis thaliana)的轉(zhuǎn)化可通過將植物花浸泡在根癌農(nóng)桿菌的溶液中來實現(xiàn)(庫提斯(Curtis)等人，2001，轉(zhuǎn)基因研究(Transgenic Res.)，10363；和青(Qing)等人，2000，分子育種植物改良中的新策略(Molecular BreedingNew Strategies in PlantImprovement)，167；兩者都以引用的方式并入本文中)。在“浸泡”植物所產(chǎn)生的種子群體中形成轉(zhuǎn)化植物。在花發(fā)育期間的特定時點，子房壁中存在小孔，根癌農(nóng)桿菌能穿過小孔進(jìn)入子房內(nèi)部。進(jìn)入子房內(nèi)部后，根癌農(nóng)桿菌使個別胚珠增殖并轉(zhuǎn)化(德斯菲克斯(Desfeux)等人，2000，植物生理學(xué)(Plant Physiology)，123895；以引用的方式并入本文中)。轉(zhuǎn)化胚珠遵循子房內(nèi)種子形成的典型路徑。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的短暫表達(dá) 如本文所說明，在本發(fā)明的許多實施例中，需要在植物中快速(例如短暫)表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽的系統(tǒng)。本發(fā)明提供一種達(dá)成所述在植物(尤其在幼苗，例如發(fā)芽的籽苗)中快速表達(dá)的有效系統(tǒng)，其利用農(nóng)桿菌構(gòu)筑體來傳遞編碼流感多肽的病毒表達(dá)系統(tǒng)。
具體來說，根據(jù)本發(fā)明，制備“投放載體”，其含有包括復(fù)制序列的農(nóng)桿菌序列且還含有帶有編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)或多肽的基因的植物病毒序列(包括自我復(fù)制序列)。優(yōu)選通過允許實質(zhì)上系統(tǒng)性傳遞的農(nóng)桿菌滲透法，將投放載體引入植物組織中。對于短暫轉(zhuǎn)化來說，投放載體的未整合T-DNA拷貝暫時保持存在于核中并且轉(zhuǎn)錄，引起載運基因的表達(dá)(卡普拉(Kapila)等人，1997，植物科學(xué)(Plant Sci.)，122101-108；以引用的方式并入本文中)。與病毒載體不同，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的短暫表達(dá)無法使所關(guān)注基因的表達(dá)系統(tǒng)性傳播。這一系統(tǒng)的一個優(yōu)勢在于可克隆長于2kb的基因以產(chǎn)生無法利用病毒載體獲得的構(gòu)筑體(韋因尼特(Voinnet)等人，2003，植物雜志(Plant J.)，33949-56；以引用的方式并入本文中)。此外，使用所述技術(shù)，可用一種以上轉(zhuǎn)基因來轉(zhuǎn)化植物，以使得能夠表達(dá)并組裝多聚蛋白質(zhì)(例如復(fù)合蛋白質(zhì)的抗體亞單位)。此外，可通過分別滲透或使用混合培養(yǎng)基來利用通過與不同農(nóng)桿菌共滲透而進(jìn)行多種轉(zhuǎn)基因共表達(dá)的可能性。
在某些實施例中，投放載體包括允許在農(nóng)桿菌中進(jìn)行選擇(或至少檢測)以及在滲透組織中進(jìn)行選擇/檢測的序列。此外，投放載體通常包括在植物中轉(zhuǎn)錄引起病毒RNA產(chǎn)生，隨后產(chǎn)生病毒蛋白質(zhì)的序列。此外，病毒蛋白質(zhì)和病毒RNA的產(chǎn)生引起快速產(chǎn)生多個拷貝的編碼所關(guān)注醫(yī)藥活性蛋白質(zhì)的RNA。所述產(chǎn)生使得在相對短的時間內(nèi)快速產(chǎn)生所關(guān)注的目標(biāo)蛋白質(zhì)。因此可產(chǎn)生用于制備蛋白質(zhì)的高效系統(tǒng)。
利用病毒表達(dá)載體的農(nóng)桿菌滲透技術(shù)可用于制備有限量的所關(guān)注蛋白質(zhì)，以便在確定其是否值得產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物之前檢驗表達(dá)水平。其它或另外，利用病毒表達(dá)載體的農(nóng)桿菌滲透技術(shù)適用于快速產(chǎn)生能夠作為主要生產(chǎn)平臺而產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)的植物。因此，這種短暫表達(dá)系統(tǒng)可以工業(yè)規(guī)模使用。
進(jìn)一步提供可在本發(fā)明的這些和其它方面使用的多種不同農(nóng)桿菌質(zhì)粒、二元質(zhì)?；蚱溲苌镏械娜我环N，諸如pBIV、pBI1221、pGreen等。大量合適載體為所屬領(lǐng)域中所已知且可根據(jù)所屬領(lǐng)域中已知的方法或本文所述的方法加以引導(dǎo)和/或修飾，以便能夠用于本文所提供的所述方法中。
例示性投放載體pBID4含有花椰菜花葉病毒(DNA植物病毒)的35S啟動子，其驅(qū)動重組病毒基因組在引入植物中后的初始轉(zhuǎn)錄；和nos終止子，即農(nóng)桿菌胭脂堿(nopaline)合成酶的轉(zhuǎn)錄終止子。所述載體進(jìn)一步含有包括用于病毒復(fù)制(126/183K)和細(xì)胞間移動(MP)的基因的煙草花葉病毒基因組序列。載體進(jìn)一步含有插入煙草花葉病毒基因組序列內(nèi)的獨特克隆位點處且轉(zhuǎn)錄受外殼蛋白亞基因組mRNA啟動子控制的編碼所關(guān)注多肽的基因。由于這一“目標(biāo)基因”(即編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)或多肽的基因)置換TMV外殼蛋白的編碼序列，故所得病毒載體為相比于含CP載體不易經(jīng)歷重組且無法在環(huán)境中有效傳播和存活的自我復(fù)制裸RNA。左和右邊界序列(LB和RB)劃定在利用帶有載體的重組農(nóng)桿菌滲透植物后轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中的投放載體區(qū)域的界限。在將帶有這一載體的農(nóng)桿菌引入植物組織中(通常通過農(nóng)桿菌滲透法進(jìn)行，但或者可通過注射或其它方式進(jìn)行)后，產(chǎn)生多個LB與RB之間的序列的單鏈DNA(ssDNA)拷貝并于數(shù)分鐘內(nèi)釋放。隨后通過病毒復(fù)制來擴(kuò)增這些所引入的序列。目標(biāo)基因的翻譯導(dǎo)致在短時間內(nèi)積累大量目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽。
在一些實施例中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的短暫表達(dá)每千克植物組織產(chǎn)生多達(dá)約5g或更多目標(biāo)蛋白質(zhì)。舉例來說，在一些實施例中，每千克植物組織產(chǎn)生多達(dá)約4g、約3g、約2g、約1g或約0.5g目標(biāo)蛋白質(zhì)。在一些實施例中，每千克植物組織產(chǎn)生至少約20mg到約500mg或約50mg到約500mg目標(biāo)蛋白質(zhì)，或約50mg到約200mg、或約50mg、約60mg、約70mg、約80mg、約90mg、約100mg、約110mg、約120mg、約130mg、約140mg、約150mg、約160mg、約170mg、約180mg、約190mg、約200mg、約250mg、約300mg、約350mg、約400mg、約450mg、約500mg、約550mg、約600mg、約650mg、約700mg、約750mg、約800mg、約850mg、約900mg、約950mg、約1000mg、約1500mg、約1750mg、約2000mg、約2500mg、約3000mg或更多目標(biāo)蛋白質(zhì)。
在一些實施例中，這些表達(dá)水平在從滲透起約6周、約5周、約4周、約3周或約2周內(nèi)達(dá)到。在一些實施例中，這些表達(dá)水平在從引入表達(dá)構(gòu)筑體起約10天、約9天、約8天、約7天、約6天、約5天、約4天、約3天、約2天或甚至約1天內(nèi)達(dá)到。因此，從引入(例如滲透)到收集的時間通常小于約2周、約10天、約1周或更短時間。這允許在從選擇氨基酸序列起約8周或更短時間內(nèi)(甚至包括“預(yù)備”表達(dá)研究的時間)制備蛋白質(zhì)。每一批蛋白質(zhì)通常也可在約8周、約6周、約5周或更短時間內(nèi)產(chǎn)生。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，這些數(shù)值可視所使用的植物類型而略有變化。大部分芽(包括豌豆)將在指定數(shù)值的范圍內(nèi)。然而，本塞姆氏煙草(Nicotiana benthamiana)因生長較慢(來自小得多的種子)，而可能生長較長時間(尤其在滲透之前)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)所利用的特定植物的生物學(xué)將清楚其它預(yù)期的調(diào)節(jié)。
本發(fā)明者已使用投放載體系統(tǒng)在多種不同幼苗中制備多種目標(biāo)蛋白質(zhì)和多肽。在一些實施例中，包括例如大粒豌豆、比爾跳豆、黃夾豆、斑點豌豆和青豆的某些豌豆品種尤其適用于實施本發(fā)明的這一方面。
本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)，各種煙草屬植物尤其適用于實施本發(fā)明的這一方面，尤其包括本塞姆氏煙草。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，煙草屬植物通常不被視為“芽”。盡管如此，本發(fā)明仍教示，煙草屬幼苗(尤其本塞姆氏煙草幼苗)適用于實施本發(fā)明。一般來說，在一些實施例中，本塞姆氏煙草植物在滲透(例如傳遞含有投放載體的農(nóng)桿菌)之前生長一段足以允許適量生物質(zhì)發(fā)育的時間。通常，所述植物在滲透之前生長大于約3周、更通常大于約4周或約5到約6周的時間以積累生物質(zhì)。
本發(fā)明者還意外地發(fā)現(xiàn)，盡管證實TMV與AlMV序列可在所述投放載體構(gòu)筑體內(nèi)有效，但在一些實施例中，AlMV序列對于確保高水平制備所傳遞的蛋白質(zhì)或多肽特別有效。
因此，在本發(fā)明的某些特定實施例中，在豌豆幼苗或煙草屬幼苗(例如本塞姆氏煙草)中由指導(dǎo)帶有所關(guān)注基因的AlMV序列產(chǎn)生的投放載體制備所關(guān)注的蛋白質(zhì)或多肽。
表達(dá)構(gòu)筑體 適用于本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)筑體的許多特征將特別針對如上文所討論的所用的特定表達(dá)系統(tǒng)。然而，可能適用于不同表達(dá)系統(tǒng)的某些方面將在此更詳細(xì)地討論。
舉一例來說，在本發(fā)明的許多實施例中，將需要所關(guān)注的蛋白質(zhì)或多肽(或核酸)的表達(dá)是可誘導(dǎo)的。在許多所述實施例中，編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)或多肽的RNA的產(chǎn)生(和/或反義RNA的產(chǎn)生)是在誘導(dǎo)型(例如外源誘導(dǎo)型)啟動子的控制下。外源誘導(dǎo)型啟動子可響應(yīng)外部而非內(nèi)部刺激來增加或減少轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。許多環(huán)境因素可充當(dāng)所述外部刺激。在某些實施例中，轉(zhuǎn)錄受熱誘導(dǎo)型啟動子(諸如熱休克啟動子)控制。
外部誘導(dǎo)型啟動子可尤其適用于受控的可調(diào)節(jié)生長環(huán)境的情形。舉例來說，使用熱休克啟動子，可簡單地使封閉環(huán)境的溫度上升來誘導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。當(dāng)然，應(yīng)了解，由于室外溫度無法控制，故在室外從不使用熱誘導(dǎo)型啟動子。室外溫度上升到超過某一水平的任何時間，啟動子都將開啟。類似地，每當(dāng)室外溫度下降時，啟動子都將關(guān)閉。所述溫度轉(zhuǎn)變可在一天內(nèi)發(fā)生，例如白天開啟表達(dá)而晚上關(guān)閉表達(dá)。熱誘導(dǎo)型啟動子(諸如本文所述的那些啟動子)甚至將不適合用于易受幾乎與室外相同程度的氣候轉(zhuǎn)變影響的溫室中。遺傳工程改造植物在溫室中的培養(yǎng)成本相當(dāng)高。相比之下，在本發(fā)明系統(tǒng)中，每個變量都可控制，從而每次收集都可實現(xiàn)最大量的表達(dá)。
用于本發(fā)明的其它外部誘導(dǎo)型啟動子包括光誘導(dǎo)型啟動子。如果封閉的可調(diào)節(jié)環(huán)境中的光總是開啟的，那么可保持光誘導(dǎo)型啟動子作為組成型啟動子?；蛘撸稍诎l(fā)育期間的特定時間通過簡單地開啟光來啟動相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。
在其它實施例中，使用化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子來誘導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。根據(jù)這些實施例，可簡單地將化學(xué)物質(zhì)噴灑或噴霧在種子、胚芽或幼苗(例如籽苗)上以誘導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)?？梢曅枰_控制噴霧和噴灑且引導(dǎo)到特定種子、胚芽或幼苗(例如籽苗)上。封閉環(huán)境缺少會使化學(xué)物質(zhì)分散偏離預(yù)定接受者的風(fēng)流或氣流，因此化學(xué)物質(zhì)停留在預(yù)定接受者上。
抗原的制備和分離 一般來說，可使用所屬領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)或生長本發(fā)明的植物、植物細(xì)胞和/或植物組織(例如克隆植物、克隆植物細(xì)胞、克隆根、克隆根系、芽、發(fā)芽的籽苗、植物等)以制備抗原。已采用多種培養(yǎng)基和生物反應(yīng)器來培養(yǎng)發(fā)根細(xì)胞、根細(xì)胞系和植物細(xì)胞(參見例如，格里(Giri)等人，2000，生物技術(shù)進(jìn)展(Biotechnol.Adv.)，181；雷奧(Rao)等人，2002，生物技術(shù)進(jìn)展(Biotechnol Adv.)，20101；和前述兩者中的參考文獻(xiàn)，其全部都以引用的方式并入本文中)。可以任何合適的方式培養(yǎng)克隆植物。
在某一實施例中，本發(fā)明的流感抗原多肽可通過任何已知方法制備。在一些實施例中，在植物或其部分中表達(dá)流感抗原多肽。根據(jù)所屬領(lǐng)域中已知的常規(guī)條件和技術(shù)來分離和純化蛋白質(zhì)。這些技術(shù)包括諸如提取、沉淀、色譜、親和色譜、電泳等方法。本發(fā)明涉及使用所屬領(lǐng)域中已知和本文所提供的多種植物表達(dá)系統(tǒng)(包括本文所述的病毒植物表達(dá)系統(tǒng))中的任一種來純化流感抗原多肽并以能承擔(dān)的規(guī)模制備流感抗原多肽。
在本發(fā)明的許多實施例中，將需要分離流感抗原多肽以用于疫苗產(chǎn)品。當(dāng)本發(fā)明的蛋白質(zhì)從表達(dá)其的植物組織或其部分(例如根、根細(xì)胞、植物、植物細(xì)胞)制備時，對于從植物材料部分或完全分離中的任一情況來說，可使用本文進(jìn)一步詳述的方法或所屬領(lǐng)域中已知的任何適用方法。當(dāng)需要將表達(dá)產(chǎn)物從表達(dá)所述表達(dá)產(chǎn)物的一些或所有植物細(xì)胞或組織中分離時，可采用任何可用的純化技術(shù)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉多種分級分離和分離程序(參見例如，斯考普斯(Scopes)等人，蛋白質(zhì)純化原理與實踐(ProteinPurificationPrinciples and Practice)，第3版，杰遜(Janson)等人，1993；蛋白質(zhì)純化原理、高分辨率方法和應(yīng)用(Protein PurificationPrinciples，High Resolution Methods，andApplications)，威利-VCH(Wiley-VCH)，1998；施普林格(Springer-Verlag)，紐約(NY)，1993；和羅意(Roe)，蛋白質(zhì)純化技術(shù)(Protein Purification Techniques)，牛津大學(xué)出版社(Oxford University Press)，2001；其各自以引用的方式并入本文中)。通常將需要使產(chǎn)物的純度高于約50％、約60％、約70％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％。關(guān)于適用于從植物組織或流體純化物質(zhì)的某些方法的討論，參見例如美國專利6,740,740和6,841,659(兩者都以引用的方式并入本文中)。
所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，獲得所需流感抗原多肽產(chǎn)物的方法是提取?？商崛≈参锊牧?例如根、葉等)以從殘余生物質(zhì)中移出所需產(chǎn)物，從而增加產(chǎn)物的濃度和純度?？稍诰彌_溶液中提取植物。舉例來說，可將植物材料轉(zhuǎn)移到一定量的已用例如磷酸鹽緩沖液緩沖的冰冷水(彼此重量比為1∶1)中。需要時可添加蛋白酶抑制劑?？赏ㄟ^用力摻合或研磨使植物材料碎裂，同時懸浮于緩沖溶液中，且通過過濾或離心移出所提取的生物質(zhì)?？赏ㄟ^其它步驟來進(jìn)一步純化溶液中所帶有的產(chǎn)物或通過冷凍干燥或沉淀轉(zhuǎn)化為干粉。提取可通過擠壓來進(jìn)行。植物或根可通過在壓榨機(jī)中擠壓或通過將其穿過間距緊密的滾筒時粉碎來提取。根據(jù)所屬領(lǐng)域中熟知的方法收集和加工從粉碎植物或根中擠出的流體。通過擠壓來提取使得產(chǎn)物以更濃的形式釋放。然而，產(chǎn)物的總體產(chǎn)率可能比在溶液中提取產(chǎn)物時低。
在一些實施例中，所制備的蛋白質(zhì)或多肽不從植物組織分離，而是在活植物(例如發(fā)芽的籽苗)的情形下提供。在一些實施例中，當(dāng)植物可食用時，直接提供含有所表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽的植物組織供食用。因此，本發(fā)明提供含有所表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽的可食用幼苗生物質(zhì)(例如可食用發(fā)芽籽苗)。
當(dāng)可食用植物(例如發(fā)芽的籽苗)表達(dá)足量的醫(yī)藥蛋白質(zhì)或多肽且活體食用時，在一些實施例中，在食用發(fā)芽的籽苗前絕對不進(jìn)行收集。以此方式，確保在向需要治療的患者投予醫(yī)藥蛋白質(zhì)之前醫(yī)藥蛋白質(zhì)不存在收集誘導(dǎo)的蛋白水解分解。舉例來說，可直接向患者傳遞準(zhǔn)備食用的幼苗(例如發(fā)芽的籽苗)?；蛘撸蛐枰委煹幕颊邆鬟f遺傳工程改造的種子或胚芽并由患者培養(yǎng)到發(fā)芽籽苗階段。在一些實施例中，向患者或治療患者的醫(yī)生提供一批遺傳工程改造的發(fā)芽籽苗，以便可培養(yǎng)表達(dá)某些所需醫(yī)藥蛋白質(zhì)的發(fā)芽籽苗的連續(xù)儲備物。這對無法承擔(dān)或交付昂貴藥物的發(fā)展中國家的人群來說可能特別有價值。培養(yǎng)本發(fā)明的發(fā)芽籽苗的容易性使得本發(fā)明的發(fā)芽籽苗尤其合乎所述發(fā)展中國家人群的需要。
在一些實施例中，植物生物質(zhì)在食用或調(diào)配前通過例如均質(zhì)化、粉碎、干燥或提取進(jìn)行加工。在一些實施例中，從生物質(zhì)分離或純化所表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽并調(diào)配成醫(yī)藥組合物。
舉例來說，可研磨、粉碎或摻合活植物(例如芽)以產(chǎn)生生物質(zhì)于含有蛋白酶抑制劑的緩沖液中的漿液。所述緩沖液優(yōu)選處于約4℃。在某些實施例中，將生物質(zhì)風(fēng)干、噴霧干燥、冷凍或冷凍干燥。如同在成熟植物中一般，這些方法中的一些方法(諸如風(fēng)干)可能導(dǎo)致醫(yī)藥蛋白質(zhì)或多肽的活性損失。然而，因為植物(例如發(fā)芽的籽苗)可能極小且通常具有大的表面積與體積的比率，所以這很可能不會發(fā)生。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，可利用許多使醫(yī)藥蛋白質(zhì)或多肽的蛋白水解最小的收集生物質(zhì)的技術(shù)，且可將這些技術(shù)應(yīng)用于本發(fā)明。
疫苗 本發(fā)明提供包含至少一種流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分的疫苗組合物，希望其在投予個體后引發(fā)生理作用。疫苗蛋白可具有對抗病癥或疾病的恢復(fù)治愈或緩和性質(zhì)且可投予用于改善緩解、減輕疾病或病癥、延遲疾病或病癥的發(fā)作、逆轉(zhuǎn)或降低疾病或病癥的癥狀或嚴(yán)重程度。包含流感抗原多肽的疫苗可具有預(yù)防性質(zhì)且可用于預(yù)防或延遲疾病發(fā)作，或降低所述疾病、病癥或病理學(xué)病狀出現(xiàn)時的嚴(yán)重程度。用本發(fā)明的抗原治療個體所引發(fā)的生理作用可包括有效免疫反應(yīng)，以致生物體感染受阻。在標(biāo)題為“投藥”的部分中更詳細(xì)地討論關(guān)于向有需要的個體投予流感抗原多肽的考慮因素。
一般來說，有效疫苗接種包括使個體的免疫系統(tǒng)暴露于一種或多種視為不需要、非所需和/或外來的且引發(fā)內(nèi)源性免疫反應(yīng)的藥劑。通常，所述免疫反應(yīng)導(dǎo)致抗原特異性天然淋巴細(xì)胞活化，接著產(chǎn)生分泌抗體的B細(xì)胞或抗原特異性效應(yīng)細(xì)胞和記憶T細(xì)胞或兩者。這一方法會產(chǎn)生長久的保護(hù)性免疫性，所述免疫性可不時地通過重復(fù)暴露于相同抗原性物質(zhì)而加強。
在一些實施例中，包含至少一種流感抗原多肽的疫苗組合物為亞單位疫苗。一般來說，亞單位疫苗包含純化抗原而非完整生物體。亞單位疫苗不具有感染性，因此其可安全地提供給免疫抑制的人員，且其很少會誘導(dǎo)不利免疫反應(yīng)和/或其它不良副作用。亞單位疫苗的一個潛在缺點是，抗原可能不會保留其天然構(gòu)形，以致針對亞單位所產(chǎn)生的抗體可能不會識別病原體表面上的相同蛋白質(zhì)；且經(jīng)分離的蛋白質(zhì)不會刺激免疫系統(tǒng)以及完整生物體疫苗。因此，在一些情形下，可能需要以高于全藥劑疫苗(例如活減毒疫苗、滅活病原體疫苗等)的劑量投予亞單位疫苗以便達(dá)到相同治療作用。相比之下，全藥劑疫苗(諸如利用活減毒病原體或滅活病原體的疫苗)通常產(chǎn)生劇烈免疫反應(yīng)，但其使用具有限制。舉例來說，活疫苗病毒株有時會引起感染性病理學(xué)，尤其當(dāng)投予免疫功能不全的接受者時。此外，許多病原體，尤其病毒(諸如流感)在其基因組中經(jīng)歷連續(xù)快速突變，這使其逃脫對抗原性不同的疫苗病毒株的免疫反應(yīng)。
在一些實施例中，本發(fā)明的亞單位疫苗包含植物產(chǎn)流感抗原多肽(例如如本文所述的HA和/或NA多肽)可以極低劑量投予且刺激免疫反應(yīng)。在一些實施例中，可使用小于約100μg、小于約90μg、小于約80μg、小于約70μg、小于約60μg、小于約50μg、小于約40μg、小于約35μg、小于約30μg、小于約25μg、小于約20μg、小于約15μg、小于約5μg、小于約4μg、小于約3μg、小于約2μg或小于約1μg的植物產(chǎn)流感抗原多肽和/或其免疫原性部分刺激免疫反應(yīng)和/或預(yù)防流感感染、延遲流感感染的發(fā)作和/或提供針對流感感染的防御。
在一些實施例中，本發(fā)明提供針對流感的亞單位疫苗。在一些實施例中，亞單位疫苗包含至少部分從非抗原性組分純化的抗原。舉例來說，亞單位疫苗可為流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分，其是在活生物體(諸如植物、病毒、細(xì)菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞、蛋等)中表達(dá)，但至少部分從活生物體的非抗原組分純化。在一些實施例中，亞單位疫苗至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％從表達(dá)抗原的生物體的非抗原組分純化。在一些實施例中，亞單位疫苗可為化學(xué)合成的流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分。
在一些實施例中，亞單位疫苗可為流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分，其是在活生物體(諸如植物、病毒、細(xì)菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞、蛋等)中表達(dá)，但并不至少部分從活生物體的非抗原組分純化。舉例來說，亞單位疫苗可為流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分，其是在直接投予個體以引發(fā)免疫反應(yīng)的活生物體中表達(dá)。在一些實施例中，亞單位疫苗可為在如本文所述的植物中表達(dá)的流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分，其中將植物材料直接投予個體以引發(fā)免疫反應(yīng)。
本發(fā)明提供醫(yī)藥流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分，其作為治療性和/或預(yù)防性治療流感感染的亞單位疫苗具有活性。在某些實施例中，流感抗原多肽可由本發(fā)明的植物或其部分(例如根、細(xì)胞、芽、細(xì)胞系、植物等)產(chǎn)生。在某些實施例中，所提供的流感抗原多肽是在植物、植物細(xì)胞和/或植物組織(例如芽、發(fā)芽的籽苗、根、根培養(yǎng)物、克隆細(xì)胞、克隆細(xì)胞系、克隆植物等)中表達(dá)，且可從植物直接使用或部分純化或純化為用于醫(yī)藥學(xué)上投予個體的制劑。
本發(fā)明提供表達(dá)流感抗原多肽的植物、植物細(xì)胞和植物組織，其在投予有需要的個體時保持醫(yī)藥活性。例示性個體包括脊椎動物(例如哺乳動物，諸如人類)。根據(jù)本發(fā)明，個體包括獸醫(yī)學(xué)個體，諸如牛、羊、犬、貓等。在某些方面，將治療有效量的可食用植物或其部分(例如芽、根)經(jīng)口投予個體。在一些方面，以如本文所述的醫(yī)藥制劑提供一種或多種流感抗原多肽。
當(dāng)需要調(diào)配包含植物材料的流感疫苗時，通常將需要利用對相關(guān)接受者(例如人類或其它動物)無毒的植物。在適當(dāng)考慮保持表達(dá)產(chǎn)物的活性的情況下，可根據(jù)所屬領(lǐng)域中已知的技術(shù)簡單地收集和加工相關(guān)植物組織(例如細(xì)胞、根、葉)。在某些實施例中，需要在可食用植物中(且具體來說是在植物的可食用部分中)具有所表達(dá)的流感抗原多肽以便可隨后食用所述材料。舉例來說，如果經(jīng)口傳遞后(適當(dāng)調(diào)配時)疫苗抗原具有活性，那么可能需要在可食用植物部分中產(chǎn)生抗原蛋白且調(diào)配所表達(dá)的流感抗原多肽以便與一些或所有表達(dá)蛋白質(zhì)的植物材料一起經(jīng)口傳遞。
本發(fā)明的疫苗組合物包含一種或多種流感抗原多肽。在某些實施例中，所投予的疫苗組合物中包括正好一種流感抗原多肽。在某些實施例中，所投予的疫苗組合物中包括至少兩種流感抗原多肽。在一些方面，組合疫苗可包括一種包含流感抗原多肽的熱穩(wěn)定性融合蛋白；在一些方面，提供兩種或兩種以上包含流感抗原多肽的熱穩(wěn)定性融合蛋白。
在一些實施例中，疫苗組合物包含正好一種HA多肽。在一些實施例中，疫苗組合物包含正好一種NA多肽。在一些實施例中，疫苗組合物包含正好兩種HA多肽。在一些實施例中，疫苗組合物包含正好兩種NA多肽。在一些實施例中，疫苗組合物包含正好三種HA多肽。在一些實施例中，疫苗組合物包含正好三種NA多肽。在一些實施例中，疫苗組合物包含四種或四種以上(例如4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種或更多種)HA多肽。在一些實施例中，疫苗組合物包含四種或四種以上(例如4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種或更多種)NA多肽。
在一些實施例中，疫苗組合物包含正好一種HA多肽和正好一種NA多肽。在一些實施例中，疫苗組合物包含正好兩種HA多肽和正好兩種NA多肽。在一些實施例中，疫苗組合物包含正好三種HA多肽和正好三種NA多肽。在一些實施例中，疫苗組合物包含四種或四種以上(例如4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種或更多種)HA多肽和四種或四種以上(例如4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種或更多種)NA多肽。在一些實施例中，疫苗組合物包含正好一種HA多肽和兩種或兩種以上(例如2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種或更多種)NA多肽。在一些實施例中，疫苗組合物包含兩種或兩種以上(例如2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種或更多種)HA多肽和正好一種NA多肽。
在一些實施例中，疫苗組合物包含兩種或兩種以上流感抗原多肽和/或其免疫原性部分的多胞形(即兩個或兩個以上氨基酸序列的串聯(lián)融合物)。舉例來說，在一些實施例中，多胞形包含正好一種HA多肽。在一些實施例中，多胞形包含包含正好一種NA多肽。在一些實施例中，多胞形包含正好兩種HA多肽。在一些實施例中，多胞形包含正好兩種NA多肽。在一些實施例中，多胞形包含正好三種HA多肽。在一些實施例中，多胞形包含正好三種NA多肽。在一些實施例中，多胞形包含四種或四種以上(例如4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種或更多種)HA多肽。在一些實施例中，多胞形包含四種或四種以上(例如4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種或更多種)NA多肽。
在一些實施例中，多胞形包含正好一種HA多肽和正好一種NA多肽。在一些實施例中，多胞形包含正好兩種HA多肽和正好兩種NA多肽。在一些實施例中，多胞形包含正好三種HA多肽和正好三種NA多肽。在一些實施例中，多胞形包含四種或四種以上(例如4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種或更多種)HA多肽和四種或四種以上(例如4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種或更多種)NA多肽。在一些實施例中，多胞形包含正好一種HA多肽和兩種或兩種以上(例如2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種或更多種)NA多肽。在一些實施例中，多胞形包含兩種或兩種以上(例如2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種或更多種)HA多肽和正好一種NA多肽。
當(dāng)利用組合疫苗時，應(yīng)了解流感抗原多肽的任何組合都可用于所述組合。組合物可包括多種流感抗原多肽，包括本文所提供的多種抗原。此外，組合物可包括本文所提供的一種或多種抗原以及一種或多種其它抗原。流感抗原多肽的組合包括從一種或多種各種亞型或病毒株獲得的流感抗原多肽以使免疫作用賦予針對一種以上感染類型的免疫反應(yīng)。流感抗原多肽的組合可包括至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種或更多種從不同亞型或病毒株獲得的抗原。在一些組合中，將至少兩種或至少三種來自不同亞型的抗原組合于一種疫苗組合物中。此外，組合疫苗可利用流感抗原多肽和來自一種或多種獨特感染劑的抗原。
其它疫苗組分 本發(fā)明的疫苗組合物可另外包括任何合適的佐劑以在投予個體時增強疫苗的免疫原性。舉例來說，所述佐劑可包括(但不限于)皂角苷，諸如皂樹(Quillaja saponaria，QS)提取物，包括食品級QS的純化子部分，諸如Quil A和QS21；明礬；金屬鹽粒子(氫氧化鋁、磷酸鋁等)；礦物油；MF59；Malp2；不完全弗氏佐劑(incomplete Freund′sadjuvant)；完全弗氏佐劑(complete Freund′s adjuvant)；3去-O-?；瘑瘟柞；|(zhì)A(3D-MPL)；脂質(zhì)A；百日咳桿菌(Bortadella pertussis)；結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)；默克佐劑65(Merck Adjuvant 65)(新澤西州羅韋的默克公司(Merck andCompany，Inc.，Rahway，NJ))；角鯊烯；病毒顆粒；水包油乳液(例如SBAS2)；脂質(zhì)體調(diào)配物(例如SBAS1)；等。其它佐劑包括免疫調(diào)節(jié)寡核苷酸，例如如WO 96/02555中所揭示的未甲基化CpG序列。預(yù)期諸如上文提及的佐劑等不同佐劑的組合提供作為TH1細(xì)胞反應(yīng)的優(yōu)選刺激劑的佐劑。舉例來說，QS21可與3D-MPL一起調(diào)配。QS213D-MPL的比率通常將為約1∶10到10∶1、1∶5到5∶1，且通常實質(zhì)上為1∶1。最佳協(xié)同作用的所需范圍可為2.5∶1到1∶1的3D-MPLQS21。適用于人類疫苗調(diào)配物的純化QS提取物的劑量為每千克體重0.01mg到10mg。
應(yīng)注意某些熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)(例如地衣多糖酶)本身可顯示免疫反應(yīng)增強活性，使得所述蛋白質(zhì)無論是在與流感抗原多肽融合使用時還是分開使用時都可考慮作為佐劑使用。因此，本發(fā)明的疫苗組合物可進(jìn)一步包含一種或多種佐劑。某些疫苗組合物可包含兩種或兩種以上佐劑。此外，視調(diào)配物和投藥途徑而定，特定調(diào)配物和/或組合中可能需要某些佐劑。
在某些情況下，可能需要通過減緩皮下或肌肉內(nèi)注射的疫苗產(chǎn)品(例如蛋白質(zhì))的一種或多種組分的吸收來延長本發(fā)明疫苗的作用。這可通過使用具有弱水溶性的結(jié)晶或非晶形材料的液體懸浮液來實現(xiàn)。產(chǎn)品的吸收速率則視其溶解速率而定，而溶解速率又可視大小和形式而定。其它或另外，通過將產(chǎn)品溶解或懸浮于油性媒劑中來實現(xiàn)非經(jīng)腸投予的產(chǎn)品的延遲吸收。通過在諸如聚丙交酯-聚乙交酯等可生物降解聚合物中形成蛋白質(zhì)的微膠囊基質(zhì)來制備可注射儲積形式。視產(chǎn)品與聚合物的比率和所采用的特定聚合物的性質(zhì)而定，可控制釋放速率?？缮锝到饩酆衔锏膶嵗ň?原酸酯)和聚(酸酐)?？赏ㄟ^將產(chǎn)品裹在與身體組織相容的脂質(zhì)體或微乳液中來制備儲積式可注射調(diào)配物?？诜{(diào)配物可使用替代聚合物傳遞媒劑。舉例來說，可使用諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸等可生物降解、生物相容性聚合物?？蓪⒖乖蚱涿庖咴圆糠终{(diào)配成微粒，例如與聚合物傳遞媒劑組合。
可將疫苗抗原的經(jīng)腸投予制劑以固體、半固體、懸浮液或乳液形式引入，且可與任何醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑(諸如水、懸浮劑和乳化劑)混合。可借助于泵或持續(xù)釋放形式投予抗原，尤其當(dāng)作為預(yù)防措施投予時，以便預(yù)防個體中疾病的發(fā)展或改善或延遲已確診的疾病?？蓪⒀a充活性化合物，例如針對欲治療的疾病或臨床病狀獨立地具有活性的化合物，或增強本發(fā)明化合物的活性的化合物并入組合物中或與組合物一起投予。可使用香料和著色劑。
任選與植物組織一起，本發(fā)明的疫苗產(chǎn)品尤其充分適合于以醫(yī)藥組合物形式經(jīng)口投予?？墒褂每诜后w調(diào)配物且其對于兒童群體可具有特別效用。視所需治療產(chǎn)品的性質(zhì)和其所需形式而定，可以多種方式(例如風(fēng)干、冷凍干燥、提取等)中的任一種來加工所收集的植物材料。可經(jīng)口單獨攝取或與食物或飼料或飲料一起攝取如上所述的所述組合物。用于經(jīng)口投予的組合物包括植物；植物提取物，和以干粉、食物、水性或非水性溶劑、懸浮液或乳液形式提供的從感染植物純化的蛋白質(zhì)。非水性溶劑的實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油、魚油和可注射有機(jī)酯。水性載劑包括水、水醇溶液、乳液或懸浮液，其包括生理食鹽水和緩沖中間非經(jīng)腸媒劑，包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖溶液(Ringer′sdextrose solution)、右旋糖加氯化鈉溶液、含有乳糖的林格氏溶液或不揮發(fā)性油。干粉的實例包括任何已干燥(例如冷凍干燥、風(fēng)干或噴霧干燥)的植物生物質(zhì)。舉例來說，可通過將植物置于商業(yè)風(fēng)干機(jī)中約120°F下風(fēng)干植物，直到生物質(zhì)含有小于5重量％的水分?？少A存所干燥的植物以供進(jìn)一步加工成大塊固體或通過研磨進(jìn)一步加工成具有所需目數(shù)大小的粉末。其它或另外，冷凍干燥可用于對風(fēng)干敏感的產(chǎn)物。可通過將產(chǎn)物置于真空干燥器中并在真空下干燥冷凍來冷凍干燥產(chǎn)物，直到生物質(zhì)含有小于約5重量％的水分?？扇绫疚乃鲞M(jìn)一步加工干燥的材料。
可將從植物獲得的材料以一種或多種草本制劑形式投予或與一種或多種草本制劑一起投予。適用的草本制劑包括液體和固體草本制劑。草本制劑的一些實例包括酊劑、提取物(例如水性提取物、醇提取物)、煎劑、干燥制劑(例如風(fēng)干、噴霧干燥、冷凍或冷凍干燥)、粉末(例如凍干粉末)和液體?？稍谥T如膠囊、片劑、栓劑、液體劑量等任何標(biāo)準(zhǔn)傳遞媒劑中提供草本制劑。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解各種可適用于本發(fā)明的傳遞草本制劑的調(diào)配物和形式。
本發(fā)明的醫(yī)藥調(diào)配物可另外包含醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑，如本文中所使用，所述賦形劑包括適合于所需特定劑型的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、稀釋劑或其它液體媒劑、分散助劑或懸浮助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑、固體粘合劑、潤滑劑等。雷氏藥學(xué)科學(xué)與實踐(Remington′s The Science and Practice of Pharmacy)，第21版，A.R.杰納羅(A.R.Gennaro)(利平科特·威廉斯·威爾金斯出版公司(Lippincott，Williams & Wilkins)，馬里蘭州巴爾的摩(Baltimore，MD)，2006)揭示用于調(diào)配醫(yī)藥組合物的各種賦形劑和其制備的已知技術(shù)。除非任何常規(guī)賦形劑介質(zhì)與物質(zhì)或其衍生物都不相容，諸如產(chǎn)生任何不合需要的生物作用或另外以有害方式與醫(yī)藥組合物的任何其它組分相互作用，否則其使用涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在一些實施例中，醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑的純度為至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。在一些實施例中，賦形劑獲準(zhǔn)用于人類和獸醫(yī)用途。在一些實施例中，賦形劑經(jīng)美國食品藥物管理局(United States Food and DrugAdministration)批準(zhǔn)。在一些實施例中，賦形劑為醫(yī)藥級賦形劑。在一些實施例中，賦形劑符合美國藥典(United States Pharmacopoeia，USP)、歐洲藥典(EuropeanPharmacopoeia，EP)、英國藥典(British Pharmacopoeia)和/或國際藥典(InternationalPharmacopoeia)的標(biāo)準(zhǔn)。
用于制造醫(yī)藥組合物的醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑包括(但不限于)惰性稀釋劑、分散劑和/或成粒劑、表面活性劑和/或乳化劑、崩解劑、粘合劑、防腐劑、緩沖劑、潤滑劑和/或油類。所述賦形劑可任選包括在調(diào)配物中。根據(jù)調(diào)配者的判斷，諸如可可脂和栓劑蠟、著色劑、涂布劑、甜味劑、調(diào)味劑和/或芳香劑等賦形劑可存在于組合物中。
例示性稀釋劑包括(但不限于)碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸鈣、磷酸二鈣、硫酸鈣、磷酸氫鈣、磷酸鈉乳糖、蔗糖、纖維素、微晶纖維素、高嶺土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化鈉、干淀粉、玉米淀粉、糖粉等和/或其組合。
例示性成粒劑和/或分散劑包括(但不限于)馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、羥基乙酸淀粉鈉、粘土、海藻酸、瓜爾膠(guar gum)、柑橘渣、瓊脂、膨潤土、纖維素和木制品、天然海綿、陽離子交換樹脂、碳酸鈣、硅酸鹽、碳酸鈉、交聯(lián)聚(乙烯吡咯烷酮)(交聯(lián)聚維酮(crospovidone))、羧甲基淀粉鈉(羥基乙酸淀粉鈉)、羧甲基纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉(交聯(lián)羧甲纖維素(croscarmellose))、甲基纖維素、預(yù)膠凝化淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纖維素鈣、硅酸鎂鋁

