專利名稱：：蟾蜍甾烯類化合物及蟾蜍甾烯鹽化物在制備治療婦科腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及蟾蜍甾烯類化合物及蟾蜍甾烯鹽化物的新用途，具體是涉及蟾蜍甾烯類化合物及蟾蜍甾烯鹽化物用于制備治療婦科腫瘤疾病藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：婦科腫瘤是危害婦女健康的重大疾病，常見(jiàn)的惡性腫瘤包括子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、乳腺癌、卵巢癌等，我國(guó)僅患子宮頸癌患病率和病死率均約占世界三分之一。治療婦科腫瘤國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界常規(guī)采用的治療方案為化學(xué)藥物治療、放射治療及手術(shù)切除等。該方案在取得一定臨床療效的同時(shí)，也因化學(xué)藥物的毒副作用、放療造成的輻射傷害，以及手術(shù)方案性器官的全切或部分切除等導(dǎo)致的醫(yī)源性問(wèn)題和相應(yīng)疾病，給患者帶來(lái)了巨大的痛苦，嚴(yán)重影響著女性的生命健康和生活質(zhì)量。中藥蟾酥為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍(BufobufogargarizansCantor)或黑眶蟾蜍的耳后腺及皮膚腺分泌的白色漿液，經(jīng)加工干燥制成。具有清熱解毒、消腫止痛、開(kāi)竅醒神功效。中醫(yī)臨床將其用于麻醉、瘡癤癰腫、中暑吐瀉、咽喉腫痛、牙痛、心力衰竭、癌癥等。蟾酥中含大量的蟾蜍毒素類物質(zhì)，此類物質(zhì)屬于甾族化合物，為蟾蜍甾烯類(蟾蜍二烯內(nèi)酯，bufadienolide),是一類在C-17e位連接六元不飽和內(nèi)酯環(huán)(a-吡喃酮環(huán))的24C強(qiáng)心留類化合物，包括脂蟾毒配基、華蟾毒配基、蟾毒靈(Bufalin)、蟾毒它靈(Bufatalin)、日蟾毒它靈(又稱日蟾毒素，Gamabufotalin)等。在以往的應(yīng)用和研究中，蟾蜍留烯類化合物主要用于治療心血管系統(tǒng)方面的疾病，如用于增強(qiáng)心肌收縮力，臨床上常用于治療心衰疾病。雖然部分蟾酥制劑在臨床上用于治療白血病，胃癌腫瘤疾病，但未見(jiàn)有把蟾蜍留烯類化合物及蟾蜍甾烯鹽化物用于治療婦科腫瘤疾病，且目前的蟾蜍制劑，以粗體物入藥居多，成分復(fù)雜，活性成分不清楚，除含有蟾毒配基、蟾蜍毒素、吲哚類生物堿外，還含有氨基酸、還原糖、甾類、肽類等多種類型的化學(xué)成分。因此，在臨床使用中，蟾蜍制劑具有多種缺點(diǎn)，出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)，血管刺激癥狀，消化道和心臟毒性等不良反應(yīng)發(fā)生率高，這都是由于活性成分不清楚，含有的無(wú)效雜質(zhì)多原因造成的，因此限制了其用于婦科腫瘤疾病的治療。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服蟾蜍制劑成分復(fù)雜，不良反應(yīng)發(fā)生率高的缺陷，提供一種成分清楚，質(zhì)量可控，以蟾蜍甾烯類化合物及蟾蜍甾烯鹽化物為活性成分制備治療婦科腫瘤疾病藥物的應(yīng)用。蟾蜍甾烯類化合物結(jié)構(gòu)式如下-式中Rl為CH0或CH3;R2為0H或H;R3為OH;R4為H;或R3和R4形成環(huán)氧橋；R5為H或0Ac。本發(fā)明提供的蟾蜍甾烯鹽化物為蟾蜍甾烯類化合物和鹽酸、硫酸、琥玻酸或硝酸所形成的鹽酸鹽、硫酸鹽、琥玻酸鹽或硝酸鹽。本發(fā)明提供的蟾蜍甾烯類化合物為以蟾蜍甾烯含量超過(guò)50%的提取物。本發(fā)明提供的蟾蜍甾烯類化合物及蟾蜍甾烯鹽化物和藥學(xué)上可接受的載體如稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑等，必要時(shí)還可以加入香味劑、甜味劑等制備成治療婦科腫瘤藥物。本發(fā)明所述的藥物可按藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)方法制備成注射液、片劑、粉針劑、顆粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜?jiǎng)┑榷喾N劑型。本發(fā)明提供的蟾蜍甾烯類化合物及蟾蜍甾烯鹽化物制成片劑時(shí)把蟾蜍甾烯類化合物或蟾蜍甾烯鹽化物和載體乳糖或玉米淀粉，需要時(shí)加入潤(rùn)滑劑硬脂酸鎂，混合均勻，然后壓片制成片劑。本發(fā)明提供的蟾蜍甾烯類化合物或蟾蜍甾烯鹽化物制成膠囊劑時(shí)把蟾蜍甾烯類化合物或蟾蜍甾烯鹽化物和載體乳糖或玉米淀粉混合均勻，整粒，然后裝膠囊制成膠囊劑。本發(fā)明提供的蟾蜍甾烯類化合物或蟾蜍甾烯鹽化物制成顆粒劑時(shí)，把蟾蜍甾烯類化合物或蟾蜍甾烯鹽化物和稀釋劑乳糖或玉米淀粉混合均勻，整粒，干燥，制成顆粒劑。本發(fā)明提供的蟾蜍留烯類化合物或蟾蜍甾烯鹽化物制成注射液時(shí)，取蟾蜍甾烯類化合物或蟾蜍甾烯鹽化物加入生理鹽水溶解然后加入活性碳，攪拌均勻，8CTC加熱30分鐘，過(guò)濾，調(diào)節(jié)PH值，用垂熔玻璃漏斗或其它濾器過(guò)濾至澄明，灌裝，在100至115。C滅菌30分鐘制成注射液。本發(fā)明提供的蟾蜍甾烯類化合物或蟾蜍甾烯鹽化物制成各種劑型藥物給藥時(shí)以蟾蜍甾烯類化合物或蟾蜍甾烯鹽化物含量計(jì)算有效劑量為0.03至30mg/人/天，做為優(yōu)選方案其劑量為0.3至7.0mg/人/天。本發(fā)明提供的蟾蜍甾烯類化合物及蟾蜍留烯鹽化物的抗婦科腫瘤包括卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌或乳腺癌。