專(zhuān)利名稱(chēng)：薺菜高純度單體黃酮及其總黃酮的制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種來(lái)源于薺菜藥材的總黃酮的制備方法 及其在制備治療心血管疾病藥物中的用途。
背景技術(shù)：
據(jù)世界衛(wèi)生組織2008年IO月份報(bào)道心血管疾病、傳染病和癌癥是 當(dāng)前導(dǎo)致人類(lèi)死亡的三大主要原因，其中死于心血管疾病的人數(shù)最多，占 全球總死亡人數(shù)的29%。據(jù)世界心臟聯(lián)盟分析預(yù)計(jì)，2020年全球心血管病 死亡率將增加50%,其心血管病死亡人數(shù)將高達(dá)2500萬(wàn)人，其中1900萬(wàn) 發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。目前心血管疾病也是中國(guó)人健康的"頭號(hào)殺手"。我國(guó) 每年死于心血管疾病人數(shù)近300萬(wàn)(約占人口總死亡率45% )，用于心血 管疾病的醫(yī)療費(fèi)高達(dá)1300億元。隨著人們生活水平的提高，人口老齡化以 及人們的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，活動(dòng)量減少，膽固醇的攝入量和體重指數(shù)都 在增加，這些都是引發(fā)心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素。我國(guó)近年來(lái)心腦血管疾 病發(fā)病率逐年上升，特別是在北方地區(qū)。目前，我國(guó)正處于心血管疾病爆 發(fā)的"窗口期"，必須及時(shí)釆取有效的干預(yù)行動(dòng)，阻止心血管病的快速發(fā)展。 心血管疾病病種多、發(fā)病率高、與人類(lèi)生存關(guān)系密切。因此預(yù)防和治療心 血管疾病曰益受到人們的關(guān)注，雖然目前巿場(chǎng)上治療心血管疾病的藥物種 類(lèi)較^,但人們攻克心血管疾病的研究^^當(dāng)務(wù)之急。
薺菜為十字花禾斗 (Cruciferae)植物薺菜Cbp5"e〃a 6wm/漏/7ostor/s (L.) Medic.的干燥全草。我國(guó)各地均有分布，江蘇、安徽及上海郊區(qū)有栽培， 具有清熱利濕、平肝明目、涼血止血、和胃消滯之功效，其主要活性成分 為黃酮類(lèi)成分。薺菜之名始見(jiàn)于唐，孫思邈《千金食治》中。在此之前均稱(chēng) 為薺。本品入藥始見(jiàn)于梁《陶弘景《名醫(yī)別錄》，列入上品。明，李時(shí)珍《本 草綱目》釋其名日"薺生濟(jì)濟(jì)，故謂之薺"。考薺菜的"薺"同"齊"，"齊"
者"濟(jì)"也，此草饑時(shí)能作菜果腹延生，傷時(shí)可止血活命.功效頗大，作用 齊全而故名。古代的薺菜，種類(lèi)繁雜。宋.唐慎微《證類(lèi)本草》引梁代名醫(yī) 陶弘景的話說(shuō)"薺類(lèi)甚多"；《本草經(jīng)集注》云"薺類(lèi)又多，此是今人可食 者，葉作菹亦佳?！对?shī)》云誰(shuí)謂茶苦，其甘如薺是也。"
國(guó)外曾在上個(gè)世紀(jì)70年代對(duì)薺菜進(jìn)行化學(xué)成分研究，發(fā)現(xiàn)其含有的黃 酮類(lèi)成分有蕓香苷(rutin)、橙皮苷 (hesperidin) [Jurisson, S.Flavonoid substances of Capsella bursa誦pastoris. Farmatsiya. 