月桂基硫酸鈉、季銨化合物等和/或其組合。
例示性表面活性劑和/或乳化劑包括(但不限于)天然乳化劑(例如阿拉伯膠、瓊脂、海藻酸、海藻酸鈉、黃芪膠、角叉菜(chondrux)、膽固醇、三仙膠、果膠、明膠、蛋黃、酪蛋白、羊毛脂、膽固醇、蠟和卵磷脂)、膠態(tài)粘土(例如膨潤土[硅酸鋁]和
)、長鏈氨基酸衍生物、高分子量醇(例如硬酯醇、鯨蠟醇、油醇、三乙酸甘油酯單硬脂酸酯、乙二醇二硬脂酸酯、單硬脂酸甘油酯和丙二醇單硬脂酸酯、聚乙烯醇)、卡波姆(carbomer)(例如羧基聚亞甲基、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物和羧基乙烯基聚合物)、角叉菜膠(carrageenan)、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素鈉、粉末狀纖維素、羥甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素)、脫水山梨糖醇脂肪酸酯(例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯

聚氧乙烯脫水山梨糖醇

聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯

脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯

脫水山梨糖醇單硬脂酸酯

脫水山梨糖醇三硬脂酸酯

甘油單油酸酯、脫水山梨糖醇單油酸酯

)、聚氧乙烯酯(例如聚氧乙烯單硬脂酸酯

聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚乙氧基蓖麻油、聚氧化亞甲基硬脂酸酯和

)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如

)、聚氧乙烯醚、(例如聚氧乙烯月桂基醚

)、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、二乙二醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、油酸鈉、油酸鉀、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、月桂基硫酸鈉、


西曲溴銨(cetrimonium bromide)、氯化十六烷基吡錠、氯芐烷銨(benzalkonium chlorid)、多庫酯鈉(docusate sodium)等和/或其組合。
例示性粘合劑包括(但不限于)淀粉(例如玉米淀粉、淀粉糊等)；明膠；糖(例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露糖醇等)；天然和合成樹膠(例如阿拉伯膠、海藻酸鈉、愛爾蘭蘚(Irish moss)提取物、潘瓦樹膠(panwar gum)、印度樹膠(ghatti gum)、艾薩普(isapol)外皮的粘液、羧甲基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、微晶纖維素、乙酸纖維素、聚(乙烯吡咯烷酮)、硅酸鎂鋁

