專利名稱：一種β-間二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯衍生物在防治瘧疾中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種"-間二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯衍生物的應(yīng)用，具體來說涉及這種間二 羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯衍生物在預(yù)防和治療瘧疾中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
瘧疾是全球最普遍，危害最嚴重的原生動物傳染病之一，是由瘧原蟲寄生在人體血液系 統(tǒng)內(nèi)引起的一種傳染性寄生蟲病，瘧疾還可以通過感染蚊蟲的叮咬在動物間和人類間進行傳 播。據(jù)世界衛(wèi)生組織《2008年世界瘧疾報告》顯示，目前世界上有近半數(shù)人口 (約為33億) 面臨感染瘧疾的危險，每年全世界死于瘧疾的人數(shù)約為100萬人，其中大多數(shù)為不滿5歲的 兒童，大部分瘧疾的病例和死亡均發(fā)生在非洲，而亞洲、拉丁美洲、中東以及歐洲部分地區(qū) 也仍有部分瘧疾病例的發(fā)生。我國在瘧疾的預(yù)防和治療方面己取得了顯著的成就，但是目前 仍有21個省、自治區(qū)、直轄市存在瘧疾傳播的現(xiàn)象，其中云南、海南兩省的瘧疾流行較為嚴 重，中部地區(qū)的蘇、魯、豫、皖、鄂5省的瘧疾流行也尚未有效地控制，其它省份也受到過 輸入性惡性瘧的威脅。
危害人類的瘧疾瘧原蟲主要有四種惡性瘧原蟲(/Va5V^力'娜/^Ci/73i7孤)，間日瘧原
蟲(尸.w'ra力、三日瘧原蟲(尸.鵬7arj'朋)和卵形瘧原蟲(尸.oraJe)。其中最常見的是惡 性癥原蟲和間日癥原蟲兩種，而惡性瘧原蟲則是到目前為止最致命的一種瘧疾感染。
早期診斷和及時治療是瘧疾控制的基本要素?？鼘?、氯喹等常規(guī)化學(xué)藥物就曾經(jīng)在瘧疾 的治療中發(fā)揮重要的作用，但隨著這些抗瘧藥的廣泛使用，瘧原蟲逐漸產(chǎn)生了抗藥性。20世 紀50年代后期在泰緬邊境和哥倫比亞就出現(xiàn)了氯喹抗性病例。隨后，氯喹抗性幾乎遍布所有 惡性瘧流行區(qū)，哌喹、甲氟喹、乙胺嘧啶和磺胺類藥物抗性株也相繼出現(xiàn)，病人甚至對青蒿 素類藥物的敏感性也開始下降。我國也同樣存在很嚴重的惡性瘧原蟲抗藥性問題。因此，人 類目前可用于防治瘧疾的抗瘧藥已無法滿足當前和將來的抗瘧需要?，F(xiàn)在只有開發(fā)出新型結(jié) 構(gòu)、新作用機理或新藥靶的抗瘧活性化合物，并積極采用聯(lián)合用藥、根據(jù)不同地區(qū)瘧原蟲耐 藥性不同而釆用不同組合用藥的策略，才能有效地防治瘧疾，控制瘧原蟲耐藥性的不斷增強 和耐藥瘧原蟲的快速蔓延。
我們在研究綠僵菌Vetar/^w'iM sp. SC0924代謝產(chǎn)物及其抗荔枝霜疫霉活性的過程中， 發(fā)現(xiàn)了五種間二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯衍生物，己公開在徐良雄的博士學(xué)位論文中(見ID 10001200418010715012)，其中包括結(jié)構(gòu)由式(1)-1表示的aigialomycin B:<formula>formula see original document page 4</formula>式(1)-1
結(jié)構(gòu)由式(1)-2表示的麥他菌素A (metarhizimycin A):<formula>formula see original document page 4</formula>式(l)-2
結(jié)構(gòu)由式(1)-3表示的麥他菌素C (metarhizimycin C):
<formula>formula see original document page 4</formula>式(1)-3
結(jié)構(gòu)由式(1)-4表示的麥他菌素D (metarhizimycin D):<formula>formula see original document page 5</formula>
式(l)-4
結(jié)構(gòu)由式(1)-5表示的麥他菌素E (metarhizimycin E):
<formula>formula see original document page 5</formula>
式(1)-
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于開發(fā)出這些間二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯衍生物在預(yù)防和治療瘧疾方 面的應(yīng)用。
我們通過體外抗瘧活性試驗證明，上述的aigialomycin B，麥他菌素A， C, D， E對惡 性瘧原蟲都有很強的抑制活性，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的P-間二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯衍生物可以用于制備預(yù)防和治療瘧疾的藥物。 所述的"-間二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯衍生物的結(jié)構(gòu)由通式(l)表示
