專利名稱：一種以異型雙功能試劑為連接橋的腦膜炎多糖結合疫苗及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明提供了一種新型的制備腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖結合疫苗的結合技術；基于此結合技術，制備 出了腦膜炎莢膜多糖結合疫苗，可用于腦脊髓膜炎等重要疾病的免疫預防，屬于生物醫(yī)藥領域。
背景技術：
流行性腦膜炎是由腦膜炎奈瑟氏球菌引起的腦膜發(fā)炎的疫癥，至今仍未得到有效控制。腦膜炎奈瑟氏球菌主要經由咳嗽，噴嚏或接吻傳播，由鼻咽部侵入血循環(huán)，最后局限于腦膜和脊髓膜，形成化膿性腦脊髓膜病變。常見的病征包括發(fā)高燒、劇烈頭痛、后頸僵硬；亦會有嗜睡、嘔吐、懼光或皮疹等情況出現(xiàn)。此病可引致腦部受損甚至死亡，病死率較高，維持在5-10%之間，遍見于世界各國，呈散發(fā)或大、小流行，以兒童發(fā)病率為高。使用抗生素可以有效治療流行性腦膜炎。在未使用抗生素以前該病的病死率在70%左右，使用抗生素治療以來病死率降低至5% 15%，甚至低于5%。然而，由于抗生素的過度使用，細菌的耐藥菌株數(shù)量和種類迅速地增長，導致治療更加困難。這引起了醫(yī)學界的廣泛憂慮，并增加了病人的治療成本和難度。為了應對不斷惡劣化的抗藥性病菌對人類的威脅，世界各地的醫(yī)生開始嚴格地控制使用抗生素，同時擴大疫苗的接種范圍。因此，研制與開發(fā)預防流行性腦膜炎的疫苗具有十分重大的意義。腦膜炎奈瑟氏菌根據其莢膜多糖的特異性可將腦膜炎球菌分成A、B、C、D、29E、H、
1、K、L、W135、X、Y、Z十三個血清群，所有血清群的細菌均可致病，但A、C、W135和Y毒力最強，上述4個血清群占病例數(shù)的95%以上，是引起腦膜炎流行最常見的菌株。莢膜多糖能夠屏蔽細菌細胞表面功能成分，使其免于被宿主免疫系統(tǒng)識別，防止補體系統(tǒng)被細菌表面的蛋白激活和免疫細胞吞噬。如果細菌被免疫細胞吞噬，莢膜多糖也能夠避免細菌被殺滅。莢膜多糖是腦膜奈瑟氏菌的主要抗原成分之一，作為疫苗對較大的兒童有一定的保護力。然而，莢膜多糖對2歲以下嬰幼兒、老年人以及B細胞免疫缺陷的人群免疫效果差，接種劑不能達到抗體保護水平，且抗體很快消失。該多糖疫苗與其它多糖疫苗一樣，屬T細胞非依賴性抗原，具有年齡相關的免疫原性，且不誘生T細胞依賴性的加強應答。通過將多糖與某種蛋白質共價結合，可使多糖轉化成T細胞依賴性抗原，從而刺激嬰幼兒的T細胞依賴性抗體的合成，并可產生加強應答，同時還能提高免疫球蛋白(IgG)的抗體比例。這種多糖結合疫苗不僅能夠保護嬰幼兒(2歲以下兒童)，還能夠大大地增強抵抗力差的病人對細菌感染的抵抗力，因此具有十分廣闊的應用前景。細菌莢膜多糖-蛋白結合疫苗最早出現(xiàn)在20世紀30年代，Goebel和Avery將3型肺炎球菌多糖連接到馬血清球蛋白上，產生的偶聯(lián)物能在動物身上產生多糖專一的抗體，同時提供相應的免疫保護。1987年，世界上第一個多糖蛋白結合疫苗，B型流感嗜血桿菌(HiB)多糖-破傷風類毒素(TT)結合疫苗被美國FDA批準進入市場。默克公司、輝瑞公司和諾華公司相繼開發(fā)了 HiB多糖-破傷風類毒素結合疫苗和流行性腦膜炎多糖-破傷風類毒素結合疫苗，并成功上市。中國專利(ZL02159032.X)公開了一種多糖-蛋白結合疫苗的制備方法，也是目前制備多糖結合疫苗最常使用的技術之一。