經(jīng)本申請(qǐng)人深入研究，蟾蜍甾烯提取物，華蟾毒精，蟾毒靈，蟾毒它靈、日蟾毒它靈和華蟾毒精、蟾毒靈、蟾毒它靈和日蟾毒它靈四個(gè)化合物的鹽酸鹽或硫酸鹽體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明對(duì)人乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌等不同婦科腫瘤細(xì)胞均具有較強(qiáng)的抑制活性，并且具有較好的量效關(guān)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蟾蜍甾烯類化合物及蟾蜍甾烯鹽化物的抗癌效果強(qiáng)于臨床上廣泛用于婦科腫瘤治療的紫衫醇。蟾蜍甾烯類化合物的制備取蟾酥150g，用乙酸乙酯萃取兩次，萃取液在40。C減壓濃縮得36.8g提取物，提取物拌等量硅膠，進(jìn)行硅膠(200目到300目)柱層析，用石油醚_丙酮(h1)洗脫，薄層色譜跟蹤，獲得有效部位后，再次柱層析，薄層色譜跟蹤，合并相同餾分，得到蟾蜍甾烯提取物，蟾蜍甾烯提取物進(jìn)行制備液相純化，得到單體化合物華蟾毒精，蟾毒靈，蟾毒它靈和日蟾毒它靈。蟾蜍甾烯鹽化物的制備取華蟾毒精，蟾毒靈，蟾毒它靈或日蟾毒它靈20mg，加入10ml鹽酸、硫酸、琥玻酸或硝酸在50。C下加熱回流30分鐘，取反應(yīng)物拌等量硅膠，進(jìn)行硅膠(200目到300目)柱層析，用石油醚一丙酮(1:1)洗脫，薄層色譜跟蹤，得到華蟾毒精，蟾毒靈，蟾毒它靈或日蟾毒它靈的鹽化物。本發(fā)明以婦科腫瘤作為研究的對(duì)象，用蟾蜍甾烯類化合物或蟾蜍甾烯鹽化物制備抗婦科腫瘤的藥物具有以下優(yōu)點(diǎn)1、針對(duì)已經(jīng)惡變的婦科腫瘤細(xì)胞具有特異性。2、蟾蜍甾烯及蟾蜍甾烯鹽化物抑制婦科腫瘤細(xì)胞增殖的有效劑量較小，潛在副作用也小，使用更安全。3、蟾蜍甾烯類化合物及蟾蜍甾烯鹽化物具有抗婦科腫瘤活性的主要成分清楚，質(zhì)量可控。4、蟾蜍甾烯類化合物及蟾蜍甾烯鹽化物抗癌效果強(qiáng)于臨床上廣泛用于婦科腫瘤治療的紫衫醇，有望成為新的抗婦科腫瘤的新藥，且資源廣泛，易得，成本較低。5、蟾蜍甾烯類化合物及蟾蜍甾烯鹽化物能和不同的賦形劑制備成不同的藥物劑型，能方便臨床應(yīng)用。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的各種等價(jià)形式的修改均落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求所限定的范圍。以下實(shí)施例所使用的實(shí)驗(yàn)材料如下實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株人卵巢癌細(xì)胞(A2780)、人卵巢癌細(xì)胞(SK-0V-3)、人宮頸癌細(xì)胞(SiHa)和人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(shikawa)由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室提供；96孔板購(gòu)自Costar公司;RMPI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;McCoys5A培養(yǎng)基購(gòu)自SIGMA公司；新生牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；噻唑藍(lán)(MTT)和DMSO購(gòu)自Amresco公司；紫杉醇注射液購(gòu)自?？谑兄扑帍S有限公司(批號(hào)080502)。MCS-1:蟾蜍甾烯提取物(蟾蜍總甾烯含量為55%)，MCS-1-2:華蟾毒精(cinobufagin)，MCS-1-3:蟾毒靈(bufalin)，MCS-1-4:蟾毒它靈(bufotalin)和MCS-1-5:日蟾毒它靈(gamabufotalin),華蟾毒精鹽酸鹽，蟾毒靈鹽酸鹽，蟾毒它靈鹽酸鹽，日蟾毒它靈鹽酸鹽，華蟾毒精硫酸鹽，蟾毒靈硫酸鹽，蟾毒它靈硫酸鹽和日蟾毒它靈硫酸鹽為南京中醫(yī)藥大學(xué)方劑實(shí)驗(yàn)室制備得到。以下實(shí)施例所使用的實(shí)驗(yàn)儀器如下超凈工作臺(tái)(蘇州凈化型號(hào)SW-CJ-IFD)，C02培養(yǎng)箱(SANYO型號(hào)XD-101)，酶標(biāo)儀BIO-RAD(ModelNO.550SerialNO.16971)。以下實(shí)施例所使用的實(shí)驗(yàn)方法如下實(shí)驗(yàn)方法使用MTT法對(duì)蟾蜍甾烯類化合物及蟾蜍甾烯鹽化物進(jìn)行體外抗婦科腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn):將相應(yīng)的細(xì)胞用胰酶進(jìn)行消化、計(jì)數(shù)、制成濃度為5X104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。將96孔板中每孔加入100ul細(xì)胞懸液(每孔5乂103個(gè)細(xì)胞)，然后置于37i:，02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；用完全培養(yǎng)基稀釋藥物至所需的不同剃度濃度，每孔加入100uL相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組，溶媒對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，再將96孔板置于37°C，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)。然后每孔加入20uLMTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150yLDMSO溶解，搖床10分鐘輕輕混勻。