專利名稱：用于獲取全肝支架的試劑盒及全肝支架獲取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獲取生物支架時(shí)使用的試劑盒，具體涉及用于獲取全肝支 架的試劑盒。本發(fā)明還涉及使用所述試劑盒獲得全肝支架的方法。
#景駄
當(dāng)前，對(duì)終末期肝病(肝硬化，肝性腦病、肝癌)唯一有效的治療方法 只有肝臟移植。其他的方法如透析等雖然能延長(zhǎng)人的生命，但是不能替代肝 臟的所有功能，很難防止病情惡化。肝移植目前雖然在手術(shù)方面己相當(dāng)成熟， 但是存在供肝短缺及術(shù)后需要長(zhǎng)期應(yīng)用免疫抑制劑等問(wèn)題，嚴(yán)重限制了肝移 植在臨床上的應(yīng)用。因此，通過(guò)肝組織工程來(lái)緩解供體短缺的現(xiàn)狀具有重要 的現(xiàn)實(shí)意義。
肝臟組織工程中理想的支架材料應(yīng)具有以下性質(zhì)連通的三維多孔結(jié)構(gòu) 和足夠的孔隙率，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)、養(yǎng)分傳輸和代謝產(chǎn)物的排放；生物相容 性好，降解性能合適，使得器官能夠生長(zhǎng)并逐漸代替支架；化學(xué)表面適合細(xì) 胞的粘附、增殖和分化；機(jī)械性能與所植入的組織的要求相匹配；適合細(xì)胞 附著的表面式樣和結(jié)構(gòu)；加載促進(jìn)生長(zhǎng)和功能形成的表面因子，以及合適的 支架表面涂層。目前肝臟組織工程支架材料主要選自可降解高分子材料和天 然基質(zhì)材料，例如聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物(PLGA)、海藻酸鈉、殼聚糖、 膠原、纖維連接蛋白、層連蛋白、透明質(zhì)酸等以及其經(jīng)過(guò)修飾后的材料。但是，現(xiàn)有的支架材料在機(jī)械強(qiáng)度、生物降解、模擬組織三維結(jié)構(gòu)及血管化方 面都存在缺陷。
Atala Anthony等在美國(guó)專利申請(qǐng)第US2005/0249816號(hào)中公開了 一種肝臟 去細(xì)胞化的方法。去細(xì)胞化是將組織或器官上的細(xì)胞利用不同的方法洗脫下 來(lái)，僅保留細(xì)胞外基質(zhì)的技術(shù)。器官通過(guò)去細(xì)胞化后所得細(xì)胞外基質(zhì)保留了 原器官的內(nèi)部三維支架結(jié)構(gòu)，且具有較好的生物相容性，可作為組織工程支 架材料。該方法通過(guò)機(jī)械手段和化學(xué)手段來(lái)實(shí)現(xiàn)，主要的步驟包括機(jī)械攪 動(dòng)或震蕩離體肝臟使其內(nèi)的細(xì)胞膜破裂，然后用細(xì)胞裂解液浸泡或灌注肝臟 使細(xì)胞分離脫落，最后用灌洗液沖洗肝臟中脫離的細(xì)胞，其中細(xì)胞裂解液可 以是含有去污劑的堿性溶液，如含0.5Q/。TritonX-100的氨溶液，所述的灌洗液 可以是蒸餾水、生理鹽水或培養(yǎng)基。該方法過(guò)程較復(fù)雜，且單用一種去污劑 去細(xì)胞的作用不夠完全。
糊贈(zèng)
為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種具有良好的機(jī)械強(qiáng)度、生物降解性、 模擬組織三維結(jié)構(gòu)及血管化的全肝支架，本發(fā)明一方面提供一種用于獲取全 肝支架的試劑盒，其包括灌注液I: 0.1%-10% (體積/體積)非離子型去污劑 的Tris-HCl溶液;和灌注液11:0.1%-10%(質(zhì)量/體積)離子型去污劑的Tris-HCl 溶液。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述非離子型去污劑選自Triton X-IOO、 Tween 20、Tween 40和Tween 80。優(yōu)選地，所述非離子型去污劑為Triton X-IOO。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述離子型去污劑為十二烷基硫酸鈉 (SDS)或熊去氧膽酸。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述灌注液I是通過(guò)將非離子型去污劑
溶于pH7-8、 50-100mM的Tris-HCl中制成的。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，所述灌注液II是通過(guò)將離子型去污劑溶于 pH7-8、 50-100mM的Tris-HCl中制成的。