落葉松阿拉伯半乳聚糖(larcharabogalactan)等)；海藻酸鹽；聚環(huán)氧乙烷；聚乙二醇；無機(jī)鈣鹽；硅酸；聚甲基丙烯酸酯；蠟；水；醇等；和其組合。
例示性防腐劑可包括(但不限于)抗氧化劑、螯合劑、抗微生物防腐劑、抗真菌防腐劑、醇防腐劑、酸性防腐劑和/或其它防腐劑。例示性抗氧化劑包括(但不限于)α生育酚、抗壞血酸、抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基大茴香醚、丁基化羥基甲苯、單硫代甘油、偏亞硫酸氫鉀、丙酸、沒食子酸丙酯、抗壞血酸鈉、亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉和/或亞硫酸鈉。例示性螯合劑包括乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)、檸檬酸單水合物、乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸二鉀、依地酸(edetic acid)、反丁烯二酸、蘋果酸、磷酸、乙二胺四乙酸鈉、酒石酸和/或乙二胺四乙酸三鈉。例示性抗微生物防腐劑包括(但不限于)氯芐烷銨、芐索氯銨(benzethonium chloride)、苯甲醇、溴硝丙二醇(bronopol)、西曲溴銨、氯化十六烷基吡錠、氯己定(chlorhexidine)、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、甘油、?？颂驵?hexetidine)、咪唑烷基脲(imidurea)、苯酚、苯氧基乙醇、苯基乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和/或硫柳汞(thimerosal)。例示性抗真菌防腐劑包括(但不限于)對羥基苯甲酸丁酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羥基苯甲酸、苯甲酸鉀、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、丙酸鈉和/或山梨酸。例示性醇防腐劑包括(但不限于)乙醇、聚乙二醇、苯酚、酚系化合物、雙酚、氯丁醇、羥基苯甲酸酯和/或苯基乙醇。例示性酸性防腐劑包括(但不限于)維生素A、維生素C、維生素E、β-胡蘿卜素、檸檬酸、乙酸、脫氫乙酸、抗壞血酸、山梨酸和/或植酸。其它防腐劑包括(但不限于)生育酚、生育酚乙酸酯、甲磺酸去鐵胺(deteroxime mesylate)、西曲溴銨、丁基化羥基大茴香醚(butylated hydroxyanisol，BHA)、丁基化羥基甲苯(butylated hydroxytoluened，BHT)、乙二胺、月桂基硫酸鈉(sodiumlauryl sulfate，SLS)、月桂基醚硫酸鈉(sodium lauryl ether sulfate，SLES)、亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鉀、偏亞硫酸氫鉀、

對羥基苯甲酸甲酯、

KATHONTM和/或
例示性緩沖劑包括(但不限于)檸檬酸鹽緩沖溶液、乙酸鹽緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液、氯化銨、碳酸鈣、氯化鈣、檸檬酸鈣、葡乳醛酸鈣、葡庚糖酸鈣、葡糖酸鈣、D-葡糖酸、甘油磷酸鈣、乳酸鈣、丙酸、戊酮酸鈣、戊酸、磷酸氫二鈣、磷酸、磷酸三鈣、磷酸氫氧化鈣、乙酸鉀、氯化鉀、葡糖酸鉀、鉀混合物、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鉀混合物、乙酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、檸檬酸鈉、乳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鈉混合物、緩血酸胺、氫氧化鎂、氫氧化鋁、海藻酸、無熱原質(zhì)水、等滲生理食鹽水、林格氏溶液、乙醇等和/或其組合。
例示性潤滑劑包括(但不限于)硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸、二氧化硅、滑石、麥芽、山崳酸甘油酯、氫化植物油、聚乙二醇、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉、亮氨酸、月桂基硫酸鎂、月桂基硫酸鈉等和其組合。
例示性油類包括(但不限于)扁桃油、杏仁油、鱷梨油、巴巴蘇油(babassu)、香檸檬油、黑加侖籽油、琉璃苣油、杜松油、春黃菊油、菜籽油、莧蒿子油、巴西棕櫚油、蓖麻油、肉桂油、可可脂油、椰子油、鱈肝油、咖啡油、玉米油、棉籽油、鴯鹋油、桉樹油、月見草油、魚油、亞麻籽油、香葉醇油、苦瓜油、葡萄籽油、榛果油、海索草油、十四烷酸異丙酯、荷荷芭油(jojoba)、夏威夷核果油(kukui nut)、雜薰衣草油(lavandin)、熏衣草油、檸檬油、山蒼子油、澳洲堅果油(macadamia nut)、錦葵油、芒果籽油、白芒花籽油、貂油、肉豆蔻油、橄欖油、橙油、深海魚油(orange roughy)、棕櫚油、棕櫚仁油、桃仁油、花生油、罌粟籽油、南瓜籽油、油菜籽油、米糠油、迷迭香油、紅花油、檀香油、茶梅油、香薄荷油、沙棘油、芝麻油、乳木果油、硅酮油、大豆油、向日葵油、茶樹油、薊油、山茶油、巖蘭草油、胡桃油和小麥胚芽油。例示性油類包括(但不限于)硬脂酸丁酯、辛酸三酸甘油酯、癸酸三酸甘油酯、環(huán)甲聚硅氧烷、癸二酸二乙酯、二甲聚硅氧烷360、十四烷酸異丙酯、礦物油、辛基十二醇、油醇、硅酮油和/或其組合。
用于經(jīng)口和非經(jīng)腸投予的液體劑型包括(但不限于)醫(yī)藥學(xué)上可接受的乳液、微乳液、溶液、懸浮液、糖漿和/或酏劑。除活性劑外，液體劑型還可包含所屬領(lǐng)域中常用的惰性稀釋劑，例如水或其它溶劑；增溶劑和乳化劑，諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油類(尤其棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和脫水山梨糖醇脂肪酸酯和其混合物。除惰性稀釋劑外，口服組合物還可包括佐劑，諸如濕潤劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、調(diào)味劑和/或芳香劑。在用于非經(jīng)腸投予的某些實施例中，將組合物與諸如

醇、油類、改性油類、二醇、聚山梨醇酯、環(huán)糊精、聚合物和/或其組合等增溶劑混合。
可注射制劑(例如無菌可注射水性或油性懸浮液)可根據(jù)已知技術(shù)，使用合適的分散劑、濕潤劑和/或懸浮劑來調(diào)配。無菌可注射制劑可為非經(jīng)腸可接受的無毒稀釋劑和/或溶劑中的無菌可注射溶液、懸浮液和/或乳液，例如1，3-丁二醇中的溶液?？刹捎玫目山邮苊絼┖腿軇┌ㄋ?、林格氏溶液、U.S.P.及等滲氯化鈉溶液。無菌不揮發(fā)性油通常用作溶劑或懸浮介質(zhì)。出于這一目的，可使用任何溫和的不揮發(fā)性油，包括合成的單甘油酯或二甘油酯。諸如油酸等脂肪酸可用于制備可注射劑。
可注射調(diào)配物可例如通過經(jīng)由截留細(xì)菌的過濾器和/或通過并入殺菌劑來殺菌，呈在使用之前可溶解或分散于無菌水或其它無菌可注射介質(zhì)中的無菌固體組合物形式。
用于經(jīng)直腸或經(jīng)陰道投予的組合物通常為栓劑，其可通過將組合物與在環(huán)境溫度下為固體但在體溫下為液體且因此在直腸或陰道腔中熔融并釋放活性成分的合適無刺激性賦形劑(諸如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟)混合來制備。
用于經(jīng)口投予的固體劑型包括膠囊、片劑、藥丸、粉末和顆粒。在所述固體劑型中，活性成分與以下各物混合至少一種醫(yī)藥學(xué)上可接受的惰性賦形劑，諸如檸檬酸鈉或磷酸二鈣；和/或填充劑或增量劑(例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸)；粘合劑(例如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠)；保濕劑(例如甘油)；崩解劑(例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉)；溶解延遲劑(例如石蠟)；吸收促進(jìn)劑(例如季銨化合物)；濕潤劑(例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯)；吸附劑(例如高嶺土和膨潤土)；和潤滑劑(例如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉)；和其混合物。在膠囊、片劑和藥丸的情況下，劑型可包含緩沖劑。
類似類型的固體組合物可以用作使用諸如乳糖(lactose/milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等賦形劑的經(jīng)填充的軟和硬明膠膠囊中的填充劑。片劑、糖衣藥丸、膠囊、藥丸和顆粒的固體劑型可使用涂層和外殼(諸如腸溶衣)和醫(yī)藥調(diào)配技術(shù)中所熟知的其它涂層來制備。其可任選包含遮光劑且可具有任選以延遲方式僅或優(yōu)先在腸道的某一部分中釋放活性成分的組成?？墒褂玫陌窠M合物的實例包括聚合物和蠟。類似類型的固體組合物可以用作使用諸如乳糖以及高分子量聚乙二醇等賦形劑的經(jīng)填充的軟和硬明膠膠囊中的填充劑。
任選與植物組織一起，疫苗產(chǎn)品尤其充分適合于以醫(yī)藥組合物形式經(jīng)口投予?？墒褂每诜后w調(diào)配物且其對于兒童群體可具有特別效用。視所需治療產(chǎn)品的性質(zhì)和其所需形式而定，可以多種方式(例如風(fēng)干、冷凍干燥、提取等)中的任一種來加工所收集的植物材料。可經(jīng)口單獨攝取或與食物或飼料或飲料一起攝取如上所述的所述組合物。用于經(jīng)口投予的組合物包括植物；植物提取物；和以干粉、食物、水性或非水性溶劑、懸浮液或乳液形式提供的從感染植物純化的蛋白質(zhì)。非水性溶劑的實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油、魚油和可注射有機(jī)酯。水性載劑包括水、水醇溶液、乳液或懸浮液，其包括生理食鹽水和緩沖中間非經(jīng)腸媒劑，包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖溶液、右旋糖加氯化鈉溶液、含有乳糖的林格氏溶液或不揮發(fā)性油。干粉的實例包括任何已干燥(例如冷凍干燥、風(fēng)干或噴霧干燥)的植物生物質(zhì)。舉例來說，可通過將植物置于商業(yè)風(fēng)干機(jī)中約120°F下來風(fēng)干植物，直到生物質(zhì)含有小于5重量％的水分?？少A存所干燥的植物以供進(jìn)一步加工成大塊固體或通過研磨進(jìn)一步加工成具有所需目數(shù)大小的粉末。其它或另外，冷凍干燥可用于對風(fēng)干敏感的產(chǎn)物。可通過將產(chǎn)物置于真空干燥器中且在真空下干燥冷凍來冷凍干燥產(chǎn)物，直到生物質(zhì)含有小于約5重量％的水分。可如本文所述進(jìn)一步加工干燥的材料。
可將從植物獲得的材料以一種或多種草本制劑形式投予或與一種或多種草本制劑一起投予。適用的草本制劑包括液體和固體草本制劑。草本制劑的一些實例包括酊劑、提取物(例如水性提取物、醇提取物)、煎劑、干燥制劑(例如風(fēng)干、噴霧干燥、冷凍或冷凍干燥)、粉末(例如凍干粉末)和液體?？稍谥T如膠囊、片劑、栓劑、液體劑量等任何標(biāo)準(zhǔn)傳遞媒劑中提供草本制劑。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解各種可適用于本發(fā)明的傳遞草本制劑的調(diào)配物和形式。
在一些方法中，將表達(dá)本發(fā)明的流感抗原多肽的植物或其部分或其生物質(zhì)以醫(yī)用食物形式經(jīng)口投予。如果呈固體形式，那么通常通過生食來食用所述可食用組合物，或如果呈液體形式，那么通過飲用來食用?？稍跓o預(yù)先加工步驟的情況下或在最小限度的烹飪制備后，直接攝取植物材料。舉例來說，可使疫苗抗原在可直接食用的芽中表達(dá)。舉例來說，疫苗抗原在紫花苜蓿芽、綠豆芽或菠菜或萵苣葉芽等中表達(dá)。在一些實施例中，可加工植物生物質(zhì)且攝取加工步驟后回收的材料。
適用于本發(fā)明的加工方法為常用于食品或飼料工業(yè)的方法。所述方法的最終產(chǎn)品通常包括實質(zhì)量的所表達(dá)抗原且其適宜食用或飲用。可將最終產(chǎn)品與諸如鹽、載劑、風(fēng)味增強劑、抗生素等其它食物或飼料形式混合，且以固體、半固體、懸浮液、乳液或液體形式食用。所述方法可包括保存步驟，例如巴氏消毒法(pasteurization)、蒸煮或添加保存和防腐劑。在本發(fā)明中可使用和加工任何植物以產(chǎn)生可食用或可飲用植物物質(zhì)?？赏ㄟ^所屬領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如凝膠電泳、ELISA或西方印跡法分析)，使用探針或產(chǎn)物特異性抗體來測試從植物獲得的制劑中流感抗原多肽的量?？墒褂眠@一測定將所攝取的疫苗抗原蛋白的量標(biāo)準(zhǔn)化。舉例來說，可通過例如混合具有不同含量的產(chǎn)物的多批產(chǎn)物來確定和調(diào)節(jié)疫苗抗原的量，以便待飲用或食用以攝取單次劑量的材料量可得到標(biāo)準(zhǔn)化。然而，本發(fā)明的封閉的可調(diào)節(jié)環(huán)境應(yīng)使進(jìn)行所述標(biāo)準(zhǔn)化程序的需要最小。
植物細(xì)胞或組織中所產(chǎn)生且由個體食用的疫苗蛋白可優(yōu)選由消化系統(tǒng)吸收。攝取僅經(jīng)最低限度地加工的植物組織的一個優(yōu)勢是使蛋白質(zhì)囊封或隔離在植物細(xì)胞中。因此，產(chǎn)物在到達(dá)胃或腸之前可能會受到至少一些保護(hù)以防在上消化道中消化，且較高比例的活性產(chǎn)物將可供吸收。
用于局部和/或經(jīng)皮投予本發(fā)明化合物的劑型可包括軟膏、糊劑、乳膏、洗劑、凝膠、粉末、溶液、噴霧、吸入劑和/或貼片。通常，在可能需要時，在無菌條件下將活性成分與醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或任何所需防腐劑和/或緩沖劑混合。另外，本發(fā)明涵蓋使用經(jīng)皮貼片，其通常具有使化合物受控傳遞至身體的額外優(yōu)點。例如通過將化合物溶解和/或分散于適當(dāng)介質(zhì)中來制備所述劑型。其它或另外，可通過提供速率控制膜和/或通過將化合物分散于聚合物基質(zhì)和/或凝膠中來控制速率。
適合用于傳遞本文所述的皮內(nèi)醫(yī)藥組合物的裝置包括短針裝置，諸如美國專利4,886,499、5,190,521、5,328,483、5,527,288、4,270,537、5,015,235、5,141,496和5,417,662中所述的裝置。皮內(nèi)組合物可通過限制針刺入皮膚內(nèi)的有效長度的裝置來投予，諸如PCT公開案WO 99/34850中所述的裝置和其功能等效物。通過液體射流注射器和/或通過刺入角質(zhì)層且產(chǎn)生到達(dá)真皮的射流的針將液體疫苗傳遞到真皮的射流注射裝置是合適的。射流注射裝置例如在以下專利中有所描述美國專利5,480,381；5,599,302；5,334,144；5,993,412；5,649,912；5,569,189；5,704,911；5,383,851；5,893,397；5,466,220；5,339,163；5,312,335；5,503,627；5,064,413；5,520,639；4,596,556；4,790,824；4,941,880；4,940,460；和PCT公開案WO 97/37705和WO 97/13537。使用壓縮氣體來加速粉末形式的疫苗穿過皮膚外層到達(dá)真皮的沖擊式粉末/粒子傳遞裝置是合適的。其它或另外，常規(guī)注射器可用于皮內(nèi)投藥的典型曼托方法(mantoux method)中。
適合于局部投予的調(diào)配物包括(但不限于)液體和/或半液體制劑，諸如擦劑、洗劑、水包油和/或油包水乳液(諸如乳膏、軟膏和/或糊劑)和/或溶液和/或懸浮液?？删植客队璧恼{(diào)配物可例如包含約1％到約10％(w/w)活性成分，不過活性成分的濃度可高達(dá)溶劑中活性成分的溶解度極限。用于局部投予的調(diào)配物可進(jìn)一步包含一種或多種本文所述的其它成分。
本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可以適合于通過口腔經(jīng)肺投予的調(diào)配物形式制備、包裝和/或銷售。所述調(diào)配物可包含干燥粒子，其包含活性成分且直徑在約0.5nm到約7nm或約1nm到約6nm的范圍內(nèi)。所述組合物宜呈使用包含可引導(dǎo)推進(jìn)劑流以分散粉末的干粉儲集器的裝置和/或使用自動推進(jìn)溶劑/粉末分配容器(諸如在密封容器中包含溶解和/或懸浮于低沸點推進(jìn)劑中的活性成分的裝置)投予的干粉形式。所述粉末包含至少98重量％的粒子具有大于0.5nm的直徑且至少95％的粒子(以數(shù)目計)具有小于7nm的直徑的粒子。或者，至少95重量％的粒子具有大于1nm的直徑且至少90％的粒子(以數(shù)目計)具有小于6nm的直徑。干粉組合物可包括固體細(xì)粉稀釋劑(諸如糖)且宜以單位劑型提供。
低沸點推進(jìn)劑一般包括在大氣壓下沸點低于65°F的液體推進(jìn)劑。通常，推進(jìn)劑可構(gòu)成組合物的50％到99.9％(w/w)，且活性成分可構(gòu)成組合物的0.1％到20％(w/w)。推進(jìn)劑可進(jìn)一步包含其它成分，諸如液體非離子性和/或固體陰離子性表面活性劑和/或固體稀釋劑(其可具有差不多與包含活性成分的粒子一樣的粒度)。
調(diào)配用于經(jīng)肺傳遞的本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可提供呈溶液和/或懸浮液液滴形式的活性成分。所述調(diào)配物可以任選為無菌的且包含活性成分的水溶液和/或稀醇溶液和/或懸浮液形式制備、包裝和/或銷售，且宜使用任何霧化和/或噴霧裝置來投予。所述調(diào)配物可進(jìn)一步包含一種或多種其它成分，包括(但不限于)調(diào)味劑(諸如糖精鈉)、揮發(fā)性油、緩沖劑、表面活性劑和/或防腐劑(諸如羥基苯甲酸甲酯)。由這一投藥途徑提供的液滴可具有在約0.1nm到約200nm范圍內(nèi)的平均直徑。
適用于經(jīng)肺傳遞的本文所述的調(diào)配物適用于鼻內(nèi)傳遞醫(yī)藥組合物。另一適合于鼻內(nèi)投予的調(diào)配物為包含活性成分且平均粒子為約0.2μm到500μm的粗粉。以如下方式投予所述調(diào)配物采用用鼻子吸，即通過經(jīng)由鼻腔從保持在鼻子附近的容器快速吸入粉末。
適合于經(jīng)鼻投予的調(diào)配物可例如包含約少到0.1％(w/w)且多到100％(w/w)的活性成分，且可包含一種或多種本文所述的其它成分。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可以適合于頰內(nèi)投予的調(diào)配物形式制備、包裝和/或銷售。所述調(diào)配物可例如呈使用常規(guī)方法制備的片劑和/或錠劑的形式且可例如0.1％到20％(w/w)為活性成分，其余部分包含經(jīng)口可溶解和/或可降解的組合物和任選一種或多種本文所述的其它成分。或者，適合于頰內(nèi)投予的調(diào)配物可包含含有活性成分的粉末和/或煙霧狀和/或霧化溶液和/或懸浮液。所述粉末狀、煙霧狀和/或煙霧狀調(diào)配物在分散時可具有在約0.1nm到約200nm范圍內(nèi)的平均粒子和/或液滴尺寸，且可進(jìn)一步包含一種或多種本文所述的其它成分。
本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可以適合于眼部投予的調(diào)配物形式制備、包裝和/或銷售。所述調(diào)配物可例如呈包括例如0.1/1.0％(w/w)活性成分于水性或油性液體賦形劑中的溶液和/或懸浮液的滴眼劑的形式。所述滴劑可進(jìn)一步包含緩沖劑、鹽和/或一種或多種本文所述的其它成分。其它適用的可眼部投予調(diào)配物包括呈微晶形式和/或呈脂質(zhì)體制劑形式的包含活性成分的調(diào)配物。預(yù)期滴耳劑和/或滴眼劑在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在某些情況下，可能需要通過減緩皮下或肌肉內(nèi)注射的疫苗產(chǎn)品(例如蛋白質(zhì))的一種或多種組分的吸收來延長疫苗的作用。這可通過使用具有弱水溶性的結(jié)晶或非晶形材料的液體懸浮液來實現(xiàn)。產(chǎn)品的吸收速率則視其溶解速率而定，而溶解速率又可視大小和形式而定。其它或另外，通過將產(chǎn)品溶解或懸浮于油性媒劑中來實現(xiàn)非經(jīng)腸投予的產(chǎn)品的延遲吸收。通過在諸如聚丙交酯-聚乙交酯等可生物降解聚合物中形成蛋白質(zhì)的微膠囊基質(zhì)來制備可注射儲積形式。視產(chǎn)品與聚合物的比率和所采用的特定聚合物的性質(zhì)而定，可控制釋放速率。可生物降解聚合物的實例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)?？赏ㄟ^將產(chǎn)品裹在與身體組織相容的脂質(zhì)體或微乳液中來制備儲積式可注射調(diào)配物。口服調(diào)配物可使用替代聚合物傳遞媒劑。舉例來說，可使用諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸等可生物降解、生物相容性聚合物。可將抗原或其免疫原性部分調(diào)配成微粒，例如與聚合物傳遞媒劑組合。
關(guān)于調(diào)配和/或制造醫(yī)藥劑的總體考慮可例如見于雷氏藥學(xué)科學(xué)與實踐(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy)，第21版，利平科特·威廉斯·威爾金斯出版公司(Lippincott Williams & Wilkins)，2005中。
投藥 本發(fā)明提供亞單位疫苗。在一些實施例中，本發(fā)明的亞單位疫苗可以低劑量投予個體以便刺激免疫反應(yīng)和/或賦予保護(hù)性。如本文中所使用，術(shù)語“低劑量疫苗”一般是指當(dāng)以低劑量投予個體時具有免疫原性和/或保護(hù)性的疫苗。根據(jù)本發(fā)明，投予低劑量疫苗包含投予包含小于100μg流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分的亞單位疫苗組合物。
在一些實施例中，投予低劑量亞單位疫苗包含向有需要的個體投予包含小于約100μg、小于約90μg、小于約80μg、小于約70μg、小于約60μg、小于約50μg、小于約40μg、小于約35μg、小于約30μg、小于約25μg、小于約20μg、小于約15μg、小于約5μg、小于約4μg、小于約3μg、小于約2μg或小于約1μg植物產(chǎn)流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分的亞單位疫苗。在一些實施例中，植物產(chǎn)流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分已至少部分從如本文所述的非抗原性組分純化。在一些實施例中，植物產(chǎn)流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分尚未至少部分從如本文所述的非抗原性組分純化。在以上標(biāo)題為“疫苗”的部分中更詳細(xì)地描述適合于投予個體的疫苗組合物。
本發(fā)明的流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分和/或其醫(yī)藥組合物(例如疫苗)可使用有效用于治療的任何量和任何投藥途徑來投予。
所需的精確量將在個體之間變化，其視個體的物種、年齡和總體狀況、感染的嚴(yán)重程度、特定組合物、其投藥模式、其活性模式等而定。為了便于劑量的投予和均一性，通常將流感抗原多肽調(diào)配成單位劑型。然而，應(yīng)了解，本發(fā)明的組合物的總?cè)沼昧繉⒃谡_醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)由主治醫(yī)生決定。用于任何特定個體或生物體的特定治療有效劑量將視多種因素而定，包括所治療的病癥和病癥的嚴(yán)重程度；所使用的特定流感抗原多肽的活性；所投予的特定醫(yī)藥組合物；投予后組合物的半衰期；個體的年齡、體重、總體健康狀況、性別和飲食；投藥時間、投藥途徑和所使用的特定化合物的排泄速率；治療持續(xù)時間；與所使用的特定化合物組合或同時使用的藥物；和醫(yī)學(xué)技術(shù)中熟知的類似因素。
本發(fā)明的醫(yī)藥組合物(例如疫苗)可通過任何途徑來投予。在一些實施例中，通過多種途徑投予本發(fā)明的醫(yī)藥組合物，包括經(jīng)口(PO)、靜脈內(nèi)(IV)、肌肉內(nèi)(IM)、動脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下(SQ)、心室內(nèi)、透皮、經(jīng)皮、皮內(nèi)、經(jīng)直腸(PR)、經(jīng)陰道、腹膜內(nèi)(IP)、胃內(nèi)(IG)、局部(例如采用粉末、軟膏、乳膏、凝膠、洗劑和/或滴劑)、經(jīng)粘膜、鼻內(nèi)、頰內(nèi)、腸內(nèi)、玻璃體、舌下；通過氣管內(nèi)滴注、支氣管滴注和/或吸入；以口服噴霧、鼻用噴霧和/或氣溶膠形式；和/或通過門靜脈導(dǎo)管。一般來說，最適當(dāng)投藥途徑將視多種因素而定，包括所投予藥劑的性質(zhì)(例如其在胃腸道環(huán)境中的穩(wěn)定性)、個體狀況(例如個體是否能夠耐受特定投藥模式)等。
在一些實施例中，通過多種投藥途徑(例如通過皮下注射和通過鼻內(nèi)吸入)傳遞本發(fā)明的疫苗。對于包括兩個或兩個以上劑量的疫苗來說，不同劑量可通過不同途徑來投予。
在一些實施例中，通過皮下注射來傳遞本發(fā)明的疫苗。在一些實施例中，通過肌肉內(nèi)和/或靜脈內(nèi)注射來投予本發(fā)明的疫苗。在一些實施例中，通過鼻內(nèi)吸入來傳遞本發(fā)明的疫苗。
在一些實施例中，通過經(jīng)口和/或經(jīng)粘膜途徑來傳遞本發(fā)明的疫苗。經(jīng)口和/或經(jīng)粘膜傳遞具有防止粘膜組織感染(許多病原體感染的首要途徑)的可能性。經(jīng)口和/或經(jīng)粘膜傳遞會引發(fā)全身性免疫反應(yīng)。在用于經(jīng)口投予刺激粘膜免疫系統(tǒng)并會引發(fā)全身性免疫的抗原的異源表達(dá)系統(tǒng)的開發(fā)方面已取得相當(dāng)大的進(jìn)展。然而，對于傳遞口服疫苗的先前嘗試已證明獲得功效需要大量抗原。因此，大量目標(biāo)抗原的經(jīng)濟(jì)制備是產(chǎn)生有效口服疫苗的前提。發(fā)展表達(dá)抗原(包括熱穩(wěn)定性抗原)的植物是解決所述難題的較實際方法。
在某些實施例中，通過向個體直接投予植物來向個體經(jīng)口投予在植物或其部分中表達(dá)的流感抗原多肽。在一些方面，提取和/或純化在植物或其部分中表達(dá)的疫苗蛋白，并用于制備醫(yī)藥組合物?？赡苄枰{(diào)配所述經(jīng)分離的產(chǎn)物以用于其預(yù)定用途(例如作為醫(yī)藥劑、疫苗組合物等)。在一些實施例中，可能需要將產(chǎn)物與一些或所有表達(dá)其的植物組織一起調(diào)配。
在某些實施例中，通過向個體直接投予植物來向個體經(jīng)口投予在植物或其部分中表達(dá)的流感抗原多肽。在一些方面，提取和/或純化在植物或其部分中表達(dá)的疫苗蛋白，并用于制備醫(yī)藥組合物?？赡苄枰{(diào)配所述經(jīng)分離的產(chǎn)物以用于其預(yù)定用途(例如作為醫(yī)藥劑、疫苗組合物等)。在一些實施例中，可能需要將產(chǎn)物與一些或所有表達(dá)其的植物組織一起調(diào)配。
植物細(xì)胞或組織中所產(chǎn)生且由個體食用的疫苗蛋白可優(yōu)選由消化系統(tǒng)吸收。攝取僅經(jīng)最低限度地加工的植物組織的一個優(yōu)勢是使蛋白質(zhì)囊封或隔離在植物細(xì)胞中。因此，產(chǎn)物在到達(dá)胃或腸之前可能會受到至少一些保護(hù)以防在上消化道中消化，且較高比例的活性產(chǎn)物將可供吸收。
當(dāng)需要將產(chǎn)物與植物材料一起調(diào)配時，通常將需要利用對相關(guān)接受者(例如人類或其它動物)無毒的植物。在適當(dāng)考慮保持表達(dá)產(chǎn)物的活性的情況下，可根據(jù)所屬領(lǐng)域中已知的技術(shù)簡單地收集和加工相關(guān)植物組織(例如細(xì)胞、根、葉)。在某些實施例中，需要在可食用植物中(且具體來說是在植物的可食用部分中)具有所表達(dá)的流感抗原多肽以便可隨后食用所述材料。舉例來說，如果經(jīng)口傳遞后(適當(dāng)調(diào)配時)疫苗抗原具有活性，那么可能需要在可食用植物部分中產(chǎn)生抗原蛋白且調(diào)配所表達(dá)的流感抗原多肽以與一些或所有表達(dá)蛋白質(zhì)的植物材料一起經(jīng)口傳遞。
在某些實施例中，本發(fā)明的流感抗原多肽和/或本發(fā)明的其醫(yī)藥組合物(例如疫苗)可以足以傳遞每日每千克個體體重約0.001mg到約100mg、約0.01mg到約50mg、約0.1mg到約40mg、約0.5mg到約30mg、約0.01mg到約10mg、約0.1mg到約10mg或約1mg到約25mg的劑量來投予以獲得所需治療作用。所需劑量可每日傳遞超過三次、每日傳遞三次、每日傳遞兩次、每日傳遞一次、每隔一日、每三日、每周、每兩周、每三周、每四周、每兩個月、每六個月或每十二個月傳遞。在某些實施例中，所需劑量可使用多次投予(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14次或更多次投予)來傳遞。
以獲得所需結(jié)果必需的量和時間來投予組合物。在某些實施例中，醫(yī)藥組合物的“治療有效量”為有效治療、減弱或預(yù)防個體疾病的量。因此，如本文中所使用，“有效治療、減弱或預(yù)防疾病的量”是指治療、減弱或預(yù)防任何個體的疾病的醫(yī)藥組合物的無毒但足夠的量。舉例來說，“治療有效量”可為治療、減弱或預(yù)防感染(例如流感感染)的量。
應(yīng)了解本發(fā)明的流感抗原多肽和/或其醫(yī)藥組合物可用于組合療法中。組合方案中采用的療法(例如治療劑或程序)的特定組合通常將考慮所需治療劑和/或程序與欲獲得的所需治療作用的相容性。應(yīng)了解所采用的療法對于相同目的(例如，可將適用于治療、預(yù)防流感感染和/或延遲流感感染發(fā)作的流感抗原多肽與另一適用于治療、預(yù)防流感感染和/或延遲流感感染發(fā)作的藥劑同時投予)可達(dá)成所需作用，或其可達(dá)成不同作用(例如控制任何不良作用)。本發(fā)明涵蓋醫(yī)藥組合物與可提高其生物可用性、降低和/或調(diào)節(jié)其代謝、抑制其排泄和/或調(diào)節(jié)其在身體中的分布的藥劑的組合傳遞。
本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可單獨投予或者與一種或多種其它治療劑組合投予?！芭c...組合”打算意味藥劑必須同時投予和/或調(diào)配用于一起傳遞，不過這些傳遞方法在本發(fā)明的范圍內(nèi)。組合物可與一種或多種其它所需治療劑或醫(yī)學(xué)程序同時投予、在所述其他治療劑或程序之前或之后投予。應(yīng)了解組合中所用的治療活性劑可同時以單一組合物形式投予或分別以不同組合物形式投予。一般來說，各藥劑將按照對于所述藥劑所規(guī)定的劑量和/或時間進(jìn)度來投予。
一般來說，預(yù)期組合利用的藥劑的利用含量不超過其個別利用時的含量。在一些實施例中，組合利用的含量將低于個別利用的含量。
在某些實施例中，與其它流感疫苗組合投予包含至少一種流感抗原多肽的疫苗組合物。在某些實施例中，與其它流感治療劑組合投予包含至少一種流感抗原多肽的疫苗組合物。在某些實施例中，與抗病毒藥物組合投予包含至少一種流感抗原多肽的疫苗組合物，所述抗病毒藥物為諸如神經(jīng)氨酸酶抑制劑(例如奧司他偉(oseltamivir)