在A=490nm處用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的吸光度即0D值，計(jì)算各藥物的抑制率。實(shí)施例l:蟾蜍甾烯提取物、華蟾毒精、蟾毒靈、蟾毒它靈或日蟾毒它靈對(duì)人卵巢癌細(xì)胞的抑制作用按照MTT實(shí)驗(yàn)方法考察蟾蜍甾烯提取物、華蟾毒精、蟾毒靈、蟾毒它靈或日蟾毒它靈對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(A2780)的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蟾蜍甾烯提取物、華蟾毒精、蟾毒靈、蟾毒它靈或日蟾毒它靈對(duì)人卵巢癌細(xì)胞A2780的均具有較強(qiáng)的抑制作用，各劑量組呈現(xiàn)了較好的量效關(guān)系。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1和表2所示。表1蟾蜍甾烯提取物對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(A2780)的作用結(jié)果卵巢癌細(xì)胞(A2780)組別ODSD抑制率陰性對(duì)照組1.6010.079溶媒對(duì)照組(0.1%DMS0)1.5920.0550.56%Taxol(10ug/ml)0.1230.00992.32%MCS-11lig/ml0.2610.04183.70%IC50=0.5ug/ml0.3750.02576.58%0.1870,25ug/ml0.4810.02869.96%wg/m0.125yg/ml0.8960.02944.03%10.0625ug/ml1.3610.0114.99%6表2華蟾毒精、蟾毒靈、蟾毒它靈和日蟾毒它靈對(duì)人卵巢癌細(xì)胞A2780的作用結(jié)果卵巢癌細(xì)胞(A2780)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例2:蟾蜍甾烯提取物、華蟾毒精、蟾毒靈、蟾毒它靈或日蟾毒它靈對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(SK-OV-3)的抑制作用。按MTT實(shí)驗(yàn)方法考察蟾蜍甾烯提取物、華蟾毒精、蟾毒靈、蟾毒它靈或日蟾毒它靈對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(SK-OV-3)的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蟾蜍甾烯提取物、華蟾毒精、蟾毒靈、蟾毒它靈或日蟾毒它靈對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(SK-OV-3)均具有較強(qiáng)的抑制作用，各劑量組呈現(xiàn)了較好的量效關(guān)系。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3和表4所示。表3蟾蜍甾烯提取物對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(SK-0V-3)的作用結(jié)果卵巢癌細(xì)胞(SK-0V-3)組別ODSD抑制率陰性對(duì)照組1.2010.061溶媒對(duì)照組(0.1%DMSO)1.1480.0234.33%陽(yáng)性對(duì)照組(10ug/mlTaxol)0.1490.08587.58%MCS-1IC50=0.288yg/m11yg/ml0.3480.05971.00%0.5ug/ml0.4950.02858.75%0.25ug/ml0.5770.03251.92%0.125yg/ml0.8090.05132.58%0.0625yg/ml0.7090.05740.92%表4華蟾毒精、蟾毒靈、蟾毒它靈和日蟾毒它靈對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(SK-OV-3)的作用結(jié)果卵巢癌細(xì)胞(SK-OV-3)組別ODSD抑制率組別ODSD抑制率陰性對(duì)照組1.1870.051陰性對(duì)照組1.1810.091溶媒對(duì)照組0.1%DMS01.0820.0618.85%溶媒對(duì)照組0.1%DMSO1.1410.0173.39%陽(yáng)性對(duì)照組10ug/mlTaxol0.1750.04585.26%陽(yáng)性對(duì)照組10ug/mlTaxol0.1220.03989.67%500nM0.2630.05977.84%500nM0.3350.02971.63%250nM0.3860.03667.48%MCS-l-4250nM0.6330.02646.40%MCS-1-125nM0.4950.02858.30%IC50=125nM0.7160.09339.37%2IC50=62.5nM0.6980.03141.20%218.89462.5nM0.7050.05740.30%87nM31.25nM0.7860.00533.78%nM31.25nM1.0670.0759.65%500nM0.3120.0473.72%500nM0.2060.05782.56%MCS-1-250nM0.4820.01659.39%MCS-1-5250nM0.3350.05471.63%3IC50:125nM0.5820.09650.97%IC50=125nM0.5880.07250.21%115.1862.5nM0.6940.03441.53%76.8362.5nM0.6310.12746.57%械31.25nM0.6870.02842.12%nM31.25nM0.7410.05837.26%8實(shí)施例3:蟾蜍甾烯提取物、華蟾毒精、蟾毒靈、蟾毒它靈或日蟾毒它靈對(duì)人宮頸癌細(xì)胞(SiHa)的抑制作用。