1973,22(5): 34-35]、 二氫非 瑟素(dihydrofisetin)、山柰^-4-甲醚(kaempferol-4 - methylether)、槲皮 素-3-甲醚 (quercetin-3-methylether)、 棉花皮素六甲醚 (gossypetin hexam勿l ether)、香葉木苷(diosmin)、刺槐乙素(robinetin)、 3，4'，7-三羥 基黃院酉同(garbanzol) [Wohlfart Ran享ier， Gademann Rolf, Kirchner Carl Peter. Physiolbgical-chemical observationai changes ih the flavonoid pattern of Capsella bursa-pastoris, Deut. Apoth,Ztg. 1972, 、12(30): 1158-1160]、獐牙菜 素(swertisin) [Al-khalil Suleiman, Abu Zarga Musa， Zeitoun Nissreen， et al.Chemical constituents of Capsella bursa-pastoris. Alexandria J. Pharm. Sci. 2000， 14(2): 91-94]、木樨草素-7-0-蕓香||苷(luteolin-7-O-galactoside)、木 褲草素-7_0-半乳糖苷(luteolin-7-O-rutinoside) [Nazmi Sabri N, Sarg T, Seif-El Din A. A. Phytochemical investigation of Capsella bursa-pastoris(L.) Medic, growing in Egypt. Egypt.丄Pharm. Sci. 1975， 16(4): 52卜522.]。國(guó)內(nèi);^ 薺菜的研究較少，尚未有薺菜中化學(xué)成分的研究，亦未見(jiàn)薺菜中總黃酮用 于心血管疾病的相關(guān)文獻(xiàn)及專(zhuān)利。近年，我們對(duì)薺菜進(jìn)行化學(xué)成分研究， 分離鑒定多種黃酮類(lèi)化合物，如小麥黃素(tricin)、山柰酚(kaempferol)、 槲皮素(quercetin)、山柰酚-7-0-a-L-吡喃鼠李糖苷(kaempferol-7-O-a-L-rhamnopyranoside )、槲皮素-3-O-p-D-吡喃葡萄糖苷
(quercetin-3-0-卩國(guó)D-glucopyanoside )、 異葒草苷 (isoorientin )、 山柰酴 -3-O-p-D- p比喃楊萄糖-7-O-a-L-吡喃鼠李糖苷(kaempferol-3-0-p-D-glucopyanosyl -7-O-a-L-rhamnopyranoside )、槲皮素-3-0-p-D-吡喃葡萄糖 -7-O-a-L- p比喃鼠李糖苷 (quercetin-3-0-卩-D-glucopyanosyl -7-O-a-L-rhamnopyranoside )、 山柰酚 -3-0- 蕓香糖眷
(kaempferol-3-O-rutinoside ) [Ning Song, Wei Xu, Hongfeng Guan, Xiaoqiu Liu, Yibo ^Vang, Xiaoling Nie. Several Flavonoids from Ga/we〃a 6腦a-; aston'51. A/aw J"owmar/ rra幽'o"a/ M^c/wes， 2007， 2 (5) : 218-222 ] 和2"-0-ct-丄-阿拉伯糖異葒草苷[宋寧，王榮榮，李占琳，劉曉秋，李文， 裴月湖.2D-NMR對(duì)薺菜中一個(gè)黃酮苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，波譜學(xué)雜志，2009, 26 ( 1 ): 88-94.]等。本發(fā)明提供了簡(jiǎn)便快速、造價(jià)低廉且適合工業(yè)化大生 產(chǎn)的制備薺菜總黃酮和高純度單體黃酮的方法及總黃酮在心血管疾病方面
本發(fā)明的目的之一在于提供一種來(lái)源于薺菜的總黃酮及一種或多種黃 酮的組合物。
本發(fā)明的目的之二在于提供所述薺菜總黃酮的用途。 本發(fā)明提供的薺菜的總黃酮類(lèi)，是從薺菜藥材中提取的，其總黃酮的 含量在60%以上，所述高純度單體黃酮包括異葒草苷和2"-0-cd-阿拉伯糖
異葒草苷。
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薺菜總黃酮的制備方法包括如下步驟
1) 預(yù)處理將采收后的薺菜藥材曬干后切段，備用；
