專利名稱：軟骨寡聚基質(zhì)蛋白在制備血管鈣化治療藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及軟骨寡聚基質(zhì)蛋白在制備治療血管鈣化的 藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血管鈣化是指在血管壁、心肌和心臟瓣膜處出現(xiàn)鈣磷沉積。臨床上血管鈣化常 見于動脈粥樣硬化、晚期腎病及糖尿病的病人。其中，動脈粥樣硬化的鈣化主要見 于血管內(nèi)膜的粥樣斑塊處；而晚期腎病、糖尿病病人的血管鈣化則主要發(fā)生在血管 的中膜，往往導(dǎo)致受累血管僵硬性增加、舒張功能降低和左心室肥大。流行病學(xué)調(diào) 査證明血管中膜鈣化與糖尿病、慢性腎病病人的心血管并發(fā)癥的高發(fā)病率和死亡率 密切木目關(guān)(John RC, Leopold JA, Loscalzo J. Vascular calcification: pathobiological mechanisms肌d clinical implications. Circ Res, 2006, 99: 1044-59)。以往，血管！丐 化被認(rèn)為是鈣磷代謝異常，從而在血管過度沉積的被動過程，然而臨床上單純控制 鈣磷的攝入并不能有效地預(yù)防和控制鈣化。近十年來人們對血管l丐化的認(rèn)識終于有
了新的突破發(fā)現(xiàn)它是一個(gè)受到高度調(diào)控的主動過程，血管中膜平滑肌細(xì)胞或血管 外膜周細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等發(fā)生骨樣/軟骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換；出現(xiàn)基質(zhì)小泡以及各 種調(diào)控骨分化的關(guān)鍵蛋白，類似于生理狀態(tài)下的骨發(fā)育過程。由于血管鈣化是一個(gè) 多病因，多途徑涉及到多種機(jī)制的復(fù)雜過程，如高無機(jī)磷或高^磷乘積、繼發(fā)性甲 狀甲狀旁腺激素激素過多、氧自由基、炎癥、細(xì)胞凋亡等過程均促進(jìn)了鈣化的發(fā)生， 因此目前臨床上采用的降低血鈣血磷，比如運(yùn)用無機(jī)焦磷酸， 一些磷離子的結(jié)合劑， 以及維生素K等，但仍不能有效的控制血管鈣化的發(fā)生發(fā)展。人們對于鈣化機(jī)制的 深入認(rèn)知對于鈣化的防治具有重要意義。
軟骨寡聚基質(zhì)蛋白COMP(Cartilage Oligomeric Matrix Protein)是2005年 Riessen等新證實(shí)的人血管中的正常細(xì)胞外基質(zhì)，由五個(gè)長度相近的亞基組成的 524KD五聚體大分子糖蛋白，主要由血管平滑肌細(xì)胞分泌(RiessenR,FenchelM, Chen H, Axel DI, Karsch KR， Lawler J. Cartilage oligomeric matrix protein (thrombospondin-5) is expressed by human vascular smooth muscle cells. Arteriosclerosis,
4thrombosis, and vascular biology, 2001; 21:47-54.)。之所以被命名為軟骨基質(zhì)蛋白，是 因?yàn)镃OMP也是軟骨的主要基質(zhì)成份。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)在制備預(yù)防或治療血管鈣化 藥物中的應(yīng)用。
上述的軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的氨基酸序列如GenBank號為EDL28815的自5，端第 1位-755位所示。
上述的血管鈣化是血管中膜的鈣化，具體是指胸主動脈平滑肌細(xì)胞鈣化或腹主 動脈轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的另一目的在于提供表達(dá)軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的重組腺病毒在制備預(yù)防 或治療血管轉(zhuǎn)化的藥物中的應(yīng)用。
上述的軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的氨基酸序列如GenBank號為EDL28815的自5'端第 1位-755位所示。
上述的血管鈣化是血管中膜的鈣化，具體是指胸主動脈平滑肌細(xì)胞朽化或腹主 動脈鈣化。
上述重組腺病毒的構(gòu)建步驟如下
1) 將軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)入穿梭載體pShuttle-CMV (-)，構(gòu)成重 組穿梭載體；
2) 將步驟l)得到的重組穿梭載體與pAdxis腺病毒骨架載體連接，制成含有 所述軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的編碼基因的重組腺病毒載體；