扎那米韋(zanamivir)

和/或M2抑制劑(例如金剛烷、金剛烷衍生物、金剛乙胺等)。
試劑盒 一方面，本發(fā)明提供包括本發(fā)明的流感抗原多肽的醫(yī)藥包裝或試劑盒。在某些實施例中，醫(yī)藥包裝或試劑盒在一個或多個任選填充有本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的一種或多種其它成分的容器中包括產(chǎn)生本發(fā)明流感抗原多肽的植物、植物細(xì)胞和/或植物組織，或含有疫苗的制劑、提取物或醫(yī)藥組合物。在一些實施例中，醫(yī)藥包裝或試劑盒在一個或多個任選填充有本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的一種或多種其它成分的容器中包括包含本發(fā)明的經(jīng)純化流感抗原多肽的醫(yī)藥組合物。在某些實施例中，醫(yī)藥包裝或試劑盒包括其它獲準(zhǔn)用作組合療法的治療劑(例如流感抗原多肽、流感疫苗、流感治療劑)。任選與所述容器相關(guān)聯(lián)的可為呈由管理醫(yī)藥產(chǎn)品的制造、使用或銷售的政府機(jī)關(guān)所指定形式的告示，所述告示反映政府機(jī)關(guān)對用于人類投藥的制造、使用或銷售的批準(zhǔn)。
提供包括治療劑和/或預(yù)防劑的試劑盒。僅作為一個非限制性實例，可提供流感疫苗(例如以口服、可注射和/或鼻內(nèi)調(diào)配物形式)并作為療法投予。可在試劑盒中提供關(guān)于投予罹患流感感染或處于流感感染風(fēng)險中的個體的醫(yī)藥劑量或其說明書。
以下代表性實例打算幫助說明本發(fā)明，而不打算，也不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。實際上，根據(jù)本文獻(xiàn)的全部內(nèi)容，包括以下實例和本文中所引用的科學(xué)和專利文獻(xiàn)的參考，本發(fā)明的各種修改和除本文所示并描述的實施例外的許多其它實施例對于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將顯而易見。以下實例含有在本發(fā)明的各種實施例和其等效物中可適合于實施本發(fā)明的信息、例證和指南。
例證 實例1來自兩種H5N1流感病毒株的重組血細(xì)胞凝集素(HA)抗原 在本實例中，評估來自H5N1流感病毒株A/安徽/1/2005和A/斑頭雁/青海/1A/2005的兩種重組血細(xì)胞凝集素(HA)抗原作為疫苗候選物的免疫原性。這些植物產(chǎn)HA抗原具有免疫原性，在小鼠中產(chǎn)生高效價的血清血細(xì)胞凝集抑制(hemagglutination inhibition，HI)和病毒中和(virus neutralizing，VN)抗體。
根據(jù)圖2中呈示的流程在植物中制備HA抗原。將HA抗原克隆到“投放載體”系統(tǒng)中(參見例如，謬斯克(Musiychuk)等人，2007，流感和其它呼吸病毒(Influenza andOther Respiratory Viruses)，119-25；和PCT公開案WO 07/095304；兩者都以引用的方式并入本文中)，具體來說克隆到載體pGR-D4中(除了越南和懷俄明病毒株，pBI-D4)。來自克隆到投放載體中的A/安徽/1/2005(DQ371928)的HA的核苷酸序列為 5’


GATCAGATATGCATTG GATACCACGCTAACAACTCTACTGAGCAAGTGGATACAATTATGGAAAAGAACG TGACTGTTACTCACGCTCAGGATATTCTTGAAAAGACTCACAACGGAAAGTTGTG CGATCTTGATGGTGTTAAGCCACTTATTCTTAGGGACTGCAGTGTTGCTGGATGG CTTCTTGGAAACCCAATGTGCGATGAGTTCATTAACGTGCCAGAGTGGTCTTATA TTGTGGAGAAGGCTAACCCAGCTAACGATCTTTGCTACCCAGGAAACTTCAACGA TTACGAAGAGCTTAAGCACCTTCTTTCTAGGATTAACCACTTCGAGAAGATTCAG ATTATTCCAAAGTCATCTTGGAGTGATCACGAGGCTTCATCTGGTGTTTCTTCAGC TTGCCCATACCAAGGTACTCCATCTTTCTTCAGGAACGTTGTTTGGCTTATTAAGA AGAACAACACTTACCCAACTATTAAGAGGTCTTACAACAACACTAACCAGGAAG ATTTGCTTATTCTTTGGGGAATTCACCACTCTAATGATGCTGCTGAACAGACTAA GTTGTACCAGAACCCAACTACTTACATTTCTGTGGGAACTTCTACTCTTAACCAG AGGCTTGTGCCAAAGATTGCTACTAGGTCTAAGGTGAACGGACAATCTGGAAGG ATGGATTTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAACGATGCTATTAACTTCGAGTCTAA CGGAAACTTCATTGCTCCAGAGTACGCTTACAAGATTGTGAAGAAAGGTGATAG TGCTATTGTGAAGTCTGAGGTGGAGTACGGAAACTGTAACACTAAGTGCCAGAC TCCAATTGGAGCTATTAACTCTTCTATGCCATTCCACAACATTCACCCACTTACTA TTGGAGAGTGCCCAAAGTACGTGAAGTCTAACAAGTTGGTGCTTGCTACTGGACT TAGGAACTCTCCACTTAGAGAGAGAAGAAGAAAGAGGGGACTTTTCGGAGCTAT TGCTGGATTCATTGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATA CCATCACTCTAATGAGCAGGGATCTGGATATGCTGCTGATAAGGAATCTACTCAG AAAGCTATTGATGGTGTTACTAACAAGGTGAACTCTATTATTGATAAGATGAACA CTCAGTTCGAAGCTGTTGGAAGAGAGTTCAACAACCTTGAGAGAAGGATTGAGA ACCTTAACAAGAAAATGGAAGATGGATTCCTTGATGTGTGGACTTACAACGCTG AGTTGCTTGTGCTTATGGAAAACGAGAGGACTCTTGATTTCCACGATTCTAACGT GAAGAACCTTTACGATAAAGTGAGGCTTCAGCTTAGGGATAACGCTAAAGAGCT TGGAAACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGATAACGAGTGCATGGAATCT GTTAGGAACGGAACTTACGATTACCCACAGTACTCTGAAGAAGCTAGGCTTAAG AGGGAAGAGATTTCTGGTGTTAAGTTGGAGTCTATTGGAACTTACCAGATTC


TGA 3’(SEQ IDNO84). 應(yīng)注意對于以上SEQ ID NO84，對于說明書中的所有序列來說，粗體/下劃線部分對應(yīng)于信號肽序列，而斜體/下劃線部分對應(yīng)于6×His標(biāo)簽和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmicreticulum，ER)滯留信號。對于具有信號肽序列、6×His標(biāo)簽或ER滯留信號中的一個或多個的所有序列來說，本發(fā)明涵蓋缺乏信號肽序列、6×His標(biāo)簽、ER滯留信號、信號肽序列與6×His標(biāo)簽兩者、信號肽序列與ER滯留信號兩者、6×His標(biāo)簽與ER滯留信號兩者、和/或信號肽序列、6×His標(biāo)簽和ER滯留信號中全部三個的這些序列的任一個。
由SEQ ID NO84編碼的蛋白質(zhì)序列為 5’

DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVT VTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEK ANPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTP SFFRNVVWLIKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYIS VGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIV KKGDSAIVKSEVEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLAT GLRNSPLRERRRKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKEST QKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIFNLNKKMEDGFLDVWTYNAE LLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESV RNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQI

3’(SEQ IDNO85). 來自克隆到投放載體中的A/斑頭雁/青海/1A/2005(DQ137873)的HA的核苷酸序列為 5’


GATCAAAT CTGCATTGGTTACCATGCTAACAATTCTACTGAGCAAGTGGATACAATTATGGAA AAGAATGTGACTGTGACTCATGCTCAGGATATTCTTGAAAAGACTCATAATGGAA AGTTGTGCGATCTTGATGGTGTTAAGCCTCTTATTCTTAGGGACTGCAGTGTTGCT GGTTGGTTGCTTGGAAATCCTATGTGCGATGAGTTCCTTAATGTGCCTGAGTGGT CTTACATTGTGGAGAAGATTAATCCTGCTAATGATCTTTGCTACCCTGGAAATTTC AATGATTACGAAGAGCTTAAACATCTTCTTTCTAGGATTAATCATTTCGAGAAGA TTCAGATTATTCCTAAGTCATCTTGGAGTGATCATGAGGCTTCATCTGGTGTTTCT TCAGCTTGCCCTTATCAGGGAAGGTCATCTTTCTTCAGGAATGTTGTTTGGCTTAT TAAGAAGAATAACGCTTACCCTACTATTAAGAGGTCTTACAACAATACTAATCAG GAGGATCTTCTTGTTCTTTGGGGTATTCATCATCCTAATGATGCTGCTGAACAGAC TAGGCTTTACCAGAATCCTACTACTTACATTTCTGTGGGAACTTCTACTCTTAATC AGAGGCTTGTGCCTAAGATTGCTACTAGGTCTAAAGTGAATGGTCAGTCTGGAAG GATGGAATTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAATGATGCTATTAATTTCGAGTCTA ATGGAAATTTCATTGCTCCTGAGAATGCTTACAAGATTGTGAAGAAGGGTGATAG TACTATTATGAAGTCTGAGCTTGAGTACGGTAATTGCAATACTAAGTGCCAGACT CCTATTGGTGCTATTAATTCTTCTATGCCTTTCCATAATATTCATCCTCTTACTATT GGTGAGTGCCCTAAGTACGTGAAGTCTAATAGGCTTGTGCTTGCTACTGGTCTTA GGAATTCTCCTCAGGGTGAAAGAAGAAGAAAGAAGAGGGGACTTTTCGGAGCTA TTGCTGGTTTTATTGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTTGATGGTTGGTACGGTTA CCATCATTCTAATGAGCAGGGTTCTGGTTATGCTGCTGATAAGGAATCTACTCAG AAAGCTATTGATGGTGTTACTAATAAGGTGAACTCTATTATTGATAAGATGAATA CTCAGTTCGAGGCTGTTGGTAGAGAGTTCAACAATCTTGAGAGAAGGATTGAGA ATCTTAATAAGAAAATGGAAGATGGTTTCCTTGATGTGTGGACTTACAATGCTGA GTTGCTTGTGCTTATGGAAAATGAGAGGACTCTTGATTTCCATGATTCTAATGTG AAGAATCTTTACGATAAAGTGAGGCTTCAGCTTAGGGATAATGCTAAAGAACTT GGAAATGGTTGCTTCGAGTTCTACCATAGATGCGATAATGAGTGCATGGAATCTG TGAGGAATGGTACTTACGATTACCCTCAGTACTCTGAAGAAGCTAGGCTTAAGAG GGAAGAGATTTCTGGTGTTAAGTTGGAGTCTATTGGTACTTACCAGATT