按MTT實(shí)驗(yàn)方法考察蟾蜍甾烯提取物、華蟾毒精、蟾毒靈、蟾毒它靈或日蟾毒它靈對(duì)人宮頸癌細(xì)胞(SiHa)的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蟾蜍甾烯提取物、華蟾毒精、蟾毒靈、蟾毒它靈或日蟾毒它靈對(duì)人宮頸癌細(xì)胞(SiHa)均具有較強(qiáng)的抑制作用，各劑量組呈現(xiàn)了較好的量效關(guān)系。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5和表6所示。表5蟾蜍甾烯提取物對(duì)人宮頸癌細(xì)胞(SiHa)的作用結(jié)果人宮頸癌細(xì)胞(SiHa)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表6華蟾毒精、蟾毒靈、蟾毒它靈和日蟾毒它靈對(duì)人宮頸癌細(xì)胞(SiHa)的作用結(jié)果s皿組別ODSD抑制率組別ODSD抑制率陰性對(duì)照組10.057陰性對(duì)照組0.9620.081溶媒對(duì)照0.1%溶媒對(duì)0.1%組DMS00.9760.0482.40%照組DMSO0.9540.020.83%陽(yáng)性對(duì)照10ug/m陽(yáng)性對(duì)lOug/ml組1Taxol0.1860.02681.40%照組Taxol0.1850.03680.77%500nM0.1960.00680.40%500nM0.210.02878.17%MCS-1250nM0.2260.01777.40%250nM0.4010.00658.32%-2125nM0.4810.04251.90%MCS-l-4125nM0.5180.01646.15%IC50=62.5nM0.5810.01441.90%IC50=62.5nM0.6430.01533.16%95.6331.25n131.16lnMM0.7530.02224.70%nM31.25nM0.6930.01827.96%500nM0.2130.01278.70%500nM0.1560.01883.78%MCS-1250nM0.2360.01976.40%250nM0.3140.02267.36%_3125nM0.5480.01245.20%MCS-1-5125nM0.4290.03855.41%IC50=62.5nM0.7040.03229.60%IC50=62.5nM0.5240.0745.53%131.131.25n85.00186nMM0.8460.01815.40%nM31.25nM0.6630.02131.08%實(shí)施例4:蟾蜍甾烯提取物、華蟾毒精、蟾毒靈、蟾毒它靈或日蟾毒它靈對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(shikawa)的作用。按MTT實(shí)驗(yàn)方法考察蟾蜍甾烯提取物、華蟾毒精、蟾毒靈、蟾毒它靈或日蟾毒它靈對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(shikawa)的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蟾蜍甾烯提取物、華蟾毒精、蟾毒靈、蟾毒它靈或日蟾毒它靈對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(shikawa)均具有較強(qiáng)的抑制作用，各劑量組呈現(xiàn)了較好的量效關(guān)系。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7和表8所示。10表7蟾蜍甾烯提取物對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(shikawa)的作用結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例5:華蟾毒精鹽酸鹽、蟾毒靈鹽酸鹽、蟾毒它靈鹽酸鹽或日蟾毒它靈鹽酸鹽對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(A2780)的作用。按MTT實(shí)驗(yàn)方法考察華蟾毒精鹽酸鹽、蟾毒靈鹽酸鹽、蟾毒它靈鹽酸鹽或日蟾毒它靈鹽酸鹽對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(A2780)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示華蟾毒精鹽酸鹽、蟾毒靈鹽酸鹽、蟾毒它靈鹽酸鹽或日蟾毒它靈鹽酸鹽對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(A2780)均具有較強(qiáng)的抑制作用，各劑量組呈現(xiàn)了較好的量效關(guān)系。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表9所示。表9華蟾毒精鹽酸鹽、蟾毒靈鹽酸鹽、蟾毒它靈鹽酸鹽或日蟾毒它靈鹽酸鹽對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(A2780)的作用結(jié)果卵巢癌細(xì)胞(A2780)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例6:華蟾毒精鹽酸鹽、蟾毒靈鹽酸鹽、蟾毒它靈鹽酸鹽或日蟾毒它靈鹽酸鹽對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(SK-0V-3)的作用。按MTT實(shí)驗(yàn)方法考察華蟾毒精鹽酸鹽、蟾毒靈鹽酸鹽、蟾毒它靈鹽酸鹽或日蟾毒它靈鹽酸鹽對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(SK-0V-3)的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示華蟾毒精鹽酸鹽、蟾毒靈鹽酸鹽、蟾毒它靈鹽酸鹽或日蟾毒它靈鹽酸鹽對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(SK-0V-3)均具有較強(qiáng)的抑制作用，各劑量組呈現(xiàn)了較好的量效關(guān)系。