專利名稱：一種提取靈芝菌絲體胞內(nèi)多糖的工藝和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥生產(chǎn)技術(shù)，具體地說是一種提取靈芝菌絲體胞內(nèi)多糖 工藝及其確定方法
背景技術(shù)：
靈芝是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，中醫(yī)上有滋補(bǔ)強(qiáng)壯，扶正固本的作用，至今已有2000 多年的使用歷史?？茖W(xué)研究認(rèn)為，靈芝具有雙向免疫調(diào)節(jié)、降血脂、抗衰老和 抗腫瘤等多種作用，這些功能來自于靈芝的多種生物活性物質(zhì)，靈芝多糖就是 其中的主要成分。
靈芝多糖廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域，市場(chǎng)需求量與日俱增，但目前靈 芝多糖的生產(chǎn)幾乎都是從子實(shí)體中提取，靈芝野生資源缺乏，人工栽培的周期 長(zhǎng)(2-3個(gè)月以上)，占地面積大，又受季節(jié)限制，從而影響了靈芝的充分利用。 利用深層發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)靈芝菌絲體多糖，其生物功效和靈芝子實(shí)體多糖幾乎相 同，而其生產(chǎn)周期短(7—10天)、成本低、產(chǎn)量大，具有工業(yè)化的生產(chǎn)前景。
在深層發(fā)酵中形成的靈芝菌絲體多糖分胞外多糖和胞內(nèi)多糖兩部分，而胞 內(nèi)多糖占了60-90%，是靈芝多糖菌絲體多糖的主要來源。常用的提取多糖方式 有熱水浸提法、酸浸提取法、堿提取法、酶提取法等。由于菌絲體細(xì)胞壁的存 在，細(xì)胞內(nèi)的組分難以順利釋放到胞外，細(xì)胞內(nèi)外的果膠質(zhì)和蛋白質(zhì)等非多糖 物質(zhì)也使多糖的提取效率和純度受到影響，傳統(tǒng)的一些提取多糖方式致使靈芝 多糖的提取過程耗時(shí)長(zhǎng)、提取率低、提取物中多糖含量相對(duì)較低，或者因化學(xué) 試劑的反應(yīng)而破壞了多糖的分子活性構(gòu)像。因此，尋找高效的多糖提取方法是 發(fā)展靈芝菌絲體多糖是這一領(lǐng)域的關(guān)鍵。天然藥用成分大多為細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物，提取時(shí)多需進(jìn)行細(xì)胞破碎，而現(xiàn)有的機(jī)械和化學(xué)方法有時(shí)難于取得理想的破碎效果。將超聲波技術(shù)應(yīng)用于靈芝菌絲體多糖的提取，是利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、高加速度、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、攪拌等作用，加速有效成分進(jìn)入溶劑，從而提高浸出率，縮短提取時(shí)間，同時(shí)可避免對(duì)提出成分的影響。此技術(shù)在中藥有效成分提取、分離與制備工藝中已被廣泛應(yīng)用。
在菌絲體多糖的提取過程中，還可利用合適的酶，在較溫和的條件下將細(xì)胞組織分解，加速有效成分的釋放，從而提高多糖得率。將纖維素酶、果膠酶及蛋白酶組成的復(fù)合酶用于多糖的提取，以除去細(xì)胞壁胞和細(xì)膜上的果膠、纖維素及蛋白質(zhì)等成分，使得菌絲體細(xì)胞順利破裂,有利于促進(jìn)胞內(nèi)多糖的溶出，以達(dá)到提高提取率、縮短提取時(shí)間、減少能耗和有效保存多糖生物活性的目的。