專利名稱：淫羊藿苷作為制備治療急性腦梗死病藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物的應(yīng)用，特別涉及將淫羊藿苷作為制備治療急性腦梗死 病藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
，
腦血管病是老年人的常見病、多發(fā)病，死亡率高，且病后多數(shù)患者留有不同 程度的殘疾。當(dāng)前，主要的臨床治療手段有溶栓、抗血小板聚集、腦保護(hù)等。因
時(shí)間窗的問題，早期溶栓受到限制；而抗血小板藥物的應(yīng)用更多著眼于腦梗死再 發(fā)的預(yù)防，因此，急性期治療的焦點(diǎn)集中在腦保護(hù)治療上。
缺血所致腦損害的發(fā)病機(jī)制目前仍不甚清楚，目前較為公認(rèn)的可能機(jī)制為 氧化應(yīng)急、興奮性氨基酸毒性、炎性反應(yīng)等，無論何種機(jī)制，疾病的最終病理過 程皆為神經(jīng)細(xì)胞的死亡，且由于凋亡與死亡的共存即缺血后中心區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞壞 死和周圍神經(jīng)細(xì)胞的凋亡過程，可使病灶逐漸擴(kuò)大加重病情進(jìn)展。大量事實(shí)證明， 線粒體的結(jié)構(gòu)和功能障礙引發(fā)自由基對細(xì)胞的損害(即氧化應(yīng)激)在此過程中發(fā) 揮了重要的作用。當(dāng)組織發(fā)生缺血、缺氧等病理改變時(shí)，可造成線粒體通透性增 加致使大量氧自由基的釋放，且組織對自由基清除能力的下降(線粒體功能異常 引發(fā)能量代謝障礙)，最終導(dǎo)致氧自由基聚集。由于腦本身的生理和生化特性， 使其表現(xiàn)為對自由基異常敏感，過量自由基的存在可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功 能的破壞。多年的研究表明，氧化應(yīng)激能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，是造成腦缺血后繼發(fā) 性病理損害的主要機(jī)制之一。臨床上，針對腦中風(fēng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)早期干預(yù)以適 度控制應(yīng)激，已獲得了一些令人滿意的結(jié)果。因此，控制氧化應(yīng)激以阻斷細(xì)胞凋 亡信號的傳導(dǎo)，尋找有效的缺血性腦損傷的保護(hù)措施顯得頗為必要。而線粒體作 為活性氧最大的產(chǎn)生地，其功能的改善不僅從源頭上減少了氧自由基的產(chǎn)生，同 時(shí)也能降低活性氧所造成的細(xì)胞損害，此對于發(fā)揮急性腦缺血再灌注損傷的保護(hù) 作用具有重要的意義。
在本發(fā)明之前，淫羊藿苷(icariin, Ica),它是從小檗科淫羊藿屬植物中提取的有效成分,是一種黃酮醇苷類化合物，為中藥中提取的單體化合物，在心 腦血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、抗炎、抗骨質(zhì)疏松、抗衰老、 抗腫瘤等方面均具有重要作用，它對心腦血管系統(tǒng)的影響，它能擴(kuò)張血管，改善 微循環(huán)，增加血流量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，研制將淫羊藿苷淫羊泰苷作為制備治療 急性腦梗死病藥物的應(yīng)用。 本發(fā)明的技術(shù)方案是
淫羊藿苷作為制備治療急性腦梗死病藥物的應(yīng)用，其主要技術(shù)特征在于將淫 羊藿苦單體經(jīng)口服應(yīng)用于急性腦梗死的治療。
本發(fā)明利用淫羊楚苷具有的強(qiáng)大的抗氧化應(yīng)激作用，且影響下游過氧化物酶 體增歹直物'激活受體y共;敫活因子la (peroxisome proliferator- activated receptor-y coactivator-l , PGC-la)的表達(dá)及活性，從而使多功能輔助活化因子的PGC-la 參與調(diào)節(jié)線粒體氧化代謝，并作為調(diào)控線粒體生物合成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在某些生理 和病理?xiàng)l件下介導(dǎo)線粒體生物形成，從而在缺血性腦損傷中包括腦梗死發(fā)揮重要 的保護(hù)作用。
應(yīng)用淫羊藿苷的機(jī)理
淫羊藿苷可抑制氧化應(yīng)激；淫羊藿苷能上調(diào)PGC-la的表達(dá)；PGC-la對氧 糖剝奪神經(jīng)元具有明顯的保護(hù)作用。