<formula>formula see original document page 5</formula>
式(1)其中化合物1即aigialomycinB: R尸0H， R2=H， R3=CH3，=為單鍵，！^和&合并為一個 氧原子，二:為雙鍵，R6=0H;或化合物2即麥他菌素A: R產(chǎn)H， R產(chǎn)0H， R3=CH3，=為單鍵， R4和R5合并為一個氧原子，::=為雙鍵，R6=0H;或化合物3即麥他菌素C: R產(chǎn)0H, R2=H， R3=CH3，
=為單鍵，R4和Re合并為一個氧原子，:=:為雙鍵，R5=0H;或化合物4即麥他菌素D: R,=0H， R2=H， R3=CH3，=為雙鍵，&和R5不存在，=:=為單鍵，R6=0H;或化合物5即麥他菌素E: R產(chǎn)H， R產(chǎn)0H， R3=CH3，=為雙鍵，[ 4和^不存在，==:為單鍵，R6=0H。
本發(fā)明的^-間二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯衍生物的制備方法，是將綠僵菌ifeta/^力'咖 sp. SC0924 CGMCC No. 2900真菌用小麥固體培養(yǎng)基或YMG液體培養(yǎng)基發(fā)酵得到發(fā)酵培養(yǎng)物， 然后將發(fā)酵培養(yǎng)物用有機溶劑提取得到提取物，然后將提取物用硅膠柱層析等方法分離并提 純得到產(chǎn)物。所述綠僵菌船tar力izi， sp.SC0924從鼎湖山國家自然保護區(qū)一土壤樣品中分 離獲得，已于2009年2月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡 稱為CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號園中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號為CGMCC No,2900。
將本發(fā)明所述的^-間二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯衍生物用人惡性瘧原蟲3D7藥物敏感株進 行體外抗瘧活性試驗，結(jié)果顯示，aigialomycin B,麥他菌素A，麥他菌素C，麥他菌素D 和麥他菌素E均有很強的抗瘧原蟲藥物敏感株活性，其中麥他菌素D的活性與青蒿素相當， aigialomycin B，麥他菌素A和麥他菌素E的活性比間苯二酚大環(huán)內(nèi)酯aigialomycin D強， 麥他菌素C的活性與aigialomycin D相當。
將本發(fā)明所述的P-間二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯衍生物用人惡性瘧原蟲Dd2藥物抗性株進 行體外抗瘧活性試驗，結(jié)果顯示，麥他菌素A，麥他菌素C，麥他菌素D和麥他菌素E均有 很強的抗瘧原蟲藥物抗性株活性，其中aigialomycin B，麥他菌素D和麥他菌素E對人的活 性比氯喹和青蒿素略差，但比aigialomycin D強。
將本發(fā)明的間二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯衍生物中的一個或一個以上的混合物添加到藥 用載體、藥用組合物中，得到防治瘧疾的藥物。
本發(fā)明的間二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯衍生物對瘧原蟲有較強的抑制活性，可用于瘧疾 的預(yù)防和治療。
具體實施例方式
下面實施例是對本發(fā)明的進一步說明，不是對本發(fā)明限制。 實施例1:
將綠僵菌yffez^r力iw'"yz7 sp. SC0924 CGMCC No. 2900菌株在小麥固體培養(yǎng)基(小麥1份， YMG液體培養(yǎng)基1.8份。所述的YMG液體培養(yǎng)基為通用培養(yǎng)基，pH5.3 5.7，每升培養(yǎng)基中 含有葡萄糖4g，麥芽提取物10g，酵母提取物4g，其余是水)上，(26±2) °C，黑暗條件下靜置培養(yǎng)6 12d，得到固體發(fā)酵培養(yǎng)物。
將固體發(fā)酵培養(yǎng)物(25L)用等體積的體積分數(shù)95%乙醇浸泡三次，每次48h，過濾后減 壓濃縮至浸膏狀(630g)，將浸膏用體積分數(shù)80%的乙醇水溶液(4L)溶解，將乙醇溶解物 用等體積的石油醚萃取3次，離棄石油醚萃取物，將剩余的乙醇水溶液在減壓除去乙醇并用 水補到原體積，將水溶液用等體積的氯仿萃取3次，分離出氯仿萃取物和水溶液，將氯仿萃 取物合并并蒸餾濃縮得到氯仿提取物19. 23g，將水溶液用等體積乙酸乙酯萃取3次，分離出 乙酸乙酯萃取物，減壓濃縮得到乙酸乙酯提取物39. 31g。