但由于加酶提取會(huì)提高生產(chǎn)成本，同時(shí)也給產(chǎn)物的分離帶來困難，在添加量上要嚴(yán)格控制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，利用超聲波作為輔助手段對(duì)靈芝菌絲體組織進(jìn)行處理，同時(shí)以纖維素酶、果膠酶及蛋白酶組成的復(fù)合酶對(duì)靈芝菌絲體水浸液酶解獲得靈芝多糖，提供一種具有比常規(guī)方法更佳的提取效果，以較低的成本提取靈芝菌絲體胞內(nèi)多糖工藝及其確定方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是 一種提取靈芝菌絲體胞內(nèi)多糖工藝組合，料液比按質(zhì)量比為l: 10— 1: 60，復(fù)合酶加入量在原料質(zhì)量的0.5%—5.0%之間，超聲波功率范圍值為100 W - 500 W之間，酶解時(shí)間范圍值為40 min - 100 min之間，酶解溫度范圍值為30。C-60 。C之間，酶解pH值范圍值為4.0-8.0之間。所述的提取靈芝菌絲體胞內(nèi)多糖工藝和方法為
1) 選取優(yōu)質(zhì)的菌絲體深層發(fā)酵所得的菌絲體干粉
2) 確定料液比
將步驟1)選定的菌絲體干粉充分溶入水中，靈芝菌絲體合理料液比在1:
10 (g:g) — 1: 60 (g:g)之間；在該料液比條件下，進(jìn)行熱水浸提多糖實(shí)驗(yàn)，控制浸提溫度為50 95 °C、浸提pH值4.0 7.5、浸提時(shí)間40 min 120 min范圍內(nèi)；浸提液蒸發(fā)濃縮5 15倍后，加入4倍體積的95%乙醇沉淀，2000rmp離心后去除上清液，真空干燥至恒重，稱量；通過比較，確定熱水浸提獲得的靈芝菌絲體胞內(nèi)多糖提取率最高的料液比，就是本品種的最佳料液比。3)確定復(fù)合酶的添加量
根據(jù)上面步驟2)中的最佳料液比配成的浸提液原料中，加入合理的復(fù)合酶量，范圍在浸提液原料質(zhì)量的0.5%—5.0%之間；在合適的酶解條件下，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，確定最適的復(fù)合酶的添加量；在該復(fù)合酶的添加量條件下，控制浸提溫度為40 65 。C、浸提pH值4.0 6.5、浸提時(shí)間40min 80min范圍內(nèi)；浸提液蒸發(fā)濃縮5 15倍后，加入4倍體積的95%乙醇沉淀，2000rmp離心后去除上清液，真空干燥至恒重，稱量；通過比較，確定靈芝菌絲體胞內(nèi)多糖提取率最高的復(fù)合酶的添加量，既為本品種的最佳復(fù)合酶的添加量。
4)確定超聲波-復(fù)合酶解法提取本菌絲體干粉多糖的最佳提取工藝組合在超聲波輔助作用下進(jìn)行靈芝發(fā)酵菌絲體多糖的復(fù)合酶解提??；在步驟2)和3)的料液比和復(fù)合酶添加量的條件下，以超聲波功率(因素A)、酶解時(shí)間(因素B)、酶解溫度(因素C)、酶解pH值(因素C)為分析對(duì)象，進(jìn)行4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，獲得最佳提取工藝組合；根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因素A的實(shí)驗(yàn)范圍值為IOO W - 500 W之間，因素B的實(shí)驗(yàn)范圍值為40 min - 100 min之間，因素C的實(shí)驗(yàn)范圍值為30°060 。C之間，因素D的實(shí)驗(yàn)范圍值為4.0-8.0之間；在該提取組合工藝條件下，進(jìn)行菌絲體多糖提取，浸提液蒸發(fā)濃縮5 15倍后，加入4倍體積的95%乙醇沉淀，2000rmp離心后去除上清液，真空干燥至恒重，稱量；通過比較，確定靈芝菌絲體胞內(nèi)多糖提取率最高的工藝組合，既為本菌絲體干粉的最佳提取工藝組合。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)
1、 利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、超高的速度、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)，可加速藥物有效成分進(jìn)入溶劑。