2) 提取加入5~12倍量的50~90%的提取溶劑進(jìn)行回流提取1~4 次，每次提取時(shí)間為0.5~3h，濾過(guò)，合并濾液；或加入5 10倍量的50~
的用途。 發(fā)明內(nèi)容90%的提取溶劑冷浸12h~ 48h,濾過(guò)，合并濾液；或加入5 15倍量的50 ~ 90%的提取溶劑超聲0.5~3小時(shí)，過(guò)濾，合并濾液。所述的提取溶劑為甲 醇、乙醇或丙酮。
3) 濃縮將步驟2)得到的濾液濃縮干燥，得到薺菜提取浸膏。
4) 上柱將步驟3)得到的浸膏以上樣于AB-8或HPD-600或D101 型大孔樹(shù)脂，上樣流速為l~3BV/h，分別釆用柱徑高比為l: 3~1: 7的大 孔吸附樹(shù)脂，上樣濃度為0.3~0.5g/ml，用30%~90%的濃度乙醇溶液進(jìn)行 洗脫。
5) 制備將收集到的洗脫液過(guò)濾，合并濾液，濃縮干燥，得到薺菜 的總黃酮提取物。
所述步驟2)的提取溶劑為乙醇，溶劑倍量為IO倍量，提取方式為回 流提取，以50%乙醇提取3次，每次提取1.5h。
所述步驟4)的大孔樹(shù)脂柱為AB-8型大孔樹(shù)脂，上樣流速為3BV/h, 柱徑高比為1: 5，乙醇濃度為50%。 所制備的總黃酮的含量在60%以上。
根據(jù)如上方案將步驟4)中選擇大孔樹(shù)脂為AB-8，流速為3BV/h，柱 徑高比為1: 5,上樣濃度為0.5g/ml,乙醇濃度為30%、 50%。得到的不 同乙醇洗脫部分經(jīng)聚酰胺色譜柱或凝膠色譜柱或高效液相半制備色譜柱， 用三氯甲烷或二氯甲烷或甲醇或乙腈或水或它們之間的不同比例的組合 洗脫，得到異葒草苷和2"-0-a-L-阿拉伯糖異葒草苷兩種高純度黃酮單體
化合物
口即將步驟4)得到的50%乙醇洗脫部分流經(jīng)聚酰胺柱色譜，用三氯甲 烷甲醇(20: l)進(jìn)行洗脫，洗脫部分再流經(jīng)SephadexLH-20柱色 譜，用純甲醇進(jìn)行洗脫，洗脫液進(jìn)行過(guò)濾，合并濾液，濃縮干燥，得到異 葒草苷，純度在98%以上。得到的30%乙醇洗脫部分流經(jīng)聚酰胺柱色譜， 用三氯甲烷甲醇(20: l)進(jìn)行洗脫，洗脫部分再流經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜，用純甲醇進(jìn)行洗脫，純甲醇洗脫部分再經(jīng)過(guò)高效液相半制備柱色 譜，用乙腈-水(15:85)進(jìn)行洗脫，洗脫液進(jìn)行過(guò)濾，合并濾液，濃縮干 燥，得到2〃 -O-a-L-阿拉伯糖異葒草苷，純度在98%以上。
本發(fā)明提供的提取方法簡(jiǎn)單、易行，以紫外分光光度法為檢測(cè)手段， 以2"-0-cc-丄-阿拉伯糖異葒草苷為檢測(cè)指標(biāo)，可以對(duì)整個(gè)工藝流程進(jìn)行質(zhì)量 控制，有效地提高了黃酮成分的含量，得到的原料藥純度高，色澤好并且 具有較好的抗心肌缺血缺氧作用；另外，該提取方法使用常規(guī)提取設(shè)備， 造價(jià)低廉，簡(jiǎn)便快速，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、薺菜總黃酮的制備
將釆收后的薺菜藥材曬干后切段，得到的薺菜生藥加入IO倍生藥量 的90%的乙醇回流提取3次，每次提取時(shí)間為1.5h，收集提取液，過(guò)濾， 得到的濾液濃縮干燥，得到薺菜提取浸膏，得到的浸膏以0.5g/ml上樣于 HPD-600型大孔樹(shù)脂，上樣流速為3BV/h,釆用柱徑高比為1: 5，用70%的濃度乙醇溶液進(jìn)行洗脫。洗脫液過(guò)濾，合并濾液，濃縮干燥、粉碎，得 到薺菜總黃酮。本發(fā)明的薺菜總黃酮，其為黃棕色粉末，以2〃-6>- -丄-阿
拉伯糖異葒草苷為對(duì)照品，釆用分光光度法，在270nm測(cè)定吸收度，計(jì) 算總黃酮的含量為61.9%。
實(shí)施例2、薺菜總黃酮的制備