TGATGA 3’(SEQ ID NO86). 由SEQ ID NO86編碼的蛋白質(zhì)序列為

DQICIGYHANNSTEQVDTIM EKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVPEW SYIVEKINPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACP YQGRSSFFRNVVWLIKKNNAYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQ NPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPE NAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSN RLVLATGLRNSPQGERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGY AADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERIENLNKKMEDGFLDV WTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHRCDN ECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQI

3’(SEQIDNO87). 接著將投放載體引入農(nóng)桿菌中并真空滲透到本塞姆氏煙草中。讓HA抗原表達(dá)并在收集前在植物生物質(zhì)中積累5-7天。
從植物生物質(zhì)純化重組HA抗原。簡單來說，在50mM NaPi(pH 8.0)、0.5M NaCl和20mM咪唑中溶解植物細(xì)胞。添加曲通(Triton)到0.5％的最終濃度并在4℃下培育20分鐘。在4℃下在78,000×g下離心提取物30分鐘或在4℃下在48,000×g下離心40分鐘。通過神奇濾布(Miracloth)過濾上清液，隨后加載到Ni-NTA管柱上。在一些情況下，利用切向流動過濾(tangential flow filtration，TFF)微量過濾步驟(0.1μm-0.2μm孔徑)再進(jìn)行任選澄清。將澄清的提取物加載到Ni-NTA管柱(用溶解緩沖液預(yù)平衡)上，并用緩沖液A(50mM NaPi(pH 7.5)、0.5M NaCl、20mM咪唑和0.5％曲通)充分洗滌管柱，隨后用緩沖液A1(與緩沖液A相同，但無曲通)洗滌。用咪唑洗脫蛋白質(zhì)。任選進(jìn)一步使用陰離子交換色譜法(Q管柱)或超濾法純化洗脫的蛋白質(zhì)。
圖3A呈示表達(dá)來自四種不同病毒株的全長H5HA(即，來自A/安徽/1/2005的H5抗原，“H5HA-A”或“HAA”；來自A/印度尼西亞/5/05的H5抗原，“H5HA-I”或“HAI”；來自A/斑頭雁/青海/1A/2005的H5抗原，“H5HA-Q”或“HAQ”；和來自A/越南/04的H5抗原，“H5HA-V”或“HAV”)的四種不同構(gòu)筑體的例示性表達(dá)數(shù)據(jù)。
來自克隆到投放載體中的A/印度尼西亞/5/05(ISDN125873)的HA的核苷酸序列為 5’


GATCAAATCTGCATTG GTTACCATGCTAACAATTCTACTGAGCAAGTGGATACAATTATGGAAAAGAATGT GACTGTGACTCATGCTCAGGATATTCTTGAAAAGACTCATAATGGAAAGTTGTGC GATCTTGATGGTGTTAAGCCTCTTATTCTTAGGGACTGCAGTGTTGCTGGTTGGTT GCTTGGAAATCCTATGTGCGATGAGTTCATTAATGTGCCTGAGTGGTCTTACATT GTGGAGAAGGCTAATCCTACTAATGATCTTTGCTACCCTGGTTCTTTCAATGATTA CGAAGAGCTTAAACATCTTCTTTCTAGGATTAATCATTTCGAGAAGATTCAGATT ATTCCTAAGTCATCTTGGAGTGATCATGAGGCTTCATCTGGTGTTTCTTCAGCTTG CCCTTACCTTGGATCTCCTTCTTTCTTCAGGAATGTTGTTTGGCTTATTAAGAAGA ATTCTACTTACCCTACTATTAAGAAGTCTTACAACAATACTAATCAGGAGGATCT TCTTGTTCTTTGGGGTATTCATCATCCTAATGATGCTGCTGAACAGACTAGGCTTT ACCAGAATCCTACTACTTACATTTCTATTGGTACTTCTACTCTTAATCAGAGGCTT GTGCCTAAGATTGCTACTAGGTCTAAAGTGAATGGTCAGTCTGGAAGGATGGAA TTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAATGATGCTATTAATTTCGAGTCTAATGGAAA TTTCATTGCTCCTGAGTACGCTTACAAGATTGTGAAGAAAGGTGATAGTGCTATT ATGAAGTCTGAGCTTGAGTACGGTAATTGCAATACTAAGTGCCAGACTCCTATGG GTGCTATTAATTCTTCTATGCCTTTCCATAATATTCATCCTCTTACTATTGGTGAGT GCCCTAAGTACGTGAAGTCTAATAGGCTTGTGCTTGCTACTGGTCTTAGGAATTC TCCTCAGAGAGAGTCTAGAAGAAAGAAGAGGGGACTTTTCGGAGCTATTGCTGG TTTTATTGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTTGATGGTTGGTATGGTTACCATCAT TCTAATGAGCAGGGTTCTGGTTATGCTGCTGATAAGGAATCTACTCAGAAAGCTA TTGATGGTGTTACTAATAAGGTGAACTCTATTATTGATAAGATGAATACTCAGTT CGAGGCTGTTGGTAGAGAGTTCAACAATCTTGAGAGAAGGATTGAGAATCTTAA TAAGAAAATGGAAGATGGTTTCCTTGATGTGTGGACTTACAATGCTGAGTTGCTT GTGCTTATGGAAAATGAGAGGACTCTTGATTTCCATGATTCTAATGTGAAGAATC TTTACGATAAAGTGAGACTTCAGCTTAGGGATAATGCTAAAGAACTTGGAAATG GTTGCTTCGAGTTCTACCATAAGTGCGATAATGAGTGCATGGAATCTATTAGGAA TGGTACTTACAATTACCCTCAGTACTCTGAAGAAGCTAGGCTTAAGAGGGAAGA GATTTCTGGTGTTAAGTTGGAGTCTATTGGAACTTACCAGATT


TGATGA 3’(SEQ ID NO88). 由SEQ ID NO88編碼的蛋白質(zhì)序列為 5’

DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVT VTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEK ANPTNDLCYPGSFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYLGSP SFFRNVVWLIKKNSTYPTIKKSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYI SIGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIV KKGDSAIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLA TGLRNSPQRESRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKE STQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYN AELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECME SIRNGTYNYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQI

3’(SEQIDNO89). 來自克隆到投放載體中的A/越南/04的HA的核苷酸序列為 5’


GATCAAATCTGCATTG GATACCACGCTAACAACTCTACTGAGCAAGTGGATACAATTATGGAAAAGAACG TGACTGTTACTCACGCTCAGGATATTCTTGAAAAGACTCACAACGGAAAGTTGTG CGATCTTGATGGTGTTAAGCCACTTATTCTTAGGGATTGCTCTGTTGCTGGATGGC TTCTTGGAAACCCAATGTGTGATGAGTTCATTAACGTGCCAGAGTGGTCTTATAT TGTGGAGAAGGCTAACCCAGTGAACGATCTTTGTTACCCTGGTGATTTCAACGAT TACGAAGAGCTTAAGCACCTTCTTTCTAGGATTAACCACTTCGAGAAGATTCAGA TTATTCCAAAGTCATCTTGGTCATCTCACGAGGCTTCTCTTGGAGTTTCTTCTGCT TGCCCATACCAGGGAAAGTCATCTTTCTTCAGGAACGTTGTTTGGCTTATTAAGA AGAACTCTACTTACCCAACTATTAAGAGGTCTTACAACAACACTAACCAGGAAG ATTTGCTTGTTCTTTGGGGAATTCACCACCCAAATGATGCTGCTGAACAGACTAA GTTGTACCAGAACCCAACTACTTACATTTCTGTGGGAACTTCTACTCTTAACCAG AGGCTTGTGCCAAGAATTGCTACTAGGTCTAAGGTGAACGGACAATCTGGAAGG ATGGAATTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAACGATGCTATTAACTTCGAGTCTA ACGGAAACTTCATTGCTCCAGAGTACGCTTACAAGATTGTGAAGAAGGGTGATA GTACTATTATGAAGTCTGAGCTTGAGTACGGAAACTGCAACACTAAGTGCCAAA CTCCAATGGGAGCTATTAACTCTTCTATGCCATTCCACAACATTCACCCACTTACT ATTGGAGAGTGCCCAAAGTACGTGAAGTCTAACAGGCTTGTGCTTGCTACTGGAC TTAGGAATTCTCCACAGAGAGAAAGAAGAAGAAAGAAAAGGGGACTTTTCGGA GCTATTGCTGGATTCATTGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTTGATGGATGGTAT GGATACCATCACTCTAATGAGCAGGGATCTGGATATGCTGCTGACAAAGAATCT ACTCAGAAAGCTATTGACGGTGTTACTAACAAGGTGAACTCTATTATTGATAAGA TGAACACTCAGTTCGAAGCTGTTGGAAGAGAGTTCAACAACCTTGAGAGAAGGA TTGAGAACCTTAACAAGAAAATGGAAGATGGATTCCTTGATGTGTGGACTTACA ACGCTGAGTTGCTTGTGCTTATGGAAAACGAGAGGACTCTTGATTTCCACGATTC TAACGTGAAGAACCTTTACGACAAAGTGAGGCTTCAGCTTAGGGATAACGCTAA AGAGCTTGGAAACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGATAACGAGTGCAT GGAATCTGTTAGGAACGGAACTTACGATTACCCACAGTACTCTGAAGAAGCTAG GCTTAAGAGGGAAGAGATTTCTGGTGTTAAGTTGGAGTCTATTGGTATCTACCAG ATT

TGA 3’(SEQ ID NO90). 由SEQ ID NO90編碼的蛋白質(zhì)序列為 5’

DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVT VTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEK ANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKS SFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYI SVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKI VKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVL ATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADK ESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTY NAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECM ESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQI

3’(SEQ ID NO91). 來自克隆到投放載體中的類B/馬來西亞/2506/2004的HA的核苷酸序列為 5’


ATCTGCACTGGAATTA CTTCATCTAACTCTCCACACGTGGTTAAGACTGCTACTCAGGGTGAAGTTAACGT GACTGGTGTTATTCCACTTACTACTACTCCAACTAAGTCTCACTTCGCTAACCTTA AGGGAACTGAGACTAGAGGAAAGTTGTGCCCAAAGTGCCTTAACTGCACTGATC TTGATGTTGCTCTTGGAAGGCCAAAGTGCACTGGAAACATTCCATCTGCTAGGGT GTCAATTCTTCACGAAGTGAGGCCAGTTACTTCTGGATGCTTCCCAATTATGCAC GATAGGACTAAGATTAGGCAGCTTCCAAACCTTCTTAGGGGATACGAGCACATT AGGCTTTCTACTCACAACGTGATTAACGCTGAGAATGCTCCAGGTGGACCATACA AGATTGGAACTTCAGGATCTTGCCCAAACGTGACTAACGGAAACGGATTCTTCGC TACTATGGCTTGGGCTGTGCCAAAGAACGATAACAACAAGACTGCTACAAACTC TCTTACTATTGAGGTTCCTTACATCTGTACTGAGGGTGAAGATCAGATTACTGTGT GGGGATTCCACTCTGATAACGAGACTCAGATGGCTAAGTTGTACGGTGATTCTAA GCCACAGAAGTTCACTTCATCTGCTAACGGTGTTACTACTCACTACGTGTCTCAG ATTGGAGGATTCCCAAACCAGACTGAGGATGGTGGACTTCCACAATCTGGAAGG ATTGTGGTGGATTACATGGTTCAGAAGTCTGGAAAGACTGGAACTATTACTTACC AGAGGGGTATTCTTCTTCCACAGAAAGTGTGGTGTGCTTCTGGAAGGTCTAAAGT GATTAAGGGATCTCTTCCACTTATTGGAGAGGCTGATTGCCTTCATGAGAAGTAC GGTGGACTTAACAAGTCTAAGCCTTACTACACTGGTGAACACGCTAAGGCTATTG GAAACTGCCCAATTTGGGTTAAGACTCCACTTAAGTTGGCTAACGGAACTAAGTA TAGGCCACCTGCTAAGTTGCTTAAAGAGAGGGGATTCTTCGGAGCTATTGCTGGA TTTCTTGAGGGAGGATGGGAGGGAATGATTGCTGGATGGCACGGATATACTTCTC ATGGTGCTCACGGTGTTGCTGTTGCTGCTGATCTTAAGTCTACTCAAGAGGCTATT AACAAGATTACTAAGAACCTTAACTCTCTTTCTGAGCTTGAGGTGAAGAACCTTC AGAGACTTTCTGGTGCTATGGATGAGCTTCACAACGAGATTCTTGAGCTTGATGA GAAAGTGGATGATCTTAGGGCTGATACAATTTCTTCTCAGATTGAGCTTGCTGTG CTTCTTTCTAACGAGGGAATTATTAACTCTGAGGATGAGCACCTTCTTGCTCTTGA GAGGAAGTTGAAGAAGATGCTTGGACCATCTGCTGTTGAGATTGGAAACGGTTG CTTCGAGACTAAGCACAAGTGCAACCAGACTTGCCTTGATAGAATTGCTGCTGGA ACTTTCGATGCTGGTGAGTTCTCTCTTCCAACTTTCGATTCTCTTAACATTACTGC TGCTTCTCTTAACGATGATGGACTTGATAACCACACT


TGA 3’(SEQ ID NO92). 由SEQ ID NO92編碼的蛋白質(zhì)序列為 5’

ICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTG VIPLTTTPTKSHFANLKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGNIPSARVSILHE VRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSTHNVINAENAPGGPYKIGTSGSCPN VTNGNGFFATMAWAVPKNDNNKTATNSLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNETQM AKLYGDSKPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKSGK TGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEH AKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHG YTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILEL DEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFE TKHKCNQTCLDRIAAGTFDAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHT
3’(SEQ ID NO93). 圖3B呈示數(shù)種大范圍流行性和季節(jié)性流感病毒株的例示性表達(dá)數(shù)據(jù)。圖4使用ELISA分析證明圖3A中所示的植物產(chǎn)抗原的抗原性。這個分析通過用1μg/ml各H5HA蛋白涂布96孔板來進(jìn)行。接著使用抗A/安徽/01/05雪貂血清、抗A/印度尼西亞/05/2005雪貂血清、抗A/越南/1194/04HA綿羊抗血清或抗A/懷俄明/03/2003HA綿羊抗血清的1∶6000稀釋液檢測抗原。所有植物產(chǎn)H5HA都顯示與針對同源H5HA產(chǎn)生的抗血清而非針對A/懷俄明/03/03H3病毒產(chǎn)生的抗血清的特異性反應(yīng)性。這些結(jié)果表明植物產(chǎn)抗原經(jīng)適當(dāng)折疊且顯示確實的抗原性。
圖5呈示在植物中表達(dá)并從植物純化的兩種H5HA抗原(即H5HA-A和H5HA-Q)的庫馬斯凝膠和西方印跡法。具體來說，用投放載體滲透7天后，H5HA-Q和H5HA-A分別積累到每千克新鮮葉生物質(zhì)478mg和836mg。提取蛋白質(zhì)并利用西方印跡分析法，使用針對來自A/越南/1194/2004的HA所產(chǎn)生的綿羊血清進(jìn)行表征。
在10μg Quil A存在下用H5HA-Q或H5HA-A皮下免疫各組8周齡雌性Balb/c小鼠(圖6)。在第0天、第14天和第28天施以免疫。在第21天和第35天，從小鼠分離血清并進(jìn)行血細(xì)胞凝集抑制(HI)和病毒中和(VN)分析(基本上如以下實例2中所述進(jìn)行)。如圖7A中所示，來自用植物中產(chǎn)生的A/安徽/01/05或A/斑頭雁/青海/1A/05HA免疫的小鼠的血清顯示顯著血細(xì)胞凝集抑制活性，即使當(dāng)用低至5μg劑量的抗原免疫小鼠時。如圖7B中所示，來自用植物中產(chǎn)生的A/安徽/01/05或A/斑頭雁/青海/1A/05HA免疫的小鼠的血清顯示顯著病毒中和活性，即使當(dāng)用低至5μg劑量的抗原免疫小鼠時。也用低至2.5μg和1μg HAA劑量的抗原免疫小鼠。圖8顯示植物產(chǎn)HA在低至1μg的劑量下引發(fā)高效價的HI。
實例2作為季節(jié)性流感疫苗候選物的植物表達(dá)的H3HA 將全長血細(xì)胞凝集素(HA)蛋白工程改造，表達(dá)并從植物中的流感A/懷俄明/03/03(H3N2)病毒株純化(圖9)。通過ELISA和單輻射免疫擴(kuò)散(single-radialimmunodiffusion，SRID)分析證實植物產(chǎn)HA的抗原性(圖9)。用植物產(chǎn)HA免疫小鼠會產(chǎn)生HA特異性體液(IgG1、IgG2a和IgG2b)和細(xì)胞(IFNγ和IL-5)免疫反應(yīng)(圖10和11)。另外，使用低至5μg的抗原劑量獲得顯著血清血細(xì)胞凝集抑制(HI)和病毒中和(VN)抗體效價(圖12)。這些結(jié)果證明植物產(chǎn)HA蛋白具有抗原性且可在小鼠中誘導(dǎo)與保護(hù)有關(guān)的免疫反應(yīng)。
材料與方法 流感HA的克隆、表達(dá)和純化 優(yōu)化編碼流感病毒的A/懷俄明/03/03病毒株的氨基酸17-532的HA序列以供在植物中表達(dá)且所述序列由GENEART AG(德國雷根斯堡(Regensburg，Germany))合成。在合成期間，將編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(KDEL)和多聚組氨酸親和純化標(biāo)簽(6×His)的序列包括在C端中。接著將所得NA序列H3HAwy克隆到投放載體pBID4中(謬斯克(Musiychuk)等人，2007，流感和其它呼吸病毒(Influenza and Other RespiratoryViruses)，1∶1；以引用的方式并入本文中)，獲得pBID4-H3HAwy。接著通過電穿孔將pBID4-H3HAwy引入根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101中。通過用含有pBID4-H3HAwy的GV3101進(jìn)行農(nóng)桿菌滲透來達(dá)成H3HAwy在溫室生長的6周齡本塞姆氏煙草葉中的表達(dá)。在農(nóng)桿菌滲透后7天收集組織并相繼采用固定金屬離子親和色譜法和陰離子交換色譜法純化植物產(chǎn)H3HAwy(ppH3HAwy)。
克隆到投放載體中的來自A/懷俄明/03/03(AAT08000)的HA的核苷酸序列為 5’


T GCCAGGAAACGATAACTCTACTGCTACTCTTTGCCTTGGACATCACGCTGTTCCA AACGGAACTATTGTGAAAACTATTACTAACGATCAGATTGAGGTGACAAACGCT ACTGAGCTTGTTCAGTCATCTTCTACTGGAGGAATTTGCGATTCTCCACACCAGA TTCTTGATGGAGAGAACTGCACTCTTATTGATGCTCTTCTTGGAGATCCACAGTG CGATGGATTCCAGAACAAGAAGTGGGATCTTTTCGTGGAAAGGTCTAAGGCTTA CTCTAACTGCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCTCTTAGGAGTCTTGTGG CTTCTTCTGGAACTCTTGAGTTCAACAACGAGTCTTTCAACTGGGCTGGAGTTACT CAGAACGGAACTTCTTCTGCTTGTAAGAGGAGGTCTAACAAGTCTTTCTTCTCTA GGCTTAACTGGCTTACTCACCTTAAGTACAAGTACCCAGCTCTTAACGTGACTAT GCCAAACAACGAGAAGTTCGATAAGTTGTACATTTGGGGAGTTCACCACCCAGTT ACTGATTCTGATCAGATTTCTCTTTACGCTCAGGCTTCTGGAAGGATTACTGTGTC TACTAAGAGGTCTCAGCAGACTGTGATTCCAAACATTGGATACCGTCCAAGAGTG AGGGATATTTCTTCTAGGATTTCTATCTACTGGACTATTGTGAAGCCAGGAGATA TTCTTCTTATTAACTCTACTGGAAACCTTATTGCTCCAAGGGGATACTTCAAGATT AGGAGTGGAAAGTCATCTATTATGAGGAGTGATGCTCCAATTGGAAAGTGCAAC TCTGAGTGCATTACTCCAAACGGATCTATTCCAAACGATAAGCCATTCCAGAACG TGAACAGGATTACTTATGGAGCTTGCCCAAGATACGTGAAGCAGAACACTCTTA AGTTGGCTACTGGAATGAGGAATGTGCCAGAGAAGCAGACTAGGGGAATTTTCG GAGCTATTGCTGGATTCATTGAGAATGGATGGGAGGGAATGGTTGATGGATGGT ACGGATTCAGGCACCAGAATTCAGAGGGAACTGGACAAGCTGCTGATCTTAAGT CTACTCAGGCTGCTATTAACCAGATTAACGGAAAGTTGAACAGGCTTATTGGAAA GACTAACGAGAAGTTCCACCAGATTGAGAAGGAGTTCTCTGAGGTTGAGGGAAG GATTCAGGATCTTGAGAAGTACGTGGAGGATACAAAGATTGATCTTTGGTCTTAC AACGCTGAGCTTCTTGTTGCTCTTGAGAACCAGCACACTATTGATTTGACTGATTC TGAGATGAACAAGTTGTTCGAGAGGACTAAGAAGCAGCTTAGGGAGAACGCTGA GGATATGGGAAATGGATGCTTCAAAATCTACCACAAGTGCGATAACGCTTGCATT GAGTCTATTAGGAACGGAACTTACGATCACGATGTGTACCGTGATGAGGCTCTTA ACAACAGGTTCCAGATTAAGGGAGTGGAGCTTAAGTCTGGATACAAGGATTGGA TTCTT