將氯仿提取物19. 00g上硅膠柱(硅膠為100 200目，300g)，以氯仿-甲醇混合溶劑作 為洗脫劑，以體積比95:5 80:20的梯度進行洗脫，用薄層層析(TLC)檢測合并相似的流份， 收集薄層板上氯仿-甲醇體積比95:5展開時比移值0. 6 0. 8的流份A，蒸餾濃縮得3. 40g， 和薄層板上氯仿-甲醇體積比90:10展開時比移值0.4 0.7的流份B，蒸餾濃縮得6.83g，將 流分A進行硅膠柱層析(硅膠100 200目，70g)，以石油醚-丙酮混合溶劑作為洗脫劑，在 體積比85:15 60:40的梯度進行洗脫，將薄層板上石油醚-丙酮體積比50:50展開時比移值 0. 4 0. 5的流份合并后以高效液相色譜(LC-6AD型半制備高效液相色譜儀，RID-10A檢測器， 日本Shimadzu公司生產(chǎn)，流動相為體積分數(shù)66%的甲醇)分離純化，得到麥他菌素D 0. 060g， 麥他菌素E 0.025g。將流份B進行硅膠柱層析(硅膠為100 200目，150g)，以石油醚-丙 酮混合溶劑作為洗脫劑，在體積比85:15 60:40的梯度進行洗脫，將薄層板上石油醚-丙酮 體積比50:50展開時比移值0. 3 0. 5的流份合并后以甲醇為溶媒重結(jié)晶得無色柱狀結(jié)晶麥他 菌素A 0.320g，重結(jié)晶后甲醇母液上常壓反相柱，以甲醇-水混合溶劑作為洗脫劑，在體積 比2:1 4:1的梯度進行洗脫，將流份以高效液相色譜(儀器同前，流動相為體積分數(shù)66%的 甲醇)純化，分別得到aigialomycinBO. 100g (Isaka， eta丄J. Org. Chem. ， 2002， 67(5)， 1561-1566) zeaenol0.060g (Sugawara， et al. Phytochemistry， 1992， 31(6): 1987-1990)。
將乙酸乙酯提取物39. OOg上硅膠柱(硅膠為100 200目，800g)，以氯仿-甲醇混合溶 劑作為洗脫劑，以體積比98:2 50:50的梯度進行洗脫，用薄層層析(TLC)檢測合并相似的 流份，收集薄層板上氯仿-甲醇體積比90:10展開時比移值0. 3 0. 5的流份C，蒸餾濃縮得 5.56g進行硅膠柱層析(100 200目，80g)，以石油醚-丙酮混合溶劑作為洗脫劑，在體積比 80:20 50:50的梯度進行洗脫,收集薄層板上氯仿-甲醇體積比90:10展開時比移值0. 3 0. 4 的流份合并后以高效液相色譜(儀器同前，流動相為體積分數(shù)34%的甲醇)純化，得到麥他 菌素C 0. 056g。
實施例2:
在體外用RMPI 1640培養(yǎng)基和體積分數(shù)10%人血清培養(yǎng)人惡性瘧原蟲3D7藥物敏感株， 紅細胞壓積為5%左右。用質(zhì)量分數(shù)5% f山梨醇將瘧原蟲同步化到環(huán)狀體時期，然后鋪板，初始感染率為1%，紅細胞壓積為5%。分別將aigialomycinB，麥他菌素A，麥他菌素C，麥 他菌素D和麥他菌素E用DMSO溶解配制成母液，再用培養(yǎng)基稀釋，活性檢測時，濃度梯度采 取三倍梯度稀釋，藥液占培養(yǎng)體系的體積分數(shù)10% (DMS0的濃度小于體積分數(shù)0.5%)。培養(yǎng) 48h后涂片，Gimsa染色，鏡檢，計數(shù)感染率。抑制率=(空白對照組感染率-藥物組感染率) /空白對照組感染率X100G/。。將抑制率和藥物濃度進行非線性回歸(Graphpad Prism 3.0)， 計算ICs。。同時以同樣方法制備的氯喹藥液，青蒿素藥液和aigialomycin D藥液作為陽性對 照。結(jié)果為，aigialomycin B的ICs。為(650 ± 87)勤1/L，麥他菌素A的ICs。為(780 ± 101) nmol/L，麥他菌素C的ICs。為(3 800 ± 680) nmol/L，麥他菌素D的1。50為(20 ± 8. 5) nmol/L，麥他菌素E的105。為(1 100 ± 280) nmol/L，對照品氯喹的ICs。為(23. 4± 8.2) nmol/L，青蒿素的ICs。為(12. 5 ± 6.7) nmol/L，間苯二酚大環(huán)內(nèi)酯aigialomycin D的IC50 為(3 100± 870) nmol/L。 實施例3:
在體外用RMPI 1640培養(yǎng)基和體積分數(shù)10%人血清培養(yǎng)人惡性瘧原蟲Dd2多藥耐藥株， 紅細胞壓積為5%左右。用質(zhì)量分數(shù)5% A山梨醇將瘧原蟲同步化到環(huán)狀體時期，然后鋪板， 初始感染率為1%，紅細胞壓積為5%。分別將aigialomycin B，麥他菌素A，麥他菌素C，麥 他菌素D和麥他菌素E用DMSO溶解配制成母液，再用培養(yǎng)基稀釋，活性檢測時，濃度梯度采 取三倍梯度稀釋，藥液占培養(yǎng)體系的體積分數(shù)10% (DMS0的濃度小于體積分數(shù)0.5%)。培養(yǎng) 48h后涂片，Gimsa染色，鏡檢，計數(shù)感染率。抑制率=(空白對照組感染率-藥物組感染率) /空白對照組感染率乂100%。將抑制率和藥物濃度進行非線性回歸(Graphpad Prism 3.0)， 計算ICs。。同時以同樣方法制備的氯喹藥液，青蒿素藥液和aigialomycin D藥液作為陽性對 照。結(jié)果為，aigialomycin B的IC幼為(1 350 ± 870) nmol/L，麥他菌素A的半數(shù)抑制濃 度(IC5。) 〉50 000 nmol/L，麥他菌素C的IC5?！?50 000腸1/L，麥他菌素D的ICs。為(8 800 ± 1 350) nmol/L，麥他菌素E的ICs。為(1 650 ± 920)畫1/L，對照品氯喹的IC5。為(112. 6± 25.6) nmol/L,青蒿素的ICs。為(13. 5 ± 5.9)腸1/L，間苯二酚大環(huán)內(nèi)酯aigialomycin D 的IC5?！?50 000 nmol/L。