將釆收后的薺菜藥材曬干后切段，得到的薺菜生藥加入8倍生藥量 60%的甲醇冷浸提取12h,收集過(guò)濾液，過(guò)濾，得到的濾液濃縮干燥，得 到薺菜的提取浸膏，得到的浸膏以0.4g/ml上樣于HPD-600型大孔樹(shù)脂， 上樣流速為2BV/h，釆用柱徑高比為1: 5,用30%的濃度乙醇溶液進(jìn)行洗 脫。洗脫液過(guò)濾，合并濾液，濃縮干燥、粉碎，得到薺菜總黃酮。本發(fā)明 的薺菜總黃酮，其為黃棕色粉末，以2〃-0- -丄-阿拉伯糖異葒草苷為對(duì)照 品，采用分光光度法，在270nm測(cè)定吸收度，計(jì)算總黃酮的含量為62.2 %。
實(shí)施例3、薺菜總黃酮的制備
將采收后的薺菜藥材曬干后切段，得到的薺菜生藥加入5倍生藥量 50%的甲醇超聲提取0.511，收集過(guò)濾液，過(guò)濾，得到的濾液濃縮干燥，得 到薺菜的提取浸膏，得到的浸膏以0.3g/ml上樣于HPD-600型大孔樹(shù)脂， 上樣流速為lBV/h,釆用柱徑高比為1: 7,用50%的濃度乙醇溶液進(jìn)行洗 脫。洗脫液過(guò)濾，合并濾液，濃縮干燥、粉碎，得到薺菜總黃酮。本發(fā)明 的薺菜總黃酮，其為黃棕色粉末，以2"-0《-丄-阿拉伯糖異葒草苷為對(duì)照 品，采用分光光度法，在270nm測(cè)定吸收度，計(jì)算總黃酮的含量為61.8 %。
實(shí)施例4、薺菜總黃酮的制備
將采收后的薺菜藥材曬干后切段，得到的薺菜生藥加入7倍生藥量 80。/。的丙酮冷浸提取24h，收集過(guò)濾液，過(guò)濾，得到的濾液濃縮干燥，得到 薺菜的提取浸膏，得到的浸膏以0.3g/ml上樣于AB-8型大孔樹(shù)脂，上樣流 速為2BV/h，采用柱徑高比為l: 5,用40%的濃度乙醇溶液進(jìn)行洗脫。洗 脫液過(guò)濾，合并濾液，濃縮干燥、粉碎，得到薺菜總黃酮。本發(fā)明的薺菜 總黃酮，其為黃棕色粉末，以2"-0- -丄-阿拉伯糖異葒草苷為對(duì)照品，采用 分光光度法，在270nm測(cè)定吸收度，計(jì)算總黃酮的含量為61.4% 。 實(shí)施例5、薺菜總黃酮的制備
將采收后的薺菜藥材曬干后切段，得到的薺菜生藥加入IO倍生藥量 70。/。的乙醇超聲提取lh,收集過(guò)濾液，過(guò)濾，得到的濾液濃縮干燥，得到 薺菜的提取浸膏，得到的浸膏以0.4g/ml上樣于AB-8型大孔樹(shù)脂，上樣 流速為2BV/h，采用柱徑高比為l: 5，用60%的濃度乙醇溶液進(jìn)行洗脫。 洗脫液過(guò)濾，合并濾液，濃縮干燥、粉碎，得到薺菜總黃酮。本發(fā)明的薺 菜總黃酮，其為黃棕色粉末，以2"-0-oc-L-阿拉伯糖異葒草苷為對(duì)照品， 釆用分光光度法，在270nm測(cè)定吸收度，計(jì)算總黃酮的含量為60.2% 。
實(shí)施例6、薺菜總黃酮的制備.
將釆收后的薺菜藥材曬干后切段，得到的薺菜生藥加入10倍生藥量60。/。的乙醇冷浸提取48h,收集過(guò)濾液，過(guò)濾，得到的濾液濃縮干燥，得到 薺菜的提取浸膏，得到的浸膏以0.4g/ml上樣于D-101型大孔樹(shù)脂，上樣 流速為3BV/h,采用柱徑高比為l: 3，用30%的濃度乙醇溶液進(jìn)行洗脫。 洗脫液過(guò)濾，合并濾液，濃縮干燥、粉碎，得到薺菜總黃酮。本發(fā)明的薺 菜總黃酮，其為黃棕色粉末，以2〃-0-a-Z-阿拉伯糖異葒草苷為對(duì)照品，采 用分光光度法，在270nm測(cè)定吸收度，計(jì)算總黃酮的含量為65.4% 。 實(shí)施例7、薺菜總黃酮的制備
將釆收后的薺菜藥材曬干后切段，得到的薺菜生藥加入15倍生藥量 90。/。的丙酮超聲提取3h,收集過(guò)濾液，過(guò)濾，得到的濾液濃縮干燥，得到 薺菜的提取浸膏，得到的浸膏以0.5g/ml上樣于D-101型大孔樹(shù)脂，上樣 流速為2BV/h，釆用柱徑高比為l: 3，用70%的濃度乙醇溶液進(jìn)行洗脫。 洗脫液過(guò)濾，合并濾液，濃縮干燥、粉碎，得到薺菜總黃酮。本發(fā)明的薺 菜總黃酮，其為黃棕色粉末，以2"-0-cc-丄-阿拉伯糖異葒草苷為對(duì)照品， 采用分光光度法，在270nm測(cè)定吸收度，計(jì)算總黃酮的含量為63.2% 。
實(shí)施例8、薺菜總黃酮的制備