2、 復(fù)合酶的加入，有效地分解了這些非多糖組分，在超聲波機(jī)制的協(xié)同作用下，可更加徹底地提高多糖的得率，縮短提取時(shí)間，節(jié)約溶劑，有利于保護(hù)多糖有效成分。
3、 技術(shù)在靈芝菌絲體多糖的提取工藝改造中，可顯著降低生產(chǎn)成本，提高分離效率，并適合在工業(yè)化生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l、
靈芝菌赤芝22號(hào)菌株(浙江省林業(yè)科學(xué)研究院提供)菌絲體深層發(fā)酵所得的菌絲體干粉多糖提取工藝組合，其組成是料液比按質(zhì)量比為l: 30，復(fù)合酶加入量為2%，超聲波功率為200W ，酶解時(shí)間50min，酶解溫度55'C，酶解pH值5.0時(shí)。
所述的提取靈芝菌絲體胞內(nèi)多糖工藝的確定方法為
1)選用靈芝菌赤芝22號(hào)菌株(浙江省林業(yè)科學(xué)研究院提供)菌絲體深層發(fā)酵所得的菌絲體干粉。
2) 確定料液比
通過熱水浸提法提取多糖。選取步驟1)的菌絲體干粉100g，以加水倍數(shù)
為分析因素，設(shè)置IO、 20、 30、 40、 50、 60倍(質(zhì)量倍數(shù))，加熱至9(TC維持3小時(shí)，過濾。將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至100ml，冷卻至常溫。力n400ml的959&乙醇于濃縮液中，同時(shí)用玻璃棒攪拌10分鐘，將混合液1000rmp離心2分鐘，去除上清液，得菌絲體多糖沉淀，真空干燥至恒重后稱量。發(fā)現(xiàn)加入30倍重量(3000g)的水后，再增加水的倍數(shù)提取獲得多糖量變化不大，故確定料液比為l: 30。3) 確定復(fù)合酶的添加量
通過復(fù)合酶解法提取多糖。以復(fù)合酶制劑添加量為實(shí)驗(yàn)因素，在料液比為l:30，溫度45'C， pH6.5，酶解時(shí)間80min的條件下，復(fù)合酶添加量設(shè)置為O. 5°/0、1.0%、 1.5%、 2.0%、 2.5%、 3.0%、 3.5% (相對(duì)菌絲體干粉的質(zhì)量百分比)，酶解時(shí)間80min后，95r加熱滅酶5min， 8CTC熱水繼續(xù)浸提60min，過濾后濾液處理步驟同l，獲得的靈芝菌絲體胞內(nèi)多糖，稱量。發(fā)現(xiàn)復(fù)合酶添加量設(shè)置為2.0%以后，再增加復(fù)合酶添加量，酶解浸提獲得的靈芝菌菌絲體胞內(nèi)多糖變化不大，故確定復(fù)合酶添加量為2. 0%。
4)確定本菌絲體干粉的最佳提取工藝組合
通過超聲波-復(fù)合酶解法提取多糖。在料液比為l: 30，加酶量2.0%的條件下，以超聲波功率(因素A)、酶解時(shí)間(因素B)、酶解溫度(因素C)、酶解pH值(因素C)為分析對(duì)象，進(jìn)行4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，正交因素水平表如下影響因素水平l水平2水平3
超聲波功率(A)100W200W300W
酶解時(shí)間(B)50min70min90min
酶解溫度(Q35 °C45 °C55 °C
酶解pH值(D)5.06.07.0
在各個(gè)正交組合條件下的超聲波-復(fù)合酶解法操作后，酶解時(shí)間95"C加熱滅 酶5min， 8(TC熱水繼續(xù)浸提60niin，過濾后濾液處理步驟同l，獲得的靈芝菌菌絲 體胞內(nèi)多糖，稱量。
試驗(yàn)結(jié)果表明，在A必C3Di的工藝組合條件下，菌絲體胞內(nèi)多糖提取率最高， 即當(dāng)料液比為l: 30，加酶量2.0%條件下，超聲波功率為200W ，酶解時(shí)間50min， 酶解溫度55X:，酶解pH值5.0時(shí)，菌絲體胞內(nèi)多糖提取率最高。