在該技術中，以己二酸二酰肼(ADH)作為連接劑結合多糖與蛋白。這種結合方式首先需要將多糖經溴化氰活化，即在堿性條件下用溴化氰作用于多糖分子上的羥基，形成氰酸酯，然后與ADH反應；氰酸酯中的一個碳氧鍵斷裂，與ADH—端的氨基發(fā)生加成反應，從而將酯酰肼(AH)基團導入多糖分子，形成多糖-AH衍生物；多糖-AH衍生物在碳二亞胺(EDAC)的介導下與載體蛋白形成穩(wěn)定的結合物。這樣的結合方式可減少多糖與載體蛋白結合的空間位阻，保留了多糖的抗原表位，同時避免了多糖本身的溶解性，減少多糖與抗血清反應的副作用。然而，上述傳統(tǒng)的多糖-蛋白結合技術存在著以下不足之處:(I)多糖-AH衍生物會繼續(xù)與溴化氰活化的多糖反應，形成多糖的自身聚合物，降低了多糖-蛋白的結合效率；
(2)EDAC在介導ADH衍化多糖與載體蛋白結合的同時，容易弓丨起多糖與載體蛋白的自身交聯(lián)，從而降低多糖-蛋白的結合效率；(3)多糖和載體蛋白均為大型生物分子，中間靠僅有6個碳原子長度的ADH相連，多糖和蛋白質的結構勢必會相互影響，使得多糖的一些重要抗原表位易被蛋白質所屏蔽，進而降低多糖的免疫原性。因此，多糖-蛋白結合疫苗的免疫原性和抗體持效性仍有待進一步提高，如多糖結合疫苗需要免疫三次才能產生免疫效果。這些不足之處限制了多糖結合疫苗的進一步發(fā)展。聚乙二醇(PEG)是一種安全的、良好水溶性、無免疫原性、無毒的聚合物，并被美國FDA批準在人體使用。PEG作為一種修飾劑已在開發(fā)蛋白質藥物和運載藥物的脂質體方面獲得廣泛應用，并取得良好的效果。2006年，Singh等(Vaccine, 2006，24:4161-4166)發(fā)現(xiàn)在包埋HIV-1的gp41表位的脂質體分子上引入PEG可增強疫苗的免疫保護效果。據推測是由于PEG分子能在脂質體周圍形成水化層，導致免疫細胞吞噬作用下降，從而增強了疫苗的免疫持效性；同時，PEG分子還增加了抗體中和抗原的難度，從而增強了抗體產生強度。因此，將PEG分子作為連接橋來制備多糖-蛋白結合疫苗，預計能提高結合疫苗的免疫原性和抗體持效性。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種以異型雙功能試劑為連接橋來制備多糖結合疫苗的技術，制備出了腦膜炎莢膜多糖結合疫苗。本發(fā)明的另一個目的還在于通過使用PEG作為多糖和蛋白之間的連接橋，進一步提高多糖結合疫苗的免疫原性和抗原持效性。本發(fā)明的腦膜炎莢膜多糖結合疫苗，其中的莢膜多糖為A群、B群、C群、W135群或Y群流行性腦脊髓膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖。本發(fā)明的腦膜炎莢膜多糖結合疫苗，其中的蛋白載體為破傷風類毒素、CRM197、白喉類毒素、百日咳類毒素、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST、外毒素A、外膜復合物C、孔蛋白、轉鐵蛋白結合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A、肺炎球菌粘附素蛋白質、卵清蛋白、牛血清白蛋白或結核菌素純化蛋白衍生物等。其中，所述的莢膜多糖和載體蛋白的質量比為(0.2 3): 1，以1:1為優(yōu)。本發(fā)明涉及多糖結合疫苗的制備工藝 ，包括以下步驟:
I)多糖的活化取IOmg多糖溶于生理鹽水中，使其終濃度為5mg/ml。然后，加入溴化氰活化