TGATGA(SEQ ID NO94). 由SEQ ID NO94編碼的蛋白質(zhì)序列為 5’

QKLPGNDNSTATLCLGHH AVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGGICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCD GFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWAGVTQN GTSSACKRRSNKSFFSRLNWLTHLKYKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPVTDS DQISLYAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGYRPRVRDISSRISIYWTIVKPGDILLINSTGN LIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVK QNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGTGQAA DLKSTQAAINQINGKL NRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSY NAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIES IRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWIL

(SEQ ID NO95). 純化的ppH3HAwy的西方印跡法分析和ELISA 為表征植物產(chǎn)HA，將從經(jīng)滲透的本塞姆氏煙草葉純化的ppH3HAwy在10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(馬薩諸塞州比爾里卡的密理博公司(Millipore，Billerica，MA))上并用0.5％I-block(加利福尼亞州福斯特城的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA))阻斷。接著將所述膜相繼與針對HA(NIBSC，編號03/212)所產(chǎn)生的綿羊抗血清和結(jié)合辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)的兔抗綿羊抗體(亞拉巴馬州蒙哥馬利的貝斯實驗室公司(BethylLaboratory Inc.，Montgomery，TX))一起培育。使用SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物(伊利諾斯州洛克福特的皮爾斯公司(Pierce，Rockford，IL))顯現(xiàn)與抗HA抗體反應(yīng)的蛋白質(zhì)。使用GeneGnome上的GeneSnap軟件(馬里蘭州弗雷德里克的凝膠成像公司(Syngene Bioimaging，F(xiàn)rederick，MD))記錄結(jié)果。使用雞蛋產(chǎn)生且經(jīng)福爾馬林(formalin)滅活的A/懷俄明/03/03病毒(iA/Wyo，NIBSC，英國赫特福德(Hertforshire UK)，編號03/220)作為陽性對照組。對于ELISA，用1μg/ml純化的ppH3HAwy或用iA/Wyo涂布96孔MaxiSorp板(能肯公司(NUNC)，紐約州羅徹斯特(Rochester，NY))。將培養(yǎng)板與針對來自A/懷俄明/03/03病毒的HA(NIBSC，編號03/212)或NA(NIBSC，編號04/258)所產(chǎn)生的綿羊抗血清的1∶1600稀釋液一起培育并使用兔抗綿羊IgG-HRP抗體(貝斯實驗室公司(Bethyl Laboratory Inc.))檢測。
單輻射免疫擴(kuò)散分析(SRID) 使用略微修改的如席爾德(Schild)等人(1975，世界衛(wèi)生組織公報(Bull.WorldHealth Org.)，52223-31；以引用的方式并入本文中)所述的SRID分析測定ppH3HAwy的濃度。使用針對純化的A/懷俄明/03/03HA和iA/Wyo(含有50μg/ml HA)所產(chǎn)生的綿羊抗血清作為參考試劑。用連續(xù)稀釋的1％(w/v)兩性洗滌劑3-14(美國拉霍亞的卡氏生物化學(xué)-貝林公司(Calbiochem-Behring，La Jolla，USA))處理ppH3HAwy和iA/Wyo，加載到含有參考綿羊抗HA血清的預(yù)制備的1％瓊脂糖凝膠的孔中，并讓其擴(kuò)散48小時。在室溫下在PBS中培育瓊脂糖凝膠24小時以去除未結(jié)合的抗原和血清組分。接著用庫馬斯藍(lán)(伊利諾斯州洛克福特的皮爾斯公司(Pierce，Rockford，IL))將凝膠染色，測量沉淀環(huán)的直徑，并測定抗原濃度。
用ppH3HAwy免疫小鼠 以2周時間間隔，在第0天、第14天、第28天，用ppH3HAwy皮下免疫各組8周齡Balb/c小鼠(每組6只小鼠)。測試三種不同抗原劑量每劑30μg、10μg和5μgppH3HAwy。對照組動物接受iA/Wyo(每劑約5μgHA)或PBS。通過添加10μg Quil A(紐約州韋斯特伯里的精細(xì)化學(xué)公司(Accurate Chemical，Westbury，NY))來進(jìn)行所有免疫。在每次免疫之前和在第三次劑量后兩周收集血清樣品。
表征免疫反應(yīng) 血清抗體反應(yīng) 利用ELISA，使用涂有1.0μg/ml iA/Wyo的96孔MaxiSorp板(能肯公司(NUNC)，紐約州羅徹斯特(Rochester，NY))測量HA特異性血清抗體反應(yīng)。用連續(xù)四倍稀釋液檢驗血清樣品并使用結(jié)合HRP的山羊抗小鼠IgG(賓夕法尼亞州西格羅夫的杰克遜免疫研究實驗室公司(Jackson Immunoresearch Laboratory Inc.，West Grove，PA.))檢測抗原特異性抗體(圖10)。使用與HRP結(jié)合的山羊抗小鼠IgG1、IgG2a或IgG2b作為二次抗體(阿拉巴馬州伯明翰的南方生物技術(shù)聯(lián)合公司(Southern Biotechnology AssociatesInc.，Birmingham，AL))來測定IgG抗體亞型的效價(圖11)。產(chǎn)生三倍于來自1∶50稀釋度下免疫前血清的值的平均OD值的血清稀釋度的倒數(shù)確定為終點效價。
ELISPOT分析 通過略微修改的如齊切斯特(Chichester)等人(2006，免疫方法雜志(J.Immunol.Methods)，30999-107；以引用的方式并入本文中)中所述的ELISPOT分析來自經(jīng)pptH3HAwy免疫的小鼠的脾細(xì)胞中分泌干擾素-γ(interferon-γ，IFNγ)和白細(xì)胞介素-5(interleukin-5，IL-5)的細(xì)胞的頻率(圖11)。簡單來說，在第42天從經(jīng)iA/Wyo或ppH3HAwy免疫的小鼠收集脾并均質(zhì)化成單細(xì)胞懸浮液。使用ACK緩沖液溶解紅細(xì)胞。將脾細(xì)胞涂鋪在涂有IFNγ或抗IL-5單克隆抗體(馬薩諸塞州貝德福德的密理博公司(Millipore，Bedford，MA))的MultiScreen-IP板(加利福尼亞州圣地亞哥的BDPharmingen公司(BD Pharmingen，San Diego，CA))中并在活體外用5μg/ml昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生的A/懷俄明/03/03HA(康涅狄格州梅里登的蛋白質(zhì)科學(xué)公司(Protein Sciences，Meriden，CT))進(jìn)行刺激。在37℃下培育培養(yǎng)板48小時，隨后丟棄細(xì)胞并將生物素標(biāo)記的抗IFNγ或抗IL-5(BD Pharmingen)添加到各孔中。相繼使用抗生蛋白鏈菌素-堿性磷酸酶和NBT/BCIP(皮爾斯公司(Pierce))顯現(xiàn)斑點。數(shù)據(jù)以每106個細(xì)胞中斑點形成細(xì)胞(spot-forming cell，SFC)的平均數(shù)目表示。
血細(xì)胞凝集抑制(HI)和病毒中和(VN)分析 用破壞受體的酶(receptor-destroying enzyme，RDE；日本東京的生研公司(DenkaSeiken Co.Ltd.，Tokyo，Japan))處理來自經(jīng)免疫小鼠的血清樣品并如先前所述用0.75％火雞紅細(xì)胞進(jìn)行HI分析(羅(Rowe)等人，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.)，37937-43；以引用的方式并入本文中)。如先前所述(羅(Rowe)等人，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.)，37937-43)，但經(jīng)以下改變，進(jìn)行微量中和分析。將MDCK細(xì)胞以每孔3×104個細(xì)胞涂鋪在96孔組織培養(yǎng)板中，并在37℃下培育18小時。同時，連續(xù)稀釋經(jīng)RDE處理的血清樣品并與等體積的2×103TCID50/ml的A/懷俄明/03/03流感病毒混合。在37℃下培育1小時后，將血清-病毒混合物添加到所涂的MDCK細(xì)胞中并進(jìn)一步培育18小時。接著用PBS洗滌培養(yǎng)板并用80％丙酮固定。如先前所述，通過ELISA測定各樣品的中和終點效價(羅(Rowe)等人，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.)，37937-43；以引用的方式并入本文中)。
統(tǒng)計分析 使用方差相等的雙尾t檢驗(two-tailed t test)進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析且在p值＜0.05時認(rèn)為有顯著性。指定無可檢測IgG、HI或VN效價的樣品的統(tǒng)計分析值為25、5或10(檢測極限分別為50、10或20)。
結(jié)果和討論 ppH3HAwy的表達(dá)和活體外表征 為了鑒別目標(biāo)表達(dá)的峰值和測定收集生物質(zhì)的最佳時間，執(zhí)行如下時程。滲透后7天，將ppH3HAwy積累到每千克新鮮葉組織約200mg的時候確定為收集時間。接著純化目標(biāo)蛋白質(zhì)且用西方印跡法、ELISA和SRID來表征。圖9A(泳道3)展示尺寸為約83kDa的蛋白質(zhì)條帶，其由綿羊抗HA血清特異性識別。進(jìn)行ELISA和SRID以進(jìn)一步表征ppH3HAwy的抗原性。在ELISA分析中，ppH3HAwy顯示與針對同源HA而非NA所產(chǎn)生的綿羊抗血清具有特異性反應(yīng)性(圖9B)。如圖9C中的SRID凝膠所示，ppH3HAwy擴(kuò)散環(huán)的尺寸等于加載有iA/Wyo的孔周圍的擴(kuò)散環(huán)，這表明ppH3HAwy有抗原性活性。這些數(shù)據(jù)共同證明ppH3HAwy經(jīng)適當(dāng)折疊且顯示確實的抗原性。
ppH3HAwy的活體內(nèi)表征 在小鼠中評估ppH3HAwy的免疫原性。分析在第二劑和第三劑抗原后收集的血清樣品的目標(biāo)特異性抗體反應(yīng)。如圖10中所示，對于所測試的所有劑量，在第一次抗原加強后都觀察到高血清IgG效價。在第二次抗原加強后這些效價進(jìn)一步增強，達(dá)到與iA/Wyo所觀察到的水平相當(dāng)?shù)乃健Ｓ?0、10或5μg劑量的ppH3HAwy引發(fā)的血清IgG水平?jīng)]有顯著不同。由于這些發(fā)現(xiàn)，免疫反應(yīng)的進(jìn)一步表征限于那些用5μg劑量的抗原免疫的動物。對A/懷俄明/03/03具有特異性的血清IgG亞型的分析揭露用ppH3HAwy進(jìn)行免疫會產(chǎn)生IgG1、IgG2a和IgG2b抗體反應(yīng)(圖11A)，從而表明Th1與Th2反應(yīng)都得到刺激。這進(jìn)一步由ELISPOT數(shù)據(jù)支持，ELISPOT數(shù)據(jù)顯示在活體外用昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生的同源HA再刺激后來自經(jīng)ppH3HAwy免疫的小鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ和IL-5(圖11B和11C)。在流感病毒感染中，IgG1抗體亞型在病毒中和和保護(hù)中起關(guān)鍵作用，而IgG2a抗體亞型與病毒清除相關(guān)(休伯(Huber)等人，2006，臨床疫苗免疫(Clin.Vaccine Immunol.)，13981-90；以引用的方式并入本文中)。因此，刺激IgG1與IgG2a對于有效流感疫苗開發(fā)都很重要。攻毒研究將進(jìn)一步說明IgG亞型對針對流感感染的保護(hù)性免疫性的潛在幫助。
為檢驗由ppH3HAwy所產(chǎn)生的抗體的功能性功效，對來自接種疫苗小鼠的血清樣品進(jìn)行HI和VN分析。在第一次抗原加強后所有接受30μg ppH3HAwy的動物都具有高于40的血清HI效價(圖12A)，而在接受10μg或5μg劑量的抗原的各組小鼠中，6只動物中有5只具有高于40的血清HI抗體效價。第二次抗原加強后，所有用ppH3HAwy免疫的組中的所有動物都具有高于160的血清HI抗體效價(圖12A)，并且在一些動物中效價達(dá)到2560。
為進(jìn)一步表征由ppH3HAwy所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，測量血清VN抗體效價(圖12B)。血清VN效價與血清HI效價相關(guān)性良好。第二次加強后，所有用ppH3HAwy免疫的小鼠針對A/懷俄明/03/03病毒的VN效價都大于等于640，達(dá)到與來自用iA/Wyo免疫的小鼠的血清所觀察到的水平類似的水平(圖12B)。當(dāng)在第二次加強后1個月評估時，HI和VN抗體效價保持在這一高水平。這些數(shù)據(jù)證明ppH3HAwy在小鼠中具有免疫原性，誘導(dǎo)針對低至5μg劑量的同源H3N2流感病毒的HI和VN抗體反應(yīng)。高于40的HI效價通常視為與在人類中的保護(hù)性免疫性一致的最小效價(霍布森(Hobson)等人，1972，衛(wèi)生學(xué)雜志(J.Hyg.)(倫敦(Lond.))，70767-77；以引用的方式并入本文中)。由于由ppH3HAwy所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)的品質(zhì)，尤其是甚至在第一次抗原加強后都能觀察到高HI和VN效價，因此本發(fā)明涵蓋如下認(rèn)識，植物產(chǎn)抗原可適用于開發(fā)有效用于人類的流感疫苗。ppH3HAwy顯示確實的抗原性且當(dāng)與Quil A一起投予時誘導(dǎo)小鼠的抗病毒抗體反應(yīng)。Quil A廣泛用作獸醫(yī)疫苗中的佐劑且已顯示增強細(xì)胞以及體液免疫反應(yīng)(片山(Katayama)和麥恩(Mine)，2006，農(nóng)業(yè)與食品化學(xué)雜志(J.Agric.Food Chem.)，543271-6；以引用的方式并入本文中)。另外，已提出將基于皂角苷的佐劑(諸如QuilA)用于人類且目前正在臨床試驗中進(jìn)行評估(巴烏克(Mbawuike)等人，2007，疫苗(Vaccine)，253263-9；和薩巴蒂尼(Sabbatini)等人，2007，臨床癌癥研究(Clin.CancerRes.)，134170-7；兩者都以引用的方式并入本文中)。然而，本發(fā)明涵蓋如下認(rèn)識，可利用諸如明礬或鋁膠等任何佐劑。實際上，在本發(fā)明的研究中，共投予鋁膠與ppH3HAwy產(chǎn)生低血清IgG和HI效價。
總的來說，本發(fā)明涵蓋如下認(rèn)識，植物產(chǎn)HA抗原可適用于開發(fā)流感疫苗。
實例3來自A/印度尼西亞/05/05的植物產(chǎn)HA保護(hù)雪貂免受同源攻毒感染 本實例證明本塞姆氏煙草植物中產(chǎn)生的來自A/印度尼西亞/5/2005的重組HA的免疫原性和保護(hù)性功效。這種植物產(chǎn)HA抗原在小鼠中誘導(dǎo)血清血細(xì)胞凝集抑制(HI)和病毒中和(VN)抗體效價。此外，用這種植物產(chǎn)HA免疫雪貂可防止同源病毒攻毒。因此，本發(fā)明涵蓋如下認(rèn)識，植物產(chǎn)HA抗原可適用于開發(fā)用于人類的流感疫苗。
圖13概述在植物中制備HA抗原的通用流程。通常如圖2和實例1中所示，在植物中制備H5HA-I抗原。將H5HA-I抗原克隆到“投放載體”系統(tǒng)中(參見例如，謬斯克(Musiychuk)等人，2007，流感和其它呼吸病毒(Influenza and Other RespiratoryViruses)，119-25；和PCT公開案WO 07/095304；兩者都以引用的方式并入本文中)，具體來說克隆到載體pGR-D4中。接著將投放載體真空滲透到本塞姆氏煙草中并讓HA抗原表達(dá)并積累在植物生物質(zhì)中。用投放載體滲透后7天，H5HA-I積累到每千克新鮮葉生物質(zhì)約800mg。
基本上如實例1中所述，從植物生物質(zhì)純化重組HA抗原。提取蛋白質(zhì)并通過庫馬斯染色(圖14A)，通過使用小鼠抗His抗體的西方印跡法分析法，(圖14B)，和通過使用針對A/印度尼西亞/05/05的雪貂抗血清或針對A/懷俄明/03/03的綿羊抗血清的ELISA(圖14C)來表征。
以2周時間間隔，在第0天、第14天和第28天，用每劑45μg、30μg、15μg或5μg植物產(chǎn)H5HA-I皮下免疫小鼠。在第21天和第35天，從小鼠分離血清并進(jìn)行血細(xì)胞凝集抑制(HI)和病毒中和(VN)分析(基本上如以下實例2中所述進(jìn)行)。如圖15A中所示，來自用植物中產(chǎn)生的A/印度尼西亞/05/05HA免疫的小鼠的血清顯示顯著血細(xì)胞凝集抑制活性，即使當(dāng)用低至15μg劑量的抗原免疫小鼠時。如圖15B中所示，來自用植物中產(chǎn)生的A/印度尼西亞/05/05HA免疫的小鼠的血清顯示病毒中和活性，即使當(dāng)用低至15μg劑量的抗原免疫小鼠時。
以2周時間間隔，在第0天、第14天和第28天，用每劑90μg或45μg的H5HA-I皮下免疫雪貂。在最后免疫后10天，用10FLD50的A/印度尼西亞/05/05對雪貂進(jìn)行鼻內(nèi)攻毒。如圖16A中所示、來自用植物中產(chǎn)生的A/印度尼西亞/05/05HA免疫的雪貂的血清顯示顯著血細(xì)胞凝集抑制活性。圖16B展示攻毒后雪貂的存活百分比。圖16C展示攻毒后8天雪貂的體重變化百分比。圖16D展示攻毒后4天雪貂鼻洗滌液中的病毒效價。
總之，來自A/印度尼西亞/05/05的重組HA(H5HA-I)成功地在植物中制備。植物產(chǎn)H5HA-I在小鼠中誘導(dǎo)高效價的血清HI和VN抗體。用植物產(chǎn)H5HA-I進(jìn)行免疫可保護(hù)雪貂免受A/印度尼西亞/05/05的攻毒感染?；谶@些數(shù)據(jù)，本發(fā)明涵蓋如下認(rèn)識，植物產(chǎn)HA抗原可適用于開發(fā)用于人類的疫苗。
實例4來自布里斯班病毒株的重組血細(xì)胞凝集素(HA)抗原 將全長血細(xì)胞凝集素(HA)蛋白工程改造，表達(dá)并從植物中的流感的A/布里斯班/10e/2007(“HAB1-H3”)、A/布里斯班/59/07(“HAB1-H1”)、B/布里斯班/3/07(“HAB1-B”)和B/佛羅里達(dá)/4/2006(“HAF1-B”)病毒株純化(圖17)。用植物產(chǎn)HAB1-H3和HAB1-H1免疫小鼠(圖18)會導(dǎo)致產(chǎn)生IgG抗體(圖19和21)，以及顯著血清血細(xì)胞凝集抑制(HI)(圖20和22)和病毒中和(VN)抗體效價。這些結(jié)果證明植物產(chǎn)HA蛋白具有抗原性且可在小鼠中誘導(dǎo)與保護(hù)有關(guān)的免疫反應(yīng)。
材料與方法 在植物中制備蛋白質(zhì) 克隆到投放載體中的來自A/布里斯班/10e/2007(“HAB1-H3”)的HA的核苷酸序列為 5’