3) 將步驟2)得到的重組腺病毒載體感染受體細(xì)胞，得到重組腺病毒。 上述軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的編碼基因的編碼序列如GenBank號為NM—016685的自
5，端第15位-2279位所示。
上述受體細(xì)胞是真核生物的傳代細(xì)胞；所述真核生物的傳代細(xì)胞可以為HEK293 細(xì)胞。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種預(yù)防或治療血管鈣化的藥物。 本發(fā)明提供的藥物的活性成分是如下1)或2):
1) 軟骨寡聚基質(zhì)蛋白；
2) 表達(dá)軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的重組腺病毒。上述重組腺病毒的構(gòu)建步驟如下
1) 將軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)入穿梭載體pShuttle-CMV (-)，構(gòu)成重 組穿梭載體；
2) 將步驟l)得到的重組穿梭載體與pAdxis腺病毒骨架載體連接，制成含有 所述軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的編碼基因的重組腺病毒載體；
3) 將步驟2)得到的重組腺病毒載體感染受體細(xì)胞，得到重組腺病毒。 上述軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的編碼基因的編碼序列如GenBank號為腿_016685的自
5，端第15位-2279位所示；上述軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的氨基酸序列如GenBank號為 EDL28815的自5'端第1位-755位所示。
上述受體細(xì)胞是真核生物的傳代細(xì)胞；所述真核生物的傳代細(xì)胞可以為HEK293 細(xì)胞。
上述血管鈣化是血管中膜的鈣化，具體是指胸主動脈平滑肌細(xì)胞鈣化或腹主動 脈鈣化。
實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由高磷(lOmM J3-甘油磷酸)體外誘發(fā)的血管中膜鈣化模型中，隨 著鈣化的進(jìn)展，牛胸主動脈平滑肌細(xì)胞表達(dá)的全長COMP呈時(shí)間依賴性減少，相伴 隨的是降解產(chǎn)物的增加，提示血管中膜鈣化過程中伴隨有正常的基質(zhì)蛋白C0MP的 降解；在CaCl2 (0.2M)誘導(dǎo)的腹主動脈鈣化模型中，C0MP全長蛋白表達(dá)也明顯減 少，相應(yīng)的其降解片段增加。
進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)如果在培養(yǎng)基中給與重組的全長COMP腺病毒，則可以有效地抑 制平滑肌細(xì)胞鈣化的發(fā)生，鈣化結(jié)節(jié)特異性茜素紅染色和"Ca2+攝取均有一定程度的 減弱；相反，如果用siRNA特異性敲低平滑肌細(xì)胞COMP水平，CaCl2誘發(fā)的平滑肌 細(xì)胞的鈣化則明顯加重。
在CaCl2誘導(dǎo)的腹主動脈鈣化模型，先用0. 2M CaCl2涂抹腹主動脈10分鐘， 之后將6X 108 pfu量的C0MP腺病毒與30% Pluronic gel (Sigma) 4"C下混勻后， 均勻涂抹在腹主動脈外膜上，對照組加入等量的GFP腺病毒與Pluronic gel同樣 處理，隨即縫合傷口 。 7天后，取處理過的腹主動脈段，進(jìn)行鈣沉積測定和von Kossa 染色，發(fā)現(xiàn)和對照組相比，過表達(dá)C0MP病毒組的鈣沉積顯著性降低到約50y。， von Kossa染色也顯示鈣結(jié)節(jié)明顯減少。


圖1為P-甘油磷酸誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的牛胸主動脈平滑肌細(xì)胞鈣化模型的圖，
6其中A是茜素紅染色圖，紅色顯示鈣沉積，B是45Ca2+攝入結(jié)果。
圖2為由高磷(10raMI3-甘油磷酸)體外誘發(fā)的血管中膜鈣化模型中COMP的表
達(dá)，其中A是鈣化過程中COMP蛋白表達(dá)的變化；B是三次實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
圖3為小分子干擾RNA特異性敲低COMP后，CaCl2誘導(dǎo)的大鼠平滑肌細(xì)胞鈣化
情況，其中A是COMP mRNA相對表達(dá)量；B是鈣沉積結(jié)果；C是茜素紅染色圖。 圖4為Ad-COMP感染過的原代牛平滑肌細(xì)胞的COMP蛋白表達(dá)量。 圖5為Ad-COMP感染過的原代牛平滑肌細(xì)胞鈣化被抑制，其中A是45(:&2+攝入結(jié)
果；B是茜素紅染色圖。
圖6是大鼠腹主動脈鈣化模型的建立，其中A是腹主動脈茜素紅染色圖，B是
主動脈中鈣沉積結(jié)果。