0.5-1.5小時，溴化氰終濃度為5 μ g/ml。溴化氰活化期間，用0.5M氫氧化鈉維持溶液pH值為10.5。活化結束后，用0.5M的鹽酸調節(jié)溶液pH值至8.5，終止反應。然后，分別加入三種不同的異型雙功能試劑(N-2-胺乙基-馬來酰亞胺，胺-PEG2K-馬來酰亞胺和胺-PEG5K-馬來酰亞胺)，多糖與異型雙功能試劑的質量比為1: (0.5-10)，于室溫下反應6-24小時；其中優(yōu)化的質量比為1:1，于室溫下反應16小時。多糖活化后的氰基與異型雙功能試劑一端的氨基反應。反應結束后，用透析袋充分透析，除去未反應的溴化氰和異型雙功能試劑。2)載體蛋白的活化載體蛋白溶于生理鹽水中，濃度為8.5mg/ml，然后加入2_亞氨基硫烷(2-1minothiolane)進行活化6_24小時，載體蛋白與2-亞氨基硫燒的摩爾比為1: (10-50)，其中優(yōu)化的活化時間為16小時，摩爾比為1:30。2-亞氨基硫烷會將載體蛋白上暴露在外面的氨基轉化成巰基?；罨Y束后，用透析袋透析充分除去未反應的2-亞氨基硫燒。3)多糖與載體蛋白的偶聯(lián)將第I步得到的活化多糖與第2步得到的活化載體蛋白混合，多糖與載體蛋白的質量比為(0.2-3): 1，于4°C下反應12-36小時，其中優(yōu)化的質量比為1: 1，于4°C下反應24小時。4)多糖結合疫苗的分離純化制備的多糖結合疫苗需要與未反應的多糖和載體蛋白分離開來。純化方法選用分子排阻層析，優(yōu)選Superdex200凝膠過濾柱(2.6cmX60cm)。本發(fā)明的多糖結合疫苗，可添加免疫佐劑，如氫氧化鋁或磷酸鋁等佐劑，用于進一步提高疫苗的免疫原性。本發(fā)明制備了以PEG為連接橋的腦膜炎球菌多糖結合疫苗，其技術優(yōu)勢體現(xiàn)在以下幾方面:I)本發(fā)明使用異型雙功能試劑作連接橋，即連接橋兩端不同的2個官能團能分別連接莢膜多糖和載體蛋白，可有效地避免在制備過程中莢膜多糖和蛋白質的自身偶聯(lián)，能夠提高結合產物的收率，并且利于產品的質量控制。2)本發(fā)明提供的多糖蛋白結合技術，未顯著改變莢膜多糖和載體蛋白的結構特征。3)本發(fā)明使用PEG作為連接 橋，可有效延長莢膜多糖與載體蛋白之間的空間距離，減小了載體蛋白對莢膜多糖抗原表位的空間屏蔽效應，有利于提高莢膜多糖的免疫原性。4)本發(fā)明使用PEG作為連接橋，由于PEG親水性較強，因此在水溶液中，其外側會形成一個巨大水化層，該水化層會對載體蛋白與多糖分子形成不同程度的屏蔽效應，具體來講，由于載體蛋白為球形，PEG水化層對其屏蔽效應會較為強烈，但多糖作為一種線狀分子，PEG水化層對其屏蔽效應會大大減弱。


圖1多糖結合疫苗的制備反應示意圖。圖2凝膠過濾分析多糖結合疫苗。用分析型凝膠過濾柱Superdex200 (IcmX 30cm)檢測多糖結合疫苗。分析條件:流動相為20mM的磷酸緩沖液(pH7.4)，流速0.5毫升/分鐘，檢測波長為280納米。圖3 NMR分析多糖結合疫苗。1H-NMR分析由Bruker600MHz核磁共振儀完成。圖4多糖結合疫苗產生的多糖特異性抗體。圖a為多糖特異性的IgG抗體滴度；圖b為多糖特異性的IgGl抗體滴度；圖c為多糖特異性的IgG2a抗體滴度；圖d為多糖特異性的IgG2a/1gGl。多糖特異性抗體滴度由ELISA方法測定。圖5多糖特異性抗體的免疫持效性。通過測定三針免疫后18周內多糖特異性IgG的滴度，來研究多糖特異性抗體的免疫持效性。多糖特異性IgG滴度由ELISA方法測定。圖6多糖結合疫苗產生的多糖特異性抗體的特異性。