CAAAAGTTGCCTGGA AACGATAATTCTACCGCTACCCTTTGCCTTGGTCATCATGCTGTTCCTAACGGAAC CATTGTGAAAACCATTACCAACGATCAGATTGAGGTGACCAATGCTACTGAGCTT GTTCAGTCATCTTCTACCGGTGAAATTTGCGATTCTCCTCACCAGATTCTTGATGG TGAAAACTGCACCCTTATTGATGCTTTGCTTGGTGATCCTCAGTGTGATGGTTTCC AGAACAAGAAGTGGGATCTTTTCGTTGAGAGGTCTAAGGCTTACTCTAACTGCTA CCCTTACGATGTTCCTGATTACGCTTCTCTTAGATCACTTGTGGCTTCATCTGGAA CCCTTGAGTTCAACAACGAGTCTTTCAATTGGACTGGTGTTACCCAGAACGGTAC TTCTTCTGCTTGCATTAGAAGGTCTAACAACTCTTTCTTCTCTAGGCTTAACTGGC TTACCCACCTTAAGTTCAAGTACCCTGCTCTTAATGTGACCATGCCTAACAACGA GAAGTTCGATAAGTTGTACATTTGGGGAGTTCATCACCCTGGTACTGATAATGAT CAGATTTTCCCTTACGCTCAGGCTTCTGGAAGGATTACTGTGTCTACCAAGAGGT CACAGCAGACTGTGATTCCTAACATTGGTTCTAGGCCAAGAGTGAGGAACATTCC TTCTAGGATTTCTATCTACTGGACCATTGTGAAGCCTGGTGATATTCTTCTTATTA ACTCTACCGGTAACCTTATTGCTCCTAGGGGATACTTCAAGATTAGAAGTGGAAA GTCATCTATTATGAGATCAGATGCTCCTATTGGAAAGTGCAACTCTGAGTGCATT ACCCCTAACGGTTCTATTCCTAACGATAAGCCTTTCCAGAACGTGAACAGGATTA CTTATGGTGCTTGCCCTAGATACGTGAAGCAGAACACCCTTAAGTTGGCTACTGG AATGAGGAATGTGCCTGAGAAGCAGACTAGGGGAATTTTCGGAGCTATTGCTGG TTTCATTGAGAATGGATGGGAGGGAATGGTTGATGGTTGGTACGGTTTCAGGCAT CAGAACTCTGAAGGTATTGGACAGGCTGCTGATCTTAAGTCTACCCAGGCTGCTA TTGATCAGATTAACGGTAAGTTGAACAGGCTTATTGGAAAGACCAATGAGAAGT TCCACCAGATTGAGAAAGAGTTCTCTGAGGTTGAGGGAAGGATTCAGGATCTTG AGAAGTACGTGGAGGATACCAAGATTGATCTTTGGTCTTACAACGCTGAGTTGCT TGTGGCTCTTGAGAATCAGCACACCATTGATCTTACCGATTCTGAGATGAACAAG TTGTTCGAAAAGACCAAGAAGCAGCTTAGGGAGAACGCTGAGGATATGGGTAAT GGTTGCTTCAAAATCTACCACAAGTGCGATAACGCTTGCATTGGTTCTATTAGGA ACGGAACCTACGATCATGATGTGTACAGGGATGAGGCTCTTAATAACAGGTTCC AGATTAAGGGTGTTGAGCTTAAGTCTGGTTACAAGGAT


TGATGA 3’(SEQ ID NO96). 由SEQ ID NO96編碼的蛋白質(zhì)序列為 5’

QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTI VKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGEICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKK WDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWTGVTQNGTSSACI RRSNNSFFSRLNWLTHLKFKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPGTDNDQIFPYA QASGRITVSTKRSQQTVIPNIGSRPRVRNIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGY FKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKL ATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGIGQAADLKSTQA AIDQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVA LENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYD HDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKD

3’(SEQ IDNO97). 克隆到投放載體中的來自A/布里斯班/59/07(“HAB1-H1”)的HA的核苷酸序列為 5’


GATACCATCTGCATTG GTTACCACGCTAACAACTCTACTGATACTGTGGATACCGTGCTTGAGAAGAATGT GACTGTGACCCACTCTGTGAACCTTTTGGAGAACTCTCACAACGGTAAGTTGTGC CTTCTTAAGGGTATTGCTCCTCTTCAGCTTGGAAATTGCTCTGTGGCTGGATGGAT TCTTGGAAATCCTGAGTGCGAGCTTCTTATTTCTAAAGAGTCTTGGTCTTACATTG TGGAGAAGCCTAATCCTGAGAACGGTACTTGCTACCCTGGTCACTTTGCTGATTA CGAAGAGCTTAGAGAGCAGCTTTCTTCTGTTTCTTCTTTCGAGAGATTCGAGATTT TCCCTAAAGAGTCATCTTGGCCTAATCATACTGTGACTGGTGTGTCTGCTTCTTGC TCTCATAACGGTGAGTCATCTTTCTACAGGAACCTTCTTTGGCTTACCGGAAAGA ACGGTCTTTACCCTAACCTTTCTAAGTCTTACGCTAACAACAAAGAGAAAGAGGT TTTGGTTCTTTGGGGTGTTCATCACCCTCCTAACATTGGTGATCAGAAGGCTCTTT ACCATACCGAGAACGCTTACGTTTCTGTGGTGTCATCTCACTACTCTAGGAAGTT CACCCCTGAGATTGCTAAGAGGCCTAAAGTGAGGGATCAAGAGGGAAGGATTAA CTACTACTGGACCCTTCTTGAACCTGGTGATACCATTATTTTCGAGGCTAACGGT AACCTTATTGCTCCTAGATACGCTTTCGCTCTTTCTAGAGGTTTCGGTTCTGGTAT TATTAACTCTAACGCTCCTATGGATAAGTGTGATGCTAAGTGCCAGACTCCTCAG GGTGCTATTAACTCTTCTCTTCCTTTCCAGAATGTGCACCCTGTTACTATTGGTGA GTGCCCTAAGTATGTGAGATCAGCTAAGTTGAGGATGGTGACCGGTCTTAGGAA CATTCCTTCTATTCAGTCTAGGGGACTTTTCGGAGCTATTGCTGGTTTTATTGAGG GAGGATGGACTGGAATGGTTGATGGTTGGTACGGTTACCATCATCAGAATGAGC AGGGTTCTGGTTATGCTGCTGATCAGAAGTCTACCCAGAACGCTATTAACGGTAT TACCAACAAGGTGAACTCTGTGATTGAGAAGATGAACACCCAGTTCACTGCTGTT GGAAAAGAGTTCAACAAGTTGGAGAGAAGGATGGAAAACCTTAACAAGAAAGT GGATGATGGTTTCATTGATATTTGGACCTACAACGCTGAGTTGCTTGTGCTTCTTG AGAATGAGAGGACCCTTGATTTCCACGATTCTAACGTGAAGAACCTTTACGAGA AGGTGAAGTCTCAGCTTAAGAACAACGCTAAAGAGATTGGAAACGGTTGCTTCG AGTTCTACCACAAGTGCAACGATGAGTGCATGGAATCTGTGAAGAACGGAACCT ACGATTACCCTAAGTACTCTGAAGAGTCTAAGTTGAACAGAGAAAAGATTGATG GTGTTAAGTTGGAGTCTATGGGAGTGTACCAGATT


TGA 3’(SEQ ID NO98). 由SEQ ID NO98編碼的蛋白質(zhì)序列為 5’

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVT VTHSVNLLENSHNGKLCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKP NPENGTCYPGHFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGESS FYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQKALYHTENAY VSVVSSHYSRKFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPRYAFAL SRGFGSGIINSNAPMDKCDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMV TGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFIDIWTYNAELLVL LENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTY DYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQI

3’(SEQ ID NO99). 克隆到投放載體中的來自B/布里斯班/3/07(“HAB1-B”)的HA的核苷酸序列為 5’


GATAGAAT CTGCACCGGTATTACCTCTTCTAACTCTCCTCACGTGGTTAAGACTGCTACTCAGG GTGAAGTTAATGTGACCGGTGTTATTCCTCTTACTACCACCCCTACCAAGTCTTAC TTCGCTAACCTTAAGGGTACTAAGACTAGAGGAAAGTTGTGCCCTGATTGCCTTA ATTGCACCGATCTTGATGTTGCTCTTGGAAGGCCTATGTGTGTTGGTACTACCCCT TCTGCTAAGGCTTCTATTCTTCACGAAGTGAGACCTGTTACTTCTGGTTGCTTCCC TATTATGCACGATAGGACCAAGATTAGGCAGCTTGCTAACCTTCTTAGGGGTTAC GAGAACATTAGGCTTTCTACCCAGAACGTGATTGATGCTGAAAAGGCTCCTGGTG GTCCTTATAGGCTTGGAACCTCTGGTTCTTGCCCTAATGCTACCTCTAAGTCTGGT TTCTTCGCTACTATGGCTTGGGCTGTGCCTAAGGATAACAACAAGAACGCTACCA ATCCTCTTACTGTGGAGGTGCCATATATCTGTACCGAGGGTGAAGATCAGATTAC TGTGTGGGGTTTCCACTCTGATGATAAGACCCAGATGAAGAACCTTTACGGTGAT TCTAACCCTCAGAAGTTCACCTCTTCTGCTAATGGTGTTACCACCCACTACGTGTC TCAGATTGGTGGTTTCCCTGATCAAACTGAGGATGGTGGACTTCCTCAGTCTGGA AGGATTGTGGTGGATTACATGATGCAAAAGCCTGGAAAGACCGGAACTATTGTG TATCAGAGGGGAGTTCTTCTTCCTCAGAAAGTGTGGTGTGCTTCTGGTAGGTCTA AAGTGATTAAGGGTTCTCTTCCTCTTATTGGAGAGGCTGATTGCCTTCATGAGAA GTACGGTGGTCTTAACAAGTCTAAGCCTTACTACACTGGTGAACACGCTAAGGCT ATTGGAAACTGCCCTATTTGGGTTAAGACCCCTCTTAAGTTGGCTAACGGTACTA AGTATAGGCCTCCTGCTAAGTTGCTTAAAGAGAGGGGATTCTTCGGAGCTATTGC TGGTTTTCTTGAGGGAGGATGGGAGGGAATGATTGCTGGATGGCACGGTTATACT TCTCATGGTGCTCACGGTGTTGCTGTTGCTGCTGATCTTAAGTCTACCCAGGAAG CTATTAACAAGATTACCAAGAACCTTAACTCTCTTTCTGAGCTTGAGGTGAAGAA CCTTCAGAGACTTTCTGGTGCTATGGATGAGCTTCACAACGAGATTCTTGAGCTT GATGAGAAAGTGGATGATCTTAGGGCTGATACCATTTCTTCTCAGATTGAGCTTG CTGTGCTTCTTTCTAACGAGGGTATCATTAACTCTGAGGATGAGCACCTTCTTGCT CTTGAGAGGAAGTTGAAGAAGATGCTTGGTCCTTCTGCTGTGGATATTGGAAATG GTTGCTTCGAGACTAAGCACAAGTGCAATCAGACTTGCCTTGATAGGATTGCTGC TGGAACTTTCAATGCTGGTGAGTTCTCTCTTCCTACCTTCGATTCTCTTAACATTA CCGCTGCTTCTCTTAACGATGATGGTCTTGATAAT


TGA3’(SEQ IDNO100). 由SEQ ID NO100編碼的蛋白質(zhì)序列為 5’

DRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNV TGVIPLTTTPTKSYFANLKGTKTRGKLCPDCLNCTDLDVALGRPMCVGTTPSAKASIL HEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLANLLRGYENIRLSTQNVIDAEKAPGGPYRLGTSGS CPNATSKSGFFATMAWAVPKDNNKNATNPLTVEVPYICTEGEDQITVWGFHSDDKT QMKNLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPDQTEDGGLPQSGRIVVDYMMQKP GKTGTIVYQRGVLLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTG EHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGW HGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEIL ELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAVDIGNG CFETKHKCNQTCLDRIAAGTFNAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHT


3’(SEQ IDNO101). 克隆到投放載體中的來自B/佛羅里達(dá)/4/2006(“HAF1-B”)(ACA33493)的HA的核苷酸序列為 5’


GATAGAAT CTGCACCGGTATTACCTCTTCTAACTCTCCTCACGTGGTTAAGACTGCTACTCAGG GTGAAGTTAATGTGACCGGTGTTATTCCTCTTACTACCACCCCTACCAAGTCTTAC TTCGCTAACCTTAAGGGTACTAGGACTAGAGGAAAGTTGTGCCCTGATTGCCTTA ATTGCACCGATCTTGATGTTGCTCTTGGAAGGCCTATGTGTGTTGGTACTACCCCT TCTGCTAAGGCTTCTATTCTTCACGAGGTGAAGCCTGTTACTTCTGGTTGCTTCCC TATTATGCACGATAGGACCAAGATTAGGCAGCTTCCTAACCTTCTTAGGGGTTAC GAGAACATTAGGCTTTCTACCCAGAACGTGATTGATGCTGAAAAGGCTCCTGGTG GTCCTTATAGGCTTGGAACCTCTGGTTCTTGCCCTAATGCTACCTCTAAGTCTGGT TTCTTCGCTACTATGGCTTGGGCTGTGCCTAAGGATAACAACAAGAACGCTACCA ATCCTCTTACTGTGGAGGTGCCATATATCTGTACCGAGGGTGAAGATCAGATTAC TGTGTGGGGTTTCCACTCTGATGATAAGACCCAGATGAAGAACCTTTACGGTGAT TCTAACCCTCAGAAGTTCACCTCTTCTGCTAATGGTGTTACCACCCACTACGTGTC TCAGATTGGTTCTTTCCCTGATCAAACTGAGGATGGTGGACTTCCTCAGTCTGGA AGGATTGTGGTGGATTACATGATGCAAAAGCCTGGAAAGACCGGAACTATTGTG TATCAGAGGGGAGTTCTTCTTCCTCAGAAAGTGTGGTGTGCTTCTGGTAGGTCTA AAGTGATTAAGGGTTCTCTTCCTCTTATTGGAGAGGCTGATTGCCTTCATGAGAA GTACGGTGGTCTTAACAAGTCTAAGCCTTACTACACTGGTGAACACGCTAAGGCT ATTGGAAACTGCCCTATTTGGGTTAAGACCCCTCTTAAGTTGGCTAACGGTACTA AGTATAGGCCTCCTGCTAAGTTGCTTAAAGAGAGGGGATTCTTCGGAGCTATTGC TGGTTTTCTTGAGGGAGGATGGGAGGGAATGATTGCTGGATGGCACGGTTATACT TCTCATGGTGCTCACGGTGTTGCTGTTGCTGCTGATCTTAAGTCTACCCAGGAAG CTATTAACAAGATTACCAAGAACCTTAACTCTCTTTCTGAGCTTGAGGTGAAGAA CCTTCAGAGACTTTCTGGTGCTATGGATGAGCTTCACAACGAGATTCTTGAGCTT GATGAGAAAGTGGATGATCTTAGGGCTGATACCATTTCTTCTCAGATTGAGCTTG CTGTGCTTCTTTCTAACGAGGGTATCATTAACTCTGAGGATGAGCACCTTCTTGCT CTTGAGAGGAAGTTGAAGAAGATGCTTGGTCCTTCTGCTGTGGAGATTGGAAATG GTTGCTTCGAGACTAAGCACAAGTGCAATCAGACTTGCCTTGATAGGATTGCTGC TGGAACTTTCAATGCTGGTGAGTTCTCTCTTCCTACCTTCGATTCTCTTAACATTA CCGCTGCTTCTCTTAACGATGATGGTCTTGATAAT


TGA 3’(SEQ ID NO102). 由SEQ ID NO102編碼的蛋白質(zhì)序列為 5’

DRICTGITSSNSPHVVKTAT QGEVNVTGVIPLTTTPTKSYFANLKGTRTRGKLCPDCLNCTDLDVALGRPMCVGTTP SAKASILHEVKPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYENIRLSTQNVIDAEKAPGGPYR LGTSGSCPNATSKSGFFATMAWAVPKDNNKNATNPLTVEVPYICTEGEDQITVWGF HSDDKTQMKNLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGSFPDQTEDGGLPQSGRIVVDY MMQKPGKTGTIVYQRGVLLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKS KPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEG MIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDE LHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAV EIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFNAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHT


3’(SEQ ID NO103). 克隆到投放載體中的來自A/新喀里多尼亞(New Caledonia)/20/99(AAP34324)的HA的核苷酸序列為 5’


GATACAATCTGCATTG GATACCACGCTAACAACTCTACTGATACTGTGGATACTGTTCTTGAGAAGAACGT GACTGTGACTCACTCTGTGAACCTTTTGGAGGATTCTCACAACGGAAAGTTGTGC CTTCTTAAGGGAATTGCTCCACTTCAACTTGGAAACTGCAGTGTGGCTGGATGGA TTCTTGGAAATCCAGAGTGCGAGCTTCTTATTTCTAAAGAGTCTTGGTCTTACATT GTGGAGACTCCAAATCCAGAGAACGGAACTTGTTACCCAGGATACTTCGCTGATT ACGAAGAGCTTAGAGAGCAGCTTTCTTCTGTTTCTTCTTTCGAGAGATTCGAGAT TTTCCCAAAAGAGTCATCTTGGCCAAACCACACTGTTACTGGTGTTTCTGCTTCTT GCTCTCATAACGGTAAGTCATCTTTCTACAGGAACCTTCTTTGGCTTACTGGAAA GAACGGACTTTACCCAAACCTTTCTAAGTCTTACGTGAACAACAAAGAGAAAGA GGTTTTGGTTCTTTGGGGAGTTCATCACCCACCAAACATTGGAAATCAGAGGGCT CTTTACCATACTGAGAACGCTTACGTGTCTGTGGTTTCTTCTCACTACTCTAGAAG GTTCACTCCAGAGATTGCTAAGAGGCCAAAAGTGAGGGATCAAGAGGGAAGGAT TAACTACTACTGGACTCTTCTTGAGCCAGGTGATACAATTATTTTCGAGGCTAAC GGAAACCTTATTGCTCCATGGTACGCTTTTGCTTTGTCTAGGGGATTCGGATCTGG AATTATTACTTCTAACGCTCCAATGGATGAGTGTGATGCTAAGTGCCAAACTCCA CAGGGTGCTATTAACTCTTCTCTTCCATTCCAGAACGTTCACCCAGTTACTATTGG AGAGTGCCCAAAGTATGTGAGATCAGCTAAGTTGAGGATGGTGACTGGACTTAG GAACATTCCATCTATTCAGTCTAGGGGACTTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATTG AGGGAGGATGGACTGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATACCATCATCAGAATG AGCAGGGATCTGGATATGCTGCTGATCAGAAGTCTACTCAGAACGCTATTAACG GAATTACTAACAAGGTGAACTCTGTGATTGAGAAGATGAACACTCAGTTCACTGC TGTGGGAAAAGAGTTCAACAAGTTGGAGAGAAGGATGGAAAACCTTAACAAGA AAGTGGATGATGGATTCCTTGATATTTGGACTTACAACGCTGAGTTGCTTGTGCT TCTTGAGAACGAGAGGACTCTTGATTTCCACGATTCTAACGTGAAGAACCTTTAC GAGAAGGTGAAGTCTCAGCTTAAGAACAACGCTAAAGAGATTGGAAACGGTTGC TTCGAGTTCTACCACAAGTGCAACAACGAGTGCATGGAATCTGTGAAGAACGGT ACTTACGATTACCCAAAGTACTCTGAAGAGTCTAAGTTGAACAGAGAAAAGATT GATGGTGTTAAGTTGGAGTCTATGGGAGTGTACCAGATT


TAA 3’(SEQ ID NO104). 由SEQ ID NO104編碼的蛋白質(zhì)序列為 5’

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVT VTHSVNLLEDSHNGKLCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVETP NPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKS SFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYVNNKEKEVLVLWGVHHPPNIGNQRALYHTENA YVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAF ALSRGFGSGIITSNAPMDECDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLR MVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQ NAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAEL LVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNNECMESVKN GTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQI

3’(SEQ IDNO105). 克隆到投放載體中的來自A/所羅門群島(Solomon Islands)/3/2006(ABU99109)的HA的核苷酸序列為 5’


GATACCATCTGCATTG GTTACCACGCTAACAACTCTACTGATACTGTGGATACCGTGCTTGAGAAGAATGT GACTGTGACCCACTCTGTGAACCTTTTGGAGGATTCTCACAACGGTAAGTTGTGC CTTCTTAAGGGTATTGCTCCTCTTCAGCTTGGAAATTGCTCTGTGGCTGGATGGAT TCTTGGAAATCCTGAGTGCGAGCTTCTTATTTCTAGAGAGTCTTGGTCTTACATTG TGGAGAAGCCTAATCCTGAGAACGGTACTTGCTACCCTGGTCACTTTGCTGATTA CGAAGAGCTTAGAGAGCAGCTTTCTTCTGTTTCTTCTTTCGAGAGATTCGAGATTT TCCCTAAAGAGTCATCTTGGCCTAACCATACCACTACTGGTGTTTCTGCTTCTTGC TCACACAACGGTGAGTCATCTTTCTACAAGAACCTTCTTTGGCTTACCGGAAAGA ACGGTCTTTACCCTAACCTTTCTAAGTCTTACGCTAACAACAAAGAGAAAGAGGT TTTGGTTCTTTGGGGTGTTCATCACCCTCCTAACATTGGTGATCAGAGGGCTCTTT ACCACAAAGAGAACGCTTACGTTTCTGTGGTGTCATCTCACTACTCTAGGAAGTT CACCCCTGAGATTGCTAAGAGGCCTAAAGTGAGGGATCAAGAGGGAAGGATTAA CTACTACTGGACCCTTCTTGAACCTGGTGATACCATTATTTTCGAGGCTAACGGT AACCTTATTGCTCCTAGATACGCTTTCGCTCTTTCTAGAGGTTTCGGTTCTGGTAT TATTAACTCTAACGCTCCTATGGATGAGTGTGATGCTAAGTGTCAGACTCCTCAG GGTGCTATTAACTCTTCTCTTCCTTTCCAGAATGTGCACCCTGTTACTATTGGTGA GTGCCCTAAGTATGTGAGATCAGCTAAGTTGAGGATGGTGACCGGTCTTAGGAA CATTCCTTCTATTCAGTCTAGGGGACTTTTCGGAGCTATTGCTGGTTTTATTGAGG GAGGATGGACTGGAATGGTTGATGGTTGGTACGGTTACCATCATCAGAATGAGC AGGGTTCAGGTTATGCTGCTGATCAGAAGTCTACCCAGAACGCTATTAACGGTAT TACCAACAAGGTGAACTCTGTGATTGAGAAGATGAACACCCAGTTCACTGCTGTT GGAAAAGAGTTCAACAAGTTGGAGAGAAGGATGGAAAACCTTAACAAGAAAGT GGATGATGGTTTCATTGATATTTGGACCTACAACGCTGAGTTGCTTGTGCTTCTTG AGAATGAGAGGACCCTTGATTTCCACGATTCTAACGTGAAGAACCTTTACGAGA AGGTGAAGTCTCAGCTTAAGAACAACGCTAAAGAGATTGGAAACGGTTGCTTCG AGTTCTACCACAAGTGCAACGATGAGTGCATGGAATCTGTGAAGAACGGAACCT ACGATTACCCTAAGTACTCTGAAGAGTCTAAGTTGAACAGAGAAAAGATTGATG GTGTTAAGTTGGAGTCTATGGGAGTGTACCAGATT