將釆收后的薺菜藥材曬干后切段，得到的薺菜生藥加入8倍生藥量的 80%的乙醇回流提取2次，每次提取時(shí)間為3h，收集提取液，濾過(guò)，得到 的濾液濃縮干燥，得到薺菜提取浸膏，得到的浸膏以0.4g/ml上樣于 HPD-600型大孔樹(shù)脂，上樣流速為3BV/h，采用柱徑高比為1: 3,用80% 的濃度乙醇溶液進(jìn)行洗脫。洗脫液過(guò)濾，合并濾液，濃縮干燥、粉碎，得 到薺菜總黃酮。本發(fā)明的薺菜總黃酮，其為黃棕色粉末，以2"-0-a-丄-阿 拉伯糖異葒草苷為對(duì)照品，采用分光光度法，在270nm測(cè)定吸收度，計(jì) 算總黃酮的含量為60.2%。
實(shí)施例9、薺菜總黃酮的制備
將采收后的薺菜藥材曬干后切段，得到的薺菜生藥加入12倍生藥量 的70%的乙醇回流提取3次，每次提取時(shí)間為0.5h，收集提取液，濾過(guò)， 得到的濾液濃縮干燥，得到薺菜提取浸膏，得到的浸膏以0.4g/ml上樣于 HPD-600型大孔樹(shù)脂,上樣流速為3BV/h，采用柱徑高比為1: 3,用70% 的濃度乙醇溶液進(jìn)行洗脫。洗脫液過(guò)濾，合并濾液，濃縮干燥、粉碎，得 到薺菜總黃酮。本發(fā)明的薺菜總黃酮，其為黃棕色粉末，以2"-0-ct-丄-阿 拉伯糖異葒草苷為對(duì)照品，釆用分光光度法，在270nm測(cè)定吸收度，計(jì) 算總黃酮的含量為61.8%。
實(shí)施例10、薺菜總黃酮的制備
將采收后的薺菜藥材曬干后切段，得到的薺菜生藥加入IO倍生藥量 的70%的乙醇回流提取3次，每次提取時(shí)間為0.5h,收集提取液，濾過(guò)， 得到的濾液濃縮干燥，得到薺菜提取浸膏，得到的浸膏以0.3g/ml上樣于 AB-8型大孔樹(shù)脂，上樣流速為3BV/h，采用柱徑高比為l: 3,用80%的 濃度乙醇溶液進(jìn)行洗脫。洗脫液過(guò)濾，合并濾液，濃縮干燥、粉碎，得到 薺菜總黃酮。本發(fā)明的薺菜總黃酮，其為黃棕色粉末，以2"-C^-丄-阿拉 伯糖異葒草苷為對(duì)照品，采用分光光度法，在270nm測(cè)定吸收度，計(jì)算
8總黃酮的含量為62.6%。
實(shí)施例11、薺菜總黃酮的制備
將釆收后的薺菜藥材曬干后切段，得到的薺菜生藥加入8倍生藥量的 80%的乙醇回流提取2次，每次提取時(shí)間為lh，收集提取液，濾過(guò)，得到 的濾液濃縮干燥，得到薺菜提取浸膏，得到的浸膏以0.4g/ml上樣于AB-8 型大孔樹(shù)脂，上樣流速為3BV/h，采用柱徑高比為1: 3，用90%的濃度乙 醇溶液進(jìn)行洗脫。洗脫液過(guò)濾，合并濾液，濃縮干燥、粉碎，得到薺菜總 黃酮。本發(fā)明的薺菜總黃酮，其為黃棕色粉末，以2"-0-a-丄-阿拉伯糖異 葒草苷為對(duì)照品，釆用分光光度法，在270nm測(cè)定吸收度，計(jì)算總黃酮 的含量為60.8%。
實(shí)施例12、薺菜總黃酮的制備
將采收后的薺菜藥材曬干后切段，得到的薺菜生藥加入io倍生藥量 的70%的乙醇回流提取3次，每次提取時(shí)間為1.5h,收集提取液，過(guò)濾， 得到的濾液濃縮干燥，得到薺菜提取浸膏，得到的浸膏以0.5g/ml上樣于 AB-8型大孔樹(shù)脂，上樣流速為3BV/h，釆用柱徑髙比為l: 5，用50%的 濃度乙醇溶液進(jìn)行洗脫。洗脫液過(guò)濾，合并濾液，濃縮干燥、粉碎，得到 薺菜總黃酮。本發(fā)明的薺菜總黃酮，其為黃棕色粉末，以2"-0-a-L-阿拉 伯糖異葒草苷為對(duì)照品，采用分光光度法，在270mn測(cè)定吸收度，計(jì)算 總黃酮的含量為63.6%。
實(shí)施例13、薺菜總黃酮的制備
將采收后的薺菜藥材曬干后切段，得到的薺菜生藥加入IO倍生藥量 的90%的乙醇回流提取3次，每次提取時(shí)間為0.5h，收集提取液，過(guò)濾， 得到的濾液濃縮干燥，得到薺菜提取浸膏，得到的浸膏以0.3g/ml上樣于 D-101型大孔樹(shù)脂，上樣流速為3BV/h,釆用柱徑髙比為1: 3,用80%的 濃度乙醇溶液進(jìn)行洗脫。洗脫液過(guò)濾，合并濾液，濃縮干燥、粉碎，得到 薺菜總黃酮。本發(fā)明的薺菜總黃酮，其為黃棕色粉末，以2"-0-ct-丄-阿拉 伯糖異葒草苷為對(duì)照品，采用分光光度法，在270nm測(cè)定吸收度，計(jì)算 總黃酮的含量為61.6%。