具體實施方式
:實施例1:多糖結合疫苗的制備連接橋不含PEG的多糖結合疫苗(PS-TT)、以PEG2K為連接橋的多糖結合疫苗(PS-P2K-TT)、以PEG5K為連接橋的多糖結合疫苗(PS-P5K-TT)的制備反應如圖1所示。將IOmg Y群腦膜炎球菌莢膜多糖溶于2ml生理鹽水中，加入20 μ L溴化氰溶液(w/v50%)進行活化，室溫反應I小時?；罨^程中，用0.5M NaOH維持溶液的pH值為10.5。活化結束后，用0.5M的鹽酸調節(jié)溶液的pH值至8.5，終止反應。隨后分別加入IOmg N-2-胺乙基-馬來酰亞胺，60mg胺-PEG2K-馬來酰亞胺(PEG分子量為2kDa)和75mg胺-PEG5K-馬來酰亞胺(PEG分子量為5kDa)。于室溫反應過夜。反應結束后，用截留分子量為50kDa的濾膜于6000g離心5次，除去未反應的小分子，獲得3種帶馬來酰亞胺基團(mal)的多糖活化產物，即 PS-mal、PS-P2K-mal 和 PS-P5K_mal。將破傷風類毒素(TT)與2-亞氨基硫烷以摩爾比1:30混合，反應pH值為7.4，于室溫下反應12小時，2-亞氨基硫烷會將破傷風類毒素分子的氨基轉化成巰基。用截留分子量為50kDa的濾膜于6000g離心5次，除去未反應的2-亞氨基硫烷。巰基化的破傷風類毒素分別與PS-mal、PS-P2K-mal和PS-P5K_mal的馬來酰亞胺基團反應。巰基化的破傷風類毒素與活化的多糖以質量比1:1混合，反應PH值為7.4，于4°C下反應24小時，得到三種多糖結合疫苗，即 PS-TT、PS-P2K-TT 和 PS-P5K-TT。實施例2:對三種多糖結合疫苗的表征將實施例1所涉及的多糖-蛋白結合產物，用Superdex200凝膠過濾柱(2.6cmX60cm)進 行分離純化，洗脫液為20mM的磷酸緩沖液(pH7.4)，流速為3毫升/分鐘。分別收集對應于PS-TT、PS-P2K-TT和PS-P5K-TT的洗脫峰。以Superdex200凝膠過濾柱(1.0cmX30cm)對純化產品進行鑒定,洗脫液為20mM的磷酸緩沖液(PH7.4)，流速為0.5毫升/分鐘。如圖2所示，與載體蛋白相比，PS-TT,PS-P2K-TT和PS-P5K-TT的出峰時間明顯提前。這表明載體蛋白與肺炎莢膜多糖結合后，分子量顯著增加。由于三種結合產物均在凝膠過濾柱的外水體積出峰，三種結合產物的出峰時間一致。用1H-NMR進行檢測多糖結合疫苗。如圖3所示，與莢膜多糖分子相比，PS-TT,PS-P2K-TT和PS-P5K-TT在0.4-1.4ppm處出現(xiàn)了特征峰，對應于載體蛋白的脂肪鏈氨基酸殘基。在7.2ppm處出現(xiàn)了對應于載體蛋白的芳香族氨基酸殘基的特征峰。這表明莢膜多糖分子成功地偶聯(lián)了載體蛋白。如圖3插圖所示，PS-TT、PS-P2K-TT和PS-P5K-TT在6.2ppm處出現(xiàn)了對應于琥珀酰亞胺的特征峰，這表明多糖結合疫苗的連接橋中含有琥珀酰亞胺。此外，由于PEG分子中大量亞甲基的存在，PS-P2K-TT和PS-P5K-TT在3.6ppm處的特征峰強度要遠大于PS-TT。這表明PS-P2K-TT和PS-P5K-TT的連接橋中PEG分子。因此，莢膜多糖在結合載體蛋白前后，其結構未發(fā)生明顯改變。實施例3:多糖結合疫苗免疫原性的測定選取32只5周齡的雌性Blab/C小鼠，體重為15_22克。隨機分為4組，即莢膜多糖組、PS-TT組、PS-P2K-TT組和PS-P5K-TT組，每組8只小鼠。