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表10所示。表10華蟾毒精鹽酸鹽、蟾毒靈鹽酸鹽、蟾毒它靈鹽酸鹽和日蟾毒它靈鹽酸鹽對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(SK-0V-3)的作用結(jié)果卵巢癌細(xì)胞(SK-0V-3)組別ODSD抑制率組別0DSD抑制率陰性對(duì)照組1,1810.054陰性對(duì)照組1.1800.091溶媒對(duì)0.1%溶媒對(duì)0.1%照組DMS01.1820.0608.85%照組DMSO1.1410.0173.39%陽(yáng)性對(duì)10ug/ml陽(yáng)性對(duì)lOug/ml照組Taxol0,1250.04589.26%照組Tsxol0.1220.03989.67%蟾毒精500nM0.2410.05477.94%蟾毒靈500nM0.3150.02371.83%鹽酸鹽250nM0.3560.03268.48%鹽酸鹽250nM0.6130.02646.80%IC50=125nM0.4650.02159.80%IC50=125nM0,7060.09340.17%83.15062.5nM0.6480.03042.20%201.58262.5nM0.8050.05747.30%nM31.25nM0.7360.01234.78%nM31.25nM1.0070.0759.12%蟾毒它500nM0.3100.0473.92%日蟾毒500nM0.1960.03184.36%靈鹽酸250nM0.4620.01160.57%它靈鹽250nM0.3150.05273.63%鹽125nM0.5470.09451.97%酸鹽125nM0.5680.07052.21%IC50=62.5nM0.6640.03142.53%IC50=62.5nM0,6110.07247.97%110.0874.433lnM31.25nM0.6570.02244.12%nM31.25nM0.7120.06238.76%實(shí)施例7:華蟾毒精鹽酸鹽、蟾毒靈鹽酸鹽、蟾毒它靈鹽酸鹽或日蟾毒它靈鹽酸鹽對(duì)人宮頸癌細(xì)胞(SiHa)的作用。按MTT實(shí)驗(yàn)方法考察華蟾毒精鹽酸鹽、蟾毒靈鹽酸鹽、蟾毒它靈鹽酸鹽或日蟾毒它靈鹽酸鹽對(duì)人宮頸癌細(xì)胞(SiHa)的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示華蟾毒精鹽酸鹽、蟾毒靈鹽酸鹽、蟾毒它靈鹽酸鹽或日蟾毒它靈鹽酸鹽對(duì)人宮頸癌細(xì)胞(SiHa)均具有較強(qiáng)的抑制作用，各劑量組呈現(xiàn)了較好的量效關(guān)系。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表ll所示。表ll華蟾毒精鹽酸鹽、蟾毒靈鹽酸鹽、蟾毒它靈鹽酸鹽和日蟾毒它靈鹽酸鹽對(duì)人宮頸癌細(xì)胞(SiHa)的作用結(jié)果13<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)施例8:華蟾毒精鹽酸鹽、蟾毒靈鹽酸鹽、蟾毒它靈鹽酸鹽或日蟾毒它靈鹽酸鹽對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(shikawa)的作用。按MTT實(shí)驗(yàn)方法考察華蟾毒精鹽酸鹽、蟾毒靈鹽酸鹽，蟾毒它靈鹽酸鹽或日蟾毒它靈鹽酸鹽對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(shikawa)的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示華蟾毒精鹽酸鹽、蟾毒靈鹽酸鹽、蟾毒它靈鹽酸鹽或日蟾毒它靈鹽酸鹽對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(shikawa)均具有較強(qiáng)的抑制作用，各劑量組呈現(xiàn)了較好的量效關(guān)系。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表12所示。表12華蟾毒精鹽酸鹽、蟾毒靈鹽酸鹽、蟾毒它靈鹽酸鹽和日蟾毒它靈鹽酸鹽對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(shikawa)的作用結(jié)果子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(shikawa)組別0DSD抑制率組別ODSD抑制率陰性對(duì)照組1.6050.032陰性對(duì)照組1.5980.036溶媒對(duì)0.1%溶媒對(duì)0.1%照組DMS01.5690.0330.93%照組DMSO1.5670.0210.88%陽(yáng)性對(duì)10ug/ml陽(yáng)性對(duì)lOug/m照組Taxol0.2120.01685.41%照組ITaxol0.2180.02487.12%500nM0.5730.1762.25%500nM0.6260.02562.35%蟾毒精250nM0.6210.01359.71%蟾毒靈250nM0.7160.02650.52%鹽酸鹽125nM0.8210.05347.68%鹽酸鹽125nM0.9080.01042.02%IC50=62.5nM1.1020.02335.21%IC50=62.5nM1.0210.02126.16%181.25243.28231.25n0nM31.25nM1.2730.04315.21%nMM1.3260.0685.32%蟾毒它500nM0.6060.03161.68%日蟾毒500nM0.5040.02164.44%靈鹽酸250nM0.6190.01657.36%它靈鹽250nM0.6050.01157.29%±卜125nM0.8160.02148.75%酸鹽125nM0.7050.03151.72%IC50=62.5nM0.9650.03440.06%IC50=62.5nM0.8420.04143.86%162.52128.2733L25nlnM31.25nM1.1560.02227.14%nMM1.0170.01731.10%實(shí)施例9:華蟾毒精硫酸鹽、蟾毒靈硫酸鹽、蟾毒它靈硫酸鹽或日蟾毒它靈硫酸鹽對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(A2780)的作用。