實(shí)施例14、薺菜總黃酮的制備
將釆收后的薺菜藥材曬干后切段，得到的薺菜生藥加入8倍生藥量的 80%的乙醇回流提取2次，每次提取時(shí)間為lh，收集提取液，過(guò)濾，得到 的濾液濃縮干燥，得到薺菜提取浸膏，得到的浸膏以0.4g/ml上樣于D-lOl 型大孔樹(shù)脂，上樣流速為3BV/h，采用柱徑高比為1: 3，用90%的濃度乙 醇溶液進(jìn)行洗脫。洗脫液過(guò)濾，合并濾液，濃縮干燥、粉碎，得到薺菜總 黃酮物。本發(fā)明的薺菜總黃酮，其為黃棕色粉末，以2"-0-ct-丄-阿拉伯糖 異葒草苷為對(duì)照品，采用分光光度法，在270nm測(cè)定吸收度，計(jì)算總黃 酮的含量為59.8%。
實(shí)施例15、薺菜總黃酮的制備
將采收后的薺菜藥材曬干后切段，得到的薺菜生藥加入12倍生藥量 的90%的乙醇回流提取3次，每次提取時(shí)間為0.5h，收集提取液，過(guò)濾，得到的濾液濃縮干燥，得到薺菜提取浸膏，得到的浸膏以0.4g/ml上樣于 D-101型大孔樹(shù)脂，上樣流速為3BV/h,采用柱徑高比為l: 3，用90%的 濃度乙醇溶液進(jìn)行洗脫。洗脫液濾過(guò)，合并濾液，濃縮干燥、粉碎，得到 薺菜總黃酮物。本發(fā)明的薺菜總黃酮，其為黃棕色粉末，以2"-0-ct-丄-阿 拉伯糖異葒草苷為對(duì)照品，采用分光光度法，在270nm測(cè)定吸收度，計(jì) 算總黃酮的含量為60.4%。
實(shí)施例16、薺菜中異葒草苷的制備
將釆收后的薺菜藥材曬干后切段，得到的薺菜生藥加入IO倍生藥量的 70%的乙醇回流提取3次，每次提取時(shí)間為1.5h,收集提取液，過(guò)濾，得 到的濾液濃縮干燥，得到薺菜提取浸膏，得到的浸膏以0.5g/ml上樣于AB-8 型大孔樹(shù)脂，上樣流速為3BV/h,采用柱徑髙比為l: 5,將得到的50%乙 醇洗脫部分流經(jīng)聚酰胺柱色譜，用三氯甲烷甲醇(20: l)進(jìn)行洗脫，再 經(jīng)SephadexLH-20柱色譜，用純甲醇進(jìn)行洗脫，洗脫液進(jìn)行過(guò)濾，合并濾 液，濃縮干燥，得到異葒草苷，純度在98%以上。
實(shí)施例17、薺菜中2"-0-cc-L-阿拉伯糖異葒草苷的制備 將采收后的薺菜藥材曬干后切段，得到的薺菜生藥加入10倍生藥量的 70%的乙醇回流提取3次，每次提取時(shí)間為1.5h，收集提取液，過(guò)濾，得 到的濾液濃縮干燥，得到薺菜提取浸膏，得到的浸膏以0.5g/ml上樣于AB-8 型大孔樹(shù)脂，上樣流速為3BV/h,釆用柱徑高比為l: 5,將得到的30%乙 醇洗脫部分流經(jīng)聚酰胺柱色譜，用三氯甲烷甲醇(20: l)進(jìn)行洗脫，洗 脫部分再流經(jīng)SephadexLH-20柱色譜，用純甲醇進(jìn)行洗脫，純甲醇洗脫部 分再經(jīng)過(guò)高效液相半制備柱色譜，用乙腈-水(15:85 )進(jìn)行洗脫，洗脫液進(jìn) 行濾過(guò)，合并濾液，濃縮干燥，得到2"-0-cc-丄-阿拉伯糖異葒草苷，純度在 98%以上。
實(shí)施例18、 2"-0-cc-丄-阿拉伯糖異葒草苷的結(jié)構(gòu)鑒定 黃色不定型粉末，mp218 22(TC， Mg-HCl反應(yīng)陽(yáng)性，Molish反應(yīng)陽(yáng)性， 酸水解檢出阿拉伯糖。ESI-MS 譜中準(zhǔn)分子離子峰 m/z:619[M+K〗+，581[M+H]+，579[M-H]-。
'H-NMR ( 600MHz,DMSO-d6, S)譜中，13.66(1H，s,5-OH), 7.41 (1H，dd， J=8.4， 2.7Hz， H國(guó)6')，7,39 (1H，d, 2.7Hz，H-2')，6.87 (lH,d， J= 8.4Hz, H-5'), 6.65 (1H, s， H-3), 6.44 (1H， s， H畫(huà)8)， 4.64 (lH，d， 《/= 9.6Hz， H-l"), 4.22 (lH,d， /=6.0Hz，H-r')， 4.29(2H,m，H-2"), 3.68 (1H，d， /= 11.4Hz, H國(guó)6"), 3.41 (lH，br.s，H-4"')， 3.41 (1H, br.s， H-3"), 3.29 (lH，br.s， H-4")， 3.26 (lH，br.s， H-3"')， 3.16(1H，br.s，H國(guó)5")， 3.16 (lH,br.s，H-2"')， 3.02 (lH,m，，H-5"') ,2.88 (lH,br.s，H-5'")。