圖7是Ad-COMP感染大鼠腹主動脈增加COMP表達(dá)量。
圖8是Ad-COMP抑制大鼠腹主動脈鈣化，其中A是主動脈von Kossa染色圖； B是主動脈中鈣沉積結(jié)果。
圖1-圖8中，Control是未鈣化的對照組，P -GP組為P -甘油磷酸誘導(dǎo)的鈣化 實(shí)驗(yàn)組，CaCl2組為CaCh誘導(dǎo)的鈣化實(shí)驗(yàn)組。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。 下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。 實(shí)施例1、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(C0MP)與血管鈣化相關(guān)性的發(fā)現(xiàn) 一、P -甘油磷酸誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的牛胸主動脈平滑肌細(xì)胞鈣化模型的建立以 及鈣化模型中C0MP的表達(dá)
1、 P -甘油磷酸誘導(dǎo)的原代牛胸主動脈平滑肌細(xì)胞鈣化模型的建立 取牛胸主動脈(取自北京清真屠宰廠)，采用組織貼塊培養(yǎng)法，即去除內(nèi)皮后 將中層平滑肌層剪成1平方毫米組織小塊貼在培養(yǎng)瓶內(nèi)，然后給予20%FBS培養(yǎng)， 大約六七天之后可見組織塊周圍有細(xì)胞爬出，待瓶內(nèi)細(xì)胞長滿后用胰蛋白酶消化傳 代保種，經(jīng)SM-alpha actin免疫熒光鑒定，為平滑肌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中，將得到的原 代平滑肌細(xì)胞鋪在六孔板中，每孔約15萬個(gè)細(xì)胞，每孔加10mmol/LP-甘油磷酸刺 激(購自Sigma公司)誘導(dǎo)牛主動脈平滑肌細(xì)胞鈣化，每2天換一次液，細(xì)胞l丐化 的鑒定使用茜素紅染色和"Ca2+攝入實(shí)驗(yàn)。其中，茜素紅染色的方法是即細(xì)胞培養(yǎng)7天后，去除培養(yǎng)液，加入1%的茜素
紅染色半小時(shí)，之后洗去浮色，照相；45Ca2+攝入的方法是即細(xì)胞培養(yǎng)5天后每孔加 入1微居45Ca2+， 48小時(shí)后用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測定細(xì)胞的45(^2+攝入情況。
以沒有經(jīng)過P-甘油磷酸刺激的細(xì)胞孔作為對照，實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，每次重復(fù) 設(shè)置平行對照孔。結(jié)果如圖l所示，與對照組相比，用P-甘油磷酸刺激的細(xì)胞染 色有明顯的紅色結(jié)節(jié)即為鈣結(jié)節(jié)(圖1A);鈣攝入(圖lB)也明顯高于對照組(Control m. P -GP, N=3，代O. 01，結(jié)果為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤)。
以上結(jié)果說明，0 -甘油磷酸誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的牛胸主動脈平滑肌細(xì)胞鈣化模 型己經(jīng)成功建立。
2、鈣化模型中COMP的表達(dá)
將步驟1得到的原代平滑肌細(xì)胞傳代培養(yǎng)，得到第五代牛主動脈平滑肌細(xì)胞， 給予其e-甘油磷酸刺激，按照步驟l提供的方法進(jìn)行鈣化誘導(dǎo)，每隔兩天換液一 次，分別在刺激后3天，5天，7天收取蛋白，進(jìn)行western blot，用抗兔的C0MP 的抗體(多克隆抗體，購自AbC扁，Cambridge公司，UK, Cat. No. abl4515，以1 : 1000稀釋。)去檢測細(xì)胞中C0MP蛋白(分子量110KD)的表達(dá)。結(jié)果如圖2A所示， 以P-actin為內(nèi)參，和Control組相比，P-GP組平滑肌細(xì)胞C0MP全長110KD是 顯著減少的，其降解片段(大約55KD)則是顯著增加的。圖2B顯示的C0MP110KD 條帶統(tǒng)計(jì)圖。
二、小干擾RNA特異性敲低C0MP后，CaCl2誘導(dǎo)的大鼠平滑肌細(xì)胞鈣化情況 1、小干擾RNA特異性敲低C0MP
設(shè)計(jì)合成了COMP特異的小分子干擾RNA。具體方法是根據(jù)大鼠C0MP序列(Pub raed Accession Number NM—012834,由Invitrogen公司Blcok-iTTM RNAi Designer 軟件設(shè)計(jì)C0MP siRNA序列COMP siRNA的正義鏈為5' - AGAAACUUGAGCUGUGUUGAU AGCC-3' ， COMP siRNA的反義鏈為5' - GGCUAUCAAGACAGCUCAAGUUUCU -3'。合 成上述序列的C0MP siRNA。