按MTT實(shí)驗(yàn)方法考察華蟾毒精硫酸鹽、蟾毒靈硫酸鹽、蟾毒它靈硫酸鹽或日蟾毒它靈硫酸鹽對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(A2780)的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示華蟾毒精硫酸鹽、蟾毒靈硫酸鹽、蟾毒它靈硫酸鹽或日蟾毒它靈硫酸鹽對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(A2780)均具有較強(qiáng)的抑制作用，各劑量組呈現(xiàn)了較好的量效關(guān)系。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表13所示。表13華蟾毒精硫酸鹽、蟾毒靈硫酸鹽、蟾毒它靈硫酸鹽和日蟾毒它靈硫酸鹽對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(A2780))的作用結(jié)果15卵巢癌細(xì)胞(A2780)組別ODSD抑制率組別ODSD抑制率陰性對(duì)照組1.5640.037陰性對(duì)照組1.4750.067溶媒對(duì)照組溶媒對(duì)照組(0.P扁SO)1.5150.0540.29%(0.1%DMS0)1.4940.0310.20%陽(yáng)性對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組(10ug/mlTaxol)0.1180.01692.63%(10ug/mlTaxol)0.1140.00592.65%蟾毒精0.5uM0.2490.02183.37%蟾毒靈0.5uM0.2520.02383.26%硫酸鹽0.25uM0.4860.06470.47%硫酸鹽0.25uM0.5170.01163.12%IC50=0.125uM0.7020.03055.32%IC50=0.125uM0.8120.01950.12%82.6580.0625uM0.8430.02146.53%126.1750.0625uM0.9160.02037.62%nM0.03125uM1.0570.01034.72%nM0.03125uM1.1280.02520.56%蟾毒它0.5uM0.4130.02174.43%日蟾毒0.5uM0.1670.02389.10%靈硫酸0.25uM0.4220.01372.29%它靈硫0.25uM0.2480.01684.39%^!0.125uM0.7950.02149.75%酸鹽0.125uM0.5020.02365.95%IC50=0.0625uM0.9030.08138.74%IC50=0.0625uM0.7020.01551.93%119.98655.017nM0.03125uM1.m0.03425.80%nM0.03125uM0.9100.03338.21%實(shí)施例10:華蟾毒精硫酸鹽、蟾毒靈硫酸鹽、蟾毒它靈硫酸鹽或日蟾毒它靈硫酸鹽對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(SK-OV-3)的作用。按MTT實(shí)驗(yàn)方法考察華蟾毒精硫酸鹽、蟾毒靈硫酸鹽、蟾毒它靈硫酸鹽或日蟾毒它靈硫酸鹽對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(SK-0V-3)的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示華蟾毒精硫酸鹽、蟾毒靈硫酸鹽、蟾毒它靈硫酸鹽或日蟾毒它靈硫酸鹽對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(SK-0V-3)均具有較強(qiáng)的抑制作用，各劑量組呈現(xiàn)了較好的量效關(guān)系。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表14所示。表14華蟾毒精硫酸鹽、蟾毒靈硫酸鹽、蟾毒它靈硫酸鹽和日蟾毒它靈硫酸鹽對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(SK-OV-3)的作用結(jié)果16<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實(shí)施例ll:華蟾毒精硫酸鹽、蟾毒靈硫酸鹽、蟾毒它靈硫酸鹽或日蟾毒它靈硫酸鹽對(duì)人宮頸癌細(xì)胞(SiHa)的作用。按MTT實(shí)驗(yàn)方法考察華蟾毒精硫酸鹽、蟾毒靈硫酸鹽、蟾毒它靈硫酸鹽或日蟾毒它靈硫酸鹽對(duì)人宮頸癌細(xì)胞(SiHa)的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示華蟾毒精硫酸鹽、蟾毒靈硫酸鹽、蟾毒它靈硫酸鹽或日蟾毒它靈硫酸鹽對(duì)人宮頸癌細(xì)胞(SiHa)均具有較強(qiáng)的抑制作用，各劑量組呈現(xiàn)了較好的量效關(guān)系。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表15所示。