本發(fā)明的另一方面提供一種獲取全肝生物支架的方法，其包括以下步驟:
(a) 以權(quán)利要求1所述的灌注液I灌注離體肝臟，使得肝臟由土黃色變 成乳白色；
(b) 以蒸餾水灌注以充分洗脫灌注液I中的非離子型去污劑； (C)以權(quán)利要求1所述的灌注液II灌注，使得肝臟變?yōu)橥该鳎?br> (d)以蒸餾水灌注以充分洗脫灌注液II中的離子型去污劑。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選的灌注速度為4 1000ml/min，并且步 驟(a)和步驟(c)可同時(shí)進(jìn)行，或連續(xù)進(jìn)行。灌注速度的選擇與具體的動(dòng)物 有關(guān)，以灌注速度不實(shí)質(zhì)性地?fù)p傷支架(例如血管部分)為宜，本領(lǐng)域技術(shù) 人員通過(guò)有限次簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)即可確定對(duì)于不同動(dòng)物的肝臟所能采取的合適灌 注速度，或者采取的灌注速度與不同動(dòng)物的肝臟血流量相當(dāng)，以減少對(duì)保留 成分的損傷，特別是血管的損傷，例如人的門靜脈血流量為750ml/min，肝動(dòng) 脈血流量為350 ml/min，灌注時(shí)可以采用相似的速度。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，在灌注之前或之中，對(duì)離體肝臟進(jìn)行機(jī) 械攪拌和/或超聲波處理。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，在灌注之前對(duì)離體肝臟施用螯合劑。優(yōu) 選地，所述螯合劑為乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇二乙醚二胺四乙酸 (EGTA)。螯合劑結(jié)合Ca2+，松解了細(xì)胞之間的橋粒連接，使得洗脫相對(duì)容 易。在本發(fā)明的又一實(shí)施方式中，在灌注之中或之后，對(duì)離體肝臟施用胰蛋 白酶和/或核酸酶。其可以降解細(xì)胞破壞后的蛋白質(zhì)與核酸，并使其分解而更 易洗脫出來(lái)。
在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，所述灌注的方法采用直接灌注法或循環(huán)灌 注法。
本發(fā)明提供的試劑盒及使用該試劑盒獲取全肝支架的方法使實(shí)質(zhì)性器官 肝臟去細(xì)胞化更完全，同時(shí)保留細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)及大部分成分，從而用作
生物支架材料，而應(yīng)用于生物人工肝的研究。其中非離子型去污劑(例如Triton X-100)破壞脂質(zhì)與脂質(zhì)及蛋白與脂質(zhì)之間的相互作用，但是蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì) 之間的相互作用仍被完整的保留；離子型去污劑(例如SDS)可以有效地溶 解細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞的核膜，還可以破壞蛋白蛋白之間的相互作用。兩者的作用 機(jī)制互補(bǔ)，聯(lián)合應(yīng)用后具有非常理想的效果。而且，本發(fā)明使用了 Tris-HCl 緩沖液，其緩沖能力強(qiáng)，可以提供更穩(wěn)定的pH環(huán)境。


圖la和圖lb顯示了通過(guò)實(shí)施例1方法處理后的肝臟的病理切片(HE染 色)，其中未見細(xì)胞，說(shuō)明本發(fā)明的方法具有非常完全的去細(xì)胞化作用；
圖2a和圖2b顯示了 Masson染色與地衣紅染色后的肝臟病理切片，以分 別顯示膠原纖維和彈力纖維，彈力纖維的保留顯示小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)的存在；
圖.3a和圖3b是掃描電鏡的結(jié)果，圖中顯示灌注后的肝臟支架保留了纖 維網(wǎng)格樣結(jié)構(gòu)與血管；
圖4a、 4b、 4c和4d分別顯示細(xì)胞在肝臟支架上的粘附生長(zhǎng)。
具體實(shí)施例方式
為了更好地理解本發(fā)明的方法，下面將通過(guò)實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)證據(jù)進(jìn)一步闡 述本發(fā)明及其優(yōu)勢(shì)。
實(shí)施例1.大鼠肝臟去細(xì)胞
1. 配制灌注液I和灌注液II:
灌注液I:取Triton X-100 10ml，溶于pH7.5、 50mM的Tris-HCl 800 ml 中，定容至1000ml，得到1% Triton X-100;
灌注液II:取SDS 10g溶于pH7.5、 50mM的Tris-HCl中800 ml,定容至 1000 ml ，得到1%SDS。
2. 灌注以實(shí)現(xiàn)去細(xì)胞化
從離體肝臟的門靜脈插管，以lOml/min的速度往離體肝臟灌注1 %Triton X-100灌注液1小時(shí)，此時(shí)肝臟中心區(qū)變成乳白色，流出的灌注液呈混濁的棕 黃色；然后用雙蒸水灌注1小時(shí)充分洗脫Triton X-IOO，接著用1% SDS灌注 液以10ml/min的速度灌注3小時(shí)，此時(shí)肝臟變?yōu)橥该?，可見其?nèi)的脈管結(jié)構(gòu)， 最后用雙蒸水灌注7小時(shí)以充分洗脫SDS。
實(shí)施例2.豬肝臟灌注去細(xì)胞 1.配制灌注液I和灌注液II:
灌注液I:取Triton X-100 100ml溶于pH8、 50mM的Tris-HCl 800ml中， 定容至1000 ml ，得到10 % Triton X國(guó)100;
灌注液II:取SDS 100g溶于pH8、 50 mM的Tris-HCl 800ml中，定容至 1000 ml,得到10%SDS。2.灌注以實(shí)現(xiàn)去細(xì)胞化
經(jīng)門靜脈與肝動(dòng)脈分別插管后，同時(shí)灌注上述灌注液I和灌注液II，至肝
臟變透明。使用的灌注速度為50ml/min。灌注后，使用雙蒸水灌注以充分洗 脫去污劑。
實(shí)施例3.小鼠肝臟去細(xì)胞
1. 配制灌注液I和灌注液II:
灌注液I:取Triton X-100 lml溶于pH7.5、 50 mM的Tris-HCl 800 ml中， 定容至1000 ml，得到0.1 % Triton X-100;
灌注液II:取熊去氧膽酸lg溶于pH7.5、 50 mM的Tris-HCl 800 ml中， 定容至1000 ml，得到0.1 %熊去氧膽酸。
2. 灌注以實(shí)現(xiàn)去細(xì)胞化
經(jīng)肝上下腔靜脈后，結(jié)扎肝下下腔靜脈，剪破門靜脈進(jìn)行灌注，灌注速度 4ml/min。按實(shí)施例1中的方法灌注。
實(shí)施例4.小鼠肝臟去細(xì)胞
1. 配制灌注液I和灌注液II:
灌注液I:取Tween20 10ml溶于pH7.0、 50 mM的Tris-HCl 800 ml中，定 容至1000 ml,得到l。/。Tween20;
灌注液II:取SDS lg溶于pH7.5、 50 mM的Tris-HCl 800 ml中，定容至 1000 ml,得到0.1Q/。SDS。
2. 灌注以實(shí)現(xiàn)去細(xì)胞化
經(jīng)肝上下腔靜脈后，結(jié)扎肝下下腔靜脈，剪破門靜脈進(jìn)行灌注，灌注速度4ml/min。按實(shí)施例1中的方法灌注。 實(shí)施例5.手術(shù)切除肝臟去細(xì)胞
將手術(shù)切除的病肝分別處理出門靜脈與肝動(dòng)脈后，經(jīng)門靜脈與肝動(dòng)脈分別 插管后，同時(shí)灌注實(shí)施例2的灌注液I和灌注液I1，至肝臟變透明。使用的灌 注速度為門靜脈750ml/min，肝動(dòng)脈250ml/min。灌注后，使用雙蒸水灌注以 充分洗脫去污劑。
實(shí)施例6.超聲波處理與灌注處理的聯(lián)合使用
1. 超聲波處理
將取得的肝臟放于盛滿PBS緩沖液的密閉容器內(nèi)(該容器經(jīng)過(guò)高壓消毒)， 將該容器放于標(biāo)準(zhǔn)的超聲池內(nèi)超聲約30min。
2. 灌注處理
超聲波處理后進(jìn)行灌注，以5ml/min的速度往離體肝臟灌注1% Triton X-100(制備方法同實(shí)施例1) 1小時(shí)，然后用雙蒸水灌注1小時(shí)充分洗脫Triton X-IOO，接著用1% SDS (制備方法同實(shí)施例1)以5 ml/min的速度灌注3小 時(shí)，最后用雙蒸水灌注2小時(shí)充分洗脫SDS。
實(shí)施例7.酶處理與灌注處理的聯(lián)合使用 1.核酸酶(DNAase)灌注液的配制
取1% Triton X-100的Tris-HCl溶液約100ml，加入20900 U的核酸酶，充 分溶解后，以1% Triton X-100的Tris-HCl溶液定容至500 ml,得到41.8u/ml 核酸酶(DNAase)灌注液。過(guò)濾除菌后放于-20^C冰箱保存。2.灌注處理
以5ml/min的速度往離體肝臟灌注核酸酶灌注液1小時(shí)，然后用雙蒸水灌 注1小時(shí)充分洗脫Triton X-100，接著用P/。SDS (制備方法同實(shí)施例1)以5 ml/min的速度灌注3小時(shí)，最后用雙蒸水灌注2小時(shí)充分洗脫SDS。