將50nmol/L COMP siRNA (體積是2. 5ul)用Oligofectamine (購自Invitro gen公司，CA)轉(zhuǎn)染至鋪在六孔板中的A7r5 (大鼠平滑肌細(xì)胞系，購自ATCC公司(C RL-1444))，每孔6萬個(gè)，48小時(shí)后提取細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以其為模板，以5' -GTGACTTCGATGCTGACAAGGT-3'和5' - GTCTTGATAGCCGAAGATGAAGC -3'為引物，實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增COMP基因。以大鼠的P-actin基因作為內(nèi)參，擴(kuò) 增P-actin基因的正義鏈為:5' -GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3'，反義鏈為5'— TCGGGGCATCGGAAC CGCTCA-3'。同時(shí)以轉(zhuǎn)染scramble siRNA (購自Invitrogen公 司，Stealth RNAi duplex Cat. No. 12935)的A7r5作為對照。設(shè)定轉(zhuǎn)染了 scr amble siRNA的A7r5的mRNA水平為1，轉(zhuǎn)染COMP siRNA的A7r5與之相比。實(shí)驗(yàn) 設(shè)三次重復(fù)，每種處理設(shè)平行孔。結(jié)果如圖3A (Scramble siRNA COMP siRNA, N二3，代0. 05)所示。其中，siRNA scramble為轉(zhuǎn)染scramble siRNA的A7r5， siRN A COMP為轉(zhuǎn)染了 COMP siRNA的A7r5。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染COMP siRNA的A7r5中COM P的mRNA水平顯著被抑制(60%)。
2、 CaCl2誘導(dǎo)的大鼠平滑肌細(xì)胞鈣化情況
將A7r5細(xì)胞鋪在六孔板里，每孔6萬個(gè)細(xì)胞，按照步驟二的步驟1提供方法將 50nmol/L COMP siRNA轉(zhuǎn)染A7r5， 48小時(shí)后，往六孔板中加5mmol/L CaCl2-給予細(xì)胞鈣 化刺激，12天后細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色和鈣沉積測定，其中，茜素紅染色和鈣沉積測定與 步驟一提供的方法相同。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，每次重復(fù)設(shè)置平行對照孔。結(jié)果如圖3所示 (Control vs. CaCl2 ，^3,尸<0.05，圖中的數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)，轉(zhuǎn)染了 COMP siRNA 的A7r5和轉(zhuǎn)染了 scramble siRNA的A7r5相比，鈣化結(jié)節(jié)明顯增多(圖3C)，鈣沉積也 明顯加重(約30%)(圖3B)。
實(shí)施例2、表達(dá)COMP的腺病毒的制備及其功能檢測 一、重組C0MP腺病毒(Ad-C0MP)的獲得及其鑒定 1、重組C0MP腺病毒的獲得
利用RT-PCR技術(shù)，從小鼠主動脈中擴(kuò)增COMP的全長cDNA (GenBank號為 麗—016685。提取小鼠主動脈中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板，用下述引物進(jìn) 行PCR擴(kuò)增。
Sense: 5， -ACGGAATTC CGCCACCATGGGCCCCACTGCCTGCGTTCTAGT-3，(序列表中 序列l(wèi));
Antisense: 5， -GCATCT AGACACACTGGTCCCTAAACTCTCTGCAG-3，(序列表中序 列2)。擴(kuò)增得到2.4kbp的片段，命名為co/z p，經(jīng)測序驗(yàn)證，得到的片段具有GenBank 號為NM一016685的自5'端第15位一2279位所示的核苷酸。該片段可以編碼序列 如GenBank號為EDL28815的第1位-755位所示的氨基酸。
腺病毒構(gòu)建參照BD公司說明(BD， Biosciences Clontech， CA)將上述得到的 c咖; 重組連接到pShuttle-CMV(-)重組穿梭載體，再將其轉(zhuǎn)移到pAdxis重組腺病 毒骨架載體上，然后讓其感染HEK293細(xì)胞系，得到細(xì)胞系內(nèi)大量復(fù)制擴(kuò)增的腺病 毒，命名為Ad-C0MP，之后收集感染的HEK293細(xì)胞進(jìn)一步純化，即氯化銫不連續(xù)超 速離心分離，之后再進(jìn)行連續(xù)密度梯度超速離心分離，最后脫鹽處理，得到的病毒 用2%甘油混勻保存。純化獲得的病毒需要進(jìn)行滴度鑒定，即將HEK293以每孔1 萬的數(shù)量鋪在96孔板內(nèi)，然后將病毒原液稀釋成不同倍數(shù)進(jìn)行感染，十天以后觀 察記錄CPE (細(xì)胞病變效應(yīng))孔數(shù)，計(jì)算得出Ad-COMP的滴度。