表15華蟾毒精硫酸鹽、蟾毒靈硫酸鹽、蟾毒它靈硫酸鹽和日蟾毒它靈硫酸鹽對(duì)人宮頸癌細(xì)胞(SiHa)的作用結(jié)果人宮頸癌細(xì)胞(SiHa)組別ODSD抑制率組別ODSD抑制率陰性對(duì)照組10.057陰性對(duì)照組0.9980.081溶媒對(duì)照組0.1%DMS00,9760.0422.40%溶媒對(duì)照組0.1%DMSO0.9540.020.83%陽(yáng)性對(duì)照組10ug/m1Taxol0.1860.01682.40%陽(yáng)性對(duì)照組lOug/mlTsxol0.1870.03480.97%華蟾毒精硫酸IC50=93.104nM500nM0.1960.01180.80%蟾毒靈硫酸鹽IC50=130.175nM500nM0.2030.02878.87%250nM0.2260.01378.40%250nM0.3990.00659.32%125nM0.4810.04052.60%125nM0.5020.01647.05%62.5nM0.5810.01142.70%62.5nM0.6130.01533.86%31.25nM0.7130.02125,60%31.25nM0.6900.01828.96%蟾毒它靈硫酸鹽IC50=129.785nM500nM0.2030.01079.70%日蟾毒它靈硫酸鹽IC50=83.257nM500nM0.1500.01883.98%250nM0.2120.01176.60%250nM0.3010.02367.96%125nM0.5160.01645.90%125nM0.4090.03357.36%62.5nM0.6970.01230.43%62.5nM0.5100.03745.96%3L25nM0.8260.01216.20%31.25nM0.6430,02032.18%實(shí)施例12:華蟾毒精硫酸鹽、蟾毒靈硫酸鹽、蟾毒它靈硫酸鹽或日蟾毒它靈硫酸鹽對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(shikawa)的作用。按MTT實(shí)驗(yàn)方法考察華蟾毒精硫酸鹽、蟾毒靈硫酸鹽、蟾毒它靈硫酸鹽或日蟾毒它靈硫酸鹽對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(shikawa)的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示華蟾毒精硫酸鹽、蟾毒靈硫酸鹽、蟾毒它靈硫酸鹽或日蟾毒它靈硫酸鹽對(duì)人子宮內(nèi)膜癌組胞(shikawa)均具有較強(qiáng)的抑制作用，各劑量組呈現(xiàn)了較好的量效關(guān)系。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表16所示。表16華蟾毒精硫酸鹽、蟾毒靈硫酸鹽、蟾毒它靈硫酸鹽和日蟾毒它靈硫酸鹽對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(shikawa)的作用結(jié)果子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(shikawa)組別ODSD抑制率組別ODSD抑制率陰性對(duì)照組1.6050.032陰性對(duì)照組1.5980.036溶媒對(duì)0.1%溶媒對(duì)0.1%照組DMS01.5690.0330.93%照組DMSO1.5670.0210.88%陽(yáng)性對(duì)10ug/ml陽(yáng)性對(duì)10ug/ml照組Taxol0.2120.01685.41%照組Tsxol0.2120.04187.07%華蟾毒500nM0.5660.1762.68%500nM0.6360.03261.49%精硫酸250nM0.6120.01360.00%蟾毒靈250nM0.7260.02350.65%125nM0.8170.06047.95%硫酸鹽125nM0.9150.01242.14%IC50:62.5nM1.0020.02235.45%IC50=62.5nM1.0180.03126.39%182.15243.3587nM31.25nM1.3730.04314.45%nM31.25nM1.3160.0675.50%蟾毒它500nM0,6010.03161.68%日蟾毒500nM0.5140.03164.44%靈硫酸250nM0.6210.01257.86%它靈硫250nM0.6160.03358.89%鹽125nM0.8150.04148.49%酸鹽125nM0.7120.04152.12%IC50=62.5nM0.9450.05140.18%IC50=62.5nM0.8530.04143.58%163.12128.7853nM31.25nM1.1750.02427.86%nM31.25nM1.0070.01731.23%根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出蟾蜍甾烯提取物和單體化合物華蟾毒精、蟾毒靈、蟾毒它靈、日蟾毒它靈及以上四個(gè)單體化合物的鹽酸鹽或硫酸鹽對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(A2780)、人卵巢癌細(xì)胞(SK-OV-3)、人宮頸癌細(xì)胞(SiHa)和人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(shikawa)的IC50值如表17所示。