專利名稱：合成苦馬豆素抗原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物化學(xué)合成苦馬豆素抗原的方法，屬于有機(jī)化學(xué)、毒理學(xué)和免疫學(xué)等技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
苦馬豆素(swainsonine，Sff)是瘋草中的主要有毒生物堿成分，是馬、牛、羊等家畜因采食瘋草后出現(xiàn)大批中毒死亡的主要原因。豆科植物瘋草的粗蛋白含量高達(dá)11% 12%，與苜蓿相當(dāng)，有著被作為優(yōu)良飼草的潛力，同時(shí)，在防沙固沙中具有重要作用。近年的研究表明，SW具有顯著的抗癌活性，為瘋草的深入研究與應(yīng)用提供了更為廣闊的前景。因此，如何解決正確有效的防治家畜中毒與充分利用的矛盾，日益成為廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)。已經(jīng)證明，通過(guò)制備SW-BSA抗原免疫山羊，能夠使山羊采食瘋草后中毒的時(shí)間顯著延遲，顯示出其在防治家畜中毒方面的應(yīng)用前景，但所用的制備方法程序繁瑣，反應(yīng)過(guò)程檢測(cè)困難，產(chǎn)率低，抗原成本過(guò)高，抗原的免疫原性不盡如人意，限制了其進(jìn)一步研究應(yīng)用。研究SW中毒機(jī)理和動(dòng)物體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)以及抗癌機(jī)制等急需建立一種SW免疫化學(xué)檢測(cè)新方法，也為SW抗原的制備從而獲得高效價(jià)的抗體提出了新的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種合成苦馬豆素抗原的方法。通過(guò)新的技術(shù)路線，探索程序簡(jiǎn)單、過(guò)程易于控制和監(jiān)測(cè)，抗原性好，特異性強(qiáng)的合成方法，為其進(jìn)一步研究應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種合成苦馬豆素抗原的方法，首先將鹵烴基芳基脂肪酸與醇反應(yīng)生成鹵烴基芳基脂肪酸酯，與苦馬豆素反應(yīng)生成帶有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的季銨鹽，再與氫氧化鈉反應(yīng)脫酯生成鈉鹽，鹽酸調(diào)節(jié)PH，生成SW-鹵烴基芳基脂肪酸；最后與牛血清白蛋白(BSA)縮合成為 SW-BSA，過(guò)葡聚糖凝膠柱層析脫鹽，冷凍干燥，測(cè)定其中BSA與SW的比例，免疫佐劑乳化得到SW免疫抗原。根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成苦馬豆素抗原的方法，其特征在于，具體制備按以下步驟進(jìn)行第一步，化合物1的合成取60mL無(wú)水甲醇，冰浴冷卻同時(shí)攪拌下逐滴加入約40ml乙酰氯，接著加入0. 1 IOg對(duì)氯甲基苯甲酸，攪拌過(guò)夜。減壓蒸除溶劑，殘留物進(jìn)行硅膠柱層析分離，氯仿為洗脫劑，分步收集，得對(duì)氯甲基苯甲酸甲酯；將1. 71 171mg(0. 1 IOmmol)的SW和2倍量的對(duì)氯甲基苯甲酸甲酯溶于IOml 干燥丙酮，再加入催化量的NaI ；80°C水浴加熱回流反應(yīng)，TLC跟蹤檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，約24h后反應(yīng)完全。蒸除丙酮，殘留物進(jìn)行硅膠柱層析，依次用氯仿和氯仿-甲醇(1 1)洗脫，收集氯仿-甲醇洗脫部分，蒸除溶劑后得白色固體，即化合物1 ；