按照獲得Ad-COMP腺病毒的方法，將co;^換成綠色熒光蛋白(GFP)基因(GFP 是GenBank號為GQ221701的自5'端第1位-661位所示的基因)，制備得到Ad-GFP 腺病毒，作為對照。
2、重組COMP腺病毒(Ad-C0MP)的鑒定
用5 M和10 M的Ad-C0MP分別感染實(shí)施例1中步驟一的步驟1得到的原代牛 平滑肌細(xì)胞，對照組用等量Ad-GFP腺病毒，48小時(shí)后，提取細(xì)胞總蛋白，用抗C0MP 特異性抗體做免疫印跡實(shí)驗(yàn)，以0-actin為內(nèi)參，結(jié)果如圖4所示，Ad-C0MP感染 過的原代牛平滑肌細(xì)胞的C0MP蛋白(110KD)水平明顯增加。
二、重組C0MP腺病毒抑制血管,丐化
1、重組C0MP腺病毒抑制P -甘油磷酸誘導(dǎo)的原代牛胸主動脈平滑肌細(xì)胞鈣化 5 M的Ad-C0MP感染實(shí)施例1中步驟一的步驟1得到的原代牛平滑肌細(xì)胞，對 照組是等量Ad-GFP， 48小時(shí)后按照實(shí)施例1中步驟一的步驟1提供的方法給予細(xì) 胞10mmol/L P -甘油磷酸刺激,7天后按照實(shí)施例1中步驟一的步驟1提供的方法進(jìn) 行細(xì)胞染色和45Ca2+攝入實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果如圖5顯示，過表達(dá)Ad-C0MP 組與Ad-GFP組相比，鈣結(jié)節(jié)明顯更少(圖5B)，鈣45攝入也顯著減少(圖5A)。 N=3，代0.05。圖中的數(shù)據(jù)為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。2、重組C0MP腺病毒抑制CaCl2誘導(dǎo)的大鼠腹主動脈鈣化
1) CaCl2誘導(dǎo)的大鼠腹主動脈鈣化模型的建立
取240-260克雄性Sprague-Dawley大鼠(湖南克萊斯景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司)， 腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg)麻醉。分離從腎動脈到髂動脈之間的腹主動脈，棉 簽涂抹0.2MCaCl2溶液10分鐘，然后關(guān)腹縫合傷口，對照組涂抹生理鹽水處理相 同時(shí)間。7天后處死大鼠取處理過的腹主動脈，按照實(shí)施例l步驟二的步驟2提供 的方法進(jìn)行茜素紅染色和鈣沉積測定。結(jié)果如圖6所示，和對照組相比，涂抹0.2M CaCl2的腹主動脈茜素紅染色有明顯的著色(圖6A)，鈣沉積也顯著增加(圖6B)。 N=6，代0.05。圖中的數(shù)據(jù)為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。
以上結(jié)果表明，CaCl2誘導(dǎo)的大鼠腹主動脈鈣化模型已經(jīng)建立。
2) 重組COMP腺病毒抑制CaCl2誘導(dǎo)的大鼠腹主動脈鈣化
重復(fù)步驟1)建立鈣化模型，涂抹0.2 M CaCl2溶液10分鐘后，立即涂抹由6 X 108 pfu量的Ad-COMP與30% Pluronic膠(購自Sigma公司)4。C下混勻的病毒， 7天后取處理段腹主動脈，進(jìn)行鈣沉積檢測，并組織切片進(jìn)行von Kossa染色。結(jié) 果如圖8顯示，和Ad-GFP相比，Ad-COMP可以顯著減少鈣結(jié)節(jié)(圖8A)，并可以顯 著抑制腹主動脈的鈣含量，抑制率達(dá)50% (圖8B)， N=5，代O. 05。圖中的數(shù)據(jù)為 平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。其中，抑制率=((Ad-GFP組的鈣含量)-(過表達(dá)Ad-COMP的鈣 含量))/ (Ad-GFP組的鈣含量)。
3) 機(jī)理分析
將6X 108 pfu量的Ad-COMP與30% Pluronic gel (購自Sigma公司)4° C 下混勻，分離完大鼠腹主動脈之后，室溫下迅速均勻地涂抹于其上；對照組采用 Ad-GFP。隨即縫合傷口。 7天后，取處理段腹主動脈，提取組織蛋白，按照實(shí)施例 l步驟一的步驟2中的方法進(jìn)行western blot法測定COMP蛋白水平。結(jié)果如圖7 顯示，相比與涂抹Ad-GFP，涂抹Ad-COMP的血管COMP表達(dá)顯著增加。將表達(dá)出的 COMP蛋白測序，其氨基酸序列如GenBank號為EDL28815的第1位m-755位v所示。
11序列表
<110〉 北京大學(xué)
〈120〉軟骨寡聚基質(zhì)蛋白在制備血管鈣化治療藥物中的應(yīng)用 〈130〉 CGGNARL92551 <160> 2
<210> <211> <212> <213〉 〈220〉 <230>
1