淫羊藍(lán)芬主要通過調(diào)控PGC-la進(jìn)而控制氧化應(yīng)激發(fā)揮缺血性腦損傷中的保 護(hù)作用。
本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)和效果將在下面繼續(xù)說明。


圖1---h鼠腦缺血后行為學(xué)結(jié)果圖
圖2—一TTC染色結(jié)果圖。 圖3—一腦含水量圖。
圖4一一淫羊蓬苷對OGD神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用的濃度曲線圖。 圖5——淫羊藿香對0GD神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用的時(shí)間曲線圖。 圖6——流式細(xì)胞儀檢測神經(jīng)元凋亡率圖。圖7——淫羊藿苷對MCA0腦組織PGC-la mRNA水平的影響圖。 圖8——淫羊藿苦對MCAO腦組織PGC-la蛋白水平的影響圖。 圖9——淫羊度苷對0GD神經(jīng)元PGC-la mRNA水平的影響圖。 圖10—_淫羊蓉芬對0GD神經(jīng)元PGC-la蛋白水平的影響圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明首先從整體角度，通過行為學(xué)、病理學(xué)、梗死體積和水腫等方面驗(yàn)證 淫羊藿苷能改善缺血性腦損傷，從而證明淫羊蕾苷對缺血性腦損傷具有治療作 用；其次，從整體到離體水平，用分子生物學(xué)等技術(shù)研究淫羊密苷發(fā)揮保護(hù)效應(yīng) 過程中PGC-la作用，以證明淫羊藿苷是具有臨床應(yīng)用價(jià)值的治療缺血性腦損傷 的藥物。
實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，淫羊愛苷可通過上調(diào)缺血性腦損傷過程中PGC-la的表達(dá)進(jìn)而發(fā) 揮保護(hù)效應(yīng)。
具體如下。 實(shí)施例l:
淫羊藿苦單體，白色粉狀，規(guī)格是10g/瓶，干燥保存于O-5'C;臨用時(shí)用少 量無水乙醇助溶(體積比小于5%),超純水配制為lmg/ml原液，IO(TC水浴加熱溶 解。
實(shí)施例2:
在體實(shí)驗(yàn)根據(jù)小鼠體重計(jì)算所需用量，抽取原液后灌胃；后續(xù)離體實(shí)驗(yàn)，將
淫羊藿苷原液根據(jù)所需濃度作相應(yīng)的稀釋。
實(shí)驗(yàn)1:體內(nèi)研究證明淫羊藿苷對缺血性腦損傷具有治療作用
成年雄性C57小鼠，體重20 - 30克，隨機(jī)分為正常對照組和腦缺血再灌注 組，腦缺血再灌注組按當(dāng)前普遍認(rèn)可的線栓法制作大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)再灌注模型，在缺血2h的基礎(chǔ)上再灌注22h， 通過行為學(xué)、病理學(xué)、梗死體積和水腫程度證明淫羊泰苷對缺血性腦損傷具有治 療作用。 1)材料和方法
治療組術(shù)前灌服以淫羊藿苷(100mg/kg/d),對照組予以等量生理鹽水，然 后制作大腦中動脈缺血動物模型，術(shù)后同樣方法每天用藥，持續(xù)至24h、 48h、72h和7天分別處死小鼠。
行為學(xué)檢測采用longa評分法神經(jīng)功能缺損評分0分無神經(jīng)損傷 癥狀；l分不能完全伸展對側(cè)前爪；2分向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圏；3分向?qū)?cè)傾倒；4 分不能自發(fā)行走，意識喪失。
TTC染色缺血后24小時(shí)、72小時(shí)和7天的腦組織在^L交叉前后等分間隔 2rara連續(xù)作5個腦冠狀切片，將其放入提前預(yù)熱在37° C的1%TTC溶液中避光 30min,期間小心翻動幾次，染色后正常組織為紅色，腦梗塞組織為白色，將腦 片平面置于刻度紙上，用數(shù)碼相機(jī)照相后輸入計(jì)算機(jī)，采用Sigma Scan Pro5. 0 (Jandel， San Real, CA, USA)軟件計(jì)算相應(yīng)的梗塞體積。
腦含水量取缺血后24小時(shí)、72小時(shí)和7天的小鼠立即斷頭處死，取出腦 組織，沿大腦中線迅速分離成缺血側(cè)和對照側(cè)大腦半球，并立即稱濕重，然后迅 速將大腦半球組織塊放入電熱烘箱中，100° C烘烤72h，再稱干重。如前所述， 腦水胂含量按下列公式計(jì)算腦組織含水量(％)=(濕重-干重)/濕重xl00%。 2)結(jié)果