第二步化合物2的合成將化合物1溶于6ml甲醇，加入6mL 6mol/L NaOH溶液，攪拌反應(yīng)2h ；用6mol/L HCl調(diào)pH 5-6 ；70°C減壓蒸除溶劑，向殘留物中加入5ml無(wú)水甲醇，攪拌數(shù)分鐘，過(guò)濾，濾渣再用5ml甲醇洗滌，收集并合并濾液和洗滌液，蒸除溶劑；殘留物進(jìn)行硅膠柱層析，甲醇洗脫，分步收集；TLC檢測(cè)，收集目標(biāo)物，合并目標(biāo)管，減壓蒸除溶劑，得白色固體狀化合物2;第三步，化合物3的合成其操作程序按常規(guī)DCC或EDC法進(jìn)行。將0. 1 IOmmol 化合物 2 和 0. 005 0. 5mmol BSA 溶于 4ml MES 溶液，加入 EDC IOOmg,室溫?cái)嚢柽^(guò)夜；次日，將反應(yīng)液過(guò)s印hadex LH-20柱，無(wú)離子水洗脫，磺基水楊酸檢測(cè)，收集蛋白部分，裝入透析袋濃縮后冷凍干燥，得白色粉末狀目標(biāo)物——化合物3 ；第四步，SW抗原的制備稱取化合物3，即SW-BSA凍干粉，加生理鹽水溶解后，加入等量白油佐劑，充分乳化，即為SW抗原。該發(fā)明涉及的合成路線簡(jiǎn)單，反應(yīng)體系穩(wěn)定，可通過(guò)紫外檢測(cè)儀對(duì)反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，同時(shí)還可采用紫外光譜分析測(cè)定抗原上SW和BSA的摩爾比?？乖瓰榘咨蜖?， 有效含量5mg/mL，免疫有效期12個(gè)月，有效保護(hù)率達(dá)到90%以上。該抗原可用于制備抗SW 單克隆抗體和研究用高效價(jià)抗SW抗體，也可用于動(dòng)物免疫，避免動(dòng)物因采食瘋草引起的中毒。動(dòng)物經(jīng)免疫后的抗體水平可通過(guò)以SW-OVA作為包被抗原的間接ELISA法檢測(cè)。


圖1為SW-氯甲基苯甲酸甲酯的質(zhì)譜(MS)；圖2為SW-氯甲基苯甲酸甲酯的1H NMR ；圖3為SW-氯甲基苯甲酸甲酯13C NMR;圖4為關(guān)鍵中間產(chǎn)物苦馬豆素-氯甲基苯甲酸的質(zhì)譜(MS)；圖5為關(guān)鍵中間產(chǎn)物苦馬豆素-氯甲基苯甲酸的 NMR ；圖6為關(guān)鍵中間產(chǎn)物苦馬豆素-氯甲基苯甲酸的13C NMR ；圖7為氯化N-(4-氨甲?；郊谆?苦馬豆素銨的質(zhì)譜(MS)；圖8為氯化N-(4-氨甲酰基苯甲基)苦馬豆素銨的1H NMR ；圖9為氯化N-(4-氨甲?；郊谆?苦馬豆素銨的13C NMR ；圖10化合物1和化合物2層析圖，其中B為SW-氯甲基苯甲酸；A為SW-氯甲基苯甲酸甲酯。圖11為SW-BSA和酰胺紫外掃描結(jié)果；BSA，Sff-BSA濃度均為0. 5X 10_5mol/L，酰胺濃度為 8. 77Xl(T5mol/L。
具體實(shí)施例方式為了更清楚的說(shuō)明本發(fā)明，特給出實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
實(shí)施例1人工抗原的合成 按以下技術(shù)路線進(jìn)行首先將鹵烴基芳基脂肪酸與醇反應(yīng)生成鹵烴基芳基脂肪酸酯，后者再與苦馬豆素反應(yīng)生成帶有芳環(huán)結(jié)構(gòu)的苦馬毒素季銨鹽。所得產(chǎn)物再與氫氧化
4鈉發(fā)生酯水解反應(yīng)，生成SW-芳基脂肪酸結(jié)合物，最后與牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白
(OVA)縮合成含有芳環(huán)橋的SW-BSA結(jié)合物(SW人工抗原)。
權(quán)利要求