42 DNA
人工序列
<400〉 1
acggaattcc gccaccatgg gccccactgc ctgcgttcta gt
42
〈210〉 <211〉 〈212〉 <213〉 <220> <230〉
2
35 DNA
人工序列
<400〉 2
gcatctagac acactggtcc ctaaactctc tgcag
3權(quán)利要求
1、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白在制備預(yù)防或治療血管鈣化的藥物中的應(yīng)用。
2、 表達(dá)軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的重組腺病毒在制備預(yù)防或治療血管鈣化的藥物中的應(yīng)用。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的氨基酸序列如GenBank號為EDL28815的第1位-755位所示。
4、 如權(quán)利要求l-3任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述血管鈣化是血管中膜的牽丐化。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述血管中膜的鈣化是胸主動脈平滑肌細(xì)胞鈣化或腹主動脈鈣化。
6、 如權(quán)利要求2-5任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述重組腺病毒的構(gòu)建步驟如下1) 將軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)入穿梭載體pShuttle-CMV (-)，構(gòu)成重組穿梭載體；2) 將步驟l)得到的重組穿梭載體與pAdxis腺病毒骨架載體連接，制成含有所述軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的編碼基因的重組腺病毒載體；3) 將步驟2)得到的重組腺病毒載體感染受體細(xì)胞，得到重組腺病毒。
7、 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的編碼基因的編碼序列如GenBank號為醒—016685的自5'端第15位-2279位所示；所述受體細(xì)胞是真核生物的傳代細(xì)胞；所述真核生物的傳代細(xì)胞為HEK293細(xì)胞。
8、 一種預(yù)防或治療血管鈣化的藥物，其活性成分是如下l)或2):1) 軟骨寡聚基質(zhì)蛋白；2) 表達(dá)軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的重組腺病毒。
9、 如權(quán)利要求8所述的藥物，其特征在于所述重組腺病毒的構(gòu)建步驟如下1) 將軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)入穿梭載體pShuttle-CMV (-)，構(gòu)成重組穿梭載體；2) 將步驟l)得到的重組穿梭載體與pAdxis腺病毒骨架載體連接，制成含有所述軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的編碼基因的重組腺病毒載體；3) 將步驟2)得到的重組腺病毒載體感染受體細(xì)胞，得到重組腺病毒；所述軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的編碼基因的編碼序列如GenBank號為NM—016685的自5'端第15位-2279位所示；所述軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的氨基酸序列如GenBank號為EDL28815的第1位-755位所示；所述受體細(xì)胞是真核生物的傳代細(xì)胞；所述真核生物的傳代細(xì)胞為HEK293細(xì)胞。
10、如權(quán)利要求8或9所述的藥物，其特征在于所述血管鈣化是血管中膜的鈣化；所述血管中膜的鈣化是胸主動脈平滑肌細(xì)胞鈣化或腹主動脈鈣化。
全文摘要
本發(fā)明公開了軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)在制備治療血管鈣化的藥物中的應(yīng)用。表達(dá)軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的重組腺病毒也可應(yīng)用于治療血管鈣化。實(shí)驗(yàn)證實(shí)表達(dá)軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的重組腺病毒抑制大鼠腹主動脈鈣化。
文檔編號A61P9/10GK101670097SQ200910093499
公開日2010年3月17日 申請日期2009年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月24日
發(fā)明者煒 孔, 杜瑤瑤, 憲 王, 悅 王 申請人:北京大學(xué)