(1) 行為學(xué)結(jié)果longa評分結(jié)果提示，在缺血24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí) 和7天，淫羊度苷可顯著減輕缺血所致神經(jīng)功能缺損，如圖1所示。
(2) TTC染色結(jié)果在缺血24小時(shí)、72小時(shí)和7天，與MCA0組相比，淫羊 愛苷的應(yīng)用均能顯著減小壞死體積，其中以72小時(shí)最為明顯，如圖2所示。
(3)腦含水量與對照組相比，MCA0組的腦含水量在24h、 72h明顯增加，而 在7天組間無顯著差異存在；與MCA0組比較，淫羊藿苷可顯著減少24h和72h 缺血組織的腦含水量，如圖3所示。
實(shí)驗(yàn)2:體外研究證明淫羊藿苷對0GD神經(jīng)元具有保護(hù)作用 1)材料和方法
原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng):懷孕15-17d野生型昆明小鼠，斷頸處死后，取其胚 胎，置于盛有冷HBSS的培養(yǎng)皿中，分離大腦皮層，1X胰酶消化后，置多聚賴氨 酸處理后的24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，2 ~ 3 x 106細(xì)胞/ml，每2-3d部分換液，共培養(yǎng) 10-14d。細(xì)胞培養(yǎng)在無血清、無酚紅和無雌激素的培養(yǎng)液(Neurobasal加上 Hepes、 B27和谷氨酰胺)中，37°C， 5°化02培養(yǎng)箱。
神經(jīng)元細(xì)胞活力檢測使用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測神經(jīng)元的細(xì)胞活力。向100m 1培養(yǎng)液/孔中加入mtt, 37 'c,5%c02的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 6h ，然后傾去全部培養(yǎng)液,每孔中加入lOOjnl dms0溶液,搖床上搖動至藍(lán)紫色 的結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)計(jì)數(shù)儀測定各組0d值。
神經(jīng)元凋亡率檢測Annexin-V/PI雙染法使用流式細(xì)胞儀4企測神經(jīng)元凋亡 率。收集神經(jīng)元離心(2000rpm離心5min); PBS洗滌細(xì)胞二次(2000rpm離心 5min)收集1 5xl()5細(xì)胞;加入500 n L的Binding Buffer懸浮細(xì)胞；力口入5mL Annexin V-FITC混勻后，加入5 m L Propidium Iodide,混勻；室溫、避光、反 應(yīng)5 ~ 15min;流式細(xì)J包4義;險(xiǎn)測。 2)結(jié)果
① 劑量曲線提示淫羊楚苷可顯著提高OGD神經(jīng)元的細(xì)胞活力，并呈明顯的劑 量相關(guān)，當(dāng)濃度達(dá)到0.8mg/l后逐漸進(jìn)入平臺期，如圖4所示；時(shí)間曲線顯示， 在0GD后6h、 12h、 24h和48h,淫羊蓉苷均有明顯的^f果護(hù)作用，此種差異以24h 最為顯著，如圖5所示。據(jù)此，后續(xù)研究均選取濃度為0. 8mg/1、 OGD后24h的 神經(jīng)元為研究對象。
② 流式細(xì)胞儀檢測神經(jīng)元死亡率與前結(jié)果相一致，淫羊藿苷可顯著減少0GD 所致細(xì)胞凋亡，如圖6所示。
實(shí)驗(yàn)3:體內(nèi)外研究淫羊藿苷發(fā)揮缺血保護(hù)作用過程中對PGC-la的影響 1)材料和方法
實(shí)時(shí)熒光定量PCR :引物為PGC-la (Sense primer: 5'-TGACACAACGCGGACAGAA-3', Anti-sense primer: 5'- GGTAGGTGATGAAA CCATAG -3',), p-actin ( Sense primer: 5，-GGCACCACACYTTCTACAATG-3，， Anti-sense primer: 5，-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAAC-3，，)；探針為PGC-la: 5'FAM + TGAGAGACCGCTTTGAAGTTTTTG + TAMRA3' ， p-actin : 5 ， -FAM+TGTGGCCCCTGAGGAGC ACCC-3'