TGATGA 3’(SEQ ID NO106). 由SEQ ID NO106編碼的蛋白質(zhì)序列為 5’

DTICIGYHANNSTDTVDTV LEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISRESWS YIVEKPNPENGTCYPGHFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTTTGVSASCS HNGESSFYKNLLWLTGKNGLYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALY HKENAYVSVVSSHYSRKFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIA PRYAFALSRGFGSGIINSNAPMDECDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVR SAKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGALAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAAD QKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFIDIWTY NAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECME SVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQI

3’(SEQ IDNO107). 克隆到投放載體中的來自A/威斯康星(Wisconsin)/67/2005的HA的核苷酸序列為 5’


CAAAAGTTGCCAGGA AACGATAACTCTACTGCTACTCTTTGCCTTGGACATCACGCTGTTCCAAACGGAA CTATTGTGAAAACTATTACTAACGATCAGATTGAGGTGACAAACGCTACTGAGCT TGTTCAGTCATCTTCTACTGGTGGAATTTGCGATTCTCCACACCAGATTCTTGATG GTGAAAACTGCACTCTTATTGATGCTTTGCTTGGAGATCCACAGTGTGATGGATT CCAGAACAAGAAGTGGGATCTTTTCGTTGAGAGGTCTAAGGCTTACTCTAACTGC TACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCTCTTAGATCACTTGTGGCTTCATCTGG AACTCTTGAGTTCAACGATGAGTCTTTCAACTGGACTGGTGTTACTCAGAACGGA ACTTCATCTTCATGCAAGAGGAGGTCTAACAACTCTTTCTTCTCTAGGCTTAACTG GCTTACTCACCTTAAGTTCAAGTACCCAGCTCTTAACGTGACTATGCCAAACAAC GAGAAGTTCGATAAGTTGTACATTTGGGGAGTTCACCACCCAGTTACTGATAATG ATCAGATTTTCCTTTACGCTCAGGCTTCTGGAAGGATTACTGTGTCTACTAAGAG GTCTCAGCAGACTGTGATTCCAAACATTGGATCTAGGCCAAGGATTAGGAACATT CCATCTAGGATTTCTATTTACTGGACTATTGTGAAGCCAGGTGATATTCTTCTTAT TAACTCTACTGGAAACCTTATTGCTCCAAGGGGATACTTCAAGATTAGAAGTGGA AAGTCATCTATTATGAGATCAGATGCTCCAATTGGAAAGTGCAACTCTGAGTGCA TTACTCCAAACGGTTCTATTCCAAACGATAAGCCATTCCAGAACGTGAACAGGAT TACTTATGGTGCTTGCCCAAGATACGTGAAGCAGAACACTCTTAAGTTGGCTACT GGAATGAGGAATGTGCCAGAGAAGCAGACTAGGGGAATTTTCGGAGCTATTGCT GGATTCATTGAGAATGGATGGGAGGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATTCAGG CATCAAAACTCTGAGGGAATTGGACAAGCTGCTGATCTTAAGTCTACTCAGGCTG CTATTAACCAGATTAACGGAAAGTTGAACAGGCTTATTGGAAAGACTAATGAGA AGTTCCACCAGATTGAGAAAGAGTTCTCTGAGGTTGAGGGAAGGATTCAGGATC TTGAGAAGTACGTGGAGGATACAAAGATTGATCTTTGGTCTTACAACGCTGAGTT GCTTGTTGCTCTTGAGAACCAGCACACTATTGATCTTACTGATTCTGAGATGAAC AAGTTGTTCGAGAGGACTAAGAAGCAGCTTAGGGAGAACGCTGAGGATATGGGA AATGGATGCTTCAAGATTTACCACAAGTGCGATAACGCTTGCATTGGATCTATTA GGAACGGAACTTACGATCACGATGTGTACAGAGATGAGGCTCTTAACAACAGGT TCCAGATTAAGGGTGTTGAGCTTAAGTCTGGATACAAGGAT


TGA 3’(SEQ ID NO108). 由SEQ ID NO108編碼的蛋白質(zhì)序列為 5’

QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTI VKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGGICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKK WDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNDESFNWTGVTQNGTSSSC KRRSNNSFFSRLNWLTHLKFKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPVTDNDQIFLY AQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGSRPRIRNIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGY FKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKL ATGMRNVPEKQTRGIFGALAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGIGQAADLKSTQA AINQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKiDLWSYNAELLVA LENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYD HDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGY 3’(SEQ ID NO109) 基本上如實例1中所述，在植物中制備抗原。
純化的植物產(chǎn)H3HA或H1HA的ELISA 通過ELISA表征來自A/布里斯班/10/07(H3N2)和A/布里斯班/59/07(H1N1)的植物產(chǎn)HA。用1μg/ml來自A/布里斯班/10/07、A/布里斯班/59/07、滅活A(yù)/布里斯班/10/07(健康與老齡部治療用物品管理局(Department of Health and Ageing Therapeutic GoodsAdministration(TGA))，批號2007/79B，澳大利亞(Australia))或滅活A(yù)/布里斯班/59/07(國家生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和管制所(National Institute for Biological Standards and Control(NIBSC))，編號08/100，英國(UK))的純化HA涂布96孔MaxiSorp板(能肯公司(NUNC)，紐約州羅徹斯特(Rochester，NY))。將培養(yǎng)板與針對來自A/布里斯班/10/07(TGA，批號AS393)或A/布里斯班/59/07(NIBSC，編號08/112)的HA所產(chǎn)生的綿羊抗血清的1∶1600稀釋液一起培育并使用兔抗綿羊IgG-HRP抗體(貝斯實驗室公司(Bethyl Laboratory Inc.))檢測。
用植物產(chǎn)H3HA或H1HA免疫小鼠 以2周時間間隔，在第0天、第14天、第28天，用植物產(chǎn)H3HA或H1HA皮下免疫各組6周齡Balb/c小鼠(每組6只小鼠)。測試三種不同抗原劑量每劑60μg、30μg和15μg。對照組動物接受PBS。通過添加10μg Quil A(紐約州韋斯特伯里的精細(xì)化學(xué)公司(Accurate Chemical，Westbury，NY))來進(jìn)行所有免疫。在每次免疫之前和在第三次劑量后兩周收集血清樣品。
表征免疫反應(yīng) 通過ELISA，使用涂有滅活A(yù)/布里斯班/10/07或A/布里斯班/59/07病毒的96孔MaxiSorp板(能肯公司(NUNC)，紐約州羅徹斯特(Rochester，NY))測量HA特異性血清抗體反應(yīng)。用連續(xù)四倍稀釋液測試血清樣品并使用結(jié)合HRP的山羊抗小鼠IgG(賓夕法尼亞州西格羅夫的杰克遜免疫研究實驗室公司(Jackson Immunoresearch LaboratoryInc.，West Grove，PA.))檢測抗原特異性抗體。產(chǎn)生三倍于來自1∶50稀釋度下免疫前血清的值的平均OD值的血清稀釋度的倒數(shù)確定為終點效價。
血細(xì)胞凝集抑制(HI)和病毒中和(VN)分析 用破壞受體的酶(RDE；日本東京的生研公司(Denka Seiken Co.Ltd.，Tokyo，Japan))處理來自經(jīng)免疫小鼠的血清樣品并如先前所述用0.75％火雞紅細(xì)胞進(jìn)行HI分析(羅(Rowe)等人，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.)，37937-43；以引用的方式并入本文中)。如先前所述(羅(Rowe)等人，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.)，37937-43)，但經(jīng)以下改變，進(jìn)行微量中和分析。將MDCK細(xì)胞以每孔3×104個細(xì)胞涂鋪在96孔組織培養(yǎng)板中，并在37℃下培育18小時。同時，連續(xù)稀釋經(jīng)RDE處理的血清樣品并與等體積的2×103TCID50/ml的A/布里斯班/10/07或A/布里斯班/59/07流感病毒混合。在37℃下培育1小時后，將血清-病毒混合物添加到所涂的MDCK細(xì)胞中并進(jìn)一步培育18小時。接著用PBS洗滌培養(yǎng)板并用80％丙酮固定。如先前所述，通過ELISA測定各樣品的中和終點效價(羅(Rowe)等人，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.)，37937-43)。
統(tǒng)計分析 使用方差相等的雙尾t檢驗進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析且在p值＜0.05時視為有顯著性。指定無可檢測IgG、HI或VN效價的樣品的統(tǒng)計分析值為25、5或10(檢測極限分別為50、10或20)。
結(jié)果和討論 HAB1-H3、HAB1-H1、HAB1-B和HAF1-B抗原都成功地在植物中制備。圖17A展示所制備的HAB1-H3和HAB1-H1蛋白的庫馬斯亮藍(lán)染色和西方印跡法。各構(gòu)筑體的總蛋白質(zhì)表達(dá)為每千克植物生物質(zhì)約800mg。圖17B展示所制備的HAB1-B和HAF1-B蛋白的庫馬斯亮藍(lán)染色和/或西方印跡法。HAB1-B的總蛋白質(zhì)表達(dá)為每千克植物生物質(zhì)約800mg。HAF1-B的總蛋白質(zhì)表達(dá)為每千克植物生物質(zhì)約325mg。
用60μg、30μg或15μg來自A/布里斯班/59/07(HAB1-H1)或A/布里斯班/10e/07(HAB1-H3)的植物產(chǎn)HA免疫小鼠。參見圖18。在抗原的引發(fā)、第一次加強和第二次加強后，通過ELISA來測定HA特異性抗體的血清效價。數(shù)據(jù)以平均抗體效價±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示(圖19和21)。
使用同源(圖20)以及異源(表4)H1N1病毒測量來自用HAB1-H1免疫的小鼠的血清的HI抗體效價。用來自經(jīng)30μgHAB1-H1免疫的組(第二次加強后)的匯集血清進(jìn)行針對異源病毒的HI分析。結(jié)果展示于圖20和表4中 表4使用異源病毒測量的HI抗體效價 使用同源(圖22)以及異源(表5)H1N1病毒測量來自用HAB1-H1免疫的小鼠的血清的HI抗體效價。用來自經(jīng)30μgHAB1-H3免疫的組(第二次加強后)的匯集血清進(jìn)行針對異源病毒的HI分析。結(jié)果展示于圖22和表5中 表5使用異源病毒測量的HI抗體效價 等效物和范圍 所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到或能夠僅使用常規(guī)實驗確定本文所述的本發(fā)明的特定實施例的許多等效物。本發(fā)明的范圍不希望限于以上實施方式，而實際上如隨附權(quán)利要求書中所述。
所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到或能夠僅使用常規(guī)實驗確定本文所述的本發(fā)明的特定實施例的許多等效物。本發(fā)明的范圍不希望限于以上實施方式，而實際上如隨附權(quán)利要求書中所述。
在權(quán)利要求書中，除非相反地指出或另外從本文顯而易見，否則諸如“一”和“所述”等冠詞可能意思是一個或一個以上。除非相反地指出或另外從本文顯而易見，否則如果群組成員中的一個、一個以上或全部存在于、用于指定產(chǎn)物或方法中或以其他方式與指定產(chǎn)物或方法有關(guān)，那么認(rèn)為滿足群組中的一個或多個成員之間包括“或”的權(quán)利要求書或?qū)嵤┓绞健１景l(fā)明包括正好群組中的一個成員存在于、用于指定產(chǎn)物或方法中或以其他方式與指定產(chǎn)物或方法有關(guān)的實施例。本發(fā)明包括群組成員中的一個以上或全部存在于、用于指定產(chǎn)物或方法中或以其他方式與指定產(chǎn)物或方法有關(guān)的實施例。此外，應(yīng)了解本發(fā)明涵蓋所有變化、組合和變更，其中將來自一個或多個所列權(quán)利要求的一個或多個限制、要素、條款、描述性術(shù)語等引入另一權(quán)利要求中。舉例來說，依賴于另一權(quán)利要求的任何權(quán)利要求可修改成包括依賴于同一基礎(chǔ)權(quán)利要求的任何其它權(quán)利要求中所見的一個或多個限制。此外，當(dāng)權(quán)利要求書描述組合物時，應(yīng)了解除非另有指示或除非所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將明顯知道會出現(xiàn)矛盾或不一致，否則包括出于本文所揭示的任一目的使用所述組合物的方法，且包括根據(jù)本文所揭示的任一制備方法或所屬領(lǐng)域中已知的其它方法制備組合物的方法。
當(dāng)要素以列表呈現(xiàn)，例如呈馬庫什(Markush)群組形式時，應(yīng)了解也揭示所述要素的各亞組，且可從群組中去除任何要素。應(yīng)了解，一般來說，當(dāng)本發(fā)明或本發(fā)明的方面被稱為包含特定要素、特征等時，本發(fā)明的某些實施例或本發(fā)明的方面由所述要素、特征等組成或基本上由所述要素、特征等組成。出于簡單的目的，那些實施例在本文中未特定地以那些詞進(jìn)行描述。應(yīng)注意術(shù)語“包含”打算為開放式的且允許包括其他要素或步驟。
當(dāng)提供范圍時，包括端點。此外，應(yīng)了解除非另有指示或另外從本文和所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的了解顯而易見，否則在本發(fā)明的不同實施例中以范圍形式表示的值可采取所述范圍中的任何特定值或子范圍，除非上下文另外明確規(guī)定，否則精確到所述范圍的下限單位的十分之一。
另外，應(yīng)了解屬于現(xiàn)有技術(shù)的本發(fā)明的任何特定實施例可明確地從權(quán)利要求書的任一個或多個權(quán)利要求中排除。因為認(rèn)為所述實施例為所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所已知，所以可將其排除在外，即使本文未明確闡明所述排除。出于任何原因，不管是否與現(xiàn)有技術(shù)的存在有關(guān)，本發(fā)明的組合物的任何特定實施例(例如任何流感亞型、進(jìn)化枝、病毒株等；任何流感多肽抗原；任何表達(dá)系統(tǒng)；任何植物制備系統(tǒng)；任何投藥方法；等)都可從任一個或多個權(quán)利要求中排除。
權(quán)利要求
1.一種亞單位疫苗組合物，其包含
植物產(chǎn)流感多肽抗原；和
醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑；
其中所述亞單位疫苗組合物在投予個體后引發(fā)免疫反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞單位疫苗組合物，其中所述植物產(chǎn)流感多肽抗原為血細(xì)胞凝集素多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞單位疫苗組合物，其中所述植物產(chǎn)流感多肽抗原為選自由SEQ ID NO1-35、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109組成的群組的血細(xì)胞凝集素多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞單位疫苗組合物，其中所述植物產(chǎn)流感多肽抗原為神經(jīng)氨酸酶多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞單位疫苗組合物，其中所述植物產(chǎn)流感多肽抗原為選自由SEQ ID NO36-43組成的群組的神經(jīng)氨酸酶多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞單位疫苗組合物，其中單次劑量的所述亞單位疫苗組合物包含不超過100μg所述植物產(chǎn)流感多肽抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞單位疫苗組合物，其中單次劑量的所述亞單位疫苗組合物包含不超過75μg所述植物產(chǎn)流感多肽抗原。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞單位疫苗組合物，其中單次劑量的所述亞單位疫苗組合物包含不超過50μg所述植物產(chǎn)流感多肽抗原。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞單位疫苗組合物，其中單次劑量的所述亞單位疫苗組合物包含不超過25μg所述植物產(chǎn)流感多肽抗原。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞單位疫苗組合物，其中單次劑量的所述亞單位疫苗組合物包含不超過10μg所述植物產(chǎn)流感多肽抗原。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞單位疫苗組合物，其中單次劑量的所述亞單位疫苗組合物包含不超過5μg所述植物產(chǎn)流感多肽抗原。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞單位疫苗組合物，其中單次劑量的所述亞單位疫苗組合物包含不超過1μg所述植物產(chǎn)流感多肽抗原。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞單位疫苗組合物，其中所述植物產(chǎn)流感多肽抗原是從植物材料純化。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的亞單位疫苗組合物，其中所述植物產(chǎn)流感多肽抗原的純度為約70％。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的亞單位疫苗組合物，其中所述植物產(chǎn)流感多肽抗原的純度為約80％。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的亞單位疫苗組合物，其中所述植物產(chǎn)流感多肽抗原的純度為約90％。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的亞單位疫苗組合物，其中所述植物產(chǎn)流感多肽抗原的純度為約95％。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的亞單位疫苗組合物，其中所述植物產(chǎn)流感多肽抗原的純度為約99％。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞單位疫苗組合物，其中所述植物產(chǎn)流感多肽抗原未從植物材料純化。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞單位疫苗組合物，其中所述植物產(chǎn)流感多肽抗原是以完整植物或植物提取物的形式投予個體。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞單位疫苗組合物，其進(jìn)一步包含至少一種疫苗佐劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的亞單位疫苗組合物，其中所述佐劑是選自由以下組成的群組明礬、Quil A、QS21、氫氧化鋁、磷酸鋁、礦物油、MF59、Malp2、不完全弗氏佐劑(incomplete Freund′s adjuvant)、完全弗氏佐劑(complete Freund′s adjuvant)、鋁膠(alhydrogel)、3去-O-酰化單磷?；|(zhì)A(3D-MPL)、脂質(zhì)A、百日咳桿菌(Bortadella pertussis)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、默克佐劑65(Merck Adjuvant 65)、角鯊烯、病毒顆粒、SBAS2、SBAS1和未甲基化CpG序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞單位疫苗組合物，其中所述抗原在選自轉(zhuǎn)基因植物和短暫表達(dá)所述抗原的植物中產(chǎn)生。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞單位疫苗組合物，其中所述抗原在所述植物中從投放載體(launch vector)表達(dá)。
25.一種在個體中誘導(dǎo)對抗流感感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)的方法，其包含向個體投予有效量的根據(jù)權(quán)利要求1到24中任一權(quán)利要求所述的亞單位疫苗組合物。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中經(jīng)口、鼻內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或肌肉內(nèi)投予所述組合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中通過供給植物細(xì)胞而向所述個體經(jīng)口投予所述組合物。
28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述個體為人類。
29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述個體是選自由鳥、豬和馬組成的群組。
30.一種產(chǎn)生流感抗原多肽的方法，其包含
a.制備編碼流感抗原多肽的核酸構(gòu)筑體；
b.將步驟a的所述核酸引入植物細(xì)胞中；和
c.在有利于表達(dá)所述流感抗原多肽的條件下培育所述植物細(xì)胞；
從而產(chǎn)生所述流感抗原多肽。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述抗原蛋白的表達(dá)受病毒啟動子的控制。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述核酸構(gòu)筑體進(jìn)一步包含載體核酸序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述載體為二元載體(binary vector)。
34.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述核酸構(gòu)筑體進(jìn)一步包含編碼病毒蛋白質(zhì)的序列。
35.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述植物細(xì)胞是選自由以下組成的群組紫花苜蓿、蘿卜、芥菜、綠豆、西蘭花、水田芹、大豆、小麥向日葵、卷心菜、三葉草、矮牽牛、西紅柿、馬鈴薯、煙堿、菠菜和小扁豆細(xì)胞。
36.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述植物細(xì)胞是屬于選自蕓苔屬(Brassicagenus)、煙草屬(Nicotiana genus)和矮牽牛屬(Petunia genus)的屬。
37.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中在發(fā)芽的籽苗中產(chǎn)生所述流感抗原多肽。
38.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其進(jìn)一步包含回收部分純化或純化的所產(chǎn)生的流感抗原多肽。
39.一種經(jīng)分離的核酸構(gòu)筑體，其包含編碼流感抗原多肽的核酸序列，其中所述流感抗原多肽包含如SEQ ID NO1-43、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109中的任一者所示的序列。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的經(jīng)分離的核酸構(gòu)筑體，其進(jìn)一步包含載體核酸序列。
41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的經(jīng)分離的核酸構(gòu)筑體，其進(jìn)一步包含病毒啟動子核酸序列。
42.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述載體為二元載體。
43.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其進(jìn)一步包含編碼病毒蛋白質(zhì)的核酸序列。
44.一種宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求39所述的核酸構(gòu)筑體。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞是選自由以下組成的群組紫花苜蓿、蘿卜、芥菜、綠豆、西蘭花、水田芹、大豆、小麥向日葵、卷心菜、三葉草、矮牽牛、西紅柿、馬鈴薯、煙堿、菠菜和小扁豆。
47.根據(jù)權(quán)利要求45所述的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞是屬于選自蕓苔屬、煙草屬和矮牽牛屬的屬。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫學(xué)和蛋白質(zhì)工程的交叉領(lǐng)域，且具體來說涉及適用于預(yù)防流感病毒感染的抗原和疫苗。提供重組蛋白抗原、組合物以及制備和使用所述抗原和亞單位疫苗組合物的方法。在一些實施例中，流感抗原包括血細(xì)胞凝集素多肽神經(jīng)氨酸酶多肽和/或其組合。
文檔編號A61K39/145GK101820903SQ200880111076
公開日2010年9月1日 申請日期2008年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月20日
發(fā)明者維達(dá)季·尤西波夫 申請人:美國弗勞恩霍夫股份有限公司