1.一種合成苦馬豆素抗原的方法，其特征在于，首先將鹵烴基芳基脂肪酸與醇反應(yīng)生成鹵烴基芳基脂肪酸酯，與苦馬豆素反應(yīng)生成帶有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的季銨鹽，再與氫氧化鈉反應(yīng)脫酯生成鈉鹽，鹽酸調(diào)節(jié)PH，生成SW-鹵烴基芳基脂肪酸；最后與牛血清白蛋白(BSA)縮合成為SW-BSA，過(guò)葡聚糖凝膠柱層析脫鹽，冷凍干燥，測(cè)定其中BSA與SW的比例，免疫佐劑乳化得到SW免疫抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成苦馬豆素抗原的方法，其特征在于，具體制備按以下步驟進(jìn)行第一步，化合物1的合成取60mL無(wú)水甲醇，冰浴冷卻同時(shí)攪拌下逐滴加入約40ml乙酰氯，接著加入0. 1 IOg 對(duì)氯甲基苯甲酸，攪拌過(guò)夜。減壓蒸除溶劑，殘留物進(jìn)行硅膠柱層析分離，氯仿為洗脫劑，分步收集，得對(duì)氯甲基苯甲酸甲酯；將1. 71 171mg(0. 1 IOmmol)的SW和2倍量的對(duì)氯甲基苯甲酸甲酯溶于IOml干燥丙酮，再加入催化量的NaI ；80°C水浴加熱回流反應(yīng)，TLC跟蹤檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，約24h后反應(yīng)完全。蒸除丙酮，殘留物進(jìn)行硅膠柱層析，依次用氯仿和氯仿-甲醇(1 1)洗脫，收集氯仿-甲醇洗脫部分，蒸除溶劑后得白色固體，即化合物1 ；第二步化合物2的合成將化合物1溶于6ml甲醇，加入6mL 6mol/L NaOH溶液，攪拌反應(yīng)2h ；用6mol/L HCl 調(diào)pH 5-6 ;70°C減壓蒸除溶劑，向殘留物中加入5ml無(wú)水甲醇，攪拌數(shù)分鐘，過(guò)濾，濾渣再用 5ml甲醇洗滌，收集并合并濾液和洗滌液，蒸除溶劑；殘留物進(jìn)行硅膠柱層析，甲醇洗脫，分步收集；TLC檢測(cè)，收集目標(biāo)物，合并目標(biāo)管，減壓蒸除溶劑，得白色固體狀化合物2 ；第三步，化合物3的合成其操作程序按常規(guī)DCC或EDC法進(jìn)行。將0. 1 IOmmol化合物2和0. 005 0. 5mmol BSA溶于4ml MES溶液，加入EDC IOOmg,室溫?cái)嚢柽^(guò)夜；次日，將反應(yīng)液過(guò)s印hadex LH-20柱，無(wú)離子水洗脫，磺基水楊酸檢測(cè)，收集蛋白部分，裝入透析袋濃縮后冷凍干燥，得白色粉末狀目標(biāo)物——化合物3 ；第四步，SW抗原的制備稱取化合物3，即SW-BSA凍干粉，加生理鹽水溶解后，加入等量白油佐劑，充分乳化，即為SW抗原。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種合成苦馬豆素抗原的方法，首先將鹵烴基芳基脂肪酸與醇反應(yīng)生成鹵烴基芳基脂肪酸酯，與苦馬豆素反應(yīng)生成帶有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的季銨鹽，再與氫氧化鈉反應(yīng)脫酯生成鈉鹽，鹽酸調(diào)節(jié)pH，生成SW-鹵烴基芳基脂肪酸；最后與牛血清白蛋白(BSA)縮合成為SW-BSA，過(guò)葡聚糖凝膠柱層析脫鹽，冷凍干燥，測(cè)定其中BSA與SW的比例，免疫佐劑乳化得到SW免疫抗原?？乖瓰榘咨蜖?，有效含量5mg/mL，免疫有效期12個(gè)月，有效保護(hù)率達(dá)到90％以上。
文檔編號(hào)C07K14/765GK102250238SQ20111012469
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月16日
發(fā)明者周樂(lè), 宋毓民, 王建華, 王愛(ài)華, 靳亞平 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)