表17蟾蜍留烯類化合物及蟾蜍甾烯鹽化物對(duì)腫瘤細(xì)胞IC50值細(xì)胞株IC50值MCS-1MCS-1-2MCS-1-3MCS-1-4MCS-1-5A27800.187yg/ml84.472nM122.029nM132.457nM59.948nMshikawa0.132ug/ml184.458nM167.926nM250.554nM134.034nMSK-0V-30.288yg/ml87.OOlnM115.184nM218.894nM76.830nMSIHA0.257ug/ml95.631nM131.186nM131.OOlnM85.OOlnMIC50值19華蟾毒精鹽酸鹽蟾毒它靈鹽酸鹽蟾毒靈鹽酸鹽曰蟾毒它靈鹽酸鹽A278081.247nM119.478nM126.138nM54.228nMshikawa83.150nM110.081nM201.582nM74.433nMSK-0V-392.130nM129.121nM130.052nM83.083nMSIHA181.250nM162.521nM243.282nM128.273nM細(xì)胞株IC50值華蟾毒精硫酸鹽蟾毒它靈硫酸鹽蟾毒靈硫酸鹽曰蟾毒它靈硫酸鹽A278082.658nM119.986nM126.175nM55.017nMshikawa83.785nM110.145nM201.027nM74.857nMSK-0V-393.014nM129.785nM130.175nM83.257nMSIHA182.157nM163.123nM243.358nM128.785nM由上表得出蟾蜍甾烯提取物，日蟾毒它靈、華蟾毒精，蟾毒靈和蟾毒它靈及以上四個(gè)化合物的鹽酸鹽或硫酸鹽對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(A2780)、人卵巢癌細(xì)胞(SK-0V-3)、人宮頸癌細(xì)胞(SiHa)和人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(shikawa)都有很好的抑制作用。蟾蜍甾烯提取物，華蟾毒精，蟾毒靈，蟾毒它靈和日蟾毒它靈及以上四個(gè)化合物的鹽酸鹽或硫酸鹽顯示了很好的抗癌活性，IC50值均達(dá)到了nM的濃度范圍，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)日蟾毒它靈顯示出了比蟾蜍甾烯提取物和三個(gè)單體化合物華蟾毒精，蟾毒靈，蟾毒它靈更好的細(xì)胞選擇活性，即具有更好的抗婦科腫瘤活性，尤其是對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(A2780)的IC50值只有59.948nM，同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示日蟾毒它靈的鹽酸鹽或硫酸鹽具有比華蟾毒精、蟾毒靈、蟾毒它靈三個(gè)單體化合物的鹽酸鹽或硫酸鹽更好的抗婦科腫瘤作用。蟾蜍甾烯類化合物的琥玻酸鹽或硝酸鹽都是以具有抗婦科腫瘤活性的蟾蜍甾烯類化合物和琥玻酸或硝酸所形成的琥玻酸鹽或硝酸鹽，形成鹽后不改變藥理活性，同樣也具有抗婦科腫瘤作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可以看出蟾蜍甾烯類化合物及其鹽化物顯示出了比紫衫醇更好的抗婦科腫瘤的活性，且活性成分清楚，有效劑量低，潛在的副作用小，很有希望開(kāi)發(fā)成為新一代抗婦科腫瘤藥物。20權(quán)利要求1、蟾蜍甾烯類化合物及蟾蜍甾烯鹽化物在制備治療婦科腫瘤藥物中的應(yīng)用。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟾蜍甾烯類化合物及蟾蜍甾烯鹽化物在制備治療婦科腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于蟾蜍甾烯類化合物為以蟾蜍甾烯含量計(jì)重量比超過(guò)50%的提取物。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟾蜍甾烯類化合物及蟾蜍甾烯鹽化物在制備治療婦科腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于蟾蜍甾烯鹽化物為蟾蜍甾烯的鹽酸鹽、硫酸鹽、琥玻酸鹽或硝酸鹽。4、根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的蟾蜍甾烯類化合物及蟾蜍甾烯鹽化物在制備治療婦科腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于將蟾蜍甾烯類化合物或蟾蜍甾烯鹽化物和藥學(xué)上可接受的載體制備成注射液、片劑、粉針劑、顆粒劑、膠囊、口服液、膏劑，或霜?jiǎng)┑乃幬铩?、根據(jù)權(quán)利要求l、2或3所述的蟾蜍甾烯類化合物及蟾蜍甾烯鹽化物在制備治療婦科腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于婦科腫瘤為卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌或乳腺癌。全文摘要本發(fā)明提供了一種蟾蜍甾烯類化合物及蟾蜍甾烯鹽化物在制備治療婦科腫瘤藥物中的應(yīng)用，通過(guò)對(duì)蟾蜍甾烯提取物和單體化合物華蟾毒精、蟾毒靈、蟾毒它靈、日蟾毒它靈及以上四個(gè)單體化合物的鹽酸鹽或硫酸鹽體外對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(A2780)、人卵巢癌細(xì)胞(SK-OV-3)、人宮頸癌細(xì)胞(SiHa)和人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(shikawa)四種婦科腫瘤的抗癌實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蟾蜍甾烯提取物和單體化合物華蟾毒精、蟾毒靈、蟾毒它靈、日蟾毒它靈及以上四個(gè)單體化合物的鹽酸鹽或硫酸鹽對(duì)四種婦科腫瘤細(xì)胞均有很強(qiáng)的抑制作用，抗癌活性強(qiáng)于陽(yáng)性藥紫衫醇，且不良反應(yīng)小，有望開(kāi)發(fā)成新的抗癌藥物。文檔編號(hào)A61K31/585GK101491531SQ200910025008公開(kāi)日2009年7月29日申請(qǐng)日期2009年2月16日優(yōu)先權(quán)日2009年2月16日發(fā)明者婧周,唐于平,段金廒,馬宏躍申請(qǐng)人:南京中醫(yī)藥大學(xué)