灌注方法可采用直接灌注與循環(huán)灌注兩種方法，其中循環(huán)灌注適用于體 積較大的肝臟，可以節(jié)省灌洗液，循環(huán)灌注中需加入濾網(wǎng)防止較大的細(xì)胞碎 片堵塞灌注管道。
雖然本發(fā)明已經(jīng)參考具體的實(shí)施方式進(jìn)行描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員通 過(guò)閱讀上述描述后，將可以對(duì)本發(fā)明做出顯而易見的修改和修飾，而不違背 本發(fā)明的意圖和本質(zhì)。本發(fā)明有意將這些修改和修飾包括在權(quán)利要求的范圍 內(nèi)。
ii
權(quán)利要求
1.一種用于獲取全肝支架的試劑盒，其包括灌注液I0.1％-10％(體積/體積比)非離子型去污劑的Tris-HCl溶液；和灌注液II0.1％-10％(質(zhì)量/體積比)離子型去污劑的Tris-HCl溶液。
2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述非離子型去污劑選自 Triton X-100、 Tween20、 Tween 40和Tween 80。
3. 如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述非離子型去污劑為 Triton X國(guó)亂
4. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述離子型去污劑為十二 烷基硫酸鈉或熊去氧膽酸。
5. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述灌注液I是通過(guò)將非 離子型去污劑溶于pH7-8、 50-100mM的Tris-HCl中制成的。
6. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，.其特征在于，所述灌注液II是通過(guò)將離 子型去污劑溶于pH7-8、 50-100mM的Tris-HCl中制成的。
7. —種獲取全肝生物支架的方法，其包括以下步驟(a) 以權(quán)利要求1所述的灌注液I灌注離體肝臟，使得肝臟由土黃色變 成乳白色；(b) 以蒸餾水灌注，以充分洗脫灌注液I中的非離子型去污劑； (C)以權(quán)利要求1所述的灌注液II灌注，使得肝臟變?yōu)橥该鳎?d)以蒸餾水灌注，以充分洗脫灌注液n中的離子型去污劑。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在灌注之前或之中，對(duì)離體 肝臟進(jìn)行機(jī)械攪拌和/或超聲波處理。
9. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在灌注之前對(duì)離體肝臟施用螯合劑。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述螯合劑為乙二胺四乙 酸或乙二醇二乙醚二胺四乙酸。
11. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在灌注之中或之后，對(duì)離 體肝臟施用胰蛋白酶和/或核酸酶。
12. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述灌注的方法為直接灌注 法或循環(huán)灌注法。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于獲取全肝支架的試劑盒，其包括灌注液I0.1％-10％(體積分?jǐn)?shù))非離子型去污劑的Tris-HCl溶液；和灌注液II0.1％-10％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))離子型去污劑的Tris-HCl溶液。本發(fā)明還提供利用上述試劑盒獲取全肝支架的方法。本發(fā)明使實(shí)質(zhì)性器官肝臟更完全地去細(xì)胞化，同時(shí)保留細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)及大部分成分，從而用作生物支架材料，而應(yīng)用于生物人工肝的研究。
文檔編號(hào)A61L27/36GK101564554SQ20091003995
公開日2009年10月28日 申請(qǐng)日期2009年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月3日
發(fā)明者周煥城, 康玉占, 艷 汪, 毅 高 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院