腹腔注射，每只每次注射含有5微克多糖，每周注射I次，共注射3次。21天后眼眶取血。用ELISA法檢測小鼠血漿中抗莢膜多糖的IgG、IgGl和IgG2a。如圖4所示，莢膜多糖組產生的抗莢膜多糖的IgG和IgGl滴度較弱，而IgG2a未檢測到。莢膜多糖與載體蛋白偶·聯(lián)后抗體滴度顯著增加。與莢膜多糖組相比，PS-TT組抗莢膜多糖的IgG和IgGl的抗體滴度分別是莢膜多糖組的37.1倍和58.6倍。PS-P2K-TT組產生的抗莢膜多糖抗體滴度要顯著高于PS-TT組，其中IgG、IgGl和IgG2a的抗體滴度分別分別是PS-TT組的2.5倍、2.4倍和6.0倍。PS-P5K-TT組產生的抗莢膜多糖IgG.1gGl和IgG2a的抗體滴度分別分別是PS-TT組的1.6倍、1.4倍和10.9倍。PS-P2K-TT組和PS-P5K-TT組的IgG2a/IgGl分別是PS-TT組的2.9倍和9.1倍。這表明PEG能增強多糖結合疫苗的Thl型免疫應答。實施例4:多糖特異性抗體的免疫持效性通過測定三針免疫后18周內多糖特異性抗體的滴度，來研究多糖特異性抗體的免疫持效性。如圖5插圖所示，莢膜多糖組產生的多糖特異性IgG滴度較低，隨著注射時間增加而逐漸降低，第4周后已無法檢測到。如圖5所示，PS-P5K-TT組產生的多糖特異性IgG滴度要低于PS-P2K-TT組，而高于PS-TT組。三種結合產物的多糖特異性IgG滴度在第2周達到峰值，在第4-18周內逐漸下降，其中PS-TT組的下降速度最快。第18周后，PS-TT組、PS-P2K-TT組和PS-P5K-TT組的多糖特異性IgG滴度分別是其峰值的11.9%, 23.0%和19.2%。因此，PEG能夠增強多糖特異性抗體的免疫持效性。實施例5:多糖特異性抗體的特異性和親合性向200倍稀釋的PS-TT組、PS-P2K-TT組和PS-P5K-TT組小鼠血漿中加入不同量的莢膜多糖，用ELISA方法檢測小鼠血漿中抗莢膜多糖的抗體水平。如圖6所示，隨著多糖加入量的增加，多糖特異性抗體結合96孔板中多糖的能力逐漸降低。當加入的多糖達到15 μ g時，抗體結合多糖的能力喪失。這表明小鼠產生的抗莢膜多糖抗體能夠特異性地結合莢膜多糖。用硫氰酸銨法測定抗莢膜多糖的抗體親合性。莢膜多糖組的多糖特異性抗體親和指數(shù)為1.18mol/L，而PS-TT組、PS-P2K-TT組和PS-P5K-TT組的抗體親和指數(shù)分別為
2.25mol/L、2.09mol/L和2.16mol/L。這表明結合載體蛋白能顯著提高多糖特異性抗體的
親合性。
權利要求
1.一種腦膜炎球菌多糖結合疫苗，以共價鍵的方式將腦膜炎莢膜多糖連接到載體蛋白上。
2.根據權利要求1所述的腦膜炎球菌多糖結合疫苗，以聚乙二醇(PEG)為連接橋連接腦膜炎莢膜多糖和載體蛋白，PEG的分子量為200-10000Da，優(yōu)化的PEG分子量為2000Da。
3.根據權利要求2所述的腦膜炎球菌多糖結合疫苗，其特征在于所述PEG為異型雙功能試劑，以PEG分子為骨架，結構式為NH2-PEG-R, PEG分子的一端為氨基，PEG分子的另一端(R)為能與巰基反應的化學基團，其中，優(yōu)選的R基團為馬來酰亞胺酯。
4.根據權利要求1所述的腦膜炎球菌多糖結合疫苗，以不含PEG的異型雙功能試劑為連接橋連接腦膜炎莢膜 多糖和載體蛋白，不含PEG的異型雙功能試劑的結構式為NH2-R1-R2，一端為氨基，另一端(R2 )為能與巰基反應的化學基團，其中，優(yōu)選的R2基團為馬來酰亞胺酯。