實(shí)施例2、
靈芝菌赤芝38號(hào)菌株(浙江省林業(yè)科學(xué)研究院提供)菌絲體深層發(fā)酵所得 的菌絲體干粉多糖提取工藝組合，其組成是料液比按質(zhì)量比為l: 40，加酶量3.0% 條件下，超聲波功率為150W ，酶解時(shí)間40min，酶解溫度45。C，酶解pH值7.0。
所述的提取靈芝菌絲體胞內(nèi)多糖工藝的確定方法為
1) 選用靈芝菌赤芝38號(hào)菌株(浙江省林業(yè)科學(xué)研究院提供)菌絲體深層發(fā) 酵所得的菌絲體干粉
2) 確定料液比
通過熱水浸提法提取多糖。選取步驟l)的菌絲體干粉100g，以加水倍數(shù)為 分析因素，設(shè)置20、 30、 40、 50、 60倍(質(zhì)量倍數(shù))，加熱至90。C維持3小時(shí)，過濾。將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至100ml，冷卻至常溫。力n400ml的95y。乙醇于濃 縮液中，同時(shí)用玻璃棒攪拌10分鐘，將混合液1000rmp離心2分鐘，去除上清液， 得菌絲體多糖沉淀，真空干燥至恒重后稱量。發(fā)現(xiàn)加入40倍重量(4000g)的水 后，再增加水的倍數(shù)提取獲得的多糖量增加量不大，故確定料液比為l: 40。 3)確定復(fù)合酶的添加量
通過復(fù)合酶解法提取多糖。以復(fù)合酶制劑添加量為實(shí)驗(yàn)因素，在料液比為l: 40，溫度45。C， p朋.5，酶解時(shí)間80min的條件下，復(fù)合酶添加量設(shè)置為O. 5%、 1.0%、 1,5%、 2.0%、 2.5%、 3.0%、 3.5% (相對(duì)菌絲體干粉的質(zhì)量百分比)，酶 解時(shí)間80min后，95匸加熱滅酶5min， 8CTC熱水繼續(xù)浸提60min，過濾后濾液處理 步驟同l，獲得的靈芝菌絲體胞內(nèi)多糖，稱量。發(fā)現(xiàn)復(fù)合酶添加量為3.0%的條件 下，再增加酶的添加量酶解浸提獲得的靈芝菌菌絲體胞內(nèi)多糖變化不大，故確 定復(fù)合酶合理添加量為3. 0%。
4)確定本菌絲體干粉的最佳提取工藝組合
通過超聲波-復(fù)合酶解法提取多糖。在料液比為l: 40，加酶量3.0%的條件下， 以超聲波功率(因素A)、酶解時(shí)間(因素B)、酶解溫度(因素C)、酶解pH值 (因素C)為分析對(duì)象，進(jìn)行4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，正交因素水平表如下
影響因素
水平l 水平2 水平3
超聲波功率(A) 酶解時(shí)間(B) 酶解溫度CC)
100W 150W 250W
50min 70min 90min
35 。C 45 °C 55 °C
酶解pH值(D)
5.0 6.0 7.0
在各個(gè)正交組合條件下的超聲波-復(fù)合酶解法操作后，酶解時(shí)間95'C加熱滅酶5min， 80。C熱水繼續(xù)浸提60min,過濾后濾液處理步驟同l，獲得的靈芝菌菌絲
體胞內(nèi)多糖，稱量。
試驗(yàn)結(jié)果表明，在A2BiC2D3的工藝組合條件下，菌絲體胞內(nèi)多糖提取率最高， 即當(dāng)料液比為l: 40，加酶量3.0%條件下，超聲波功率為150W ，酶解時(shí)間40min， 酶解溫度45。C，酶解pH值7.0時(shí)，菌絲體胞內(nèi)多糖提取率最高。
權(quán)利要求
1、一種提取靈芝菌絲體胞內(nèi)多糖工藝組合，其特征在于各組分為液比按質(zhì)量比為1∶10-1∶60，復(fù)合酶加入量在原料質(zhì)量的0.5％-5.0％之間，超聲波功率范圍值為100W-500W之間，酶解時(shí)間范圍值為40min-100min之間，酶解溫度范圍值為30℃-60℃之間，酶解pH值范圍值為4.0-8.0之間。