根據(jù)分子生物學(xué)技術(shù)常規(guī)，提取腦組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDM,再作實(shí)時(shí)熒光 定量PCR。反應(yīng)條件95° C 5分鐘1個循環(huán)，95° C 30秒、60° C 1分鐘40
個循環(huán)。
Western Blot:大腦皮質(zhì)組織研磨后提取蛋白并定量，100g/L SDS-PAGE 凝膠80ug蛋白/孔，恒流40mA電泳，恒壓100V電轉(zhuǎn)膜2h，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜。50g/L脫脂奶粉于室溫封閉lh,分別加入稀釋的一抗4。C孵育過夜。TBST洗膜后， 加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗，28。C孵育90min, TBST洗膜，加入化學(xué)發(fā)光試劑至膜上 3min，最后曝光、顯影。 2)結(jié)果
① 淫羊藿苷對MCAO腦組織PGC-la水平的影響
實(shí)時(shí)定量PCR 4企測顯示與缺血對照組相比，淫羊藿普可增加PGC-la mRNA 的表達(dá)水平，且具有時(shí)間依賴性，在缺血后72h和7d與單純?nèi)毖M相比具有顯 著性差異，如圖7所示。
Western Blot ;險(xiǎn)測顯示與mRNA水平相一致，PGC-la蛋白水平在缺血對照 組與淫羊藿苷組間在各時(shí)間點(diǎn)(24小時(shí)、72小時(shí)和7天)均存在顯著性差異， 且PGC-la有隨時(shí)間延長逐漸升高的趨勢，如圖8所示。
② 淫羊藿苷對OGD神經(jīng)元PGC-la水平的影響 實(shí)時(shí)定量PCR檢測顯示與對照組相比，OGD過程中PGC-la raRM水平呈上升
趨勢；而淫羊藿芬的應(yīng)用愈加增加PGC-la mRNA的表達(dá)，與單純OGD組存在顯著 差異，如圖9所示。
Western Blot ;險(xiǎn)測顯示與mRNA水平相一致，PGC-la蛋白水平在對照組與OGD 組和OGD組與OGD淫羊度苷干預(yù)組間均存在顯著性差異，如圖10所示。
權(quán)利要求
1.淫羊藿苷作為制備治療急性腦梗死病藥物的應(yīng)用，其特征在于將淫羊藿苷單體經(jīng)口服應(yīng)用于急性腦梗死的治療。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的淫羊密脊作為制備治療急性腦梗死病藥物的應(yīng)用，其 特征在于無水乙醇助溶淫羊泰苷，體積比小于5%,超純水配制為lmg/ml原液， IO(TC水浴加熱溶解。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的淫羊藿苷作為制備治療急性腦梗死病藥物的應(yīng)用，其特 征在于其口服應(yīng)用劑量為100mg/kg。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種將淫羊藿苷作為制備治療急性腦梗死病藥物的應(yīng)用。本發(fā)明技術(shù)方案是將淫羊藿苷單體經(jīng)口服應(yīng)用于急性腦梗死的治療，無水乙醇助溶淫羊藿苷，體積比小于5％，超純水配制為1mg/ml原液，100℃水浴加熱溶解，口服應(yīng)用劑量為100mg/kg。本發(fā)明克服了治療急性腦梗死病藥物存在的各種缺陷。本發(fā)明成功地將淫羊藿苷轉(zhuǎn)用作治療急性腦梗死病藥物，利用抗氧化應(yīng)激作用，且影響下游過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisomeproliferator-activated receptor-γcoactivator-1，PGC-1α)的表達(dá)及活性，從而使多功能輔助活化因子的PGC-1α參與調(diào)節(jié)線粒體氧化代謝，并作為調(diào)控線粒體生物合成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在某些生理和病理?xiàng)l件下介導(dǎo)線粒體生物形成，從而在缺血性腦損傷中包括腦梗死發(fā)揮重要的保護(hù)作用。
文檔編號A61P9/10GK101590071SQ20091003295
公開日2009年12月2日 申請日期2009年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月9日
發(fā)明者張辰宇, 運(yùn) 徐, 朱海榮 申請人:南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院