權(quán)利要求
1.以下通式(1)表示的化合物在制備治療瘧疾的藥物方面的應(yīng)用，式(1)其中化合物1R1＝OH，R2＝H，R3＝CH3， id="icf0002" file="A2009100376380002C2.tif" wi="6" he="1" top= "108" left = "89" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>為單鍵，R4和R5合并為一個氧原子， id="icf0003" file="A2009100376380002C3.tif" wi="6" he="1" top= "107" left = "167" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>為雙鍵，R6＝OH；或化合物2R1＝H，R2＝OH，R3＝CH3， id="icf0004" file="A2009100376380002C4.tif" wi="6" he="1" top= "116" left = "99" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>為單鍵，R4和R5合并為一個氧原子， id="icf0005" file="A2009100376380002C5.tif" wi="6" he="1" top= "116" left = "175" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>為雙鍵，R6＝OH；或化合物3R1＝OH，R2＝H，R3＝CH3， id="icf0006" file="A2009100376380002C6.tif" wi="6" he="1" top= "124" left = "108" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>為單鍵，R4和R6合并為一個氧原子， id="icf0007" file="A2009100376380002C7.tif" wi="6" he="1" top= "124" left = "184" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>為雙鍵，R5＝OH；或化合物4R1＝OH，R2＝H，R3＝CH3， id="icf0008" file="A2009100376380002C8.tif" wi="6" he="1" top= "133" left = "115" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>為雙鍵，R4和R5不存在， id="icf0009" file="A2009100376380002C9.tif" wi="6" he="1" top= "132" left = "169" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>為單鍵，R6＝OH；或化合物5R1＝H，R2＝OH，R3＝CH3， id="icf0010" file="A2009100376380002C10.tif" wi="6" he="1" top= "141" left = "99" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>為雙鍵，R4和R5不存在， id="icf0011" file="A2009100376380002C11.tif" wi="6" he="1" top= "141" left = "154" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>為單鍵，R6＝OH。
全文摘要
本發(fā)明涉及通式(1)表示的β-間二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯衍生物在預(yù)防和治療瘧疾中的應(yīng)用，其中化合物1R₁＝OH，R₂＝H，R₃＝CH₃，為單鍵，R₄和R₅合并為一個氧原子，為雙鍵，R₆＝OH；或化合物2R₁＝H，R₂＝OH，R₃＝CH₃，為單鍵，R₄和R₅合并為一個氧原子，為雙鍵，R₆＝OH；或化合物3R₁＝OH，R₂＝H，R₃＝CH₃，為單鍵，R₄和R₆合并為一個氧原子，為雙鍵，R₅＝OH；或化合物4R₁＝OH，R₂＝H，R₃＝CH₃，為雙鍵，R₄和R₅不存在，為單鍵，R₆＝OH；或化合物5R₁＝H，R₂＝OH，R₃＝CH₃，為雙鍵，R₄和R₅不存在，為單鍵，R₆＝OH。實驗證明該系列化合物具有很強的抗瘧原蟲藥物敏感株活性和抗瘧原蟲藥物抗性株活性。
文檔編號A61K31/365GK101513401SQ200910037638
公開日2009年8月26日 申請日期2009年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月6日
發(fā)明者何正祥, 徐良雄, 游劍嵐, 薛璟花, 陳小平, 魏孝義 申請人:中國科學(xué)院華南植物園;中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院