2、 一種按照權(quán)利要求l所述的提取靈芝菌絲體胞內(nèi)多糖的工藝和方法，其特 征在于1) 選取優(yōu)質(zhì)的菌絲體深層發(fā)酵所得的菌絲體干粉2) 確定料液比將步驟1)選定的菌絲體干粉充分溶入水中，靈芝菌絲體合理料液比在1: 10 (g:g) — 1: 60 (g:g)之間，在該料液比條件下，進(jìn)行熱水浸提多糖 實(shí)驗(yàn)，控制浸提溫度為50 95 °C、浸提pH值4. 0 7. 5、浸提時(shí)間40min 120min范圍內(nèi)，浸提液蒸發(fā)濃縮5 15倍后，加入4倍體積的95%乙醇沉淀， 2000rmp離心后去除上清液，真空干燥至恒重，稱量，通過比較，確定熱水 浸提獲得的靈芝菌絲體胞內(nèi)多糖提取率最高的料液比，就是本品種的最佳 料液比；3)確定復(fù)合酶的添加量根據(jù)上面步驟2)中的最佳料液比配成的浸提液原料中，加入合理的復(fù)合 酶量，范圍在浸提液原料質(zhì)量的0.5%—5.0%之間，在合適的酶解條件下， 進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，確定最適的復(fù)合酶的添加量，在該復(fù)合酶的添加量條件 下，控制浸提溫度為40 65 °C、浸提pH值4. 0 6. 5、浸提時(shí)間40 min 80 min范圍內(nèi)，浸提液蒸發(fā)濃縮5 15倍后，加入4倍體積的95%乙醇沉淀，2000rmp離心后去除上清液，真空干燥至恒重，稱量，通過比較，確定靈芝 菌絲體胞內(nèi)多糖提取率最高的復(fù)合酶的添加量，既為本品種的最佳復(fù)合酶 的添加量；4)確定超聲波-復(fù)合酶解法提取本菌絲體干粉多糖的最佳提取工藝組合 在超聲波輔助作用下進(jìn)行靈芝發(fā)酵菌絲體多糖的復(fù)合酶解提取，在步驟2) 和3)的料液比和復(fù)合酶添加量的條件下，以超聲波功率(因素A)、酶解 時(shí)間(因素B)、酶解溫度(因素C)、酶解pH值(因素C)為分析對(duì)象，進(jìn) 行4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，獲得最佳提取工藝組合，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因素 A的實(shí)驗(yàn)范圍值為IOO W - 500 W之間，因素B的實(shí)驗(yàn)范圍值為40 min - 100 min 之間，因素C的實(shí)驗(yàn)范圍值為3(TC-60 "C之間，因素D的實(shí)驗(yàn)范圍值為4. 0-8.0 之間，在該提取組合工藝條件下，進(jìn)行菌絲體多糖提取，浸提液蒸發(fā)濃縮5 15倍后，加入4倍體積的95。/。乙醇沉淀，2000rmp離心后去除上清液，真空干 燥至恒重，稱量，通過比較，確定靈芝菌絲體胞內(nèi)多糖提取率最高的工藝組 合，既為本菌絲體干粉的最佳提取工藝組合。
全文摘要
一種提取靈芝菌絲體胞內(nèi)多糖工藝組合，料液比按質(zhì)量比為1∶10-1∶60，復(fù)合酶加入量在原料質(zhì)量的0.5％-5.0％之間，超聲波功率范圍值為100W-500W之間，酶解時(shí)間范圍值為40min-100min之間，酶解溫度范圍值為30℃-60℃之間，酶解pH值范圍值為4.0-8.0之間。所述的提取靈芝菌絲體胞內(nèi)多糖工藝和方法為選取優(yōu)質(zhì)的菌絲體深層發(fā)酵所得的菌絲體干粉；確定料液比；確定復(fù)合酶的添加量；確定超聲波-復(fù)合酶解法提取本菌絲體干粉多糖的最佳提取工藝組合。
文檔編號(hào)A61P3/06GK101560260SQ200910007918
公開日2009年10月21日 申請(qǐng)日期2009年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月26日
發(fā)明者李衛(wèi)旗 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)