5.根據權利要求4所述的不含PEG的異型雙功能試劑NH2-R1-R2，Rl為碳數(shù)為1_10的烷基，優(yōu)選的異型雙功能試劑為N-2-胺乙基-馬來酰亞胺。
6.根據權利要求1所述的腦膜炎球菌多糖結合疫苗，所用的腦膜炎莢膜多糖為A群、B群、C群、W135群和Y群流行性腦脊髓膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖。
7.根據權利要求1所述的腦膜炎球菌多糖結合疫苗，所用的載體蛋白包括但不限于破傷風類毒素、CRM197、白喉類毒素、百日咳類毒素、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST、外毒素A、外膜復合物C、孔蛋白、轉鐵蛋白結合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A、肺炎球菌粘附素蛋白質、卵清蛋白、牛血清白蛋白或結核菌素純化蛋白衍生物。
8.根據權利要求1所述的腦膜炎球菌多糖結合疫苗的制備方法，其特征在于由以下三步組成:(1)腦膜炎球菌多糖的活化反應與衍化反應；(2)載體蛋白的巰基化；(3)衍化的腦膜炎球菌多糖與巰基化的載體蛋白結合。
9.根據權利要求8所述的腦膜炎球菌多糖結合疫苗的制備方法，其特征在于腦膜炎球菌多糖的活化反應與衍化反應先用溴化氰活化腦膜炎球菌多糖，然后用含PEG或不含PEG的異型雙功能試劑去衍化腦膜炎球菌多糖。
10.根據權利要求9所述的腦膜炎球菌多糖結合疫苗的制備方法，其特征在于衍化反應于室溫下進行6-24小時，以16小時為優(yōu)。腦膜炎球菌多糖與異型雙功能試劑的質量比為 1: (0.5-10)，以 1:1 為優(yōu)。
11.根據權利要求8所述的腦膜炎球菌多糖結合疫苗的制備方法，其特征在于，載體蛋白的巰基化，所用的巰基化試劑能將載體蛋白的氨基轉化為巰基，所用的巰基化試劑包括但不限于2-亞氨基硫燒(2-1minothiolane),載體蛋白與2-亞氨基硫燒的摩爾比為1: (10-50),以 1:30 為優(yōu)。
12.根據權利要求8所述的腦膜炎球菌多糖結合疫苗的制備方法，其特征在于，衍化的腦膜炎球菌多糖與巰基化的載體蛋白結合步驟中，腦膜炎球菌多糖和載體蛋白的質量比為(0.2-3):1，以1:1為優(yōu)；于4°C下反應12-36小時，以24小時為優(yōu)。
13.按權利要求1所述的腦膜炎球菌多糖結合疫苗制劑是注射劑型。
14.按權利要求1所述的腦膜炎球菌多糖結合疫苗，可用于預防腦脊髓膜炎奈瑟氏球菌的感染。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種以含PEG的異型雙功能試劑作橋連劑的新型多糖結合疫苗制備技術，并基于此技術，開發(fā)出了腦膜炎球菌多糖結合疫苗，此技術的優(yōu)勢在于(1)避免了傳統(tǒng)工藝中多糖和蛋白質各自的自身交聯(lián)，提高了產率，也利于質量控制；(2)長的PEG鏈可增大多糖和蛋白質之間的距離，降低兩者之間相互的空間屏蔽效應，提高多糖結合疫苗的免疫原性。
文檔編號A61K39/095GK103083652SQ201310047118
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月6日 優(yōu)先權日2013年2月6日
發(fā)明者胡濤, 安文琪, 蘇志國, 范蓓, 黃慶瑞, 馬小偉, 潘若文 申請人:中國科學院過程工程研究所, 華蘭生物工程股份有限公司, 華蘭生物疫苗有限公司