'C-NMR ( 150MHz，DMSO-d6, 5)譜中，182.0(C-4), 164.2 (C-7), 163.7(C國(guó)2)， 161.9 (C-9)， 156.5 (C-5), 149.8 (C誦4'), 145.8 (C國(guó)3'), 121.5 (C-l')， 119.0(C-6')， 116.2(C畫(huà)5')， 113.4(C-2'), 108.2(C-6)， 105.4 (C國(guó)l'") ， 103.4 (C-10)，102.8 (C-3)， 93.0 (C-8)， 81.8 (C-5")， 80.4 (C-2")， 78.8(C-3")， 72.5 (C-3'"), 71.5 (C-4")， 71.2 (C國(guó)l")， 70.6 (C-2"')， 67.0(C-4"')， 64.6(C-5'"),61.5(C-6")。
實(shí)施例19薺菜總黃酮對(duì)異丙腎上腺素所致急性心肌缺血小鼠的常 壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)
取健康昆明種小鼠40只，雌雄兼用，體重20士2g,隨機(jī)分為四組 正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、薺菜總黃酮組和美托洛爾組，分別尾靜脈注射 藥物，正常對(duì)照組尾靜脈注射等容積生理鹽水，各給藥組容積均為 0.1ml/10g。給藥后5分鐘后除正常對(duì)照組注射等容積生理鹽水外，各組小 鼠腹腔注射異丙腎上腺素(Iso)10mg/kg,各組給藥容積均為0.2ml/10g, 10 分鐘后立即將小鼠放入盛有15g鈉石灰的250 ml磨口廣口瓶，凡士林密封。 以最后一次呼吸為準(zhǔn)，觀察記錄各組動(dòng)物存活時(shí)間。
結(jié)果實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠存活時(shí)間 顯著減少，薺菜總黃酮(60mg/kg)組與模型對(duì)照組相比小鼠存活時(shí)間顯著 延長(zhǎng)。提示薺菜總黃酮對(duì)Iso所致的心肌缺血缺氧有保護(hù)作用。結(jié)果見(jiàn)表1 。
表i急性心肌缺血小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)結(jié)果
組別劑量(mg/kg)動(dòng)物數(shù)(n)動(dòng)物存活時(shí)間(7士 SD, n=10)
i卜:常對(duì)照組—1034, 5±3. 63
模型對(duì)照組—1018. 8 ±2.,
薺菜組(60mg/kg)601025. 1±3, 1***
陽(yáng)性對(duì)照藥組1028. 7 ±5. 50***
與止常對(duì)照組比，,PO.00L;與模型對(duì)照組比,***P<0.00權(quán)利要求
1、一種從薺菜中提取高純度單體黃酮及其總黃酮的方法，其特征在于該方法所得總黃酮物質(zhì)的含量在60％以上。
2、 如權(quán)利要求1所述的薺菜高純度單體黃酮及其總黃酮的制備方法， 其特征包括以下步驟1) 預(yù)處理將釆收后的薺菜藥材曬干后切段，備用；2) 提取加入5 12倍量的50~90%的提取溶劑進(jìn)行回流提取1 4 次，每次提取時(shí)間為0.5 3h，濾過(guò)，合并濾液；或加入5 10倍量的50~ 90%的提取溶劑冷浸12h~48h，濾過(guò)，合并濾液；或加入5 15倍量的 50~90%的提取溶劑超聲0.5~3小時(shí)，過(guò)濾，合并濾液，所述的提取溶劑 為甲醇、乙醇或丙酮。3) 濃縮將步驟2)得到的濾液濃縮干燥，得到薺菜提取浸膏。4) 上柱將步驟3)得到的浸膏以上樣于AB-8或HPD-600或D101 型大孔樹(shù)脂，上樣流速為1 3BV/h,分別釆用柱徑高比為1: 3 1: 7的大 孔吸附樹(shù)脂，上樣濃度為0.3~0.5g/ml，用30%~90%的濃度乙醇溶液進(jìn)行 洗脫。5) 制備將收集到的洗脫液過(guò)濾，合并濾液，濃縮干燥，得到薺菜 的總黃酮提取物。6) 純化將步驟4)得到的不同乙醇洗脫部分經(jīng)聚酰胺色譜柱或凝膠 色譜柱或高效液相半制備色譜柱，用三氯甲烷或二氯甲烷或甲醇或乙腈或 水或它們之間的不同比例的組合洗脫，得到異葒草苷和2"-0-ct-L-阿拉伯 糖異葒草苷兩種高純度黃酮單體化合物。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的薺菜高純度單體黃酮及其總黃酮的制備方 法，其特征在于，所述步驟2)提取方式為回流，且回流提取方法是以 50%乙醇提取3次，溶劑倍量為10倍，每次提取時(shí)間為1.5h。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述薺菜高純度單體黃酮及其總黃酮的的制備方 法，其特征在于所述步驟4)的大孔樹(shù)脂柱為AB-8型大孔樹(shù)脂，上樣 濃度為0.5g/ml,流速為3BV/h,柱徑高比為1: 5,乙醇濃度為30%、 50%。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的薺菜高純度單體黃酮及其總黃酮的制備方 法，其特征在于所述步驟6)中異葒草苷的制備為將得到的50%乙醇洗 脫部分流經(jīng)聚酰胺柱色譜，用三氯甲烷甲醇(20: l)進(jìn)行洗脫，洗脫 部分再流經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用純甲醇進(jìn)行洗脫，洗脫液進(jìn)行過(guò) 濾，合并濾液，濃縮干燥，得到異葒草苷，純度在98%以上。<formula>formula see original document page 2</formula>
6、根據(jù)權(quán)利要求2所述的薺菜高純度單體黃酮及其總黃酮的制備方法，其特征在于所述步驟6)中2"-0-cc-丄-阿拉伯糖異葒草苷的制備為將 得到的30%乙醇洗脫部分流經(jīng)聚酰胺柱色譜，用三氯甲烷甲醇(20: 1) 進(jìn)行洗脫，洗脫部分再流經(jīng)SephadexLH-20柱色譜，用純甲醇進(jìn)行洗脫， 純甲醇洗脫部分再經(jīng)過(guò)高效液相半制備柱色譜，用乙腈-水(15:85)進(jìn)行 洗脫，洗脫液進(jìn)行過(guò)濾，合并濾液，濃縮干燥，得到2"-0-ct-丄-阿拉伯糖 異葒草苷，純度在98%以上。2"_0+丄_阿拉伯糖異葒草苷
7、薺菜單體黃酮及總黃酮在制備治療心血管疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種薺菜中總黃酮及幾種高純度單體黃酮的制備方法及總黃酮在心血管疾病方面的用途，是來(lái)源于薺菜中的黃酮類(lèi)化合物，總黃酮制備方法包括藥材提取、總黃酮制備。其將薺菜的干燥全草用醇回流、超聲或冷浸提取，然后使用大孔樹(shù)脂進(jìn)行上柱，使用30～90％的醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，醇洗脫液濃縮干燥后得到總黃酮，含量在60％以上，通過(guò)該方法制備的總黃酮可以用于制備治療心血管疾病的藥物。單體黃酮的制備方法包括藥材提取、分離及純化。本發(fā)明的提取方法簡(jiǎn)單實(shí)用，快速簡(jiǎn)便且造價(jià)低廉，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61K31/7042GK101538297SQ20091001132
公開(kāi)日2009年9月23日 申請(qǐng)日期2009年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月28日
發(fā)明者洲 蘭, 劉曉秋, 寧 宋, 王榮榮 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)藥科大學(xué)